JPH1123578A - アルドラーゼアイソザイムの測定方法及びアルドラーゼアイソザイム測定用標準液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血清干渉の影響を減少し、正確で信頼性に優
れたアルドラーゼアイソザイムの測定方法、血清干渉の
影響を減少し、正確で信頼性に優れたアルドラーゼアイ
ソザイムの測定を可能にする希釈溶媒及び血清干渉の影
響を減少し、正確で信頼性に優れたアルドラーゼアイソ
ザイムの測定を可能にするアルドラーゼアイソザイムの
標準液を提供する。 【解決手段】 ウマ由来の血清又は血漿の存在下にアル
ドラーゼアイソザイムを検出又は定量することを特徴と
するアルドラーゼアイソザイム測定方法、アルドラーゼ
アイソザイムの測定において、検体の希釈又は標準液の
希釈に用いるウマ由来の血清又は血漿を含む希釈溶媒及
び希釈溶媒としてウマ由来の血清又は血漿を含有してな
るアルドラーゼアイソザイムを測定するための標準液。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アルドラーゼアイ
ソザイムの測定方法及びアルドラーゼアイソザイム測定
用標準液に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルドラーゼは、解糖系酵素の一つであ
り、生体の組織、細胞中に広く本酵素活性が見出され、
少なくともアイソザイムとして、Ａ、Ｂ、Ｃの３種類が
知られている。各アルドラーゼアイソザイムの分子量は
それぞれ１５万、１５．４万、１５．６万ダルトンで、
いずれも分子量約４万のサブユニットα、β、γで構成
される４量体であり臓器特異性が高い。アルドラーゼＡ
は、主に心臓、骨格筋、脳血管内皮細胞に、アルドラー
ゼＢは、主に肝臓、腎臓、腸上皮に、アルドラーゼＣ
は、脳、脊髄に多く存在している。

【０００３】アルドラーゼの測定法としては、従来、電
気泳動法やＦＤＰ（フルクトース−１，６−二リン酸）
をＦ１Ｐ（フルクトース−１−リン酸）とする分解活性
比ＦＤＰ／Ｆ１Ｐを測定する活性測定法が知られてい
る。しかし、電気泳動法では、各アルドラーゼアイソザ
イムのバンドの位置が近接しているため判別が困難であ
るうえ、定量性に乏しいという問題点がある。また、従
来の分解活性比ＦＤＰ／Ｆ１Ｐを測定する活性測定法で
は、アルドラーゼの総酵素活性として測定するため、個
々のアルドラーゼアイソザイムを分別定量することがで
きず疾患特異性が低く信頼性が乏しいという問題点があ
る。

【０００４】アルドラーゼアイソザイムを分別定量する
方法として、アルドラーゼＡ、Ｂ、Ｃの個々のアルドラ
ーゼアイソザイムに対する抗体を用いた測定例が報告さ
れている。アルドラーゼＡについては、ＲＩＡ法を用い
た測定例として、Asakaら（Clinica Chimica Acta,117,
289-296,1981、Cancer,51,1873-1878,1983）の報告や特
開昭５４−１４７０９７号公報、特開昭５６−１２５６
６７号公報等の報告がある。比色系ＥＩＡ法を用いた測
定例として、特開昭５６−４８８９４号公報がある。ま
た、蛍光系ＥＩＡ法を用いた測定例としては、Okajima
ら(Clinica ChimicaActa,187,265-272,1990)の報告があ
る。

【０００５】アルドラーゼＢについては、ＲＩＡ法を用
いた測定例として、Asakaら(Oncodevelopment Biology
and Medicine,4,187-195,1983, Hepatology, 4(3),531-
535,1984、Cancer,62,2554-2557,1988）の報告がある。
蛍光系ＥＩＡ法を用いた測定例として、Haimotoら（Cli
nica Chimica Acta,154,203-212,1986）の報告がある。
アルドラーゼＣについては、蛍光系ＥＩＡ法を用いた測
定例としてHaimotoら(Clinica Chimica Acta,154,203-2
12,1986)の報告がある。

