KR20070018995A - 표적 물질을 신속 간편하게 검출하는 방법 및 그를 위한효소 면역학적 키트 - Google Patents

표적 물질을 신속 간편하게 검출하는 방법 및 그를 위한효소 면역학적 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR20070018995A
KR20070018995A KR1020067026223A KR20067026223A KR20070018995A KR 20070018995 A KR20070018995 A KR 20070018995A KR 1020067026223 A KR1020067026223 A KR 1020067026223A KR 20067026223 A KR20067026223 A KR 20067026223A KR 20070018995 A KR20070018995 A KR 20070018995A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
enzyme
target substance
substance
support
immunological kit
Prior art date
Application number
KR1020067026223A
Other languages
English (en)
Inventor
나오꼬 시바야마
게이시 미와
Original Assignee
도레이 가부시끼가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 도레이 가부시끼가이샤 filed Critical 도레이 가부시끼가이샤
Priority to KR1020067026223A priority Critical patent/KR20070018995A/ko
Publication of KR20070018995A publication Critical patent/KR20070018995A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/29—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands using visual detection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5412—IL-6
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5421—IL-8

Abstract

샘플 중의 1종 또는 복수종의 표적 물질을 동시에 신속 간편하게 검출할 수 있는 측정 키트 및 상기 측정 방법, 또한 상기 키트 또는 상기 측정 방법에 의해 표적 물질이 관계하는 질환을 진단한다.
표적 물질을 인식하는 물질을 표면에 고정화한 지지체, 표적 물질에 대한 효소 표지 항체, 효소 표지 항체를 발색시킨 후의 반응산물이 수불용성이 되는 기질로 구성되고, 상기 지지체 표면의 발색에 의해서 샘플 중의 표적 물질을 검출하는 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트, 또는 인큐베이션 공정과 발색 공정의 2 단계의 반응 공정을 포함하며, 또한 발색 반응 후의 지지체 표면의 색을 육안에 의해서 판단하는 것으로, 샘플 중의 표적 물질을 검출하거나 또는 표적 물질 농도를 측정한다.
효소 면역학적 키트, 사이토카인, 발색 반응, 슈퍼항원

Description

표적 물질을 신속 간편하게 검출하는 방법 및 그를 위한 효소 면역학적 키트 {METHOD OF RAPIDLY AND EASILY DETECTING TARGET SUBSTANCE AND ENZYMOIMMUNOLOGICAL KIT}
본 발명은 1종 또는 복수종의 표적 물질을 신속 간편하게 검출하는 측정 키트와 상기 측정 키트를 이용한 방법에 관한 것이다. 특히, 혈액 중 등에 존재하는 세균 독소 또는 사이토카인의 검출에 이용함으로써 세균 독소 또는 사이토카인에 관련된 질환을 신속하게 진단하기 때문에 적합하게 이용된다.
감염에서 기인한 질환이나 중증 췌염, 열상, 외상 등 비감염성 질환에서는 심각한 전신성 염증 반응이 관찰되고, 그 때의 환자 혈 중 사이토카인 농도는 높은 값(고사이토카인혈증)인 것으로 알려져 있다(이가꾸노 아유미 2001/1/6 Vol.196 No.1 이시야꾸 출판 주식회사). 사이토카인은 본래 생체 방어를 위해서 감염, 외상 등의 자극에 의해 면역 담당 세포를 비롯한 각종 세포에 의해서 생산되어 세포밖으로 방출되어 작용하는 면역 관련 단백질이라고 생각되지만, 생체내에서 과잉으로 생산됨으로써 각종 염증성 질환에 있어서의 조직 상해나 병태에 관여하는 것이 밝혀졌다. 분명한 감염이 확인되지 않는 경우에도, 황색 포도상 구균이나 A군 β 용혈성 연쇄 구균 등이 생산하는 독소인 슈퍼항원에 의해서 면역계가 과잉으로 활 성화되어 고사이토카인혈증이 되는 경우가 있다. 슈퍼항원이란, 종래의 항원과는 달리, 항원 제시 세포내에서의 프로세싱 과정을 거치지 않고 항원 제시 세포 상의 주요 조직 적합성 항원 클래스 II(Major Histocompatibility Antigen Complex Class II; 이하, MHC 클래스 II라 함)에 결합하고, 또한 이 MHC 클래스 II와의 복합체를 형성함으로써 특정 Vβ 영역을 갖는 T 세포를 자극하여 면역계를 매우 활성화시키는 화합물이고, 발열이나 발진, 혈압 저하나 식중독시의 구토 또는 자기 면역 질환의 유발 등을 야기한다고 되어 있다. 슈퍼항원으로서는 황색 포도상 구균 외독소인 스타필로코커스 장관 독소 A, B, C, D, E, H, I(Staphylococcal Enterotoxin A, B, C, D, E, H, I; 이하 각각 SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEH, SEI라 함) 또는 독소성 쇼크 증후군 톡신-1(Toxic Shock Syndrome Toxin-1; 이하, TSST-1이라 함)이나 A군 β 용혈성 연쇄 구균 외독소인 스트렙토코커스 발열성 외독소 A, C(Streptcoccal Pyrogenic Exotoxin A, C; 이하 각각 SPEA, SPEC라 함), 바이러스 단백질이나 식물 단백질을 포함하여 수십 종류 확인되고 있지만, 앞으로도 특정화되어 갈 가능성이 있다. 슈퍼항원이 관여하는 질환으로서는, TSST-1에서 기인하는 독소성 쇼크 증후군(toxic shock syndrom; 이하, TSS라 함)나 신생아 TSS형 발진증(Neonatal TSS-like exanthematous disease; 이하, NTED라 함) 등이 있다. 또한, 성홍열나 극증성(劇症性) A군 연쇄 구균 감염증(Streptcoccal Toxic Shock Syndrome; 이하, STSS라 함), 급성 전신성 혈관염인 가와사키병에도 슈퍼항원의 관여가 시사되었다.
고사이토카인혈증에서는 전신 염증에 의해 장기 부전이 되거나, 염증 반응이 진행되어 죽음에 이르는 것이 보고되었지만, 병상의 진행이 빠르기 때문에, 혈 중 사이토카인 농도를 얼마나 신속하게 측정하고, 또한 치료에 의해 저하시키는가가 환자의 예후를 크게 좌우하였다. TSS에서는 조기 진단ㆍ치료 개시에 의해 중증화를 막는 것이 중요하고, STSS에서도 증상의 진행이 빠르기 때문에, 조기에 진단하여 적절한 치료를 실시하지 않으면 사지의 괴사와 그의 치료를 위한 사지 절단, 나아가서는 죽음이라는 결정적인 상태를 맞게 된다.
그러나 현재, 환자의 혈 중 사이토카인 농도를 측정하기 위해서는, 채취한 검체는 병원의 검사실 또는 외부 검사 회사에 제출해야만 한다. 검사실에서는 고도ㆍ복잡한 기술이나 기기를 필요로 하는 효소 면역학적 측정법(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay; 이하, ELISA법이라 함)로써 사이토카인을 측정하는 것이 대부분이고, 결과가 나오기까지는 상응하는 시간과 비용이 소요된다. TSS나 STSS의 진단을 위해서 슈퍼항원을 측정하는 경우에도, 복잡한 기술과 시간을 필요로 하고, 따라서 매우 단시간에, 또한 침상에서 농도를 측정할 수 있는 신속 간편한 측정 방법이 요망되었다. 이 문제에 대하여, A군 β 용혈성 연쇄 구균 감염의 신속 진단에 관해서는 스트렙(Strep) A 항원의 측정 방법이 특허 문헌 1에 개시되었지만, 검출 대상은 A군 β 용혈성 연쇄 구균으로 한정되고, 또한 검체 중의 슈퍼항원 농도를 측정할 수 있는 것은 아니었다.
특허 문헌 1에 개시된 측정 방법은 지지체 상에서 표적 물질을 인식하는 물질-표적 물질-표지 항체의 결합 복합체를 형성시키고, 표지 항체로부터 발생하는 시그널을 검출함으로써 표적 물질을 검출하는 것을 목적으로 하고 있다. 이러한 측정 방법은 다양하게 존재하였다. 예를 들면, 상기 ELISA도 지지체 상에 표적 물질을 인식하는 물질-표적 물질-효소 표지 항체의 결합 복합체를 형성시키고, 액계에서 효소 반응을 수행하여 발색시키고, 액의 흡광도를 측정하여 표적 물질을 검출한다고 하는 것이었다. 또한, 각종 면역 크로마토그래피법도 알려져 있고, 면역 크로마토그래피법에서도 지지체 상에서 표적 물질을 인식하는 물질-표적 물질-표지 항체의 결합 복합체를 형성시켜 표적 물질을 검출한다. ELISA법은 흡광도를 흡광도계를 이용하여 측정하기 때문에, 표적 물질을 정확하게 정량하는 것이 가능하였지만, 상술한 바와 같이 신속하며 또한 용이하게 측정하는 것은 곤란하였다. 한편, 특허 문헌 1에 개시된 측정법이나 면역 크로마토그래피법은 원래 신속하며 또한 용이하게 측정하는 것을 목적으로 개발된 방법이기 때문에, 신속하며 또한 용이하게 표적 물질을 측정하는 것은 가능하였다. 그러나, 용이성을 중시하고 있기 때문에, 육안에 의해 양성인지 음성인지를 판단하는 정성을 위한 방법이고, 표적 물질을 정확하게 정량할 수는 없었다.
이와 같이, 종래에는 신속하며 또한 용이한 측정이라고 하는 필요성과 정확한 정량이라고 하는 2 가지 모두의 필요성을 만족시키는 측정법은 존재하지 않았다.
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 (평)6-50973호 공보
<발명의 개시>
본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해소하고, 1종 또는 복수종의 표적 물질을 동시에 신속 간편하게 검출할 수 있는 측정 키트, 및 상기 측정 방법, 또한 상기 키트 또는 상기 측정 방법에 의해 표적 물질이 관계하는 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자는 신속하며 또한 용이한 측정에 대한 필요성 및 정확한 정량에 대한 필요성의 상기 두가지 모두를 충족시키는 측정법에 대하여 예의 검토하였다. 본 발명자는 신속하며 또한 용이한 측정을 행하기 위해서는 복잡한 시약 첨가의 필요성이 없고, 또한 측정 완료까지의 공정수도 적으며, 시그널을 육안으로 정확한 정량을 행하기 위해서는, 지지체 상에서 형성되는 표적 물질을 인식하는 물질-표적 물질-표지 항체의 결합 복합체로부터 발생하는 시그널이 표적 물질과 시그널의 크기 사이에 직선성이 성립될 필요가 있고, 직선성을 성립시키기 위해서는 지지체에 고상화하는 표적 물질을 인식하는 물질량 및 표지 항체량을 적절한 범위로 조절함으로써 가능한 것을 발견하였다.
본 발명자들은 예의 검토한 결과, 표적 물질을 인식하는 물질을 포함하는 용액과 지지체를 접촉시킬 때의 용액 중의 표적 물질을 인식하는 물질의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖인 경우에 표적 물질을 양호한 감도로 검출할 수 있음을 발견하였다. 또한, 검출 감도를 더 올리기 위해서는 용액 중의 표적 물질을 인식하는 물질의 농도가 0.5 내지 10 ㎍/㎖로 하면 보다 바람직한 것을 발견하였다. 또한, 발명자들은 예의 검토한 결과, 인큐베이션 공정에서 사용되는 용액 중의 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖인 경우에 비특이 결합에 의한 발색없이 인큐베이션 시간을 가장 짧게 할 수 있는 것도 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서 하기의 구성을 갖는다.
