KR20160072626A - 패혈증 인자 il-6 간이 진단 키트 - Google Patents

패혈증 인자 il-6 간이 진단 키트 Download PDF

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박진호
오홍근
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전북대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 개(canine)의 IL-6 항원을 검출하는 패혈증 진단 키트에 관한 것이다. 구체적으로 상기 진단 키트는 시료가 흡수되는 샘플 패드(sample pad), 시료 내의 개(canine)의 IL-6 항원과 결합하는 단클론 마우스 항-개(canine) IL-6 항체와 금의 축합체를 포함하는 금 축합 패드(gold conjugation pad), 다클론 산양 항-개(canine) IL-6 항체가 고정된 반응선(test line)과 다클론 산양 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 구비된 반응막(test membrane) 및 잔량의 시료가 흡수되는 흡습 패드(absorption pad)를 포함하는 테스트 스트립을 포함한다. 본 발명의 진단 키트를 이용하면, 패혈증에 의해 생성된 개(canine)의 IL-6 항원을 특별한 기계적인 조작 없이 간단하게 패혈증의 여부를 육안으로 확인할 수 있다.

Description

패혈증 인자 IL-6 간이 진단 키트{Rapid diagnostic Kit for detecting sepsis factor IL-6}
본 발명은 개(Canine)의 패혈증 시, 체내(혈중)에 증가되어 있는 IL-6를 검출하는 패혈증 간이 진단 키트에 관한 것이다.
일반적으로, 패혈증은 미생물에 감염되어 전신에 심각한 염증 반응이 나타나는 상태를 말한다. 체온이 38도 이상으로 올라가는 발열 증상 혹은 36도 이하로 내려가는 저체온증, 호흡수가 분당 24회 이상으로 증가(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 혹은 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라고 부른다. 이러한 전신성 염증 반응 증후군이 미생물의 감염에 의한 것일 때 패혈증이라고 한다.
패혈증의 초기 증상으로는 호흡 수가 빨라지고, 지남력(시간, 장소, 사람에 대한 인지력)의 상실이나 정신 착란 등의 신경학적 장애가 나타날 수 있다. 혈압의 저하 및 신체 말단에 공급되는 혈액량의 저하로 인하여 피부가 시퍼렇게 보이기도 한다. 균혈증(세균이 혈액 내에 돌아다니는 증상)이 있으면 세균이 혈류를 따라 돌아다니다가 신체의 특정 부위에 자리를 잡아 그 부위에 병적인 변화를 일으킬 수 있다. 원인균에 특이적인 피부의 변화가 나타나서 패혈증의 원인을 진단하는 데 도움이 되기도 한다. 소화기 계통의 증상으로는 구역, 구토, 설사 및 장 마비 증세가 나타나고 심한 스트레스 상황에서는 소화기의 출혈 증상도 나타날 수 있다.
이러한 패혈증에 특이적인 진단법이 알려져 있지않기 때문에 환자의 체온, 맥박수, 호흡수, 혈압, 혈액검사상의 백혈구 수치 등을 종합하여 판단하며, 패혈증의 원인이 될 수 있는 감염증이 있는지를 확인하여 진단한다. 따라서 개(Canine)의 패혈증 상태를 확인하기 위해서는 이의 진단과 관련한 특이적인 기술이 절실히 필요한 실정이나, 아직까지는 미흡한 상황이다.
패혈증 진단 관련 기술의 일례로는 한국등록특허 제1398890호에 패혈증 진단용 조성물 및 그 방법 및 키트에 관하여 개시되어 있고, 한국등록특허 제1300601호에 염증질환 및 패혈증 진단방법 및 이를 위한 키트에 관하여 개시되어 있으나, 본원 발명의 개의 패혈증 진단 키트에 관한 것은 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 시료 내의 개(canine)의 IL-6 항원과 결합하는 단클론 마우스 항-개(canine) IL-6 항체와 금의 축합체를 포함하는 금 축합 패드(gold conjugation pad) 및 다클론 산양 항-개(canine) IL-6 항체가 고정된 반응선(test line)과 다클론 산양 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 구비된 반응막(test membrane)을 포함하는 테스트 스트립을 이용하여 개(canine)의 IL-6 항원을 95% 이상의 민감도 및 97% 이상의 특이도로 검출하는 패혈증 진단 키트를 제공함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 시료가 흡수되는 샘플 패드(sample pad);
(b) 시료 내의 개(canine)의 IL-6 항원과 결합하는 단클론 마우스 항-개(canine) IL-6 항체와 금의 축합체를 포함하는 금 축합 패드(gold conjugation pad);
(c) 다클론 산양 항-개(canine) IL-6 항체가 고정된 반응선(test line)과 다클론 산양 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 구비된 반응막(test membrane); 및
(d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡습 패드(absorption pad)
를 포함하는 테스트 스트립으로 구비되는 개(canine)의 IL-6 항원을 검출하는 패혈증 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 개(canine)의 IL-6 항원을 검출하는 패혈증 진단 키트를 이용하는 진단방법을 제공한다.
본 발명은 개(canine)의 IL-6 항원을 검출하는 패혈증 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명의 패혈증 진단 키트는 면역크로마토그래피(immunochromatography)법에 의한 것으로, 상세하게는 항원에 대한 항체의 면역학적 반응성과 금 입자(colloidal gold)의 발색 특성, 유동성 및 막(Porous membrane)의 모세관 현상에 의한 분자의 이동을 응용한 것이다. 따라서 기존의 다단계(Multi-step)의 면역측정법에서 볼 수 있는 검체 희석, 세정 및 효소결합체와 기질의 반응을 통한 발색 과정을 하나로 통합하여 원-스텝(one-step)으로 신속하게 검사할 수 있는 편리성이 있다. 또한, 검사결과를 특정한 장비를 사용하지 않고 판정할 수 있는 용이성 및 경제성, 검사결과 판독의 신속성의 장점이 있다.
도 1은 신속 면역크로마토그래피법의 모식도이다.
도 2는 재조합 canine IL-6의 SDS-PAGE 사진이다. lane 1: 크기 마커(Bio-rad, Cat. No. 161-0374, Precision plus protein standard); lane 2는 재조합 Canine IL-6이다. (원천: 대장균 유래, Thr23-Met207, with an N-terminal Met & Pro24-Met207, 활성도: Measured in a cell proliferation assay using T1165.85.2.1 mouse plasmacytoma cells. Nordan, R.P. et. (1987) J. Immunol. 139:813. 이 효과에 대한 ED50은 대략 5-25ng/㎖임).