【０００６】上述のようにアルドラーゼアイソザイムの
測定法には、多くの報告例がある。また、生体内におい
て、各アルドラーゼアイソザイムが存在する臓器や組織
が比較的限局されていることから、これらを分別定量す
ることは、各種臓器や細胞等の病変に伴う悪性腫瘍、代
謝異常、内分泌異常の診断において臨床上有用となる。
しかし、従来のこれらの免疫測定法を用いて血清又は血
漿中の微量成分を測定する場合、測定対象の微量成分の
濃度が、標準液から得られる検量線と相関しない血清等
の干渉現象（以下、血清干渉と略す）が存在する。その
ため、血清干渉の影響を減少させることは、測定値の信
頼性を確保する上で極めて重要である。アルドラーゼア
イソザイムの測定では放射性同位体を用いたり、検体を
５０倍程度希釈し、さらに蛍光を用いて検出する等の方
法を用いている。しかし、操作が煩雑な上、特別な機器
が必要であること等の問題がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】請求項１、２、３、
４、５、６及び７記載の発明は、血清干渉の影響を減少
し、正確で信頼性に優れたアルドラーゼアイソザイムの
測定方法を提供するものである。請求項８記載の発明
は、血清干渉の影響を減少し、正確で信頼性に優れたア
ルドラーゼアイソザイムの測定を可能にする希釈溶媒を
提供するものである。請求項９及び１０記載の発明は、
血清干渉の影響を減少し、正確で信頼性に優れたアルド
ラーゼアイソザイムの測定を可能にするアルドラーゼア
イソザイムの標準液を提供するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記（１）〜
（９）に関する。 （１）ウマ由来の血清又は血漿の存在下にアルドラーゼ
アイソザイムを検出又は定量することを特徴とするアル
ドラーゼアイソザイム測定方法。 （２）ウマ由来の血清又は血漿を含む標準液を用いる上
記（１）記載のアルドラーゼアイソザイムの測定方法。 （３）検体の希釈液としてウマ由来の血清又は血漿を含
有する希釈溶媒を用いる上記（１）又は（２）記載のア
ルドラーゼアイソザイムの測定方法。 （４）測定原理が固相抗体及び酵素標識抗体を用いる酵
素免疫測定法である上記（１）、（２）又は（３）記載
のアルドラーゼアイソザイムの測定方法。 （５）比色系により酵素を検出する上記（４）記載のア
ルドラーゼアイソザイムの測定方法。

【０００９】（６）化学発光系により酵素を検出する上
記（４）記載のアルドラーゼアイソザイムの測定方法。 （７）測定すべきアルドラーゼアイソザイムがアルドラ
ーゼＢである上記（１）、（２）、（３）、（４）、
（５）又は（６）記載の測定方法。 （８）アルドラーゼアイソザイムの測定において、検体
の希釈又は標準液の希釈に用いるウマ由来の血清又は血
漿を含む希釈溶媒。 （９）希釈溶媒としてウマ由来の血清又は血漿を含有し
てなるアルドラーゼアイソザイムを測定するための標準
液。 （１０）アルドラーゼアイソザイムがアルドラーゼＢで
ある上記（９）記載のアルドラーゼＢを測定するための
標準液。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、ウマ由来の血清又は血漿としては、ウ
マ胎児、ウマ新生児、仔ウマ、成ウマ等の血液から、通
常の方法により得られる血清又は血漿が使用できる。ウ
マ血清は、通常、ウマ血液を凝固させ、フィブリノーゲ
ンからフィブリン化し、これを除去することにより得ら
れる。例えば、ウマ血液を採血後、好ましくは４〜４０
℃、さらに好ましくは２５〜３７℃の条件下で血液を凝
固させ、遠心分離（５００〜５，０００×ｇで５〜６０
分間、好ましくは１，０００〜３，０００×ｇで１０〜
３０分間）し、その上清から得ることができる。あるい
は次の血漿の調製で述べるように血液抗凝固剤の作用に
より調製して得た血漿を、トロンビンや蛇毒等の血液凝
固促進剤を作用させ、フィブリノーゲンからフィブリン
化し、これを除去することで血漿を血清化することもで
きる。このようにして調製したウマ血清は、調製後直ち
に使用可能であるが、非動化、例えば５６℃で３０分間
処理したものも使用できる。

【００１１】ウマ血漿は、通常の方法で得られる。例え
ば、ウマ血液を適当な血液抗凝固剤の存在下で採血する
か、又は、血液採血後、血液抗凝固剤を添加し、遠心分
離（（５００〜５，０００×ｇで５〜６０分間、好まし
くは１，０００〜３，０００×ｇで１０〜３０分間）し
その上清から得られる。適当な抗凝固剤としては、ヘパ
リン、ＥＤＴＡ−２Ｎａ、クエン酸ナトリウム、フッ化
ナトリウム等が挙げられ使用できるが、これらに限定さ
れることはない。上記で得られるウマ由来の血清又は血
漿は、アルドラーゼアイソザイムを測定するための標準
液（以下、標準液と略す）の調製及び測定すべき検体の
希釈に使用する希釈溶媒として用いる。