(1) 1종류 이상의 표적 물질을 인식하는 물질을 표면에 고정화한 후에 비표적 물질의 비특이 흡착을 저해하는 처리를 실시한 지지체,
1종류 이상의 상기 표적 물질에 대한 효소 표지 항체,
1종류 이상의 상기 효소 표지 항체를 발색시킨 후의 반응산물이 수불용성이 되는 기질 및
이들을 수용하는 1개 이상의 용기
를 포함하며,
상기 용기 중에서 항체 항원 반응 및 발색 반응시키고,
표적 물질을 인식하는 물질이 상기 지지체 표면에, 샘플량에 대하여 2 cm2/㎖ 이상이 되도록 고정화된, 상기 지지체 표면의 발색에 의해서 샘플 중의 표적 물질을 검출하는 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
(2) 1종류 이상의 표적 물질을 인식하는 물질을 표면에 고정화한 후에 비표적 물질의 비특이 흡착을 저해하는 처리를 실시하고, 1종류 이상의 기지 농도의 표적 물질을 반응시킨 지지체,
1종류 이상의 상기 표적 물질에 대한 효소 표지 항체,
1종류 이상의 상기 효소 표지 항체를 발색시킨 후의 반응산물이 수불용성이 되는 기질 및
이들을 수용하는 1개 이상의 용기
를 포함하며,
상기 용기 중에서 항체 항원 반응 및 발색 반응시키고,
표적 물질을 인식하는 물질이 상기 지지체 표면에, 샘플량에 대하여 2 cm2/㎖ 이상이 되도록 고정화된, 상기 지지체 표면의 기지 농도의 표적 물질이 반응한 부분과 그 이외의 부분의 발색 비교에 의해 미지 농도의 샘플 중의 표적 물질의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
(3) (2)에 있어서, 상기 지지체 표면의 발색에 의해서 샘플 중의 표적 물질을 검출함과 동시에 상기 지지체 표면의 기지 농도의 표적 물질이 반응한 부분과 그 이외의 부분의 발색 비교에 의해 미지 농도의 샘플 중의 표적 물질의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 있어서, 표적 물질을 인식하는 물질을 포함하는 용액과 지지체를 접촉시킴으로써 지지체의 표면에 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화하며, 고정화할 때의 상기 용액 중의 표적 물질을 인식하는 물질의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖인 효소 면역학적 키트.
(5) (4)에 있어서, 고정화할 때의 pH가 6.5 내지 8.0인 효소 면역학적 키트.
(6) (4) 또는 (5)에 있어서, 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖인 효소 면역학적 키트.
(7) (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 있어서, 지지체에 고정화된 표적 물질을 인식하는 물질이, 샘플 중의 표적 물질의 농도와 발색 강도가 일차적인 상관 관계 가 되는 양으로 고정화된 것인 효소 면역학적 키트.
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 물질을 인식하는 물질이 표적 물질에 대한 항체이며, 상기 항체가 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
(9) (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 있어서, 방부제에 의한 처리, 가압 처리 또는 가열 처리, 또는 불활성 가스 또는 진공 상태에서의 보존에 의해, 처리 후 6개월을 지날 때까지 표적 물질을 인식하는 물질의 활성이 저하되지 않는 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
(10) (1) 내지 (9) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체가 막대 형상, 판 형상 또는 오목부를 갖는 형상인 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
(11) (1) 내지 (10) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 표지 항체가 모노클로날 항체인 효소 면역학적 키트.
(12) (11)에 있어서, 모노클로날 항체가 인간 인터루킨에 대한 항체인 효소 면역학적 키트.
(13) (11) 또는 (12)에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 IgG인 효소 면역학적 키트.
(14) (13)에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 IgG1인 효소 면역학적 키트.
(15) (12) 내지 (14) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 인터루킨이 IL-6 또는 IL-8인 효소 면역학적 키트.
(16) (15)에 있어서, 모노클로날 항체가 인간 IL-6의 아미노산 서열의 149 내지 173번의 아미노산을 포함하는 단편을 인식하는 모노클로날 항체인 효소 면역학적 키트.
(17) (15)에 있어서, 모노클로날 항체가 인간 IL-6의 아미노산 서열의 153 내지 162번의 아미노산을 포함하는 단편을 인식하는 모노클로날 항체인 효소 면역학적 키트.
(18) (16)에 있어서, 인간 IL-6에 대한 항체가 미공연균(微工硏菌) 기탁 제10713호로서 미생물 공업 기술원 연구소에 기탁되어 있는 하이브리도마가 생산하는 클론 IG61인 효소 면역학적 키트.
(19) (17)에 있어서, 인간 IL-8에 대한 항체가 미공연균 기탁 제12710호로서 미생물 공업 기술원 연구소에 기탁되어 있는 하이브리도마가 생산하는 클론 EL139인 효소 면역학적 키트.
(20) (1) 내지 (19) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 표지 항체의 효소가 호스 래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-D-갈락토시다제 중 어느 것으로부터 선택되는 것인 효소 면역학적 키트.
(21) (1) 내지 (20) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 표지 항체의 효소가 호스 래디쉬 퍼옥시다제이고, 상기 기질이 3-아미노-9-에틸카르바졸, 5-아미노살리실산, 4-클로로-1-나프톨, o-페닐렌디아민, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산), 3,3-디아미노벤지딘, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, o-디아니시딘, 3,3-디메톡시벤지딘 중 어느 것을 포함한 용액으로부터 선택되는 것인 효소 면역학적 키트.
(22) (1) 내지 (20) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 표지 항체의 효소가 알칼리 포스파타제이고, 상기 기질이 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 니트로블루 테트라졸륨, p-니트로페닐 포스페이트 중 어느 것을 포함한 용액으로부터 선택되는 것인 효소 면역학적 키트.
(23) (1) 내지 (20) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 표지 항체의 효소가 β-D-갈락토시다제이고, 또한 상기 기질이 o-니트로페닐-β-D-갈락토시드 또는 5-브로모-4-클로로-3-인돌-β-D-갈락토피라노시드 중 어느 것을 포함한 용액으로부터 선택되는 것인 효소 면역학적 키트.
(24) (1) 내지 (23) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 물질이 사이토카인, 황색 포도상 구균 외독소, A군 연쇄 구균 외독소 중 어느 것인 효소 면역학적 키트.
(25) (24)에 있어서, 상기 사이토카인이 염증성 사이토카인인 효소 면역학적 키트.
(26) (25)에 있어서, 상기 염증성 사이토카인이 IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-γ 중 어느 것인 효소 면역학적 키트.
(27) (24) 내지 (26) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인의 검출 한계 농도를 500 pg/㎖로 한 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
(28) (24)에 있어서, 상기 황색 포도상 구균 외독소가 슈퍼항원인 효소 면역학적 키트.
(29) (28)에 있어서, 상기 슈퍼항원이 SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEH, SEI, SEJ, TSST-1 중 어느 것인 효소 면역학적 키트.
(30) (24)에 있어서, 상기 A군 연쇄 구균 외독소가 슈퍼항원인 효소 면역학적 키트.
(31) (30)에 있어서, 상기 슈퍼항원이 SPEA, SPEC, SPEF, SPEG, SPEH 중 어느 것인 효소 면역학적 키트.
(32) (1) 내지 (27) 중 어느 한 항에 있어서, 고사이토카인혈증이 원인인 질환을 신속하게 판정하기 위한 효소 면역학적 키트.
(33) (1) 내지 (24), (28) 및 (29) 중 어느 한 항에 있어서, 황색 포도상 구균이 원인인 질환을 신속하게 판정하기 위한 효소 면역학적 키트.
(34) (1) 내지 (24), (30) 및 (31) 중 어느 한 항에 있어서, A군 β 용혈성 연쇄 구균이 원인인 질환을 신속하게 판정하기 위한 효소 면역학적 키트.
(35) (1) 내지 (35) 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 표면의 발색을 측정 장치에 의해 수치화하고, 상기 수치를 이용하여 발색을 정량화하며, 지지체 표면으로부터 반사된 빛을 400 내지 700 nm의 범위에서 분광시키고, 각 파장마다의 반사율을 측정하여 XYZ 또는 L*a*b* 표색계에서의 파라미터를 측정하는 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
(36) (1) 내지 (35) 중 어느 한 항에 기재된 효소 면역학적 키트를 이용하여 샘플 중의 표적 물질을 검출하거나 또는 샘플 중의 표적 물질 농도를 측정하는 방법.
(37) 표적 물질을 인식하는 물질로 피복된 부분을 갖는 지지체, 샘플 및 표적 물질에 대한 효소 표지 항체를 동시에 인큐베이팅하는 인큐베이션 공정, 및
반응산물이 수불용성이 되는 기질에 의해서 발색시키는 발색 공정의 2 단계의 반응 공정
을 포함하며,
인큐베이션 공정에서 표적 물질을 인식하는 물질이 상기 지지체 표면에, 샘플량에 대하여 2 cm2/㎖ 이상이 되도록 첨가하고,
발색 반응 후의 지지체 표면의 색을 육안에 의해서 판단하는 것을 특징으로 하는 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
(38) (37)에 있어서, 표적 물질을 인식하는 물질로 피복된 부분을 갖는 지지체에 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화할 때에, 표적 물질을 인식하는 물질의 용액의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖이고, pH가 6.5 내지 8.0인, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
(39) (37) 또는 (38)에 있어서, 발색 공정에서 사용되는 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖인, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
(40) (37) 내지 (39) 중 어느 한 항에 있어서, 발색 반응 후의 지지체 표면의 색을 육안에 의해서 판단하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중의 표적 물질 농도를 측정하기 위한 방법.
(41) (37) 내지 (39) 중 어느 한 항에 있어서, 발색 반응 후의 지지체 표면의 색을 기기에 의해서 수치화하고, 그것을 이용하여 발색을 정량하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
(42) (36) 내지 (41) 중 어느 한 항에 있어서, 샘플로부터 반사된 빛을 400 내지 700 nm의 범위에서 분광시키고, 각 파장마다의 반사율을 측정하여 표색계에서의 파라미터를 측정하며, 상기 표색계가 XYZ 또는 L*a*b*인, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
(43) (37) 내지 (42) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 공정과 발색 공정 사이에 세정 공정을 포함하는, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
(44) (37) 내지 (43) 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션, 세정, 발색의 각 공정에서의 반응 온도가 4 ℃ 내지 40 ℃의 범위인, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
(45) (44)에 있어서, 상기 인큐베이션 공정, 발색 공정, 세정 공정이 실온에서 실시되는, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
(46) (37) 내지 (45) 중 어느 한 항에 있어서, 샘플량이 200 ㎕ 이하인, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
(47) (37) 내지 (46) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 공정의 시간이 5 내지 60 분의 범위이고, 상기 발색 공정의 시간이 5 내지 30 분의 범위인, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
(48) (37) 내지 (47) 중 어느 한 항에 있어서, 표적 물질을 인식하는 물질로 피복된 부분을 갖는 지지체의 상기 표적 물질을 인식하는 물질로 피복된 부분의 일부 및 피복되어 있지 않은 부분의 일부 중 적어도 한쪽에, 1종류 이상의 기지 농도의 표적 물질을 반응시킨 후, 기지 농도의 표적 물질이 반응한 부분과 그 이외의 부분의 발색 비교에 의해서 미지 농도의 샘플 중의 표적 물질 농도를 측정하는, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
(49) (37) 내지 (48) 중 어느 한 항에 있어서, 표적 물질을 인식하는 물질로 피복된 부분을 갖는 지지체가 2종 이상의 다른 농도의 표적 물질을 인식하는 물질로 피복되어 있고, 2 부분 이상의 발색 정도를 비교함으로써 샘플 중의 표적 물질 농도를 측정하는 방법.