도 3은 항-Canine IL-6의 SDS-PAGE 결과이다. lane 1: size marker (Bio-rad, Cat. No. 161-0374, Precision plus protein standard); lane 2: 단클론 마우스 항-canine IL-6(단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247017)); lane 3: 단클론 마우스 항-canine IL-6 MAb (단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247002)); lane 4: 다클론 산양 항 canine IL-6이다.
도 4는 다클론 산양 항-canine IL-6의 중화항체가에 대한 결과이다.
도 5는 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247017)의 중화항체가에 대한 결과이다.
도 6은 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247002)의 중화항체가에 대한 결과이다.
도 7은 항원-항체 간의 반응성을 나타낸 도면이다. 1. 다클론 산양 항-canine IL-6, 2. 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone:247002), 3. 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone:247017)
도 8은 항체 쌍에 따른 재조합 canine IL-6에 대한 민감도를 나타낸 도면이다.
도 9는 항체 쌍에 따른 재조합 canine IL-6에 대한 특이도를 나타낸 도면이다.
도 10은 항원의 농도에 따른 민감도를 비교한 도면이다.
도 11은 임상 양성 검체에 대한 민감도를 비교한 도면이다.
도 12는 음성 검체에 대한 특이도를 비교한 도면이다.
도 13은 분주한 항체의 농도에 따른 민감도를 비교한 도면이다.
도 14는 멤브레인 상에 검사선(T)과 대조선(C)을 나타낸 모식도이다.
도 15는 멤브레인의 제조과정을 나타낸 흐름도이다.
도 16은 금 입자의 모식도이다.
도 17은 항원의 농도와 콜로이달 골드 용액의 pH 조건에 따른 본 발명의 진단 키트의 민감도를 나타낸 도면이다.
도 18은 멤브레인 상에 축합 패드를 나타낸 모식도이다.
도 19는 축합 패드의 제조 공정도이다.
도 20은 샘플 패드의 제조 공정도이다.
도 21은 흡습 패드의 제조 공정도이다.
도 22는 검사용 스트립의 구성을 나타낸 도면이다. ① 샘플 패드 (sample pad); ② 축합 패드 (conjugate pad); ③ 검사선 (test line, T); ④ 대조선 (control line, C); ⑤ 흡습 패드 (absorption pad); ⑥ 플라스틱 카드 (plastic card); ⑦ 나이트로셀룰로오스 멤브레인 (nitrocellulose membrane)
도 23은 본 발명의 디바이스 및 스트립의 내/외부 모식도를 나타낸 도면이다.
도 24는 본 발명의 진단 키트를 이용한 검사방법을 나타낸 도면이다.
도 25는 본 발명의 진단 키트의 결과 해석을 나타낸 도면이다.
도 26은 본 발명의 진단 키트의 검출한계를 시험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 27은 본 발명의 진단 키트의 특이도를 시험한 결과(음성 검체 #1~10)의 예를 나타낸 도면이다.
도 28은 본 발명의 진단 키트의 민감도를 시험한 결과(양성 검체 #1~10)의 예를 나타낸 도면이다.
도 29는 본 발명의 진단 키트의 정밀도를 시험 분석한 결과이다.
본 발명은 (a) 시료가 흡수되는 샘플 패드(sample pad); (b) 시료 내의 개(canine)의 IL-6 항원과 결합하는 단클론 마우스 항-개(canine) IL-6 항체와 금의 축합체를 포함하는 금 축합 패드(gold conjugation pad); (c) 다클론 산양 항-개(canine) IL-6 항체가 고정된 반응선(test line)과 다클론 산양 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 구비된 반응막(test membrane); 및 (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡습 패드(absorption pad)를 포함하는 테스트 스트립으로 구비되는 개(canine)의 IL-6 항원을 검출하는 패혈증 진단 키트에 관한 것이다.
상기 진단 키트는 샘플 패드, 금 축합 패드, 반응선, 대조선 및 흡습 패드의 순서로 위치하는 것이 바람직하며, 상기 반응선에 0.1 내지 10㎍의 다클론 산양 항-개(canine) IL-6 항체가 고정되어 있는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 상기 금 축합 패드에 0.01 내지 1.0㎍의 단클론 마우스 항-개(canine) IL-6 항체와 금의 축합체가 분주된 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 상기 대조선에는 0.1 내지 10㎍의 다클론 산양 항-마우스 IgG가 처리된 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 상기 진단 키트에 사용되는 시료는 혈청 또는 혈장인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 개의 혈액으로부터 분리한 혈청 또는 혈장인 것이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 패혈증의 진단에서 95% 이상의 민감도 및 97% 이상의 특이도를 나타내는 것이 특징이며, 상기 패혈증의 진단에서 시료 중의 IL-6 항원의 농도가 2ng/㎖ 이상인 것을 검출하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 진단 키트를 이용하는 패혈증의 진단방법에 과한 것이다. 본 발명의 패혈증의 진단방법은 구체적으로 시료를 상기 패혈증 진단 키트의 샘플 패드에 투입하여 테스트 스트립의 반응선과 대조선에 색띠가 나타나면 패혈증 양성으로 판단하고, 대조선에만 색띠가 나타나면 패혈증 음성으로 판단하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 패혈증 진단 키트는 순수 정제한 다클론 산양 항-canine IL-6 항체가 멤브레인의 검사선 부위에 적당 농도로 분주되어 있고, 대조선 부위에는 마우스 IgG에 대해 특이적으로 결합하는 다클론 산양 항-마우스 IgG가 분주되어 있다. 따라서 미지의 검체를 적량 키트와 반응시키면, 검체 내 canine IL-6 항원의 유무에 따라 축합 패드의 단클론 마우스 항-canine IL-6-금 축합체와 1차적인 항원-항체 반응을 하게 되고 막의 모세관 현상에 의해 흘러가다가 검사선 부위에 분주되어 있는 다클론 항체와 2차적인 항원-항체 반응을 하게 되며, 최종적으로 대조선 부위에 있는 다클론 산양 항-마우스 IgG와 결합함으로써 검사의 종료가 이루어지게 된다. 반응 종료 후 검사선에 색띠의 유무에 따라 검체내 canine IL-6의 존재 여부를 판독하게 된다.
본 발명에서 민감도(sensitivity)는 감별검사에서 실제로 양성인 시료 중에서 검사 결과가 양성으로 나올 확률의 합으로, 검사가 어느 정도로 양성(유병자) 시료를 골라내는 지를 확인할 수 있는 지표이다.
