JP3341629B2 - ヘリコバクター・ピロリ除菌治療の診断用試薬 - Google Patents
ヘリコバクター・ピロリ除菌治療の診断用試薬Info
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- JP3341629B2 JP3341629B2 JP13055297A JP13055297A JP3341629B2 JP 3341629 B2 JP3341629 B2 JP 3341629B2 JP 13055297 A JP13055297 A JP 13055297A JP 13055297 A JP13055297 A JP 13055297A JP 3341629 B2 JP3341629 B2 JP 3341629B2
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- Japan
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヘリコバクター・
ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）除
菌治療の診断用試薬に関する。更に詳しくは、ヘリコバ
クター・ピロリの膜破砕物から得られた分子量１０ＫＤ
〜１００ＫＤの外膜抗原を用いてなるヘリコバクター・
ピロリ除菌治療の診断用試薬に関する。
ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）除
菌治療の診断用試薬に関する。更に詳しくは、ヘリコバ
クター・ピロリの膜破砕物から得られた分子量１０ＫＤ
〜１００ＫＤの外膜抗原を用いてなるヘリコバクター・
ピロリ除菌治療の診断用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】１９８３年に胃炎、胃・十二指腸潰瘍、
胃ガンなどの原因となる細菌として患者標本からヘリコ
バクター・ピロリが発見された。この細菌への感染が消
化器関連の多様な疾患の引き金となることが明らかにな
るにつれて、ヘリコバクター・ピロリの除菌治療が注目
されている。殊に、治療後に繰り返し潰瘍を発症する患
者からヘリコバクター・ピロリを除菌したところ、潰瘍
の再発が抑制されることが報告されたため、消化性潰瘍
の治療では胃酸分泌抑制剤に抗菌剤を併用することが行
われるようになった。
胃ガンなどの原因となる細菌として患者標本からヘリコ
バクター・ピロリが発見された。この細菌への感染が消
化器関連の多様な疾患の引き金となることが明らかにな
るにつれて、ヘリコバクター・ピロリの除菌治療が注目
されている。殊に、治療後に繰り返し潰瘍を発症する患
者からヘリコバクター・ピロリを除菌したところ、潰瘍
の再発が抑制されることが報告されたため、消化性潰瘍
の治療では胃酸分泌抑制剤に抗菌剤を併用することが行
われるようになった。
【０００３】ヘリコバクター・ピロリ感染患者では、治
療によって生体内からヘリコバクター・ピロリが除菌さ
れた後、血清中の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体
価は徐々に低下し、時間とともにほぼ陰性化することが
知られている。そこで除菌治療のモニターには、これま
で行われていたヘリコバクター・ピロリを測定する培養
法、組織学的検査法、ラピッドウレアーゼテスト（ＲＵ
Ｔ）、尿素呼気試験（ＵＢＴ）等の浸襲的な直接試験法
に代えて、非浸襲的な血清中の抗ヘリコバクター・ピロ
リ抗体を免疫測定する方法が簡便で、多量の検体の同時
測定が可能であるためにその抗体価をモニターする方法
が行われている。従来、この抗ヘリコバクター・ピロリ
抗体の測定には、培養したヘリコバクター・ピロリを超
音波処理等によって破砕した未精製の可溶化抗原を固相
に結合させて製造したenzyme linked immunosorbent as
say （ＥＬＩＳＡ）試薬キットが多数開発され販売され
ている。これらの試薬には偽陰性を避けるために単一菌
株でなく、複数の菌株から取得した混合抗原を使用する
ことも行われていた。
療によって生体内からヘリコバクター・ピロリが除菌さ
れた後、血清中の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体
価は徐々に低下し、時間とともにほぼ陰性化することが
知られている。そこで除菌治療のモニターには、これま
で行われていたヘリコバクター・ピロリを測定する培養
法、組織学的検査法、ラピッドウレアーゼテスト（ＲＵ
Ｔ）、尿素呼気試験（ＵＢＴ）等の浸襲的な直接試験法