(50) (37) 내지 (49) 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 물질이 사이토카인이고, 그의 검출 한계 농도가 500 pg/㎖인 방법.
(51) (24) 내지 (27) 및 (32) 중 어느 한 항에 기재된 효소 면역학적 키트에 의해서 사이토카인을 검출하여 고사이토카인혈증을 진단하는 방법.
(52) (28) 내지 (29) 및 (33) 중 어느 한 항에 기재된 효소 면역학적 키트에 의해서 황색 포도상 구균 외독소를 검출하여 황색 포도상 구균이 원인인 질환을 진단하는 방법.
(53) (30), (31) 및 (34) 중 어느 한 항에 기재된 효소 면역학적 키트에 의해서 A군 β 용혈성 연쇄 구균 외독소를 검출하여 A군 β 용혈성 연쇄 구균이 원인인 질환을 진단하는 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2004-144511호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1은 IL-8을 첨가한 인간 혈장에 의한 지지체의 발색을 나타내는 사진이다.
도 2는 IL-6을 첨가한 인간 혈장에 의한 지지체의 발색을 나타내는 사진이다.
도 3은 환자 혈청 중의 IL-8에 의한 지지체의 발색(L*a*b* 표색계에 의한 정량)을 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명의 측정 방법의 1 양태의 공정 개략도이다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
본 발명은 표적 물질을 신속 간편하게 검출할 수 있는 측정 키트, 표적 물질을 신속 간편하게 검출하는 측정 방법, 및 표적 물질이 관계하는 질환의 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화한 지지체와 표적 물질에 대한 효소 표지 항체를 측정 대상인 샘플과 함께 인큐베이팅하고, 그 후 지지체를 효소 표지 항체를 발색시킨 후의 반응산물이 수불용성이 되는 기질을 이용하여 발색시키는 방법으로, 1종 또는 복수종의 표적 물질의 농도를 신속 간편하게 검출할 수 있는 방법을 발견하였다.
본 발명에 있어서 「표적 물질을 인식하는 물질」은 표지 물질에 결합할 수 있는 물질을 말하며, 표적 물질에 대한 항체나 표적 물질과 수용체-리간드의 관계인 경우의 수용체 또는 리간드, 또는 표적 물질과 결합하는 효소나 기질 등이 포함되지만, 바람직하게는 결합력이 강한 항체가 이용된다.
또한, 본 발명에 있어서의 「인큐베이션」이란, 항원 항체 반응시에 일정 온도에서 방치하는 것이다. 항원 항체 반응이란, 항체가 상보적인 구조를 갖는 항원과 특이적으로 결합하는 것을 말하며, 본 발명에 있어서는 표적 물질을 인식하는 물질과 표적 물질의 결합을 말한다.
또한, 본 발명에 있어서의 「세정」이란, 인큐베이션 공정에서 항원 항체 반응을 하지 않은 물질을 씻어내는 것이고, 세정 재료로서는 세정 효과가 있으며 항원 항체 반응으로 결합한 물질에 영향을 주는 것이 아니라면 특별히 한정은 없고, 세정 효과를 높이기 위해서 계면활성제를 첨가할 수도 있다. 또한, 세정 방법으로도 지지체 자체에 흠집을 내는 것과 같은 방법이 아니라면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서의 인큐베이션, 세정, 발색의 각 공정에서의 반응 온도는 특별히 한정되지 않지만, 반응 용액이 동결 또는 증발하지 않고, 또한 효소가 실활되지 않도록 4 ℃ 내지 40 ℃의 범위인 것이 바람직하지만, 효소를 활성화시켜 반응을 신속하게 종료시키기 위해서 15℃ 내지 40 ℃의 범위인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서의 인큐베이션 공정에서는 인큐베이션 시간이 길수록 표적 물질과 그것을 인식하는 물질 및 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 반응하는 비율이 증가하고, 결과적으로 발색 정도도 높아지지만, 어느 정도 시간이 지나면 항원 항체 반응이 포화된다. 또한, 신속하게 측정을 완료하기 위해서는 인큐베이션 시간을 짧게 할 필요가 있다. 인큐베이션 공정에 소요되는 시간을 짧게 하기 위해서는, 지지체의 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화한 부분에 대하여 샘플량의 비를 높게 하거나, 또는 인큐베이션 공정에서 사용되는 용액 중의 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도를 높게 하거나, 또는 표적 물질을 인식하는 물질의 지지체에의 고정화 밀도를 높게 할 수 있다. 표적 물질을 인식하는 물질은 표적 물질을 인식하는 물질을 포함하는 용액과 지지체를 접촉시킴으로써 지지체 표면에 고정화할 수 있다. 지지체에 결합되어 있는 항체량이 많을수록 보다 많은 항원을 흡착시킬 수 있기 때문에, 감도를 향상시키고, 반응 시간의 단축을 실현할 수 있지만, 반대로 항원이 흡착할 수 있는 부분을 서로 차단할 정도의 양이면 분자끼리가 반응 부분을 차단하는 흡착 효율이 저하되기 때문에, 고정화량을 최적화하는 것이 필요하다. 발명자들은 예의 검토한 결과, 표적 물질을 인식하는 물질을 포함하는 용액과 지지체를 접촉시킬 때의 용액 중의 표적 물질을 인식하는 물질의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖인 경우에 표적 물질을 양호한 감도로 검출할 수 있음을 발견하였다. 또한, 검출 감도를 더 올리기 위해서는 용액 중의 표적 물질을 인식하는 물질의 농도가 0.5 내지 10 ㎍/㎖로 하면 보다 바람직한 것을 발견하였다. 지지체의 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화한 부분의 면적 대 샘플량의 비가 높아지면 높아질수록, 고정화한 물질과 표적 물질이 접촉할 기회가 많아지고, 그 만큼 인큐베이션 시간을 짧게 할 수 있다. 구체적으로는, 지지체에 있어서 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화한 부분에 대한 샘플량의 비가 2 cm2/㎖ 이상인 것이 바람직하다. 즉, 표적 물질을 인식하는 물질이 상기 지지체 표면에, 샘플량에 대하여 2 cm2/㎖ 이상이 되도록 고정화되어 있다. 본 발명의 측정에 있어서 용기 중에서 항체 항원 반응시킬 때에, 지지체의 표적 물질을 고정화한 부분을 샘플 중에 침지시킨 상태에서 인큐베이팅하지만, 이 때에 샘플 1 ㎖에 대하여 지지체 상의 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화한 부분의 2 cm2 이상이 침지되도록 고정화, 첨가하는 샘플량 및/또는 용기의 크기를 조정할 수 있다. 예를 들면, 도 4는 본 발명의 측정 방법의 1 양태의 공정 개략도이지만, 도 4에 나타내는 예에서는 전형적으로는 250 ㎕의 샘플을 용기에 첨가하여 인큐베이션을 행한다. 이 경우, 표적 물질을 고정화한 지지체를 침지할 때에, 표적 물질을 고정화한 부분의 적어도 0.5 cm2가 샘플 중에 침지될 수 있다. 인큐베이션 공정에서 사용되는 용액 중 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도는 너무 높으면 지지체나 고정화한 물질에의 비특이적인 결합에 의한 발색의 증가를 초래하기 때문에, 인큐베이션 시간이 가장 짧고, 또한 비특이 결합에 의한 발색을 하지 않는 최적 농도로 하는 것이 바람직하다. 발명자들은 예의 검토한 결과, 인큐베이션 공정에서 사용되는 용액 중 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖인 경우에 비특이 결합에 의한 발색없이 인큐베이션 시간을 가장 짧게 할 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명에서는 지지체에 있어서 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화한 부분에 대한 샘플량의 비가 2 cm2/㎖ 이상이고, 또한 표적 물질을 인식하는 물질을 포함하는 용액과 지지체를 접촉시킬 때의 용액 중 표적 물질을 인식하는 물질의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖이며, 또한 인큐베이션 공정에서 사용되는 용액 중 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖인 경우에는, 인큐베이션 공정 시간은 5 내지 60 분이 바람직하고, 15 내지 60 분이 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서의 발색 공정에서는, 발색 공정 시간이 길수록 발색 정도가 증가하고, 반대로 발색 시간이 너무 긴 경우에는 발색 기질 자체가 자연 분해에 의해 발색된다. 본 발명에서는 지지체에 있어서 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화한 부분에 대한 샘플량의 비가 2 cm2/㎖ 이상이고, 또한 표적 물질을 인식하는 물질을 포함하는 용액과 지지체를 접촉시킬 때의 용액 중 표적 물질을 인식하는 물질의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖이며, 또한 인큐베이션 공정에서 사용되는 용액 중 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖이고, 또한 인큐베이션 공정 시간이 5 내지 60 분인 경우에, 발색 공정은 5 내지 30 분인 것이 바람직하고, 15 분 내지 30 분이 가장 바람직하다. 또한, 지지체에 항원 항체 반응으로 결합한 효소와 발색 기질이 접촉할 기회를 많게 하고, 발색 시간을 짧게 하기 위해서, 효소 표지 항체가 결합되어 있는 부분에 대한 발색기 질량의 비를 2 cm2/㎖로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 「발색」이란, 물질을 검출하기 위해서 시약을 첨가하여 목적하는 색을 나타내는 것이다. 본 발명의 측정 방법 및 효소 면역학적 키트에서는, 발색 정도를 육안으로 곧 확인할 수 있지만, 기기에 의해 표색계에서의 파라미터를 측정하고, 그것을 이용하여 발색을 정량할 수도 있다. 즉, 본 발명에서는 반사광을 측정함으로써 표적 물질을 정량할 수 있다.
표색계란, 물체의 색이나 광원의 색을 수치나 기호로 표현하는 방법을 말한다. 그 중에서도 L*a*b* 표색계는 국제 조명 위원회(CIE)가 정한 균등색 공간의 하나이고, 또한 JIS(JIS Z 8729)에도 채용되고 있다. L*a*b* 표색계는 샘플에 대한 XYZ 표색계에서의 3 자극값인 X, Y, Z로 계산된다. XYZ 표색계는 현재 CIE 표준 표색계로서 각 표색계의 기초가 되는 빛의 3원색의 가법(加法) 혼색의 원리에 기초하고, 색도도를 사용하여 색을 Yxy의 3개의 값으로 나타낸다. Y는 반사율이며 명도에 대응하고, xy가 색도가 된다. L*a*b* 표색계에서는 명도가 L*, 색상과 채도를 나타내는 색도가 a*, b*로 표시되고, L*가 클수록 백색에 근접하며, L*가 작을수록 흑색에 근접한다. a*는 적색 방향, -a*는 녹색 방향, b*는 황색 방향, -b*는 청색 방향을 나타내고, 숫자의 절대값이 커짐에 따라서 색이 선명해지며, 숫자의 절대값이 작아질수록 흐릿한 색이 된다. 그 때문에, 인간의 색각(色覺)에 가장 가깝다고 되어 있다. 본 발명에 있어서 기기에 의한 표색계 파라미터 측정은 발색 정도를 기기에 의해 수치화하고, 그것을 이용하여 발색을 정량할 수 있다면 한정은 없다. 구체적으로는 샘플로부터 반사된 빛을 가시 영역인 400 내지 700 nm의 범위에서 분광시키고, 각 파장마다의 반사율을 측정하여 표색계에서의 파라미터를 계산할 수 있으면 되고, 이 반사율 측정으로부터 XYZ 표색계에서의 파라미터나 L*a*b* 표색계에서의 파라미터 등을 계산할 수 있다. 반사율의 측정은, 예를 들면 시판되는 분광 측색계(색채계)를 이용하여 행할 수 있다.