또한, 특이도(specificity)는 감별검사에서 실제로 음성인 시료 중에서 검사결과가 음성으로 나올 확률의 합으로 검사가 어느 정도로 음성(정상) 시료를 잘 골라내는지를 확인할 수 있는 지표이다.
또한, 정확도(accuracy)는 감별검사에서 전체 시료에 대하여 실제 양성 시료를 양성으로 판별한 수와 실제 음성 시료를 음성으로 판별한 시료 수의 합의 비율을 의미한다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. Canine 항- IL -6 진단 키트의 개발을 위한 최적의 원료 쌍의 선정
[항- Canine IL -6 항체 및 항원의 준비]
(1) 항원
개의 혈액 시료에서 canine IL-6의 존재 여부를 진단하기 위한 항체의 선별 및 진단 키트 제작을 위한 표준물질로 재조합 canine IL-6 (recombinant Canine IL-6, Cat. No.: 1609-CL-025)를 R&D systems사로부터 구매하여 사용하였다.
정량 : 상기 항원을 3차 증류수로 녹여 250 ㎍/㎖로 만들었고, 항원을 희석하여 Bio-rad Protein assay Dye Reagent Concentrate (Cat. #500-0006)로 단백질 정량을 수행하여 항원의 농도를 확인하였다.
전기영동 : 상기 항원을 12% SDS-PAGE를 수행하여 도 2에 개시한 바와 같이 약 20 kDa 근처의 단일 밴드를 확인하였다. 상기 밴드는 항원의 예상 크기인 20.8kDa과 동일하였다.
(2) 항체
Canine IL-6 진단을 위해 멤브레인에 고정할 항체와 금(gold) 입자 축합체(conjugate)를 제조하기 위하여 다클론 산양 항-canine IL-6(Canine IL-6 Affinity Purified Polyclonal Ab)와 단클론 마우스 항-canine IL-6(Canine IL-6 MAb) 2종(단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247017), Mouse IgG2A & 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247002), Mouse IgG2B)를 R&D systems사로부터 구매하였다.
정량:
동결건조된 각각의 항체를 3차 증류수로 녹여 라인 분주의 적정농도 기준인 1mg/㎖로 만든 후, 분광기를 이용해 A280에서 흡광도를 측정하였고, 입고 시 기재된 항체의 농도와 편차가 없음을 확인하였다.
전기영동:
상기 항체들을 12% polyacrylamide 겔 전기영동을 수행하여 도 3에 개시한 바와 같이, 3종의 항체는 약 50kDa의 밴드와 약 25kDa의 2개의 밴드를 확인하였다.
항체의 특이도:
다클론 산양 항-canine IL-6는 ELISA와 웨스턴블롯에서 canine IL-6와 반응성이 좋으며, 재조합 feline IL-6 항원, 재조합 porcine IL-6 항원과 5% 미만의 교차반응을 나타내고, 재조합 human IL-6, 재조합 mouse IL-6, 재조합 rat IL-6, 재조합 cotton rat IL-6, 재조합 equine IL-6와 단지 0.2%의 교차반응을 나타낸다.
단클론 마우스 항-canine IL-6는 ELISA와 Western Blot에서 canine IL-6와 반응성이 좋으며, 재조합 equine IL-6 항원, 재조합 human IL-6 항원, 재조합 mouse IL-6, 재조합 porcine IL-6, 재조합 rat IL-6과 10~50% 미만의 교차반응을 나타내며, mCardiotrophin-1, rhCLC, rrCNTF, 재조합 cotton rat IL-6, rmIL-11, rmLIF, 또는 rmOncostatin M과 교차반응이 없는 것이다.
중화항체가:
다클론 산양 항 canin IL-6의 중화항체가: 도 4에 개시한 바와 같이 T1165.85.2.1 마우스 형질 세포종 세포주에서 IL-6 유도 증식을 중화하는 능력이 있으며, 중화 용량(ND50)은 50ng/㎖의 재조합 canine IL-6에 대해 0.4~2.0㎍/㎖이다.
단클론 마우스 항-canine IL-6(단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247017))의 중화항체가: 도 5에 개시한 바와 같이 T1165.85.2.1 마우스 형질 세포종 세포주에서 IL-6 유도 증식을 중화하는 능력이 있으며, 중화 용량(ND50)은 50ng/㎖의 재조합 canine IL-6에 대해 10~30㎍/㎖이다.
단클론 마우스 항-canine IL-6(단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247002))의 중화항체가: 도 6에 개시한 바와 같이 T1165.85.2.1 마우스 형질 세포종 세포주에서 IL-6 유도 증식을 중화하는 능력이 있으며, 중화 용량(ND50)은 50ng/㎖의 재조합 canine IL-6에 대해 1~5㎍/㎖이다.
실시예 1-1. 항원과 항체의 반응성 확인
상기 항원과 항체 간의 반응성 여부를 확인하기 위해, 상기 항체 3종을 골드 컨쥬게이션(축합체)을 형성하여 멤브레인에 고정화된 항원과의 반응성 정도를 알아보았다.
(1) 항원의 고정화
250㎍/㎖의 재조합 canine IL-6를 니트로셀룰로오스 멤브레인이 부착된 스트립에 1㎕를 점적한 후, 25~30℃, 20% 이하의 습도 조건이 유지되는 건조실에서 건조한 후 사용하였다.
(2) 항체-금 입자 축합체의 제조
항체가 pH 7~9 조건에서 콜로이달 골드와 반응성이 좋으므로, 특별한 첨가물이 없는 경우, 일반적으로 pH 9 조건에서 금 축합체를 제조하였다.
① 40~50nm의 콜로이달 골드 10㎖을 K2CO3를 이용해 pH 9.0으로 적정한 후, 1㎖의 콜로이달 골드를 취하여 1.5㎖ 튜브에 넣었다.
② 상기 3종의 항체를 각각 0.1mg/㎖의 농도가 되도록 인산 완충용액으로 희석하여 0.1㎖을 제조하였다.
③ 상기 콜로이달 골드를 넣은 튜브에 각각의 희석된 항체를 넣은 후, 바로 vortex mixer를 이용해 약 30초간 세게 섞어 준 후, 약 10분간 약하게 흔들어주며 반응시켰다.
④ 상기 단계 ③ 이후에, 각각의 튜브에 5% 카제인(casein)을 100㎕씩 넣은 후, 즉시 voltex mixer를 이용해 약 30초간 세게 섞어 준 후, 약 10분간 약하게 흔들어주며 반응시켰다.