に代えて、非浸襲的な血清中の抗ヘリコバクター・ピロ
リ抗体を免疫測定する方法が簡便で、多量の検体の同時
測定が可能であるためにその抗体価をモニターする方法
が行われている。従来、この抗ヘリコバクター・ピロリ
抗体の測定には、培養したヘリコバクター・ピロリを超
音波処理等によって破砕した未精製の可溶化抗原を固相
に結合させて製造したenzyme linked immunosorbent as
say （ＥＬＩＳＡ）試薬キットが多数開発され販売され
ている。これらの試薬には偽陰性を避けるために単一菌
株でなく、複数の菌株から取得した混合抗原を使用する
ことも行われていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、未精製
抗原又は混合抗原を結合させた抗体測定試薬で患者血清
の測定を行うと、前記直接試験法で生体内からヘリコバ
クター・ピロリの除菌が確認されたにもかかわらず、抗
ヘリコバクター・ピロリ抗体価の低下が遅延するため、
治療終了後短期間での除菌治療の判定がつけ難く、血清
測定では少なくとも６カ月以上の長期観察が必要とされ
ている（臨床検査 Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．２，ｐ１７１
〜ｐ１７４（１９９７）参照）。そのため治療後早期の
除菌判定は、血清中の抗体測定で確定することができ
ず、抗体測定に加えて、従来の直接試験法による確認試
験が依然として行われていた。
抗原又は混合抗原を結合させた抗体測定試薬で患者血清
の測定を行うと、前記直接試験法で生体内からヘリコバ
クター・ピロリの除菌が確認されたにもかかわらず、抗
ヘリコバクター・ピロリ抗体価の低下が遅延するため、
治療終了後短期間での除菌治療の判定がつけ難く、血清
測定では少なくとも６カ月以上の長期観察が必要とされ
ている（臨床検査 Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．２，ｐ１７１
〜ｐ１７４（１９９７）参照）。そのため治療後早期の
除菌判定は、血清中の抗体測定で確定することができ
ず、抗体測定に加えて、従来の直接試験法による確認試
験が依然として行われていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究し
た結果、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体を測定するため
に用いる抗原として、ヘリコバクター・ピロリ菌体成分
から外膜を分離し、その膜抗原成分をウエスタンブロッ
ト法により分画したところ、分子量１０ＫＤ〜１００Ｋ
Ｄに存在する外膜抗原と反応する血清中の抗ヘリコバク
ター・ピロリ抗体の抗体価が除菌治療とともに低下し、
治療との相関性が高いことを見出し本発明を完成するに
至った。
た結果、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体を測定するため
に用いる抗原として、ヘリコバクター・ピロリ菌体成分
から外膜を分離し、その膜抗原成分をウエスタンブロッ
ト法により分画したところ、分子量１０ＫＤ〜１００Ｋ
Ｄに存在する外膜抗原と反応する血清中の抗ヘリコバク
ター・ピロリ抗体の抗体価が除菌治療とともに低下し、
治療との相関性が高いことを見出し本発明を完成するに
至った。
【０００６】本発明では、ヘリコバクター・ピロリの膜
破砕物から得られた分子量１０ＫＤ〜１００ＫＤの外膜
抗原を用いることにより殊に除菌治療のモニターとして
有用な抗ヘリコバクター・ピロリ抗体測定試薬が得られ
る。
破砕物から得られた分子量１０ＫＤ〜１００ＫＤの外膜
抗原を用いることにより殊に除菌治療のモニターとして
有用な抗ヘリコバクター・ピロリ抗体測定試薬が得られ
る。
【０００７】本発明のヘリコバクター・ピロリ外膜抗原
は以下に示す方法に従い取得することができる。まずヘ
リコバクター・ピロリはＩｎｇｒｉｄらの方法（Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３３（２）ｐ３８１−
３８４（１９９５）を参照）に従いヘリコバクター・ピ
ロリを含む培養液を１０％ＣＯ2 と５％Ｏ2 の存在下、
３７℃で２〜３日間培養する。次いで得られた菌体を公
知の細菌破砕法に従い破砕する。細菌の破砕には、例え
ばＦｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ等を用いる加圧破砕法、超
音波処理法、リゾチーム等を用いる酵素消化法、浸透シ
ョック法、凍結融解法等を採用することができる。
は以下に示す方法に従い取得することができる。まずヘ