이 때, 상기 조건에서 측정한 경우, 샘플 중 표적 물질의 농도와, 분광 반사율로부터 계산되는 L*, a*, b* 등의 값이나 또는 L*a*b* 표색계에서의 좌표 L*, a*, b*의 차인 ΔL*, Δa*, Δb*로부터 계산할 수 있는 ΔE*(ab) 등의 값은 일정 범위 농도에서 일차적인 상관 관계에 있는 것으로, 샘플 중 표적 물질의 농도를 정확하게 정량할 수 있다. 또한, L*, a*, b*법에 의해 수치화된 값은 인간의 색각에 의해 판단한 명도나 채도에 가깝기 때문에, 육안에 의한 신속한 판정 결과 모두 상관이 높고, 또한 정밀도도 높다고 하는 특징을 가지며, 신속한 측정과 정확한 정량을 동시에 행할 때에는 흡광도에 의한 정량 방법보다 우수하였다.
이하, 본 발명의 효소 면역학적 키트에 대하여 상술하고, 또한 본 발명의 측정 방법에 대하여 설명한다.
본 발명의 효소 면역학적 키트는 샘플 중 표적 물질을 검출하기 위한 것이다. 여기서 말하는 「검출」이란, 표적 물질의 존재를 확인하는 것이고, 표적 물질의 농도를 정량 또는 반정량하는 것을 포함한다. 표적 물질이 포함되어 있는 샘플로서는, 표적 물질, 지지체에 고정화한 물질, 및 표적 물질에 대한 효소 표지 항체와의 항원 항체 반응을 원활하게 하기 위해서도 유동성이 있는 용액인 것이 바람직하지만, 특히 액체이어야만 하는 것은 아니고, 예를 들면 샘플이 고체인 경우에는 적당한 용매에 의해서 용해 또는 용매 중에 분산시킬 수 있다. 또한, 측정에 필요한 샘플량으로서는, 샘플이 지지체의 표적 물질을 인식하는 물질이 고정화된 부분에 접촉할 수 있는 정도의 양이면 특별히 제한은 없다. 혈액 등, 채취량이 한정되어 있기 때문에 샘플량이 소량인 경우도 많고, 그와 같은 경우에는 희석함으로써 샘플량을 증가시킬 수도 있지만, 표적 물질 농도만을 저하시킨 것만으로는, 표적 물질, 지지체에 고정화한 물질 및 표적 물질에 대한 효소 표지 항체가 단위 시간당 접촉하는 횟수가 감소되고, 반응의 저하에 의해 육안 및 표색계 측정 기기에 의한 표적 물질의 검출 또는 정량이 곤란해질 가능성이 있다. 총 반응량을 감소시키지 않기 위해서 인큐베이션 시간을 연장시킬 수도 있지만, 측정을 신속하게 한다고 하는 관점에서 다음 방법을 채용하는 것이 바람직하다. 즉, 샘플량이 적은 경우에는, 이미 서술한 바와 같이 지지체의 표적 물질을 인식하는 물질이 고정화된 부분의 면적에 대한 샘플량의 비, 또는 인큐베이션 공정에서의 용액 중 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도, 또는 표적 물질을 인식하는 물질의 지지체에의 고정화 밀도를 높게 할 수 있다. 또한, 가능한 한 소량이며 또한 취급하기 쉬운 양의 샘플, 예를 들면 10 ㎕ 내지 200 ㎕로 측정하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 표적 물질을 인식하는 물질을 피복하는 것 또는 고정화하는 것이란, 공유 결합, 금속 결합, 이온 결합, 소수 결합, 수소 결합, 친수성 결합등으로 표적 물질을 인식하는 물질을 지지체에 결합시키는 것을 가리킨다. 이 고정화 후에 표적 물질의 비특이 흡착을 저해하는 처리를 실시하여, 표적 물질을 인식하는 물질이 고정화되지 않은 부분에 표적 물질이 흡착하는 것을 막음으로써 효율적으로 표적 물질을 검출할 수 있다. 비특이 흡착을 저해하는 처리 방법으로서는, 표적 물질을 인식하는 물질이 결합하지 않은 간극 부분을 다른 물질로 덮는, 블로킹이라 불리는 방법을 사용할 수 있다. 표적 물질을 인식하는 물질이 단백질인 경우에는, 고정화한 분자의 입체 구조를 유지할 것으로 기대되는 카제인이나 소 알부민을 포함하는 용액을 이용하여 블로킹하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는 지지체를 복수개의 다른 농도의 표적 물질을 인식하는 물질로 피복시킨 후, 샘플 중 표적 물질을 항원 항체 반응시킴으로써 표적 물질을 검출하고, 발색에 의해 샘플 중 표적 물질을 검출할 수 있다. 또한, 상기 지지체 표면의 기지 농도의 표적 물질이 반응한 부분과 그 이외의 부분의 발색을 비교함으로써 샘플 중의 농도를 측정할 수도 있다. 또한, 동시에 상기 지지체 표면의 발색에 의해서 샘플 중 표적 물질을 검출함과 동시에 상기 지지체 표면의 기지 농도의 표적 물질이 반응한 부분과 그 이외의 부분의 발색 비교에 의해서 미지 농도의 샘플 중 표적 물질의 농도를 측정할 수도 있다.
「표적 물질을 인식하는 물질」로서는, 표적 물질에 대한 항체나 표적 물질과 수용체-리간드의 관계에 있는 경우의 수용체 또는 리간드 또는 표적 물질과 결합하는 효소나 기질 등이 포함되지만, 결합력이 강한 항체가 바람직하게 이용된다.
본 발명에 있어서의 표적 물질, 즉 검출 대상 물질은 특별히 한정되지 않고, 단백질, 펩티드, 지질 등의 생체 분자나 약제, 색소, 중금속 등의 비생체 물질 등이 포함된다. 표적 물질을 2종의 항체로 포착하는 방법을 이용하는 경우에는, 표적 물질은 12 내지 15개의 아미노산을 포함하는 펩티드 이상의 분자량을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서의 표적 물질로서의 사이토카인으로서는 특별히 한정되지 않고, 사이토카인의 유래로서는, 인간, 마우스, 토끼, 돼지 등 다양한 동물 유래의 사이토카인이나 배양 세포가 생산하는 사이토카인 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서의 표적 물질로서의 황색 포도상 구균 외독소 및 A군 β 용혈성 연쇄 구균 외독소로서는 상기 세균에 의해 생산되는 물질이라면 한정되지 않지만, 바람직하게는 항원 제시 세포에 의한 프로세싱을 받지 않고 MHC 클래스 II 분자와 T 세포 수용체(T Cell Recepter; 이하, TCR이라 함) Vβ의 외측에 결합함으로써 면역학적인 특이성을 넘어 T 세포를 과잉으로 활성화시키는, 일반적으로 슈퍼항원으로서 분류되어 있는 물질이다.
본 발명에서 지지체의 재질은 특별히 한정되지 않지만, 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화하는 부분에서는 표적 물질을 인식하는 물질과 친화성을 갖는 재료가 바람직하다. 표적 물질을 인식하는 물질이 단백질인 경우에는, 폴리스티렌이나 폴리메틸메타크릴레이트 등의 흡착성이 높은 고분자 물질을 주재료로 한 재료가 바람직하다. 형상으로서도 특별히 한정되지 않지만, 육안 또는 표색계 측정 기기에 의해서 발색을 확인하기 때문에, 막대 형상 또는 판 형상 또는 오목부를 갖는 형상이 바람직하고, 스틱 막대 형상 또는 판형의 경우에는 주걱형, 스틱형 또는 플레이트형 등 평면 부분을 갖는 형상이 보다 바람직하다. 오목부를 갖는 형상인 경우에는, 샘플, 효소 표지 항체를 인큐베이팅할 수 있도록, 액체가 넘쳐 흐르지 않는 형상이 좋다. 또한, 지지체는, 표적 물질을 고정화하는 부분(측정 부분)과 측정자가 지지체를 유지하기 위한 부분(유지 부분)을 갖는 것이 작업 조작상 바람직하다. 또한, 유지 부분의 재료는 특별히 한정되지 않고, 측정 부분과 다른 소재일 수도 있다. 지지체에는 샘플명을 기재하는 스페이스가 있으면 좋다.
본 발명에 사용되는 표적 물질에 대한 항체는 표적 물질을 특이적으로 인식할 수 있고, 또한 표적 물질에 대하여 지지체에 고정화한 물질이 인식하는 부위와 효소 표지 항체가 인식하는 부위가 각각 다르다면 특별히 한정되지 않고, 항체로서는 포유 동물을 표적 물질로 면역하여 얻어지는 항혈청으로부터 정제되는 폴리클로날 항체 및 표적 물질로 면역된 포유 동물로부터 취출한 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시킴으로써 얻어진 하이브리도마로부터 생산되는 모노클로날 항체를 모두 사용할 수 있다. 표적 물질에 대한 폴리클로날 항체는 포유 동물에게 표적 물질을 감작하여 얻어지는 항혈청을 재료로 하여 염석, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등 각종 수단으로 정제함으로써 얻을 수 있다. 표적 물질에 대한 모노클로날 항체는 마우스 등 적당한 동물을 표적 물질로 면역시킨 후, 비세포를 골수종 세포와 융합시키고, 얻어진 하이브리도마 중에서 표적 물질과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 클론을 ELISA 등의 수법을 이용하여 선택한 후, 얻어진 하이브리도마의 배양 상청 또는 하이브리도마를 적당한 동물에게 접종하여 얻어지는 복수(復水)를 재료로 하여 모노클로날 항체를 정제할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 표적 물질에 대한 항체는 표적 물질을 인식하는 물질로서 지지체에 고정화하기 위해서 사용할 수 있고, 또한 항체를 효소 표지화하여 지지체에 결합한 표적 물질을 인식하기 위해서도 이용된다. 효소 표지 항체로서는, 표적 물질에 대한 높은 선택성을 얻기 위해서 모노클로날 항체를 이용하는 것이 바람직하지만, 지지체에 고정화한 표적 물질을 인식하는 물질이 모노클로날 항체인 경우에는, 효소 표지 항체로서 폴리클로날 항체를 이용할 수도 있다.