【００１２】本発明において、標準液は、上記希釈溶媒
とアルドラーゼアイソザイムを混合したものであり、ア
ルドラーゼアイソザイムを適当な濃度に調製したもので
ある。希釈溶媒としては、ウマ由来の血清又は血漿をそ
のまま原液として、又は、これらを適当な緩衝液で希釈
し使用する。標準液中のウマ由来の血清又は血漿の最終
的な含有量は、測定感度、測定系等で異なる。含有量が
少なすぎると血清干渉を減少する効果が期待できなくな
るため好ましくない。しかし、例えば、サンドイッチＥ
ＩＡ法の場合、１〜１００（Ｖ／Ｖ）％が好ましく、よ
り好ましくは１０〜１００（Ｖ／Ｖ）％、特に好ましく
は５０〜１００（Ｖ／Ｖ）％を含有させる。なお、適当
な緩衝液としては、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸
緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。これら適当
な緩衝液中には、本発明の効果を損なわず、測定系を妨
害しない限り、チロメサールやアジ化ナトリウム等の防
腐剤やウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の安定化剤等を
添加補助剤として含有させることができる。

【００１３】標準液の調製に使用できるアルドラーゼア
イソザイムとしては、アルドラーゼアイソザイムを含有
する患者血清が使用でき、好ましくは心臓、骨格筋、
脳、肝臓、腎臓等の組織から抽出又は精製したアルドラ
ーゼアイソザイム、あるいは遺伝子組み換え法で作成し
たアルドラーゼアイソザイムも使用することができる。
アルドラーゼアイソザイムとしては、アルドラーゼＡ、
アルドラーゼＢ、アルドラーゼＣ等が挙げられる。これ
ら標準液は、一種類のアルドラーゼアイソザイムを含有
するものとして調製し使用できるし、あるいは複数のア
ルドラーゼアイソザイムを組み合わせ含有するように調
製し使用できる。又、複数のアルドラーゼアイソザイム
としては、粗精製物や各アルドラーゼアイソザイムの精
製物の混合物が使用できる。これら調製した標準液は、
最終的には溶液状態で使用するが、長期保存を目的に凍
結乾燥品とすることもできる。

【００１４】調製した標準液は、あらかじめ、測定対象
のアルドラーゼアイソザイムの濃度が明らかな標準品で
検定しておき、較正用の検量線の作成のために使用され
る。通常、既知濃度の標準液の個数は、異なる濃度のも
のが２個以上必要である。異なる濃度の標準液の一つと
して、アルドラーゼアイソザイムを含まない標準液も使
用できる。標準液の個数と濃度は、測定方法とその感
度、測定する濃度範囲内での検量線の形等により較正の
誤差を最小にするよう適宜設定することが好ましい。一
般に、測定の信頼性を向上させるには、標準液の個数を
多くするのが好ましいが、測定の操作性とランニングコ
ストの低減には標準液の個数を少なくすることが好まし
い。

【００１５】測定すべき検体としては、血清、血漿、リ
ンパ液、尿等の体液が使用できる。測定すべき検体は、
希釈せずに用いることもできるし、希釈して用いること
もできる。検体を希釈するための希釈溶媒としては、上
記標準液の調製において使用されるのと同様の希釈溶媒
が使用することができる。ウマ由来の血清又は血漿は原
液のまま、あるいは適当な安定化剤、防腐剤等を含む緩
衝液で希釈して使用することができる。一般に、希釈倍
数は低く抑えることが測定感度の観点から、好ましい
が、測定方法、測定感度、測定条件等に応じて適宜選択
できる。

【００１６】本発明の測定原理について以下に説明す
る。本発明の測定方法は、アルドラーゼアイソザイムの
測定に際し、ウマ由来の血清又は血漿を含有する希釈溶
媒を用いて調製した標準液の使用又は測定すべき検体を
希釈する工程のいずれか一方又は両方を含むことを特徴
とする。アルドラーゼアイソザイムの測定の原理として
は、測定すべきアルドラーゼアイソザイムを十分測定出
来る感度が得らる検出方法であれば、特に限定されない
が、好ましい方法としては、特異性の点から抗体を使用
する免疫学的測定方法が挙げられる。免疫学的測定方法
としては、酵素標識抗体を用いる酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ法）、放射性同位体標識抗体を用いる放射性免疫測定
法（ＲＩＡ法）、蛍光色素標識抗体を用いる蛍光免疫測
定法（ＦＩＡ法）、ポリスチレン粒子にこの抗体を感作
したラテックス凝集比濁法（ＬＩＡ法）等が挙げられ
る。