⑤ 상기 단계 ④ 이후에, 원심분리기를 이용해 8,000rpm, 4℃ 조건에서 약 10분간 원심분리하고, 상층액을 제거한 후, 1% BSA/2mM borax 용액 1㎖을 첨가하여 펠렛을 완벽하게 용해시켰다.
⑥ 상기 5단계 이후에, 원심분리기를 이용해 8,000rpm, 4℃ 조건에서 약 10분간 원심분리하고, 상층액을 제거한 후, 1% BSA/borax 용액으로 최종부피가 0.1㎖이 되도록 첨가하여 펠렛을 완벽하게 용해시켜 항체-금 입자 축합체를 제조하였다.
(3) 항원-항체 반응성 선별
항원이 고정화된 스트립과 항체-금 축합체를 이용해 항원과 항체 간의 반응성 정도를 분석하였다. 이를 위하여 96웰 플레이트에 상기 제조한 항체-금 축합체 2㎕와 버퍼(50mM borate pH 9.3, 0.5% casein, 50mM NaCl, 2% Tween 20) 48㎕를 넣고 섞어준 후, 항체가 흡착된 스트립을 꽂아 5분간 반응시킨 후 결과를 확인하였다.
도 7에 개시한 바와 같이, 상기 제조한 3종의 항체-금 축합체는 스트립에 고정화된 항원과 반응하여 발색을 나타냈다.
실시예 1-2. 최적 항체 쌍 선정
(1) 항체 쌍 선정
canine IL-6 진단을 위해 각각의 항체를 스트립에 고정하고, 각각의 항체를 금 축합체로 제조한 최적의 쌍을 선정하고자 하였다.
1mg/㎖로 희석된 각각의 항체 1㎕를 3개의 스트립에 점적하여 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 항체를 고정하고 건조하여, 고정화된 항체 스트립을 제조하였다.
3종의 항체에 대하여, 상기 2)의 항체-금 축합체 제조 방법과 동일한 방법으로 최종 부피가 0.1㎖이 되도록 각각의 항체-금 축합체를 제조하였다.
① 민감도( sensitivity ) 분석
96웰 플레이트에 상기 제조한 3㎕의 항체-금 축합체와 42㎕의 완충용액(50mM borate pH 9.3, 0.5% casein, 50mM NaCl, 2% Tween 20)을 각 3개의 웰에 넣어 섞어준 후, 포스페이트 완충용액으로 희석하여 준비한 100ng/㎖의 재조합 canine IL-6를 각 웰에 5㎕씩 분주하고 혼합하여 약 1분간 반응시킨 후, 자신의 항체와 다른 2개의 항체가 흡착된 스트립을 꽂아 5분간 반응시킨 후 결과를 확인하였다(도 8).
② 특이도( specificity ) 분석
96웰 플레이트에 3㎕의 항체-금 축합체와 47㎕의 완충용액(50mM borate pH 9.3, 0.5% casein, 50mM NaCl, 2% Tween 20)을 넣어 잘 섞어 준 후, 자신의 항체와 다른 2개의 항체가 흡착된 스트립을 꽂아 5분간 반응시킨 후 결과를 확인하였다(도 9).
단클론 항체의 경우, 동일한 항체끼리의 쌍 및 서로 다른 단클론 항체 쌍 조건에서 항원에 대한 반응성이 없는 것으로 나타났고, 다클론 항체와 다클론 항체 쌍의 경우, 재조합 항원에 대해서도 발색을 보였지만 도 9에서 개시한 바와 같이 전개 버퍼 용액에서도 발색을 나타내 항체 쌍 선정 대상에서 제외하였다.
단클론 항체와 다클론 항체 쌍에 대한 결과는 민감도(sensitivity) 분석에서는 모두 발색하였고, 항원의 첨가 없이 전개 완충용액과 금 축합체로만 반응시킨 특이도 시험에서는 모두 발색을 나타내지 않았다(도 8 & 9).
다클론 항체를 금 축합체의 원료로 사용할 경우, 일반적으로 금 축합체의 안정성이 낮아질 우려가 있으므로 혈액류의 검사조건에서는 민감도가 다소 떨어지는 것을 고려하여 다클론 항체를 멤브레인에 고정하고, 단클론 항체를 금 축합하기로 하였다.
멤브레인에 고정시킨 다클론 항체에 대해 2종의 단클론 항체의 민감도가 거의 유사한 결과를 보였기에 2종 항체를 이용해 항원 농도별 시험을 통해 최적의 항체 쌍을 선정하기로 하였다.
(2) 최적의 항체 쌍의 선정
상기 시험을 통해 다클론 항체를 고정 항체로 사용하기로 결정하였고, 단클론 항체 2개 중 금 축합체 제조용으로 사용할 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 가장 우수한 단클론 항체를 선별하기 위한 시험을 진행하였다.
① 다클론 항체의 멤브레인 고정화
1mg/㎖ 농도의 다클론 산양 항-canine-IL-6을 라인 분주기를 이용해 검사선에 분주하고, 일정한 라인 발색을 위해 대조선에는 다클론 산양 항-마우스 IgG를 1 mg/㎖ 농도로 분주하였다.
② 단클론 항체 골드 축합체 및 패드 처리
2종의 단클론 마우스 항-canine IL-6 clone(247002), 247017)은 각 10㎖ 콜로이달 골드를 이용해 금 축합체를 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 제조하였다. 제조된 항체-금 축합체를 540 nm의 파장 영역에서 O.D 값을 측정한 후 최종 O.D가 6이 되게 희석하여 폴리에스터 패드(polyester pad)에 처리한 후 건조실에서 1일간 건조하여 사용하였다.
③ 금 축합체 처리 용액 제조
1×PBS, 5% 자당(sucrose), 0.5% 카제인(casein)과 금 축합체가 O.D 6이 되도록 첨가하여 용액을 제조하였다. 1장 처리 시 15㎖을 사용하였다.
(3) 샘플 패드의 처리
유리섬유(glass fiber) 패드에 50mM borate pH 9.3, 0.5% casein, 50mM NaCl, 2% Tween 20 용액을 1장 기준으로 35㎖을 제조하여 처리한 후 건조실에서 1일간 건조하여 사용하였다.
(4) 라미네이션 ( lamination ) 및 절단
건조된 분주카드, 축합패드, 샘플 패드, 흡습패드를 카세트 조립에 맞게 절단하여 각각의 부자재가 중첩되도록 라미네이션을 한 후 4mm로 절단한다.