リコバクター・ピロリはＩｎｇｒｉｄらの方法（Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３３（２）ｐ３８１−
３８４（１９９５）を参照）に従いヘリコバクター・ピ
ロリを含む培養液を１０％ＣＯ2 と５％Ｏ2 の存在下、
３７℃で２〜３日間培養する。次いで得られた菌体を公
知の細菌破砕法に従い破砕する。細菌の破砕には、例え
ばＦｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ等を用いる加圧破砕法、超
音波処理法、リゾチーム等を用いる酵素消化法、浸透シ
ョック法、凍結融解法等を採用することができる。
【０００８】次いで、得られた菌体破砕物は水溶液溶解
物を分離してヘリコバクター・ピロリ膜を取得した後、
この膜沈殿物について超遠心分画法、ショ糖密度勾配
法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等を単独又は組
み合わせて精製し、分子量１０ＫＤ〜１００ＫＤの画分
を得、本発明のヘリコバクター・ピロリ外膜抗原を得
る。この抗原の取得は例えばＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙｆｏｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）ｐ．５２−６１（１９８
１）等に記載の方法によって実施することができる。本
発明のヘリコバクター・ピロリ外膜抗原は前記分子量１
０ＫＤ〜１００ＫＤのヘリコバクター・ピロリ外膜抗原
からさらに２０ＫＤ〜４０ＫＤを分画して使用すること
もできる。
物を分離してヘリコバクター・ピロリ膜を取得した後、
この膜沈殿物について超遠心分画法、ショ糖密度勾配
法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等を単独又は組
み合わせて精製し、分子量１０ＫＤ〜１００ＫＤの画分
を得、本発明のヘリコバクター・ピロリ外膜抗原を得
る。この抗原の取得は例えばＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙｆｏｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）ｐ．５２−６１（１９８
１）等に記載の方法によって実施することができる。本
発明のヘリコバクター・ピロリ外膜抗原は前記分子量１
０ＫＤ〜１００ＫＤのヘリコバクター・ピロリ外膜抗原
からさらに２０ＫＤ〜４０ＫＤを分画して使用すること
もできる。
【０００９】上記方法により取得したヘリコバクター・
ピロリ外膜抗原は、従来の免疫測定に使用される各種免
疫測定用の固相に結合させて固相試薬を製造することが
できる。標識免疫測定用の固相としては例えばプラスチ
ック製の試験管、プラスチック製のマイクロプレートウ
エル、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、各種メンブ
レン、磁性粒子等である。
ピロリ外膜抗原は、従来の免疫測定に使用される各種免
疫測定用の固相に結合させて固相試薬を製造することが
できる。標識免疫測定用の固相としては例えばプラスチ
ック製の試験管、プラスチック製のマイクロプレートウ
エル、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、各種メンブ
レン、磁性粒子等である。
【００１０】また、ヘリコバクター・ピロリ外膜抗原と
固相とを結合させるには、固相試薬を製造するための周
知の共有結合又は非共有結合を作る方法を利用して行う
ことができる。非共有結合による方法としては前記ヘリ
コバクター・ピロリ外膜抗原と固相とを混合して行う物
理吸着法を挙げることができる。一方、共有結合による
方法としては例えばグルタールアルデヒド法、過ヨウ素
酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、公知
の各種架橋剤（マレイミド試薬等）を用いる方法等を挙
げることができる（例えば「蛋白質核酸酵素」別冊３１
号、３７〜４５頁（１９８７）参照）。
固相とを結合させるには、固相試薬を製造するための周
知の共有結合又は非共有結合を作る方法を利用して行う
ことができる。非共有結合による方法としては前記ヘリ
コバクター・ピロリ外膜抗原と固相とを混合して行う物
理吸着法を挙げることができる。一方、共有結合による
方法としては例えばグルタールアルデヒド法、過ヨウ素
酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、公知