【００１７】本発明において好ましい免疫学的測定法と
しては、放射性物質の廃棄の問題がない点からＥＩＡ
法、ＦＩＡ法、ラテックス凝集法が挙げられ、より好ま
しい免疫学的測定法として測定の自動化が可能な点から
ＥＩＡ法、ラテックス凝集比濁法が挙げられる。又、比
較的測定感度が良好な点からＥＩＡ法、例えば、サンド
イッチＥＩＡ法が特に好ましい測定法として挙げられ
る。以下、免疫学的測定法の代表例として、反応原理が
固相抗体及び酵素標識抗体を用いるサンドイッチＥＩＡ
法による例で説明する。

【００１８】サンドイッチＥＩＡ法の測定法の概要は、
まず、固相抗体に、ウマ由来の血清又は血漿を含有する
希釈溶媒を用いて調製した標準液又は測定すべき検体又
は該希釈液溶媒で希釈した測定すべき検体を加え、固相
抗体／アルドラーゼアイソザイムの複合体を形成させ
る。次いで必要に応じて未反応物質を洗浄液で洗浄す
る。その後、酵素標識抗体（標識２次抗体）を加え、固
相抗体／アルドラーゼアイソザイム／酵素標識抗体の複
合体を形成させる。そして、個々の標準液、測定すべき
検体中のアルドラーゼアイソザイムの量を、存在量に応
じ形成したアルドラーゼアイソザイム−標識体（酵素標
識抗体等）複合体中の標識体（酵素標識抗体等）を指標
として検出し測定する。さらに、既知濃度の標準液によ
る標識体の測定結果をもとに未知濃度の検体中のアルド
ラーゼアイソザイム量を定量する。

【００１９】標識体としては、一般に、アルカリフォス
ファターゼ、ペルオキシターゼ、グルコースオキシター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ等の標識酵素が用いられる。
また、ＥＩＡ法においては、最終的に測定すべき標識酵
素（標識体）の検出方法としては、吸光度を検出する比
色系、発光強度を検出する化学発光系によるものが利用
できる。

【００２０】以下、サンドイッチＥＩＡ法の測定法に用
いる測定試薬を説明する。固相抗体及び酵素標識抗体
（標識２次抗体）に用いる抗体としては、抗アルドラー
ゼ抗体、抗アルドラーゼＡ抗体、抗アルドラーゼＢ抗
体、抗アルドラーゼＣ抗体が挙げられ、測定すべき対象
により、これら抗体は、単独で又は組合せて使用され
る。例えば、測定すべき対象がアルドラーゼＡの場合
は、固相抗体に抗アルドラーゼＡ抗体を、アルドラーゼ
Ｂを測定すべき場合は、固相抗体に抗アルドラーゼＢ抗
体を、アルドラーゼＡ、アルドラーゼＢ、アルドラーゼ
Ｃをすべて測定すべき場合は、これら全てのアルドラー
ゼアイソザイムに反応する（共通抗原認識部位を認識す
る）抗体である各抗アルドラーゼ抗体、もしくは、抗ア
ルドラーゼＡ抗体、抗アルドラーゼＢ抗体、抗アルドラ
ーゼＣ抗体を含有する混合物を固相抗体に固定化する。
これら抗体の由来としては、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニ
ワトリ、アヒル等のポリクローナル抗体が挙げられる。
又、ポリクローナル抗体に限らずモノクローナル抗体も
使用できる。

【００２１】上記抗体としては、免疫グロブリン画分に
限らず、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ画分等に精製しても使
用できるし、感度、特異性を向上させるためアフィニテ
ィ精製法により精製した特異抗体が使用できる。さら
に、検体中のリウマチ因子、補体成分等による非特異反
応による測定値への影響を避ける目的で、抗体分子をペ
プシンやパパイン等の限定分解酵素でＦｃ部分を切断し
分離除去しF(ab')2、Fab'、Fab画分として使用すること
もできる。固相担体としては、マイクロプレート、ポリ
スチレンビーズ、磁性体を包埋させたポリスチレン粒子
等を利用することができる。固相抗体を作成する際の抗
体は、０．１〜１０００μg/mlの濃度で固定化に使用で
きるが、１〜１００μg/mlの濃度で使用するのがより好
ましい。