(5) 최적 쌍 선정 시험
① 재조합 canine IL-6 항원을 인산염 완충용액으로 1ng/㎖, 2ng/㎖, 5ng/㎖, 10ng/㎖, 20ng/㎖ 및 50ng/㎖의 농도로 희석하였다.
② ELISA kit을 이용해 IL-6 항원이 양성인 개의 혈청(serum) 5개와 음성인 개의 혈청(serum)을 5개를 준비하였다.
③ 96웰 플레이트에 희석된 canine IL-6 항원과, 상기 단계 ②에서 준비한 음성 및 양성 임상검체를 각각 100㎕씩 2개의 웰에 분주하였다.
④ 제조된 2개의 항체 쌍에 대한 스트립을 각각 같은 농도의 항원 및 같은 음성 및 양성 검체에 각각 꽂아 10분에 결과를 판독하였다.
항원 농도에 대한 민감도 시험에서 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247002)를 금 축합 한 조건에서는 5ng/㎖의 농도 이상에서 양성 결과를 나타냈고, 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247017)을 금 축합한 조건에서는 2ng/㎖의 농도 이상에서 약한 발색을 나타냈다(도 10).
임상 양성 검체에 대한 민감도 시험:
R&D사 Canine IL-6 Duoset(Cat. No.:DY1609)를 이용해 양성으로 판정된 검체 5개에 대해 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247002) 금 축합체는 2.5ng/㎖를 제외한 4개 검체에 대해 양성의 결과를 보였고, 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247017) 금 축합체는 5개 검체 모두에서 양성 결과를 나타냈다(도 11).
임상 음성 검체에 대한 특이도 시험:
R&D사 Canine IL-6 Duoset(Cat. No.:DY1609)를 이용해 음성으로 판정된 검체 5개에 대해 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247002) 금 축합체와 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247017) 금 축합체 모두 5개 검체 모두에 대해 음성 결과를 나타냈다(도 12).
도 10 내지 도 12에 개시한 바와 같이, 음성 임상검체에 대해서는 두 개의 금 축합체 모두 음성의 결과를 나타냈으나, 항원 농도별 시험과 양성 임상 검체에 대한 시험에서는 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247017)이 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone 247002)에 비해 민감도가 약간 우수한 것으로 나타나 멤브레인 고정화용 항체는 다클론 산양 항-canine IL-6를 선정하였고, 금 축합체 제조용 항체는 단클론 마우스 항-canine IL-6 (clone 247017)일 때 최적인 것으로 분석되었다.
실시예 2. 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 Canine IL -6 진단 키트 의 제작
(1) 항체의 멤브레인 고정화
멤브레인에 분주할 항체를 인산염 완충용액으로 농도별로 희석하여 각각의 항체에 대한 멤브레인 고정화의 최적 농도를 설정하였다.
ⓐ 농도별 분주 조건 설정
니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)을 플라스틱 카드에 라미네이션(lamination)하였다. 이후, 검사선(T) 부위에는 다클론 산양 항-canine IL-6를, 대조선(C) 부위에는 다클론 산양 항-마우스 IgG를 분주하여 멤브레인에 흡착이 가능하고 효과적인 검출 감도를 갖기 위한 분주 조건을 설정하였다.
분주용 항체의 준비는 1×PBS, 0.5% sucrose 조건하에서 검사선용 항체와 대조선용 항체를 각각 0.5 mg/㎖, 0.75 mg/㎖, 1 mg/㎖ 농도로 만들어진 다클론 산양 항-canine IL-6를 각각의 농도로 분주하였다.
ⓑ 농도별 민감도 비교 시험
분주된 멤브레인을 플라스틱 카드에 부착한 후 골드패드와 샘플 패드를 부착하여 재조합 canine IL-6의 농도별(0.5, 1, 2, 5, 10ng/㎖)로 각각의 분주된 농도에 대해 민감도를 시험하였다. 도 13에 개시한 바와 같이 0.5mg/㎖ 농도에서는 재조합 canine IL-6를 2ng/㎖까지 검출할 수 있으나 발색이 약하였고, 0.75mg/㎖과 1mg/㎖ 농도에서는 재조합 canine IL-6를 1ng/㎖ 농도까지 검출 가능한 민감도를 나타냈다. 보다 안정적인 민감도를 유지하기 위해 1mg/㎖의 분주 농도를 최적의 조건으로 설정하였다.
멤브레인 부착 및 분주:
플라스틱 카드에 멤브레인을 부착하고, 하기의 분주 조건으로 분주한 후 30% 이하의 습도가 유지되는 건조실에서 2일간(48시간) 동안 건조시켰다.
[분주 조건]
대조선: 다클론 산양 항-마우스 IgG, 1 mg/㎖ -> 1㎕
검사선: 다클론 산양 항 canine IL-6, 1mg/㎖ -> 1㎕
(2) 항체의 금 축합반응 ( antibody - gold conjugation )
1) 콜로이달 골드 ( colloidal gold )의 제조 조건 설정
일정량의 콜로이달 골드를 증류수에 녹인 후, 100℃에서 강하게 저어주면서 환원제로 구연산나트륨(sodium citrate)을 첨가하여 약 40nm 크기의 콜로이드성 금 입자를 제조하여 사용하였다.
분광기를 이용해 제조된 콜로이달 골드의 O.D 값을 측정한 결과, 540nm에서 최고 값을 나타냈으며, O.D540=2.0의 값을 나타냈다.
2) 금 입자 축합체의 제조 조건 설정
콜로이달 골드 용액을 pH 7.0, 8.0, 9.0의 조건으로 적정한 후, 단클론 마우스 항-canine IL-6(clone-247017)를 금 축합하여 비특이 반응이 없는 pH 조건을 찾기 위해 ELISA 음성 및 양성 저역가 검체에 대해 비교 시험하였고, 도 17에 개시한 바와 같이 약-양성 검체에서는 pH 7.0, 8.0, 9.0 조건 사이의 차이가 없이 약하지만 양성 발색을 보였으나, 음성 검체에 대해 pH 7.0 조건에서는 2개의 검체에 대해 약-양성 결과를 나타냈다. pH 8.0과 pH 9.0의 결과가 거의 유사하지만 항체의 경우 pH 9.0에서 최적의 조건을 갖는 것으로 알려져 있어 안정적으로 pH 9.0을 항체-금축합체 제조의 최적 조건으로 설정하였다.