の各種架橋剤（マレイミド試薬等）を用いる方法等を挙
げることができる（例えば「蛋白質核酸酵素」別冊３１
号、３７〜４５頁（１９８７）参照）。
【００１１】更に、本発明の抗ヘリコバクター・ピロリ
抗体測定試薬では、固相に結合した抗ヘリコバクター・
ピロリ抗体又は未結合の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体
を測定するために標識試薬を使用する。この標識試薬と
しては、標識物を結合して製造した標識抗免疫グロブリ
ン抗体、標識ヘリコバクター・ピロリ抗原、標識抗ヘリ
コバクター・ピロリ抗体等を挙げることができる。標識
試薬に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体又はモ
ノクローナル抗体であってもく、更にこの抗体をペプシ
ン等の酵素処理及び／又は還元処理して製造したＦａ
ｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2 等の抗体フラグメントで
あってもよい。免疫グロブリン抗体としては、例えば抗
ヒトＩｇＧ抗体等を挙げることができる。標識ヘリコバ
クター・ピロリ抗原は、前記ヘリコバクター・ピロリ外
膜画分等の抗原と前記標識物とを結合させて製造するこ
とができる。
抗体測定試薬では、固相に結合した抗ヘリコバクター・
ピロリ抗体又は未結合の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体
を測定するために標識試薬を使用する。この標識試薬と
しては、標識物を結合して製造した標識抗免疫グロブリ
ン抗体、標識ヘリコバクター・ピロリ抗原、標識抗ヘリ
コバクター・ピロリ抗体等を挙げることができる。標識
試薬に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体又はモ
ノクローナル抗体であってもく、更にこの抗体をペプシ
ン等の酵素処理及び／又は還元処理して製造したＦａ
ｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2 等の抗体フラグメントで
あってもよい。免疫グロブリン抗体としては、例えば抗
ヒトＩｇＧ抗体等を挙げることができる。標識ヘリコバ
クター・ピロリ抗原は、前記ヘリコバクター・ピロリ外
膜画分等の抗原と前記標識物とを結合させて製造するこ
とができる。
【００１２】標識物質には従来使用されていた標識免疫
測定に用いられる例えば酵素、放射性同位元素、蛍光物
質、発光物質、着色粒子、金属コロイド粒子等を挙げる
ことができる。酵素としては、例えばペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ（Ａｌｐ）、β
−ガラクトシダーゼ等を挙げることができる。放射性同
位元素としては、ヨウ素１２５、トリチウム等、蛍光物
質としては、ローダミン、ウンベリフェロン等、発光物
質としてはルミノール又はイソルミノール誘導体、アク
リジニウムエステル誘導体等を挙げるとができる。
測定に用いられる例えば酵素、放射性同位元素、蛍光物
質、発光物質、着色粒子、金属コロイド粒子等を挙げる
ことができる。酵素としては、例えばペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ（Ａｌｐ）、β
−ガラクトシダーゼ等を挙げることができる。放射性同
位元素としては、ヨウ素１２５、トリチウム等、蛍光物
質としては、ローダミン、ウンベリフェロン等、発光物
質としてはルミノール又はイソルミノール誘導体、アク
リジニウムエステル誘導体等を挙げるとができる。
【００１３】またこの標識試薬は、固相試薬を製造する
際に使用した共有結合又は非共有結合による方法に従い
前記抗体又は前記ヘリコバクター・ピロリ外膜抗原と前
記標識物質とを結合させて製造することができる。
際に使用した共有結合又は非共有結合による方法に従い
前記抗体又は前記ヘリコバクター・ピロリ外膜抗原と前
記標識物質とを結合させて製造することができる。
【００１４】本発明の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体測
定試薬では、前記固相試薬及び前記標識試薬を用いて抗
ヘリコバクター・ピロリ抗体を測定する。この抗体測定
は周知の１−ステップサンドイッチ法、ディレイ−１−
ステップサンドイッチ法、２−ステップサンドイッチ法
等のサンドイッチ法、競合法等である。前記サンドイッ
チ法では、前記標識抗免疫グロブリン抗体及び標識ヘリ
コバクター・ピロリ抗原を用いることができる。サンド