【００２２】次いで、非特異的反応を防ぐためにこの固
相を蛋白質含有液で処理（ブロッキング処理）し洗浄し
て、固相とすることができる。ブロッキング処理に用い
る蛋白質としては、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ
と略す）のほか、各種アルブミン、ミルク、ゼラチン等
の蛋白質があり、これらを単独又は組合せで使用でき
る。これらの蛋白質は、０．１〜１０％(ｗ／ｖ)の濃度
で使用するのが好ましく、１〜５％(ｗ／ｖ)の濃度で使
用するのがより好ましい。以上により、固相抗体ができ
る。

【００２３】一方の検出用の抗体として酵素を標識した
酵素標識抗体（標識２次抗体）を用意する。酵素標識抗
体に使用できる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、グリコシダーゼ、β−カラクトシ
ダーゼ等が挙げられる。測定感度を上げるためには公知
のアビジン−ビオチン法を用いることが好ましい。例え
ば、ビオチン等の反応基を持つ抗アルドラーゼアイソザ
イム抗体と、アビジン等の反応基を持つ酵素（ペルオキ
シダーゼ等）を用いることができる。酵素の検出方法
は、用いる酵素及び基質により異なるが、化学発光、比
色系等が利用できる。

【００２４】酵素標識抗体の標識法には公知の各種方法
が適用できる。例えばペルオキシダーゼで標識するに
は、マレイミド・ヒンジ法、サクシンイミド法等により
直接両者を結合させることができる。酵素標識抗体は、
測定時に０．０１〜１００μg/mlの濃度で使用するのが
好ましく、０．１〜１０μg/mlの濃度で使用するのがよ
り好ましい。アビジン−ビオチン法を用いる場合、ビオ
チン等の反応基をもつ抗体は、０．０１〜１００μg/ml
の濃度で使用するのが好ましく、０．１〜１０μg/mlの
濃度で使用するのがより好ましい。また、アビジン等の
反応基をもつ酵素（例えばペルオキシダーゼ）は、０．
０１〜１００μg/mlの濃度で使用することが好ましく、
０．１〜１０μg/mlの濃度で使用するのがより好まし
い。

【００２５】アビジン−ビオチン法を用いる場合、あら
かじめビオチン等の反応基を持つ抗体とアビジン等の反
応基を持つ酵素を反応させ、複合体を調製しておき、こ
れを用いてもよい。この複合体は、０．０１〜１００μ
g/mlの濃度で使用できるが、０．１〜１０μg/mlの濃度
が好ましい。測定試薬には、その他、反応用緩衝液、洗
浄液、基質等が組み合わされる。比色系の場合の基質と
しては、例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；3,
3',5,5'-Tetramethylbenzidine）、ＡＢＴＳ（2,2'-Azi
no-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）、
ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ＮＰＰ； p-Nitrophen
ylphosphate）、ＯＰＤ（o-Phenylenediamine Dihydroc
hloride），ＯＮＰＧ（o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyr
anoside）等が挙げられる。停止液には、酸、アルカリ
の他各種有機溶剤が挙げられる。

【００２６】比色系による吸光度の検出のほか、化学発
光を用いて検出してもよい。例えば、化学発光系の場合
には、ルミノール類と過酸化水素の組合せが発光基質と
して用いられる。発光基質を含む発光試薬に含まれる脱
脂粉乳又は卵白アルブミンは、最終濃度で０．００１〜
１％(ｗ／ｖ)の濃度で使用するのが好ましいが、０．０
１〜０．２％(ｗ／ｖ)の濃度で使用するのがより好まし
い。また、過酸化水素は、最終濃度で０．４〜５．０ｍ
Ｍの濃度で使用するのが好ましい。また、ルミノール類
としてはルミノールのほか、イソルミノール等も使用で
きる。ルミノール類は最終濃度で０．１〜１００ｍＭの
濃度で使用するのが好ましいが、１〜１０ｍＭの濃度で
使用するのがより好ましい。

【００２７】また、必要に応じてさらに増感剤が用いら
れるがこれは、ルミノールの一電子酸化を助けて増感作
用を有するもので、４−ヨードフェノール、４−ブロモ
フェノール、４−フェニルフェノール、２−クロロ−４
−フェニルフェノール、４−（２′−チエニル）フェノ
ール、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、４−［４′−
（２′−メチル）チアゾリル］フェノール、４−［２′
−（４′−メチル）チアゾリル］フェノール、４−
（２′−ベンゾチアゾリル）フェノール、３−（１０−
フェノチアジル）−ｎ−プロピル−スルホン酸塩等が使
用できる。増感剤は最終濃度で０．００１〜１０ｍＭの
濃度で使用するのが好ましいが、０．０１〜１ｍＭの濃
度で使用するのがより好ましい。発光試薬中には、安定
性等の性能を上げるために、グリセリン、マンニトー
ル、ソルビトール等の糖アルコールや界面活性剤を添加
してもよい。