(3) 축합 패드의 제조
도 19에 개시한 바와 같이, 축합 패드의 제조는 축 패드의 전처리 단계; 금 축합체 용액의 분주 및 건조 단계; 및 축합 패드의 절단 단계로 이루어진다.
1) 축합 패드의 전처리 단계
축합 패드의 전처리는 PVA(polyvinylalcohol) 농도와 트리스 완충용액의 농도를 변화시켜 설정한 최적조건인 0.5% PVA(polyvinylalcohol)가 함유된 트리스 완충용액(20mM, pH 8.0)으로 충분히 적셔 건조기에서 완전히 건조시키는 것이다.
전 처리된 축합 패드에 직경이 약 40nm인 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)에 적정 농도의 항체가 결합된 금 축합체 용액을 분주하고, 30% 이하의 습도가 유지되는 건조실에서 완전히 건조시킨 후 규격대로 (7mm×300mm) 절단하여 사용하였다.
2) 축합 패드의 제조 조건 설정
금 축합체 용액은 단클론 마우스 항-canine IL-6 금 축합체를 1×PBS, 5% sucrose, 0.5% 카제인(casein)과 혼합하여 O.D540=6이 되도록 제조하였다.
200mm×300mm의 폴리에스터 패드 1장 처리 시, 상기 제조한 금 축합체 용액15㎖을 사용하였다. 처리된 패드는 건조실에서 습도가 30% 이하가 유지되도록 약 24시간 동안 충분히 건조한 후 사용하였다(도 18).
(4) 샘플 패드( sample pad ) 조성 및 제작
샘플 패드는 검체의 원활한 전개 및 비특이 반응의 최소화를 위해 50mM borate pH 9.3, 0.5% 카제인(casein), 50mM NaCl, 2% Tween 20 용액에 검체 패드를 충분히 적시고, 건조기에서 완전히 건조시킨 후 규격대로 (18mm×300mm) 절단하여 사용하였다(도 20).
(5) 흡습 패드 ( absorption pad ) 제작
건조기에서 수분을 완전히 건조한 상태로 아무런 처리 없이 그대로 사용하며, 검체의 원활한 흡수를 위해 플라스틱 카드의 끝으로부터 멤브레인과 중첩할 수 있는 규격 (18mm×300mm)으로 절단하여 사용하였다(도 21).
(6) 플라스틱 하우징 ( 디바이스 )
용액을 샘플 패드에 첨가했을 때 넘치는 현상이 일어나지 않고, 특히, 90~120㎕의 용액을 샘플 패드에 넣었을 때에도 넘치는 현상이 없으며, 검체를 넣었을 경우, 최대한의 항원-항체 반응이 일어나도록 유도하고, 검체 주입 후, 용액의 전개속도는 130~180초 이내에 대조선까지 전개되며, 검사용 스트립을 조립할 경우, 흔들리지 않는 검사용 스트립을 장착할 디바이스(device)를 사출하였다.
(7) 디바이스의 조립
상기 각 공정에서 준비한 축합 패드, 샘플 패드, 흡습 패드, 검사용 스트립을 준비하였다. 즉, 멤브레인의 하단에는 축합 패드를 샘플 패드와 부분 중첩이 되도록 부착하고, 멤브레인의 상단에는 흡습 패드를 부착하여 검사 시험지를 완성하고, 완성된 검사용 시험지를 절단기를 이용하여 4mm 정도로 절단하여 스트립을 제작하였다. 이후, 플라스틱 하우징에 넣어 조립하고, 이것을 방습제가 내장된 기밀용기에 넣고 포장하였다(도 22 및 23).
(8) 검사방법
본 발명의 진단 키트는 일정 농도 이상의 canine IL-6의 존재 유무를 알 수 있는 키트로, 전혈분리 패드가 사용되지 않았기에 전혈에는 적용되지 않는다.
신선한 혈장 및 혈청의 사용을 권하며, 냉장 보관 후 검사할 때에는 실온에 약 30분간 방치하였다가 사용한다.
① 알루미늄 포장지를 개봉하여 검사용 카세트를 꺼낸 후, 검체 120㎕를 피펫 등 적정한 도구를 이용하여 검체 점적 부위에 떨어뜨린다.
② 10~15분 사이에 대조선과 검사선의 발색 여부를 확인한다.
③ canine IL-6의 존재 여부를 진단한다. 단, 15분 이후에 나타나는 결과는 판정에 포함하지 않는다(도 24).
(9) 결과판정 및 해석
검사선(T)과 대조선(C) 색띠의 유무를 조사하여 양성과 음성을 판정한다. 대조선(C)은 검체 내의 canine IL-6 존재 여부와 상관없이 항상 나타나는 선이며, 이는 반응상의 이상 유무를 확인하기 위한 것이다.
검사선(T)은 검체 내의 canine IL-6 존재 유무에 따라 발색의 여부가 정해지며, 검사선(T)의 발색 여부에 따라 양성 또는 음성으로 판정한다.
일례로, 검사선(T)에는 색띠가 없고, 대조선(C)에만 색띠가 나타나는 경우 음성으로 판정하며, 대조선(C)과 검사선(T) 둘 다에 색띠가 나타날 경우 양성으로 판정한다. 대조선(C)에 색띠가 나타나지 않는 경우는 검사선(T)에 색띠가 나타나더라도 검사가 잘못되었거나 시약의 품질에 문제가 있는 것으로 새로운 시약을 이용하여 재시험을 수행해야 한다(도 25).
실시예 3. 진단 키트 효능 시험
(1) 재조합 canine IL -6 항원에 대한 검출 한계
재조합 canine IL-6 항원을 인산염 완충용액으로 0.5ng/㎖, 1ng/㎖, 2ng/㎖, 5ng/㎖에 대해 반복시험을 수행한 결과, 도 26에 개시한 바와 같이 2ng/㎖ 이상의 농도에서는 모두 양성의 결과를 나타냈고, 1ng/㎖의 경우 3개 중 1건에서 양성으로 판별하기 힘든 정도의 약한 발색이 나타났고 2개는 양성결과를 나타냈으며, 0.5ng/㎖은 음성의 결과를 나타냈다.
따라서, 본 연구결과의 산물인 canine IL-6 진단 키트의 검출한계는 2ng/㎖임을 알수 있었다(표 1).