본 발명에 있어서의 효소 표지 항체는 효소와 항체 또는 항체 단편을 연결한 (항체에 효소를 표지화한) 것으로, 면역 조직 화학 염색, 면역 측정 등의 목적으로 이용되고 있는 것을 사용할 수 있다. 효소 표지 항체에 표지되어 있는 효소에는 특별히 한정은 없지만, 기질의 검출물에의 전환 능력이 높은 것과 효소의 실활이 적기 때문에 호스 래디쉬 퍼옥시다제(Horse radish Peroxidase; 이하, HRP라 함), 알칼리 포스파타제(Alkaline Phosphatase; 이하, ALP라 함), β-D-갈락토시다제(β-D-galactosidase; 이하, β-Gal이라 함) 중 어느 것을 선택하는 것이 바람직하다.
효소의 표지 방법으로서는, 공유 결합에 의한 표지법과 비공유 결합에 의한 표지법의 두 방법으로 크게 구별된다. 공유 결합에 의한 표지법으로서는, 항체나 항체 단편의 아미노기와 효소의 아미노기를 이용하여 연결할 수 있는 방법이나, 효소와 항체를 유전자 수준에서 결합시키고, 효소 표지 항체를 제조하는 방법, 또한 항체나 항체 단편을 환원하여 생성되는 힌지부의 티올기를 선택적으로 이용하여 효소와 연결할 수 있는 방법 등이 있다. 비공유 결합에 의한 방법으로서는, 효소와 항효소 항체를 반응시켜두고, 이것과 목적 항체 사이를 항체에 대한 항체로 가교함으로써, 또한 항체를 비오틴 표지해두고, 이것과 효소 표지 아비딘을 반응시켜도 효소 표지 항체를 제조할 수 있다. 본 발명에 있어서의 효소 표지 항체의 제조 방법으로서는 특별히 한정은 없지만, 효소 표지 항체의 Fab' 단편의 비특이 흡착이 적고 항체 활성도 손상되지 않는, 환원 후 공유 결합에 의해 티올기를 효소와 연결할 수 있는 방법이 바람직하다.
본 발명에 있어서 효소 표지 항체를 발색시킨 후의 반응산물이 수불용성이 되는 기질이란, 효소 표지 항체를 발색시키는 것이며, 그 후의 반응산물이 수불용성이 되는 물질을 말한다. 효소 표지 항체를 발색시킨 후의 반응산물이 수불용성이 되는 기질로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 효소 표지 항체로서 HRP 표지를 선택한 경우에는, 기질로서는 3-아미노-9-에틸카르바졸, 5-아미노살리실산, 4-클로로-1-나프톨, o-페닐렌디아민, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산), 3,3-디아미노벤지딘, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, o-디아니시딘, 3,3-디메톡시벤지딘 중 어느 것이 포함되는 용액일 수 있다. 또한, 효소 표지 항체로서 ALP 표지를 선택한 경우에는, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 니트로블루 테트라졸륨, p-니트로페닐 포스페이트 중 어느 것이 포함되는 용액을 기질로서 사용할 수 있다. 또한, 효소 표지 항체로서 β-Gal 표지를 선택한 경우에는, o-니트로페닐-β-D-갈락토시드 또는 5-브로모-4-클로로-3-인돌-β-D-갈락토피라노시드 중 어느 것을 포함한 용액을 사용할 수 있다.
발색의 검출은 육안으로 행할 수도 있고, 분광 측색계를 이용하여 반사광을 측정할 수도 있다. 이 경우, 지지체 상의 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화하고, 인큐베이팅시에 샘플 중의 표적 물질과 반응하여, 표적 물질을 인식하는 물질-표적 물질-효소 표지 항체의 결합 복합체가 형성된 부분의 발색과, 그 이외의 부분의 색을 비교함으로써 표적 물질의 존재 유무를 결정할 수 있고, 또는 표적 물질을 정량할 수 있다. 또한, 미리 기지의 농도의 표적 물질을 포함하는 샘플을 이용하여 농도 대 반사광의 표준 곡선을 제조해두고, 상기 곡선에 기초하여 측정한 샘플 중 표적 물질의 농도를 구할 수도 있다.
도 4에 본 발명의 측정 방법의 1 양태의 공정 개략도를 나타낸다. 본 발명의 효소 면역학적 키트는 1종류 이상의 표적 물질을 인식하는 물질을 표면에 고정화한 후에 비표적 물질의 비특이 흡착을 저해하는 처리를 실시한 지지체, 1종류 이상의 상기 표적 물질에 대한 효소 표지 항체, 1종류 이상의 상기 효소 표지 항체를 발색시킨 후의 반응산물이 수불용성이 되는 기질, 및 이들 물질을 수용하는 1개 이상의 용기를 적어도 포함한다. 이것은, 표적 물질을 인식하는 물질을 피복한 지지체, 표적 물질, 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 3종류를 개개의 용기에 수용할 수도 있고, 3종류를 1개의 용기에 수용할 수도 있으며, 또는 표적 물질을 피복한 지지체와 기질의 2종, 또는 지지체 및 효소 표지 항체의 2종을 1개의 용기에 수용하고, 나머지 1종류를 다른 용기에 수용하는 것과 같은 양태일 수도 있음을 의미한다. 또한, 이 용기를 항원 항체 반응 및 발색 반응시키기 위한 용기로서 이용한다. 표적 물질을 인식하는 물질을 피복한 지지체, 표적 물질, 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 3종류를 수용하고, 또한 이들을 반응시키기 위한 용기의 재질로서는 특별히 한정되지 않지만, 단백질인 효소 표지 항체가 용기에 부착되기 어려운 것이 바람직하다. 표적 물질을 피복한 지지체와 기질의 2종을 수용하고, 또한 이들을 반응시키기 위한 용기, 또는 지지체 및 효소 표지 항체의 2종을 수용하며, 또한 반응시키기 위한 용기의 재질로서도 특별히 한정은 없다. 지지체나 용기에는 샘플명을 기재할 수 있는 스페이스가 있으면 좋다.
본 발명의 효소 면역학적 키트는 그 성능이 6개월 이상 유지되는 것이 바람직하지만, 성능을 6개월 이상 유지하기 위해서, 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화한 지지체나 표적 물질에 대한 효소 표지 항체 및 발색 공정에서 사용되는 기질을 보존 처리하는 방법이 바람직하게 이용된다. 성능의 저하란, 주로 표적 물질의 검출 감도가 저하되는 것이다. 본 발명에서는 지지체에 고정화한 표적 물질을 인식하는 물질이나 블로킹제, 또는 효소 표지 항체가 열화되지 않도록, 보존액으로서 티메로살이나 벤조산나트륨, 소르브산칼륨, 데히드로아세트산나트륨, 히노키티올, 파라옥시벤조산부틸, ε-폴리리신, 프로타민, 항생 물질 등을 첨가한 용액이나, 고농도 사카로스 용액이나 NaCl 용액을 이용하거나 하여 방부 가공을 할 수 있다. 방부를 위해 아지드화나트륨을 이용할 수도 있지만, HRP 표지 항체를 사용하는 경우에는, 발색의 저하를 초래하기 때문에 바람직하지 않다. 표적 물질에 대한 효소 표지 항체나 발색 공정에서 사용되는 기질은 분자의 크기가 여과막의 공경보다 작으면 여과에 의해서 멸균할 수도 있고, 가압이나 가열에 의해서 변질될 우려가 없으면 오토클레이브 처리에 의해서 용액을 멸균할 수도 있다. 또한, 키트를 희가스나 불연성 질소 등의 불활성 가스 중에서 보존하거나, 키트를 진공 상태로 보존함으로써 키트의 성능 열화를 막을 수 있고, 자외선에 의한 손상을 막기 위해서는 수납 용기를 차광 용기로 할 수 있다.
본 발명에서는 지지체를 표적 물질을 인식하는 물질로 고정화한 후에 지지체의 일부분에 기지 농도의 표적 물질을 반응시켜 두고, 그 지지체를 이용하여 미지 농도의 표적 물질을 포함하는 샘플을 표적 물질에 대한 효소 표지 항체와 함께 인큐베이팅하며, 세정 공정을 경유한 후에 기질에 의해 발색시켜, 기지 농도의 표적 물질을 반응시킨 부분과 그 이외의 부분의 발색을 비교함으로써 미지 농도의 샘플 중의 표적 물질 농도를 측정할 수 있다. 이 방법에서는, 샘플 중의 표적 물질 농도를 보다 정확하게 알 수 있다. 기지 농도의 표적 물질을 반응시키는 부분은 표적 물질을 인식하는 물질로 피복한 부분일 수도 있고, 표적 물질을 인식하는 물질로 피복되지 않은 부분일 수도 있으며, 상기 두 부분 모두일 수도 있지만, 계속되는 인큐베이션 공정에서 효소 표지 항체와 접촉해야만 하고, 또한 발색 공정에서 기질과 접촉해야만 한다.
본 발명에 있어서의 효소 면역학적 키트, 및 본 발명에 있어서의 인큐베이션 공정과 효소 표지 항체를 발색시킨 후의 반응산물이 수불용성이 되는 기질에 의해서 발색시키는 발색 공정의 2 단계의 반응 공정을 포함하는 측정 방법에 의해서 질환을 신속하게 진단하고, 환자에 대한 치료 방법을 단시간에 결정할 수 있다. 질환으로서는, 표적 물질의 증감이 원인이 되어 발증하는 것일 수도 있고, 또한 표적 물질이 직접 발증에는 관여하지 않지만, 그 질환에 의해 표적 물질이 증감하는 것일 수도 있다.
사이토카인이 높은 값인 것이 문제인 질환에서는, 사이토카인 농도가 500 pg/㎖ 이상인 경우에 치료를 필요로 하는 경우가 많기 때문에(슈깡 이가꾸노 아유미 2001/1/6 Vol.196 No.1), 샘플 중의 사이토카인 농도가 500 pg/㎖ 이상인지 어떤지를 아는 것이 중요하다. 상기 측정 키트 및 상기 측정 방법을 이용하면, 500 pg/㎖ 이상의 샘플 중의 사이토카인을 검출할 수 있기 때문에, 고사이토카인혈증을 진단할 수 있다.
예를 들면, 사이토카인이 높은 값인 것으로 알려져 있는 질환으로서 SIRS(전신 염증 반응 증후군; Systemic Inflammatory Response Syndrome)라 불리는 상태가 있고, 급성의 심각한 전신성 염증 반응에 대하여 제안되어 있는 개념이다. 체온, 심박수, 호흡수, 백혈구수 중 2 항목 이상이 비정상이었을 때에 SIRS의 상태이라고 하지만, 이 상태에서는 염증성 사이토카인의 작용에 의해서 장기 부전이 되거나, 전신성 염증 반응이 진행되어 죽음에 이르는 것이 보고되었다. SIRS를 야기하는 원인으로서, 인터루킨(이하, IL이라 함)이나 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor; 이하, TNF라 함)나 인터페론류가 알려져 있고, 특히 IL-1, IL-2, IL-6, TNF, IL-8, IFN-γ 등이라는 염증성 사이토카인이 SIRS에 깊이 관여하고 있는 것으로 시사되었다.
사이토카인은 면역 반응, 염증 반응에 깊이 관여하는 미량 생리 활성 물질로, 주로 백혈구로부터 생산되고, IL-1, IL-6, TNF는 모두 급성기 반응을 야기하며, 간세포에 일련의 급성기 단백질을 합성, 분비시킬 뿐 아니라, 내인성 발열 물질로서 작용한다. IL-2는 킬러 세포의 유도나 활성화, B 세포 증식 등 다양한 작용을 나타낸다. IL-8은 호중구와 T 세포를 염증 국소에 끌어 모은다. IFN-γ는 매크로파지를 활성화하여 활성 산소의 생산을 촉진시키기도 한다.