【００２８】以上、本発明の特に好ましい測定方法及び
測定試薬として、サンドイッチＥＩＡ法を例に説明した
が、その他の免疫学的測定法においても、標識体とその
検出方法の違いはあるが、標準液、検体の希釈液として
ウマ由来の血清又は血漿を含有させることにより適用で
き、血清干渉の影響を減少できる。標識体として、サン
ドイッチＥＩＡ法での標識酵素の代わりに、ＲＩＡ法の
場合は、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１等の放射性同位体
（アイソトープ）が、ＦＩＡ法の場合は、ＦＩＴＣ (fl
uorescein isothiocyanate)やＡＭＣＡ(7-amino-4-meth
ylcoumarin)等の標識蛍光色素が、ＬＩＡ法の場合は、
ポリスチレン等のラテックスやリポソーム等の粒子がそ
れぞれ用いられる。また、検出法としては、ＲＩＡ法の
場合には放射線強度が、ＦＩＡ法の場合には蛍光強度又
は蛍光偏向解消度が、ＬＩＡ法の場合には吸光度又は散
乱強度がそれぞれ用いられる。

【００２９】

【実施例】本発明を実施例により詳細に説明する。以
下、アルドラーゼＢを特異的に測定する比色サンドイッ
チＥＩＡ測定法を例に説明する。 １．アルドラーゼＢの精製 ヒト肝パウダー1容量に５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液
（５ｍＭ ＥＤＴＡ及び４ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール、５μg/mlアプロチニン、５μg/mlペプスタチンを
含む、pH７．５）４容量を加え、ミキサーでホモジナイ
ズした。これを遠心分離（３５００×ｇ、１時間）し、
上清に硫安を加え４５％(Ｗ／Ｖ)飽和液とした。これを
再び遠心分離（３５００×ｇ、１時間）し、上清に硫安
を加え６０％(Ｗ／Ｖ)飽和液とした。遠心分離後、生じ
た沈澱を少量の１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（１ｍＭ
ＥＤＴＡ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、pH７．５）
に溶解し、セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５（ファ
ルマシア バイオテク株式会社商品名）を用いて脱塩し
た。

【００３０】２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含む、pH７．５）で平衡化したホスフォセルロ
ースカラム Ｐ１１（ワットマン株式会社商品名）に、
前記脱塩した溶液を加え、カラム容積の３倍量の２０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡを含む、pH７．
５）で洗浄した。次いで、２．５ｍＭ ＦＤＰ（フルク
トース−１，６−二リン酸）を含む５０ｍＭ トリス塩
酸緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡを含む、pH７．５）で溶出
し、アルドラーゼ活性画分を分取した。これを、２０ｍ
Ｍ トリス塩酸緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡを含む、pH７．
５）に透析し、精製アルドラーゼＢを得た（濃度：１０
００ng/ml）。

【００３１】２．アルドラーゼＢの免疫と抗血清の調製 １mg/mlのアルドラーゼＢ １mlを等容量のフロイント
完全アジュバントと混和し、ウサギ（ニュージランドホ
ワイト種）に３週間に１回の割合で計４回皮下免疫し、
最終免疫日より１週間後に採血し、アルドラーゼＢを認
識する抗体を含有する抗アルドラーゼＢ抗血清（以下、
抗血清と略す）を得た。

【００３２】３．抗血清からＩｇＧ抗体の精製 上記２．で得た抗血清をプロテインＡ固定化カラムに加
え、カラム容積の５倍量のリン酸緩衝液（１．５ｍＭ
ＫＨ₂ＰＯ₄、８．１ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、２．７ｍＭ
ＫＣｌ、１３６．９ｍＭ ＮａＣｌを含む：pH７．２）
（以下、ＰＢＳと略す）で洗浄後、１００ｍＭ クエン
酸緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、pH４．０）で
溶出し、アルドラーゼＢを認識するＩｇＧ画分抗体（以
下、ＩｇＧ抗体と略す）を得た。