イッチ法による測定は、免疫反応により固相上に形成さ
れた免疫複合体の標識物を測定する方法に従い行うこと
ができる。例えば２−ステップサンドイッチ法ではまず
固相試薬と、検体とを緩衝液中でインキュベーション
（例えば５〜５０℃、５分〜１日）した後、固相を洗浄
する。次に標識試薬を含む緩衝液中に固相を移し、さら
にインキュベーション（例えば５〜５０℃、５分〜１
日）した後、固相を再び洗浄する。このようにして固相
上に形成された免疫複合体から標識物の測定を行う方法
である。
定試薬では、前記固相試薬及び前記標識試薬を用いて抗
ヘリコバクター・ピロリ抗体を測定する。この抗体測定
は周知の１−ステップサンドイッチ法、ディレイ−１−
ステップサンドイッチ法、２−ステップサンドイッチ法
等のサンドイッチ法、競合法等である。前記サンドイッ
チ法では、前記標識抗免疫グロブリン抗体及び標識ヘリ
コバクター・ピロリ抗原を用いることができる。サンド
イッチ法による測定は、免疫反応により固相上に形成さ
れた免疫複合体の標識物を測定する方法に従い行うこと
ができる。例えば２−ステップサンドイッチ法ではまず
固相試薬と、検体とを緩衝液中でインキュベーション
（例えば５〜５０℃、５分〜１日）した後、固相を洗浄
する。次に標識試薬を含む緩衝液中に固相を移し、さら
にインキュベーション（例えば５〜５０℃、５分〜１
日）した後、固相を再び洗浄する。このようにして固相
上に形成された免疫複合体から標識物の測定を行う方法
である。
【００１５】本発明において、標識物の測定には標識物
に対応した装置として放射性同位元素を放射線測定する
他、発光、蛍光、発色等を目視又は比色計、蛍光光度
計、フォトンカウンター、感光フィルム等の測定機器を
用いて測定し行うことができる。標識物質が酵素の場合
には、その酵素活性を発光基質、蛍光基質、発色基質等
を加えて反応を行い、その発光、蛍光、発色等を目視又
は前記測定機器により測定を行うことができる。
に対応した装置として放射性同位元素を放射線測定する
他、発光、蛍光、発色等を目視又は比色計、蛍光光度
計、フォトンカウンター、感光フィルム等の測定機器を
用いて測定し行うことができる。標識物質が酵素の場合
には、その酵素活性を発光基質、蛍光基質、発色基質等
を加えて反応を行い、その発光、蛍光、発色等を目視又
は前記測定機器により測定を行うことができる。
【００１６】また、本発明の免疫測定試薬は、ヘリコバ
クター・ピロリ外膜抗原を用いた固相試薬、標識抗体又
は標識抗原とから構成されるサインドイッチ法の試薬、
又は前記固相試薬と、標識抗ヘリコバクター・ピロリ抗
体とから構成される競合法の試薬である。この測定試薬
には、試薬が固体状態である場合には溶解液、標識物質
が酵素である場合には基質、その酵素反応を停止させる
ための反応停止試薬等を任意に組み合わせてキットを構
成することができる。
クター・ピロリ外膜抗原を用いた固相試薬、標識抗体又
は標識抗原とから構成されるサインドイッチ法の試薬、
又は前記固相試薬と、標識抗ヘリコバクター・ピロリ抗
体とから構成される競合法の試薬である。この測定試薬
には、試薬が固体状態である場合には溶解液、標識物質
が酵素である場合には基質、その酵素反応を停止させる
ための反応停止試薬等を任意に組み合わせてキットを構
成することができる。
【００１７】更に前記ヘリコバクター・ピロリ外膜抗原
は、免疫測定用固相の各種粒子と結合させることにより
凝集免疫測定試薬を製造することもできる。粒子として
は、公知の凝集免疫測定に用いられる例えば羊、牛、
馬、山羊、家兎等の動物赤血球、ポリスチレンラテック
ス等の高分子ラテックス粒子、ゼラチン粒子（特公昭６
３−２９２２３号参照）、磁性粒子（特公平３−１７１
０３号参照）等挙げることができる。抗原と粒子とを結
合させるには、吸着法の他、周知のタンニン酸、グルタ
ールアルデヒド、トリレンジイソシアネート（ＴＤＩ）
等の架橋試薬が用いられる。
は、免疫測定用固相の各種粒子と結合させることにより
凝集免疫測定試薬を製造することもできる。粒子として
は、公知の凝集免疫測定に用いられる例えば羊、牛、
馬、山羊、家兎等の動物赤血球、ポリスチレンラテック
ス等の高分子ラテックス粒子、ゼラチン粒子（特公昭６
３−２９２２３号参照）、磁性粒子（特公平３−１７１
０３号参照）等挙げることができる。抗原と粒子とを結
合させるには、吸着法の他、周知のタンニン酸、グルタ
ールアルデヒド、トリレンジイソシアネート（ＴＤＩ）
等の架橋試薬が用いられる。
【００１８】本発明の測定に用いられる検体としては、
特に制限はなく、例えば全血、血清、血漿、尿、リンパ
液等の体液を挙げることができる。