췌염 환자에 있어서도 중증도와 혈 중 사이토카인 농도가 상관된 것으로 보고되었다. 그의 원인으로서, 사이토카인에 의해 활성화된 호중구가 장기를 파괴하고, 또한 그 자극에 의해서 사이토카인이 유도된다는 악순환을 들 수 있다(이시야꾸 출판 주식회사 별책 이가꾸노 아유미 사이토카인-기초부터 임상 응용까지). 또한, 중증 급성 췌염에 있어서 혈 중 IL-6의 농도가 높은 값인 경우에는 장기 부전을 합병하는 등의 중증화의 위험성이 높은 것이 보고되었다(「일본 구급 의학회 잡지」 Volume 11, Number 10, October 2000).
혈구 탐식 증후군에서는 림프구계 세포가 증식함으로써 고사이토카인혈증을 초래하는 상태에 있고, 사이토카인에 의해 림프구나 단구 등의 탐식능이 항진되어 혈구를 파괴하고, 중증화되면 다장기 부전 등을 야기하는 경우도 있다. 이 질환의 진단은 어렵고, 또한 원인이나 치료법 등도 연구 중에 있다.
IL-8을 복강 또는 정맥 주사하면, 1 시간 이내에 말초혈 중의 호중구가 증가하고, 피하 투여나 관절강내 투여에서는 투여된 국소에 대량의 호중구 및 T 림프구의 동원이 관찰된다. 특히 지속 정맥내 투여에 의해서 폐포의 파괴를 야기하여 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome; 이하, ARDS라 함)형의 양상을 나타내거나, 관절강내 투여에서는 골막 파괴가 확인되는 등의 강한 장기 장해 작용도 있다. 생체내에서도 통풍, 만성 관절 류마티스, 신우 신염, 천식, 패혈증, ARDS, 클론병, 궤양성 대장염 등의 질환으로 IL-8이 검출되고 있다.
그 밖에, 혈관염을 수반하는 가와사키병, 면역계 질환인 교원병, 스틸병 등에도 고사이토카인혈증이 관여된다고 하고, 또한 절박 조산 증례에 있어서의 양수 중의 사이토카인이 조산의 마커로서 유용하다고 되어 있다(Ginekol Pol. 2003 Oct; 74(10): 1343-7).
또한, 외상 침습 후, 면역 담당 세포의 과잉 활성에 의한 사이토카인의 생산이 SIRS를 유도하여 장기 장해의 원인이 되는 것이 개시되었다. 염증성 사이토카인의 생체내 투여에 의해 쇼크가 재현되고, 또한 손상입은 후에 고사이토카인혈증이 지속되면, 감염증의 병발률이나 그것에 기초하는 사망률이 유의하게 상관되는 것이 보고되었다. 외상사의 50 ％ 이상은 사고 직후의 불가역적인 신경 손상이나 대량 출혈이 아니라, 그것을 지난 후의 패혈증이나 다장기 부전(MOF)에 의한 것이라고 한다. 열상 모델에서도, 외독소가 조기의 T 세포성 반응을 증강시켜 치사적인 쇼크형 병체를 유도하는 것이 보고되었다. 이들은 SIRS 병태에 있어서 면역 응답이 항진된 사실을 나타내는 것이고, 또한 그것이 병태의 심각화에 관여한다고 하는 보고이다. 임상적으로는 ARDS나 TSS가 해당한다고 생각되고 있지만, 이 경우 부전 장기에 기본적으로는 감염은 없고, 마치 자기 면역 질환과 같이 활성화된 면역 담당 세포에 의해 중요 장기에서 장애가 발생된다.
또한, 감염에 기인한 질환이어도 고사이토카인혈증이 되는 것으로 알려져 있다. 분명한 감염이 확인되지 않는 경우에도, 황색 포도상 구균이나 A군 β 용혈성 연쇄 구균 등이 생산하는 슈퍼항원에 의해서 면역계가 과잉으로 활성화되어 고사이토카인혈증이 되는 경우가 있으므로, 조기 진단이 중요하다. 슈퍼항원이 관여하는 질환으로서는, TSS, NTED, 전신 에르시니아균 감염증, 성홍열이나 STSS 등을 들 수 있고, 급성 전신성 혈관염인 가와사키병에도 슈퍼항원의 관여가 시사되었다. 이들 질환에서는 조기의 신속한 진단과 그 진단에 기초하는 치료의 개시에 의해 중증화를 막는 것이 중요하다. 특히 STSS에서는 인두통, 발열, 소화기 증상(식욕 부진, 구역질, 구토, 설사), 저혈압 등의 패혈증 증상, 근육통 증상으로부터 시작되지만, 증상의 진행은 급속하고, 24 시간 이내에 연부 조직 병변, 순환ㆍ호흡기 부전, 혈액 응고 이상, 신장ㆍ간 증상 등 다장기 부전을 일으킨다. 조기에 적절한 처치를 실시하지 않는 경우에는, 다장기 부전, 사지의 괴사, 사망이라는 결정적인 상태가 된다. 이들 감염증의 원인균의 존재는 균 배양에 의해 증명할 수도 있지만, 배양에는 1 주간 이상 걸리는 경우가 많다. 또한, A군 β 용혈성 연쇄 구균 감염의 신속 검출에 대해서는 스트렙 A 항원의 측정 방법이 일본 특허 공개 (평)6-50973호 공보에 개시되었지만, 검출 대상은 A군 β 용혈성 연쇄 구균으로 한정되고, 또한 검체 중의 슈퍼항원 농도를 측정할 수 있는 것은 아니다. 황색 포도상 구균 감염의 신속 검출 키트도 판매되고 있지만, 이들은 배양 후의 균을 대상으로 한다.
혈 중의 사이토카인 농도나 슈퍼항원 농도가 높은 값인 상태에서는, 신속하게 상태를 파악하여 문제 물질의 농도를 급속히 저하시키는 것이 환자의 예후를 좌우한다. 또한 현재, 사이토카인이나 슈퍼항원을 측정하는 경우에는 균 배양이나 ELISA 등의 복잡한 기술과 시간을 필요로 하고, 매우 단시간에 또한 침상에서 농도를 측정할 수 있는 신속 간편한 측정 방법이 요망되었다. 진단이 어려운 경우에도 이들 질환에 관련된 물질의 농도를 손쉽게 조사할 수 있다면, 병을 지나치지 않고 조기에 적절한 치료를 받을 수 있게 된다.
이하에 실시예를 이용하여 상세히 설명하지만, 발명의 내용이 실시예로 한정 되는 것은 아니다.
실시예 1: 지지체에의 IL-8에 대한 항체의 고정화, 블로킹 및 보존 처리
항 인간 IL-8 폴리클로날 항체가 2 ㎍/㎖가 되도록 인산 완충 식염수로 제조하고, 폴리프로필렌 용기에 1 ㎖ 분주하였다. 이것에 폴리스티렌제 지지체(눈크사 제조)를 침지하여 4 ℃에서 18 시간 정치함으로써 스틱에 항 IL-8 항체를 고정화하였다.
그 후, 용기 중 및 스틱에 부착되어 있는 용액을 제거하고, 소혈청 알부민(세로로지칼사 제조)이 0.5 ％ 첨가된 인산 완충 식염수 1 ㎖에 지지체를 침지하여 실온(22 ℃)에서 2 시간 정치함으로써 블로킹 처리를 실시하였다. 그 후, 용기 중 및 스틱에 부착되어 있는 용액을 제거하고, 30 ％의 사카로스를 포함하는 인산 완충 용액 1 ㎖에 침지하여 보존 처리를 실시하였다. 그 후, 용기 중 및 지지체에 부착되어 있는 용액을 제거하였다. 항 인간 IL-8 폴리클로날 항체는 인간 섬유 아세포 유래 천연형 IL-8을 토끼에게 피하 투여하여 얻어진 항혈청을, IL-8 고정화 칼럼을 이용한 친화성 정제한 것을 이용하였다.
실시예 2: 인큐베이션 공정, 수세 공정 및 발색 공정
HRP 표지화 항 IL-8 모노클로날 항체가 0.5 ㎍/㎖가 되도록, 소혈청 알부민(세로로지칼사 제조)가 0.25 ％, Tween 20(도쿄 가세이사 제조)이 0.05 ％ 첨가되어 있는 인산 완충 식염수로 제조하고, 이것을 폴리프로필렌제 용기에 250 ㎕씩 분주하였다. HRP 표지 모노클로날 항체는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 주오 다이 6)에 기탁되어 있는 미공연균 기탁 제12710호 EL139를 배양함으로써 얻은 모노클로날 항체를 HRP로 표지화하여 얻었다. 이것에, 인간 IL-8(바이오소스사 제조)이 각각 4 ng/㎖, 2 ng/㎖, 1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 0.25 ng/㎖, 0 ng/㎖가 되도록 제조된 인간 혈장(바이오소스사 제조 ELISA에 의해서 IL-8이 검출 감도 이하의 농도인 것을 이미 확인함)을 각각 개개의 용기에 250 ㎕씩 분주하였다. 이것에 실시예 1에서 제조한 지지체를 침지하여 30 분간 실온(22 ℃)에서 정치하였다. 지지체는 실시예 1의 조작 후 41 일 경과하였다. 이 때, 지지체에 있어서 항 인간 IL-8 폴리클로날 항체를 표면에 고정화한 부분에 대한 인간 혈장량의 비는 6.7 cm2/㎖였다. 그 후, 용기 중 및 지지체에 부착되어 있는 용액을 제거하고, 증류수로써 세정하였다. 용기에 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 포함하는 기질(프로메가사 제조)을 1 ㎖ 분주하고, 15 분간 실온에서 정치하였다. 그 후, 용액 중 및 지지체에 부착되어 있는 용액을 제거하고, 증류수로써 세정하였다. 지지체의 발색 정도를 육안 및 L*a*b* 표색계에서 확인하였다. L*값, a*값, b*값은 코니카 미놀타사 분광 측색계(CM-2600d)를 사용하여 측정하고, 0 ng/㎖의 L*값, a*값, b*값과 비교하였다. 도 1에 IL-8을 첨가한 인간 혈장에 의한 지지체의 발색을 나타내는 사진을 나타내고, 표 1에 ΔL*값, Δa*값, Δb*값을 나타낸다.
Figure 112006092295603-PCT00001
실시예 3: 지지체에의 IL-6에 대한 항체의 고정화, 블로킹 및 보존 처리
항 인간 IL-6 폴리클로날 항체가 2 ㎍/㎖가 되도록 인산 완충 식염수로 제조하고, 폴리프로필렌 용기에 1 ㎖ 분주하였다. 이것에 폴리스티렌제 지지체(눈크사 제조)를 침지하여 4 ℃에서 18 시간 정치함으로써 스틱에 항 IL-6 항체를 고정화하였다. 그 후, 용기 중 및 스틱에 부착되어 있는 용액을 제거하고, 소혈청 알부민(세로로지칼사 제조)가 0.5 ％ 첨가된 인산 완충 식염수 1 ㎖에 지지체를 침지하여 실온(22 ℃)에서 2 시간 정치함으로써 블로킹 처리를 실시하였다. 그 후, 용기 중 및 스틱에 부착되어 있는 용액을 제거하고, 30 ％의 사카로스를 포함하는 인산 완충 용액 1 ㎖에 침지하여 보존 처리를 실시하였다. 그 후, 용기 중 및 지지체에 부착되어 있는 용액을 제거하였다. 항 인간 IL-6 폴리클로날 항체는 인간 섬유 아세포 유래의 천연형 IL-6을 염소에게 피하 투여하여 얻어진 항혈청을, IL-6 고정화 칼럼을 이용한 친화성 정제한 것을 이용하였다.