본 발명의 진단 키트 검출 한계를 시험한 결과
항원 농도 1회 2회 3회
0.5ng/㎖ 음성 음성 음성
1ng/㎖ 양성 +/- 양성
2ng/㎖ 양성 양성 양성
5ng/㎖ 양성 양성 양성
10ng/㎖ 양성 양성 양성
(2) 민감도 및 특이도
1) 검체 정보:
R&D사 canine IL-6 Duoset(Cat. No.:DY1609)를 이용해 임상 검체를 시험하였고, 시험결과를 토대로 1ng/㎖ 기준으로 1ng/㎖ 미만의 canine IL-6 농도 값을 나타낸 검체는 음성 검체로, 1ng/㎖ 이상의 농도를 나타내는 검체는 양성으로 정하였을 때 도 27에 개시한 바와 같은 결과를 나타냈다.
표 2 및 3에 100 검체의 양성혈청과 100 검체의 음성 혈청에 대한 진단 결과를 개시하였다.
본 발명의 진단 키트를 이용한 음성 혈청의 진단 결과
검체 # ELISA 결과 (ng/㎖) 신속진단
키트 결과		 검체# ELISA 결과 (ng/㎖) 신속진단
키트 결과
1 0.051 음성 51 0.167 음성
2 0.044 음성 52 0.174 음성
3 0.089 음성 53 0.076 음성
4 0.011 음성 54 0.087 음성
5 0.121 음성 55 0.053 음성
6 0.104 음성 56 0.051 음성
7 0.045 음성 57 0.066 음성
8 0.067 음성 58 0.110 음성
9 0.099 음성 59 0.241 음성
10 0.035 음성 60 0.117 음성
11 0.041 음성 61 0.067 음성
12 0.022 음성 62 0.028 음성
13 0.041 음성 63 0.018 음성
14 0.145 음성 64 0.065 음성
15 0.167 음성 65 0.062 음성
16 0.106 음성 66 0.051 음성
17 0.078 음성 67 0.082 음성
18 0.025 음성 68 0.121 음성
19 0.016 음성 69 0.081 음성
20 0.038 음성 70 0.066 음성
21 0.047 음성 71 0.131 음성
22 0.036 음성 72 0.099 음성
23 0.078 음성 73 0.017 음성
24 0.025 음성 74 0.026 음성
25 0.145 음성 75 0.031 음성
26 0.210 음성 76 0.041 음성
28 0.135 음성 78 0.053 음성
29 0.210 양성 79 0.137 음성
30 0.134 음성 80 0.212 음성
31 0.024 음성 81 0.201 음성
32 0.035 음성 82 0.023 음성
33 0.067 음성 83 0.031 음성
34 0.026 음성 84 0.052 음성
35 0.016 음성 85 0.056 음성
36 0.035 음성 86 0.062 음성
38 0.089 음성 88 0.081 음성
39 0.018 음성 89 0.099 음성
40 0.026 음성 90 0.022 음성
41 0.035 음성 91 0.032 음성
42 0.041 음성 92 0.043 음성
43 0.119 양성 93 0.064 음성
44 0.241 음성 94 0.032 음성
45 0.015 음성 95 0.025 음성
46 0.242 음성 96 0.088 음성
47 0.011 음성 97 0.034 양성
48 0.016 음성 98 0.016 음성
49 0.141 음성 99 0.021 양성
50 0.191 음성 100 0.053 음성
본 발명의 진단 키트를 이용한 양성 혈청의 진단 결과
검체 # ELISA 결과 (ng/㎖) 신속진단
키트 결과		 검체# ELISA 결과 (ng/㎖) 신속진단
키트 결과
1 1.551 양성 51 3.33 양성
2 1.892 양성 52 2.97 양성
3 5.311 양성 53 12.24 양성
4 3.758 양성 54 9.065 양성
5 12.215 양성 55 5.644 양성
6 11.250 양성 56 7.745 양성
7 3.423 양성 57 8.955 양성
8 5.553 양성 58 8.327 양성
9 2.178 양성 59 4.668 양성
10 18.89 양성 60 9.433 양성
11 15.38 양성 61 7.433 양성
12 8.550 양성 62 7.666 양성
13 2.650 양성 63 9.088 양성
14 1.396 양성 64 6.088 양성
15 2.178 양성 65 7.009 양성
16 5.126 양성 66 2.043 양성
17 1.253 음성 67 3.056 양성
18 2.631 양성 68 4.421 양성
19 2.668 양성 69 6.543 양성
20 14.553 양성 70 4.970 양성
21 18.345 양성 71 4.447 양성
22 19.997 양성 72 2.432 양성
23 3.446 양성 73 3.112 양성
24 5.321 양성 74 4.221 양성
25 2.434 양성 75 5.021 양성
26 1.780 양성 76 2.011 양성
28 6.356 양성 78 2.022 양성
29 8.335 양성 79 1.982 음성
30 3.422 양성 80 2.523 양성
31 5.234 양성 81 3.132 양성
32 11.643 양성 82 2.223 양성
33 19.436 양성 83 4.124 양성
34 4.675 양성 84 5.142 양성
35 8.436 양성 85 1.487 양성
36 3.275 양성 86 10.044 양성
38 5.174 양성 88 16.324 양성
39 3.264 양성 89 19.454 양성
40 5.264 양성 90 7.244 양성
41 6.432 양성 91 6.358 양성
42 2.654 양성 92 2.055 음성
43 6.434 양성 93 3.044 양성
44 7.325 양성 94 5.867 양성
45 1.543 음성 95 2.878 양성
46 4.435 양성 96 8.022 양성
47 3.654 양성 97 2.411 양성
48 3.223 양성 98 2.644 음성
49 7.656 양성 99 4.222 양성
50 8.325 양성 100 7.011 양성
민감도는 상위의 진단방법(본 발명의 경우 ELISA 기법을 기준으로 하였다)으로 양성으로 판정된 검체에 대해 양성의 결과를 나타내는 정도로 정의하였다. 하기 계산식(1)으로부터 본 발명의 민감도가 95%임을 알 수 있었다.
식 (1) 민감도(%)=(양성 결과의 검체 수/검사에 사용된 전체 검체 수 )× 100
따라서, 본 발명의 진단 키트의 민감도(%)= 양성 95 검체/전체 시료 100 검체×100=95%이다.
특이도는 상위의 진단방법(본 발명의 경우 ELISA 기법을 기준으로 하였다)으로 음성으로 판정된 검체에 대해 음성의 결과를 나타내는 정도로 정의하였다. 하기 계산식(2)로부터 본 발명의 특이도가 97%임을 알수 있었다.