特に制限はなく、例えば全血、血清、血漿、尿、リンパ
液等の体液を挙げることができる。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明する。
明する。
【００２０】実施例１ ヘリコバクター・ピロリ外膜抗
原の作製 培養により得たヘリコバクター・ピロリ３．５ｍｇ（ｗ
ｅｔ ｎｅｔ）を緩衝液（０．２５Ｍ Ｓｕｃｒｏｓ
ｅ，５０ｍＭ トリエタノールアミン，１ｍＭＥＤＴ
Ａ，０．５ｍＭ ＰＭＳＦ，１ｍＭ ＤＴＴ）７．５ｍ
ｌに浮遊し、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｅｓｓで処理後、遠心機
で１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。上清をさら
に１００，０００ｒｐｍ ３０分間遠心し、沈殿画分に
ついてしょ糖密度勾配遠心法（Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ
４０．１；２８，０００ｒｐｍ；２４時間）を行い分子
量１０ＫＤ〜１００ＫＤの外膜画分を得た。この画分を
さらに５０，０００ｒｐｍ３時間遠心し沈殿に緩衝液
（０．２５Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅ，５０ｍＭ ＴＥＡ，１
ｍＭ ＤＴＴ）を加えて溶解しヘリコバクター・ピロリ
外膜抗原とした。単離したヘリコバクター・ピロリ外膜
抗原はｓｏｄｉｕｍｕｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ
−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用し、
クーマシー染色にて分子量を測定した。その結果ヘリコ
バクター・ピロリ外膜抗原はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて
１０ＫＤ〜１００ＫＤにバンドが見られた。
原の作製 培養により得たヘリコバクター・ピロリ３．５ｍｇ（ｗ
ｅｔ ｎｅｔ）を緩衝液（０．２５Ｍ Ｓｕｃｒｏｓ
ｅ，５０ｍＭ トリエタノールアミン，１ｍＭＥＤＴ
Ａ，０．５ｍＭ ＰＭＳＦ，１ｍＭ ＤＴＴ）７．５ｍ
ｌに浮遊し、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｅｓｓで処理後、遠心機
で１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。上清をさら
に１００，０００ｒｐｍ ３０分間遠心し、沈殿画分に
ついてしょ糖密度勾配遠心法（Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ
４０．１；２８，０００ｒｐｍ；２４時間）を行い分子
量１０ＫＤ〜１００ＫＤの外膜画分を得た。この画分を
さらに５０，０００ｒｐｍ３時間遠心し沈殿に緩衝液
（０．２５Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅ，５０ｍＭ ＴＥＡ，１
ｍＭ ＤＴＴ）を加えて溶解しヘリコバクター・ピロリ
外膜抗原とした。単離したヘリコバクター・ピロリ外膜
抗原はｓｏｄｉｕｍｕｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ
−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用し、
クーマシー染色にて分子量を測定した。その結果ヘリコ
バクター・ピロリ外膜抗原はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて
１０ＫＤ〜１００ＫＤにバンドが見られた。
【００２１】実施例２ 抗ヘリコバクター・ピロリ抗体
の測定 実施例１で作製し０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で
希釈したヘリコバクター・ピロリ外膜抗原をＥＬＩＳＡ
用マイクロプレートモジュール（Ｎｕｎｃ社製）の各ウ
エルに１００μｌずつ加え、４℃一晩インキュベートし
固相化した。次に、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳ（以下ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎという）で各ウエルを洗
浄後、ＰＢＳで希釈した１％のＢｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕ
ｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）３００μｌを加え４℃一
晩ブロッキングを行った。ブロッキング液を除いた後、
５０００倍に希釈した検体を１００μｌ加え３７℃で１
時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄
した後、酵素標識した抗ヒトＩｇＧ（γ鎖）抗体を各ウ
エルに１００μｌずつ加え、３７℃１時間反応させた。
反応をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄し、２，
２’−アジノビス−３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸（ＡＢＴＳ）を各ウエルに１００μｌずつ加
え、室温で３０分間反応後、反応停止液を各ウエルに１
００μｌずつ加え波長４１４ｎｍの発色を測定した。
の測定 実施例１で作製し０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で
希釈したヘリコバクター・ピロリ外膜抗原をＥＬＩＳＡ
用マイクロプレートモジュール（Ｎｕｎｃ社製）の各ウ
エルに１００μｌずつ加え、４℃一晩インキュベートし
固相化した。次に、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳ（以下ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎという）で各ウエルを洗
浄後、ＰＢＳで希釈した１％のＢｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕ
ｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）３００μｌを加え４℃一
晩ブロッキングを行った。ブロッキング液を除いた後、
５０００倍に希釈した検体を１００μｌ加え３７℃で１
時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄
した後、酵素標識した抗ヒトＩｇＧ（γ鎖）抗体を各ウ
エルに１００μｌずつ加え、３７℃１時間反応させた。
反応をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で十分に洗浄し、２，
２’−アジノビス−３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸（ＡＢＴＳ）を各ウエルに１００μｌずつ加
え、室温で３０分間反応後、反応停止液を各ウエルに１
００μｌずつ加え波長４１４ｎｍの発色を測定した。
【００２２】従来法の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体測
定試薬は、培養したヘリコバクター・ピロリ菌体を破砕
して得られた可溶化抗原を前記ＥＬＩＳＡ用マイクロプ
レートモジュールのウエルに前記方法に従い結合させて
作製した。
定試薬は、培養したヘリコバクター・ピロリ菌体を破砕
して得られた可溶化抗原を前記ＥＬＩＳＡ用マイクロプ
レートモジュールのウエルに前記方法に従い結合させて
作製した。
【００２３】測定検体は、胃潰瘍の症状を有する患者に
ヘリコバクター・ピロリの消失の有無により除菌成功群
と不成功群に分けた。ヘリコバクター・ピロリの存在
は、培養法、組織学的検査法、ラピッドウレアーゼテス
ト（ＲＵＴ）、尿素呼気試験（ＵＢＴ）を行い、少なく
とも２種以上の検査法で陽性と認められた場合にヘリコ
バクター・ピロリ陽性とした。除菌成功患者群について
除菌治療開始前及び治療終了後１〜４回採血し、治療前
を１００％とした場合の治療後の発色強度を測定した。
その結果を図１に示す。除菌不成功患者群では、その発
色強度は治療前と同一又は上昇が見られた。
ヘリコバクター・ピロリの消失の有無により除菌成功群
と不成功群に分けた。ヘリコバクター・ピロリの存在
は、培養法、組織学的検査法、ラピッドウレアーゼテス
ト（ＲＵＴ）、尿素呼気試験（ＵＢＴ）を行い、少なく
とも２種以上の検査法で陽性と認められた場合にヘリコ
バクター・ピロリ陽性とした。除菌成功患者群について
除菌治療開始前及び治療終了後１〜４回採血し、治療前
を１００％とした場合の治療後の発色強度を測定した。
その結果を図１に示す。除菌不成功患者群では、その発
色強度は治療前と同一又は上昇が見られた。
【００２４】
【発明の効果】本発明の除菌治療の診断用試薬は、従来
の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体のＥＬＩＳＡ試薬と比