실시예 4: 인큐베이션 공정, 수세 공정 및 발색 공정
HRP 표지화 항 IL-6 모노클로날 항체가 0.5 ㎍/㎖가 되도록, 소혈청 알부민(세로로지칼사 제조)이 0.25 ％, Tween 20(도쿄 가세이사 제조)이 0.05 ％ 첨가되어 있는 인산 완충 식염수로 제조하고, 이것을 폴리프로필렌제 용기에 250 ㎕씩 분주하였다. HRP 표지 모노클로날 항체는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁되어 있는 미공연균 기탁 제10713호(국제 기탁 제2878호) IG61을 배양함으로써 얻은 모노클로날 항체를 HRP로 표지화하여 얻었다. 이것에 인간 IL-6(바이오소스사 제조)이 각각 5 ng/㎖, 2.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 0.25 ng/㎖, 0 ng/㎖가 되도록 제조된 인간 혈장(바이오소스사 제조 ELISA에 의해서 IL-6이 검출 감도 이하의 농도인 것을 이미 확인함)을 각각 개개의 용기에 250 ㎕씩 분주하였다. 이것에 실시예 1에서 제조한 지지체를 침지하여 30 분간 실온(22 ℃)에서 정치하였다. 지지체는 실시예 1의 조작 후 41 일 경과하였다. 이 때, 지지체에 있어서 항 인간 IL-6 폴리클로날 항체를 표면에 고정화한 부분에 대한 인간 혈장량의 비는 6.7 cm2/㎖였다. 그 후, 용기 중 및 지지체에 부착되어 있는 용액을 제거하고, 증류수로써 세정하였다. 용기에 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 포함하는 기질(프로메가사 제조)를 1 ㎖ 분주하여 15 분간 실온에서 정치하였다. 그 후, 용액 중 및 지지체에 부착되어 있는 용액을 제거하고, 증류수로써 세정하였다. 지지체의 발색 정도를 육안 및 L*a*b* 표색계에서 확인하였다. L*값, a*값, b*값은 코니카 미놀타사 분광 측색계(CM-2600d)를 사용하여 측정하고, 0 ng/㎖의 L*값, a*값, b*값과 비교하였다. 도 2에 IL-6을 첨가한 인간 혈장에 의한 지지체의 발색을 나타내는 사진을 나타내고, 표 2에 ΔL*값, Δa*값, Δb*값을 나타낸다.
Figure 112006092295603-PCT00002
이와 같이 사이토카인의 농도에 따라서 지지체의 발색 정도가 다른 것, 및 인간 사이토카인의 농도와 L*값, a*값, b*값이 상관되는 것, 또한 샘플 중 사이토카인의 농도가 500 pg/㎖ 이상인 경우에만 발색을 확인할 수 있음이 제시되었다.
비교예 1: 지지체에의 표적 물질에 대한 항체의 고정화량에 의한 발색 정도
실시예 1에 있어서의 항 인간 IL-8 폴리클로날 항체 및 실시예 3에 있어서의 항 인간 IL-6 폴리클로날 항체가 0.05 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖가 되도록 제조하였다. 후의 조작은 샘플로서, IL-6, IL-8이 각각 0.5 ng/㎖가 되도록 제조된 인간 혈장(바이오소스사 제조 ELISA에 의해 IL-6 및 IL-8이 검출 감도 이하의 농도인 것을 이미 확인함)을 이용한 것 이외에는, 실시예 1 내지 4에 따랐다.
이와 같이, 지지체에의 표적 물질에 대한 항체의 고정화량이 너무 적은 경우 및 너무 많은 경우에는 발색 정도가 저하되고, 샘플 중 사이토카인의 농도가 500 pg/㎖인 발색을 확인할 수 없었다.
비교예 2: 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도에 의한 발색 정도
실시예 2에 있어서의 HRP 표지화 항 IL-8 모노클로날 항체 및 실시예 4에 있어서의 HRP 표지화 항 IL-6 모노클로날 항체가 0.05 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖가 되도록 제조하였다. 후의 조작은 샘플로서, IL-6, IL-8이 각각 0.5 ng/㎖가 되도록 제조된 인간 혈장(바이오소스사 제조 ELISA에 의해서 IL-6 및 IL-8이 검출 감도 이하의 농도인 것을 이미 확인함)과 사이토카인을 포함하지 않는 인간 혈장을 이용한 것 이외에는 실시예 1 내지 4에 따랐다.
이와 같이, 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도가 너무 낮은 경우에는 샘플 중 사이토카인의 농도가 500 pg/㎖인 발색을 확인할 수 없었다. 또한, 너무 많은 경우에는 비특이 발색에 의해 사이토카인이 포함되지 않은 샘플이어도 발색되는 것을 확인하였다.
실시예 5: 고사이토카인혈증 환자 혈액 중의 사이토카인 측정
실시예 2에 있어서 인간 IL-8이 첨가된 인간 혈장 대신에 사이토카인 농도가 기지인 고사이토카인 환자의 혈청을 사용하여 지지체의 발색 정도를 확인하였다.
환자 혈 중 사이토카인 농도는 ELISA(바이오소스사 제조)에 의해 확인하였다. 도 3에 환자 혈청 중의 IL-8에 의한 지지체의 발색(L*a*b* 표색계에 의한 정량)을 나타내는 사진을 나타내고, 표 3에 ΔL*값, Δa*값, Δb*값을 나타낸다.
Figure 112006092295603-PCT00003
이와 같이, 실시예 2에 있어서의 지지체의 발색과 비교함으로써 혈 중 사이토카인 농도를 측정할 수 있고, 고사이토카인혈증을 진단할 수 있었다.
본 발명의 효소 면역학적 키트는 2 공정의 조작으로 지지체의 발색에 의해 신속하며 또한 용이하게 표적 물질을 측정할 수 있다. 또한, 표적 물질을 인식하는 물질이 상기 지지체 표면에, 샘플량에 대하여 2 cm2/㎖ 이상이 되도록 고정화되어 있고, 샘플 중 표적 물질의 농도와 발색 강도가 일차적인 상관 관계가 되기 때문에 표적 물질을 정확하게 정량할 수 있다.
따라서, 발색의 유무 판정에 의해 표적 물질의 존재, 비존재를 결정할 수도 있고, 또한 표적 물질의 정확한 농도도 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 효소 면역학적 키트에 의해 사이토카인, 황색 포도상 구균 외독소, A군 연쇄 구균 외독소를 검출할 수 있고, 고사이토카인혈증, 황색 포도상 구균이 원인인 질환 및 A군 β 용혈성 연쇄 구균이 원인인 질환을 신속하며 또한 용이하게 진단할 수 있으며, 또한 정확하게 진단할 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물은 그 내용의 전체를 본 명세서에 포함하는 것으로 한다. 또한, 첨부된 청구 범위에 기재되는 기술 사상 및 발명의 범위를 일탈하지 않는 범위내에서 본 발명의 다양한 변형 및 변경이 가능한 것은 당업자에게는 용이하게 이해될 것이다. 본 발명은 이러한 변형 및 변경도 포함하는 것을 의도하고 있다.

Claims (53)

1종류 이상의 표적 물질을 인식하는 물질을 표면에 고정화한 후에 비표적 물질의 비특이 흡착을 저해하는 처리를 실시한 지지체,
1종류 이상의 상기 표적 물질에 대한 효소 표지 항체,
1종류 이상의 상기 효소 표지 항체를 발색시킨 후의 반응산물이 수불용성이 되는 기질 및
이들을 수용하는 1개 이상의 용기
를 포함하며,
상기 용기 중에서 항체 항원 반응 및 발색 반응시키고,
표적 물질을 인식하는 물질이 상기 지지체 표면에, 샘플량에 대하여 2 cm2/㎖ 이상이 되도록 고정화된, 상기 지지체 표면의 발색에 의해서 샘플 중의 표적 물질을 검출하는 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
1종류 이상의 표적 물질을 인식하는 물질을 표면에 고정화한 후에 비표적 물질의 비특이 흡착을 저해하는 처리를 실시하고, 1종류 이상의 기지 농도의 표적 물질을 반응시킨 지지체,
1종류 이상의 상기 표적 물질에 대한 효소 표지 항체,
1종류 이상의 상기 효소 표지 항체를 발색시킨 후의 반응산물이 수불용성이 되는 기질 및
이들을 수용하는 1개 이상의 용기
를 포함하며,
상기 용기 중에서 항체 항원 반응 및 발색 반응시키고,
표적 물질을 인식하는 물질이 상기 지지체 표면에, 샘플량에 대하여 2 cm2/㎖ 이상이 되도록 고정화된, 상기 지지체 표면의 기지 농도의 표적 물질이 반응한 부분과 그 이외의 부분의 발색 비교에 의해 미지 농도의 샘플 중 표적 물질의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
제2항에 있어서, 상기 지지체 표면의 발색에 의해서 샘플 중의 표적 물질을 검출함과 동시에 상기 지지체 표면의 기지 농도의 표적 물질이 반응한 부분과 그 이외의 부분의 발색 비교에 의해 미지 농도의 샘플 중 표적 물질의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 물질을 인식하는 물질을 포함하는 용액과 지지체를 접촉시킴으로써 지지체의 표면에 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화하며, 고정화할 때의 상기 용액 중의 표적 물질을 인식하는 물질의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖인 효소 면역학적 키트.
제4항에 있어서, 고정화할 때의 pH가 6.5 내지 8.0인 효소 면역학적 키트.
제4항 또는 제5항에 있어서, 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖인 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체에 고정화된 표적 물질을 인식하는 물질이, 샘플 중 표적 물질의 농도와 발색 강도가 일차적인 상관 관계가 되는 양으로 고정화된 것인 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 물질을 인식하는 물질이 표적 물질에 대한 항체이며, 상기 항체가 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 방부제에 의한 처리, 가압 처리 또는 가열 처리, 또는 불활성 가스 또는 진공 상태에서의 보존에 의해, 처리 후 6개월을 지날 때까지 표적 물질을 인식하는 물질의 활성이 저하되지 않는 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체가 막대 형상, 판 형상 또는 오목부를 갖는 형상인 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 표지 항체가 모노클로날 항체인 효소 면역학적 키트.
제11항에 있어서, 모노클로날 항체가 인간 인터루킨에 대한 항체인 효소 면역학적 키트.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 IgG인 효소 면역학적 키트.
제13항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 IgG1인 효소 면역학적 키트.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 인터루킨이 IL-6 또는 IL-8인 효소 면역학적 키트.
제15항에 있어서, 모노클로날 항체가 인간 IL-6의 아미노산 서열의 149 내지 173번의 아미노산을 포함하는 단편을 인식하는 모노클로날 항체인 효소 면역학적 키트.