식 (2) 특이도(%)=음성 결과의 검체 수/검사에 사용된 전체 검체 수 × 100
따라서, 본 발명의 진단 키트의 특이도(%) = 음성 97 검체/100 검체×100 = 97%이다.
2) 결과해석
R&D사 Canine IL-6 Duoset(Cat. No.:DY1609)의 표준시료로 진단한 결과 본 발명의 일실시예로부터 제조된 진단 키트는 97%의 특이도를 나타냈고, 95%의 민감도를 나타냈다.
따라서, 본 발명의 진단 키트의 정확도는 200 검체 중 192 검체에 대한 결과가 일치하였으므로 96%의 정확도를 보인다고 할 수 있다.
(3) 정밀성
동일한 음/양성 검체에 대해 동일인이 반복하였을 경우, 서로 다른 사람간에 시험했을 경우, 서로 다른 시험일에 시험했을 경우, 서로 다른 장소에서 시험했을 경우 결과가 일치하는지 여부를 5개의 검체에 대해 확인하였다.
1) 검체 정보
음성 - 재조합 canine IL-6 희석용 인산염 완충용액
양성 - 재조합 canine IL-6 항원을 인산염 완충용액을 이용하여 2ng/㎖, 5ng/㎖, 10ng/㎖, 20ng/㎖
2) 동일인 반복시험
동일인이 5개의 음/양성 검체에 대해 3회 반복하였을 때 같은 결과를 나타내는지 여부를 확인한다.
동일인 반복 시험을 통한 정밀도 분석 결과
검체 1회 2회 3회
PBS 음성 음성 음성
양성-2ng/㎖ 양성 양성 양성
양성-5ng/㎖ 양성 양성 양성
양성-10ng/㎖ 양성 양성 양성
양성-20ng/㎖ 양성 양성 양성
모든 경우에서 음성 검체는 음성으로 양성 검체는 양성의 결과를 나타냈으므로 동일인의 반복 시험에 대한 정밀도가 우수하다고 할 수 있다.
3) 사람간
서로 다른 3인이 5개의 음/양성 검체에 대해 시험하였을 때 같은 결과를 나타내는지 여부를 확인한다.
사람간 시험 분석을 통한 정밀도 분석 결과
검체 이○○ 김○○ 윤○○
PBS 음성 음성 음성
양성-2ng/㎖ 양성 양성 양성
양성-5ng/㎖ 양성 양성 양성
양성-10ng/㎖ 양성 양성 양성
양성-20ng/㎖ 양성 양성 양성
모든 경우에서 음성 검체는 음성으로 양성 검체는 양성의 결과를 나타냈으므로 서로 다른 사람간의 정밀도가 우수하다고 할 수 있다.
시험일자별 정밀도의 분석 결과
검체 1일차 2일차 3일차
PBS 음성 음성 음성
양성-2ng/㎖ 양성 양성 양성
양성-5ng/㎖ 양성 양성 양성
양성-10ng/㎖ 양성 양성 양성
양성-20ng/㎖ 양성 양성 양성
모든 경우에서 음성 검체는 음성으로 양성 검체는 양성의 결과를 나타냈으므로 서로 다른 시험일 간의 정밀도가 우수하다고 할 수 있다.
시험 장소에 따른 분석의 정밀도 분석 결과
검체 사무실 연구소 회의실
PBS 음성 음성 음성
양성-2ng/㎖ 양성 양성 양성
양성-5ng/㎖ 양성 양성 양성
양성-10ng/㎖ 양성 양성 양성
양성-20ng/㎖ 양성 양성 양성
(4) 효능 시험 결과 분석
본 발명의 일실시예로 제조된 진단 키트의 검출 한계는 2ng/㎖로 나타났으며, 음/양성 검체에 대한 민감도와 특이도는 각각 95%와 97%를 보였고, 동일인 반복/사람간/시험일간/장소간 정밀성 시험에서는 모든 시험에 있어 음/양성에 맞게 정확한 결과를 나타냈다(도 29). 따라서, 본 발명의 canine IL-6 진단 키트는 효능 면에서 ELISA와 유사한 결과를 나타냈고, 검사방법 및 해석에 있어 더욱 쉬운 과정을 거치므로 기존 키트를 대체할 수 있는 효능시험 결과라고 판단된다.

Claims (10)

  1. (a) 시료가 흡수되는 샘플 패드(sample pad);
    (b) 시료 내의 개(canine)의 IL-6 항원과 결합하는 단클론 마우스 항-개(canine) IL-6 항체와 금의 축합체를 포함하는 금 축합 패드(gold conjugation pad);
    (c) 다클론 산양 항-개(canine) IL-6 항체가 고정된 반응선(test line)과 다클론 산양 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 구비된 반응막(test membrane); 및
    (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡습 패드(absorption pad)
    를 포함하는 테스트 스트립으로 구비되는 개(canine)의 IL-6 항원을 검출하는 패혈증 진단 키트.
  2. 제1항에 있어서, 샘플 패드, 금 축합 패드, 반응선, 대조선 및 흡습 패드의 순서로 위치하는 패혈증 진단 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 반응선에 다클론 산양 항-개(canine) IL-6 항체가 0.1 내지 10㎍이 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 패혈증 진단 키트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 금 축합 패드에 0.01 내지 1.0㎍의 단클론 마우스 항-개(canine) IL-6 항체와 금의 축합체가 분주된 것을 특징으로 하는 패혈증 진단 키트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 대조선에는 0.1 내지 10㎍의 다클론 산양 항-마우스 IgG가 처리된 것을 특징으로 하는 패혈증 진단 키트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 시료는 개의 혈액으로부터 분리한 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 패혈증 진단 키트.
  7. 제1항에 있어서, 상기 패혈증의 진단에서 95% 이상의 민감도 및 97% 이상의 특이도를 가지는 것을 특징으로 하는 패혈증 진단 키트.
  8. 제1항에 있어서 상기 패혈증의 진단에서 시료 중의 IL-6 항원의 농도가 2ng/㎖ 이상인 것을 검출하는 것을 특징으로 하는 패혈증 진단 키트.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 패혈증 진단 키트를 이용하여 패혈증을 진단하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 시료를 상기 패혈증 진단 키트에 투입하여 테스트 스트립의 반응선과 대조선에 색띠가 나타나면 패혈증 양성으로 판단하고, 대조선에만 색띠가 나타나면 패혈증 음성으로 판단하는 것을 특징으로 하는 패혈증을 진단하는 방법.
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