較して除菌治療との相関性が高いため、除菌治療のモニ
ターに有用であり、更に精度の高い感染の診断法にも用
いることができる。
の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体のＥＬＩＳＡ試薬と比
較して除菌治療との相関性が高いため、除菌治療のモニ
ターに有用であり、更に精度の高い感染の診断法にも用
いることができる。
【図１】除菌成功患者群について、ヘリコバクター・ピ
ロリ外膜抗原を用いて製造したＥＬＩＳＡ試薬（本願）
及び可溶化抗原から製造したＥＬＩＳＡ試薬（従来法）
により抗ヘリコバクター・ピロリ抗体を測定した時の発
色の相対強度を示す図である。
ロリ外膜抗原を用いて製造したＥＬＩＳＡ試薬（本願）
及び可溶化抗原から製造したＥＬＩＳＡ試薬（従来法）
により抗ヘリコバクター・ピロリ抗体を測定した時の発
色の相対強度を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 安住 純一 東京都新宿区西新宿２丁目７番１号 富 士レビオ株式会社内 (56)参考文献 特表 平11−505267（ＪＰ，Ａ) 特表 平10−511116（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−509308（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/569
Claims (2)
- 【請求項１】 ヘリコバクター・ピロリの膜破砕物から
得られた分子量１０ＫＤ〜１００ＫＤのヘリコバクター
・ピロリ外膜抗原を用いてなるヘリコバクター・ピロリ
除菌治療の診断用試薬。 - 【請求項２】 外膜抗原を免疫測定用固相に結合した固
相試薬からなる請求項１記載の診断用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13055297A JP3341629B2 (ja) | 1997-05-06 | 1997-05-06 | ヘリコバクター・ピロリ除菌治療の診断用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13055297A JP3341629B2 (ja) | 1997-05-06 | 1997-05-06 | ヘリコバクター・ピロリ除菌治療の診断用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10307142A JPH10307142A (ja) | 1998-11-17 |
| JP3341629B2 true JP3341629B2 (ja) | 2002-11-05 |
Family
ID=15037010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13055297A Expired - Fee Related JP3341629B2 (ja) | 1997-05-06 | 1997-05-06 | ヘリコバクター・ピロリ除菌治療の診断用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3341629B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4852706B2 (ja) * | 2006-03-28 | 2012-01-11 | 国立大学法人高知大学 | Ｈ．ピロリ関連特発性血小板減少性紫斑病の検出方法、およびその予防治療剤のスクリーニング方法 |
| WO2023145787A1 (ja) * | 2022-01-25 | 2023-08-03 | 学校法人北里研究所 | 菌体可溶化画分を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法 |
| WO2023145788A1 (ja) * | 2022-01-25 | 2023-08-03 | 学校法人北里研究所 | 菌体外膜画分を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法 |
-
1997
- 1997-05-06 JP JP13055297A patent/JP3341629B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH10307142A (ja) | 1998-11-17 |
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