【００３３】４．抗アルドラーゼＢ ＩｇＧ抗体の精製 ２ｇのＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア
バイオテク株式会社商品名）を１００ｍＭ 重炭酸緩
衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌを含む、pH８．３）で平衡
化した後、８mgの精製アルドラーゼＢを加え、４℃で一
晩ゆっくり振とうした。得られたアルドラーゼＢ結合セ
ファロース４Ｂゲルを１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液
（５００ｍＭ ＮａＣｌを含む、pH８．５）で洗浄した
後、上記３．のプロテインＡで精製したＩｇＧ抗体を加
え、室温で１時間ゆっくり振とうした。次に、このゲル
をカラムに充填し、１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（５
００ｍＭ ＮａＣｌを含む、pH８．５）で洗浄した。次
いで、カラムに２００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（pH２．
３）を流し、抗アルドラーゼＢ ＩｇＧ抗体を溶出、分
取した。速やかにＰＢＳに透析し、アフィニティ精製−
抗アルドラーゼＢＩｇＧ抗体（以下、抗アルドラーゼＢ
ＩｇＧ抗体と略す）を得た。

【００３４】５．抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗体
の調製 アガロースビーズに固定化されたペプシン（含量３mg/m
l）：Immobilized Pepsin（PIERCE商品名）を２００ｍ
Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．５）で洗浄した。上
記４．で得た抗アルドラーゼＢ ＩｇＧ抗体を２００ｍ
Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．５）に透析し、これ
をアガロースビーズに固定化されたペプシンと混合し、
３７℃で一晩振とう後、ＰＢＳに透析した。次に、これ
をプロテインＡ固定化カラムに加え、未消化のＩｇＧ画
分やＦｃ画分を吸着させた。次いで、上記カラムにＰＢ
Ｓを加え、プロテインＡ未吸着画分を分取した。次に、
これを分子量５０，０００透析膜を用いてＰＢＳに透析
し、抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗体を得た。

【００３５】６．比色系サンドイッチＥＩＡ法用測定試
薬及び装置の準備 （１）アルドラーゼＢ標準液 上記１．で得た精製アルドラーゼＢを２０ｍＭ トリス
塩酸緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡ、チロメサールを含む、pH
７．５）でアルドラーゼＢの濃度が１０、２０、６０、
２００、６００、２０００ng/mlになるように希釈し、
この等量（１０．０ml）とウマ血清（コスモ・バイオ株
式会社）の等量（１０．０ml）を混合しアルドラーゼＢ
標準液（血清）とした。予め調製（凍結保存、−８０
℃）し表示してある社内のアルドラーゼＢ標準品（４．
９、９．８、２９．４、９８．０、２９４．０、９８
０．０ng/ml）をもとに、下記の測定試薬（比色系サン
ドイッチＥＩＡ法）を用いて検定した結果、それぞれア
ルドラーゼＢ標準液の濃度は、４．９、９．９、２９．
６、９８．６、２９５．８、９８６．０ng/mlであっ
た。ウシ血清をウシ血漿（コスモ・バイオ株式会社）に
変え、上記と同様に調製し、検定したアルドラーゼＢ標
準液の濃度は、５．１、１０．２、３０．６、１０２．
０、３０６．０、１０２０．０ng/mlであった。

【００３６】（２）抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗
体固定化プレート 抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗体を１０μg/ml含有
するＰＢＳ（pH７．２）を、ポリスチレン製９６穴イム
ノプレート（日本インターメッド株式会社）の各ウェル
に１００μｌ加え、３７℃で１時間静置した。この液を
除去し、１％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ含有ＰＢＳを各ウェルに４
００μｌ加え、３７℃で１時間静置し、固相担体上の未
反応部分をブロックした。各ウェルを０．１％(ｖ／ｖ)
Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業株式会社）含有ＰＢＳ
（以下ＰＢＳ−Ｔと略す）で３回洗浄し抗アルドラーゼ
Ｂ Ｆ(ａｂ′)₂抗体固定化プレートを得た。

【００３７】（３）希釈溶媒 ウマ、ヤギ、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジの血清または
血漿をそのまま用いた。 （４）抗体希釈液 ０．６％(ｗ／ｖ)ＢＳＡを含有するＰＢＳ（pH７．
２）。 （５）洗浄液 １％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業株式会社商
品名）を含有するＰＢＳ。

【００３８】（６）ビオチン化抗アルドラーゼＢ Ｆ
(ａｂ′)₂抗体 抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗体０．１mgにpH８〜
９になるように１ｍＭＮａＨＣＯ₃を加えpHを調製した
後、これにビオチン(Sulfosuccinimidyl-6-(Biotinamid
o)Hexanoate Sodium Salt)０．０１mgを加え混和し、室
温で３時間振とうし反応させた。反応終了後、これをＰ
ＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（ファルマ
シア バイオテク株式会社商品名）に加え、未反応のビ
オチンを除去し、ビオチン化抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａ
ｂ′)₂抗体を得た。抗体希釈液を用いて最終濃度を１μ
g/mlに調製した。