제15항에 있어서, 모노클로날 항체가 인간 IL-6의 아미노산 서열의 153 내지 162번의 아미노산을 포함하는 단편을 인식하는 모노클로날 항체인 효소 면역학적 키트.
제16항에 있어서, 인간 IL-6에 대한 항체가 미공연균(微工硏菌) 기탁 제10713호로서 미생물 공업 기술원 연구소에 기탁되어 있는 하이브리도마가 생산하는 클론 IG61인 효소 면역학적 키트.
제17항에 있어서, 인간 IL-8에 대한 항체가 미공연균 기탁 제12710호로서 미생물 공업 기술원 연구소에 기탁되어 있는 하이브리도마가 생산하는 클론 EL139인 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 표지 항체의 효소가 호스 래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-D-갈락토시다제 중 어느 것으로부터 선택되는 것인 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 표지 항체의 효소가 호스 래디쉬 퍼옥시다제이고, 상기 기질이 3-아미노-9-에틸카르바졸, 5-아미노살리실산, 4-클로로-1-나프톨, o-페닐렌디아민, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산), 3,3-디아미노벤지딘, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, o-디아니시딘, 3,3-디메톡시벤지딘 중 어느 것을 포함한 용액으로부터 선택되는 것인 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 표지 항체의 효소가 알칼리 포스파타제이고, 상기 기질이 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 니트로블루 테트라졸륨, p-니트로페닐 포스페이트 중 어느 것을 포함한 용액으로부터 선택되는 것인 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소 표지 항체의 효소가 β-D-갈락토시다제이고, 또한 상기 기질이 o-니트로페닐-β-D-갈락토시드 또는 5-브로모-4-클로로-3-인돌-β-D-갈락토피라노시드 중 어느 것을 포함한 용액으로부터 선택되는 것인 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 물질이 사이토카인, 황색 포도상 구균 외독소, A군 연쇄 구균 외독소 중 어느 것인 효소 면역학적 키트.
제24항에 있어서, 상기 사이토카인이 염증성 사이토카인인 효소 면역학적 키트.
제25항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인이 IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-γ 중 어느 것인 효소 면역학적 키트.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인의 검출 한계 농도를 500 pg/㎖로 한 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
제24항에 있어서, 상기 황색 포도상 구균 외독소가 슈퍼항원인 효소 면역학적 키트.
제28항에 있어서, 상기 슈퍼항원이 SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEH, SEI, SEJ, TSST-1 중 어느 것인 효소 면역학적 키트.
제24항에 있어서, 상기 A군 연쇄 구균 외독소가 슈퍼항원인 효소 면역학적 키트.
제30항에 있어서, 상기 슈퍼항원이 SPEA, SPEC, SPEF, SPEG, SPEH 중 어느 것인 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 고사이토카인혈증이 원인인 질환을 신속하게 판정하기 위한 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제24항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 황색 포도상 구균이 원인인 질환을 신속하게 판정하기 위한 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제24항, 제30항 및 제31항 중 어느 한 항에 있어서, A군 β 용혈성 연쇄 구균이 원인인 질환을 신속하게 판정하기 위한 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 표면의 발색을 측정 장치에 의해 수치화하고, 상기 수치를 이용하여 발색을 정량화하며, 지지체 표면으로부터 반사된 빛을 400 내지 700 nm의 범위에서 분광시키고, 각 파장마다의 반사율을 측정하여 XYZ 또는 L*a*b* 표색계에서의 파라미터를 측정하는 것을 특징으로 하는 효소 면역학적 키트.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 기재된 효소 면역학적 키트를 이용하여 샘플 중의 표적 물질을 검출하거나 또는 샘플 중의 표적 물질 농도를 측정하는 방법.
표적 물질을 인식하는 물질로 피복된 부분을 갖는 지지체, 샘플 및 표적 물질에 대한 효소 표지 항체를 동시에 인큐베이팅하는 인큐베이션 공정, 및
반응산물이 수불용성이 되는 기질에 의해서 발색시키는 발색 공정의 2 단계 의 반응 공정
을 포함하며,
인큐베이션 공정에서 표적 물질을 인식하는 물질이 상기 지지체 표면에, 샘플량에 대하여 2 cm2/㎖ 이상이 되도록 첨가하고,
발색 반응 후의 지지체 표면의 색을 육안에 의해서 판단하는 것을 특징으로 하는 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
제37항에 있어서, 표적 물질을 인식하는 물질로 피복된 부분을 갖는 지지체에 표적 물질을 인식하는 물질을 고정화할 때에, 표적 물질을 인식하는 물질의 용액의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖이고, pH가 6.5 내지 8.0인, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 발색 공정에서 사용되는 표적 물질에 대한 효소 표지 항체의 농도가 0.1 내지 20 ㎍/㎖인, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 발색 반응 후의 지지체 표면의 색을 육안에 의해서 판단하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중의 표적 물질 농도를 측정하기 위한 방법.
제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 발색 반응 후의 지지체 표면의 색을 기기에 의해서 수치화하고, 그것을 이용하여 발색을 정량하는 것을 특징으로 하는, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플로부터 반사된 빛을 400 내지 700 nm의 범위에서 분광시키고, 각 파장마다의 반사율을 측정하여 표색계에서의 파라미터를 측정하며, 표색계가 XYZ 또는 L*a*b*인, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 공정과 발색 공정 사이에 세정 공정을 포함하는, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션, 세정, 발색의 각 공정에서의 반응 온도가 4 ℃ 내지 40 ℃의 범위인, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
제44항에 있어서, 상기 인큐베이션 공정, 발색 공정, 세정 공정이 실온에서 실시되는, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플량이 200 ㎕ 이하인, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 공정 시간이 5 내지 60 분의 범위이고, 상기 발색 공정 시간이 5 내지 30 분의 범위인, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 물질을 인식하는 물질로 피복된 부분을 갖는 지지체의 상기 표적 물질을 인식하는 물질로 피복된 부분의 일부 및 피복되어 있지 않은 부분의 일부 중 적어도 한쪽에, 1종류 이상의 기지 농도의 표적 물질을 반응시킨 후, 기지 농도의 표적 물질이 반응한 부분과 그 이외의 부분의 발색 비교에 의해서 미지 농도의 샘플 중의 표적 물질 농도를 측정하는, 샘플 중의 표적 물질을 검출하기 위한 방법.
제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 물질을 인식하는 물질로 피복된 부분을 갖는 지지체가 2종 이상의 다른 농도의 표적 물질을 인식하는 물질로 피복되어 있고, 2 부분 이상의 발색 정도를 비교함으로써 샘플 중의 표적 물질 농도를 측정하는 방법.
제37항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 물질이 사이토카인이고, 그의 검출 한계 농도가 500 pg/㎖인 방법.
제24항 내지 제27항 및 제32항 중 어느 한 항에 기재된 효소 면역학적 키트에 의해서 사이토카인을 검출하여 고사이토카인혈증을 진단하는 방법.
제28항, 제29항 및 제33항 중 어느 한 항에 기재된 효소 면역학적 키트에 의해서 황색 포도상 구균 외독소를 검출하여 황색 포도상 구균이 원인인 질환을 진단하는 방법.
제30항, 제31항 및 제34항 중 어느 한 항에 기재된 효소 면역학적 키트에 의해서 A군 β 용혈성 연쇄 구균 외독소를 검출하여 A군 β 용혈성 연쇄 구균이 원인인 질환을 진단하는 방법.
KR1020067026223A 2004-05-14 2005-05-13 표적 물질을 신속 간편하게 검출하는 방법 및 그를 위한효소 면역학적 키트 KR20070018995A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020067026223A KR20070018995A (ko) 2004-05-14 2005-05-13 표적 물질을 신속 간편하게 검출하는 방법 및 그를 위한효소 면역학적 키트

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2004-00144511 2004-05-14
KR1020067026223A KR20070018995A (ko) 2004-05-14 2005-05-13 표적 물질을 신속 간편하게 검출하는 방법 및 그를 위한효소 면역학적 키트

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070018995A true KR20070018995A (ko) 2007-02-14

Family

ID=43652212

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067026223A KR20070018995A (ko) 2004-05-14 2005-05-13 표적 물질을 신속 간편하게 검출하는 방법 및 그를 위한효소 면역학적 키트

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20070018995A (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100883530B1 (ko) * 2007-07-30 2009-02-13 한국과학기술연구원 대장암 진단용 단백질 마커 아데노실호모시스테이나제 및이에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단키트
KR101356073B1 (ko) * 2012-03-19 2014-01-28 한국과학기술원 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100883530B1 (ko) * 2007-07-30 2009-02-13 한국과학기술연구원 대장암 진단용 단백질 마커 아데노실호모시스테이나제 및이에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단키트
KR101356073B1 (ko) * 2012-03-19 2014-01-28 한국과학기술원 효소 기질의 고분자화에 의한 그라핀옥사이드의 형광저하를 이용한 바이오센서 및 이를 이용한 검출방법

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1322960B2 (en) Allergen-microarray assay
US6916626B1 (en) Detection of Candida
JP5818916B2 (ja) 尿路感染症の診断方法
KR20160072626A (ko) 패혈증 인자 il-6 간이 진단 키트
JP5891230B2 (ja) 細菌性髄膜炎の治療方法
EP0840126B1 (en) Marker and immunological reagent for dialysis-related amyloidosis, diabetes mellitus and diabetes mellitus complications
KR20130090892A (ko) 면역분석에서 시약의 반응성을 조절하기 위한 공동 결합
KR100877913B1 (ko) 돼지혈청으로부터 일본뇌염바이러스 항체 검출을 위한면역크로마토그래피 진단 키트
KR20070018995A (ko) 표적 물질을 신속 간편하게 검출하는 방법 및 그를 위한효소 면역학적 키트
EP1321478A2 (en) Antibody against Streptococcus mutans and its use in an immunoassay
KR20160110701A (ko) 막 기반 다중튜브를 포함하는 생체 물질 분석 장치
CN115353566B (zh) 用于检测白细胞介素1-β的抗体组合及其应用
JP4839674B2 (ja) 標的物質を迅速簡便に検出する方法およびそのための酵素免疫学的キット
US20100267009A1 (en) Method for the in vitro diagnosis and/or in vitro therapy monitoring of infections
TWI832901B (zh) 血紅素之測定試劑、測定套組及測定方法
US6235487B1 (en) Method of diagnosing Crohn&#39;s disease
WO2001081927A1 (fr) Procede de detection du streptococcus sobrinus et anticorps contre ce dernier
WO2005111616A1 (ja) 標的物質を迅速簡便に検出する方法およびそのための酵素免疫学的キット
KR20200015276A (ko) 쯔쯔가무시균 유래 엑소좀을 이용한 쯔쯔가무시병의 진단방법
KR101741206B1 (ko) 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 특이항체 진단용 래피드 키트
GB2217335A (en) Compositions for isolation and immobilisation of C-reactive protein in body liquids
JP3569588B2 (ja) 尿路感染症の診断用キット
JP3309900B2 (ja) 抗ｆｋｂｐ１２自己抗体の検出方法
CN107022028B (zh) 特异性抗CitH3单克隆抗体及其酶联免疫吸附试验试剂盒在脓毒症诊断中的应用
CN117491650A (zh) 一种外周血Hb-Aβ复合物定量检测试剂盒、检测方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Withdrawal due to no request for examination