【００３９】（７）アビジン化ペルオキシダーゼ 抗体希釈液を用いて最終濃度を０．５μg/mlに調製し
た。 （８）基質液 測定の用時に、０．０２％(ｖ／ｖ)過酸化水素と０．０
４％(ｗ／ｖ)ＴＭＢ（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
e）を等量混合し調製した。 （９）反応停止液 １Ｍ Ｈ₃ＰＯ₄。 （１０）マイクロプレートリーダー（東ソー株式会社、
ＭＰＲ Ａ４ｉ）

【００４０】７．比色系サンドイッチＥＩＡ法による標
準曲線 抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗体固定化プレート
に、ウマ血清又はウマ血漿を希釈溶媒としてそれぞれに
作成した濃度の異なるアルドラーゼＢ標準液を各ウェル
に１００μｌ加え、４℃で一晩静置した。各ウェルを洗
浄液４００μｌで５回洗浄し、ビオチン化抗アルドラー
ゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗体を各ウェルに１００μｌ加え室
温で１時間静置した。各ウェルを洗浄液４００μｌで５
回洗浄し、アビジン化ペルオキシダーゼを各ウェルに１
００μｌ加え、室温で１時間静置した。各ウェルを洗浄
液４００μｌで５回洗浄し、基質液を各ウェルに１００
μｌ加えた。発色が見られたところで、各ウェルに反応
停止液を１００μｌ加えた。マイクロプレートリーダー
（東ソー株式会社、ＭＰＲ Ａ４ｉ）で４５０nm（対照
６００nm）の吸光度を測定した。横軸にアルドラーゼＢ
の濃度をとり、縦軸の４５０nm（対照６００nm）の吸光
度をとり、グラフにプロットしてアルドラーゼＢの標準
曲線とした。図１は、本発明の測定方法（比色法）にお
いて、ウマ血清を希釈溶媒として使用し作製したアルド
ラーゼＢ標準液を用いた場合の標準曲線を示すグラフで
ある。横軸にアルドラーゼＢの濃度(ng/ml)をとり、縦
軸に吸光度（４５０nm）をとる。図２は、本発明の測定
方法（比色法）において、ウマ血漿を希釈溶媒として使
用し作製したアルドラーゼＢ標準液を用いた場合の標準
曲線を示すグラフである。横軸にアルドラーゼＢの濃度
(ng/ml)をとり、縦軸に吸光度（４５０nm）をとる。

【００４１】８．比色系サンドイッチＥＩＡ法による希
釈直線性試験（希釈溶媒に血清を使用） 抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗体固定化プレート
に、測定すべき検体としてヒト血清をＰＢＳ並びに各種
動物血清で倍々に希釈した希釈系列を用いて、これらの
１００μｌを各ウェルに添加し、４℃で一晩静置した。
各ウェルを洗浄液４００μｌで５回洗浄し、ビオチン化
抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗体を各ウェルに１０
０μｌ加え室温で１時間静置した。各ウェルを洗浄液４
００μｌで５回洗浄し、アビジン化ペルオキシダーゼを
各ウェルに１００μｌ加え、室温で１時間静置した。各
ウェルを洗浄液４００μｌで５回洗浄し、基質液を各ウ
ェルに１００μｌ加えた。発色が見られたところで、各
ウェルに反応停止液を１００μｌ加えた。反応停止後各
ウェルをマイクロプレートリーダー（東ソー製、ＭＰＲ
Ａ４ｉ）を用いて４５０nm（対照６００nm）の吸光度
を測定した。図３〜９は、本発明の測定方法（比色法）
において、各種動物血清〔ウマ（図３）、ヤギ（図
４）、ウサギ（図５）、ブタ（図６）、ウシ（図７）、
ヒツジ（図８）〕及びＰＢＳ（図９）を希釈溶媒として
ヒトアルドラーゼＢ含有血清を使用した場合の希釈直線
性試験を示すグラフである。横軸に各種動物血清による
ヒトアルドラーゼＢ含有血清の希釈度をとり、縦軸にア
ルドラーゼＢの測定値をとる。

【００４２】以上のように、ウマ以外の各種動物血清を
希釈溶媒として用いた場合には、本希釈直線性試験での
直線関係が得られず、血清干渉の問題が認められた。本
発明によるウマ由来の血清を希釈溶媒とした場合にの
み、良好な直線関係が得られ、血清干渉の問題を解消で
きた。

【００４３】９．比色系サンドイッチＥＩＡ法による希
釈直線性試験（希釈溶媒に血漿を使用） 抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗体固定化プレート
に、測定すべき検体としてヒト血漿をＰＢＳ並びに各種
動物血漿で倍々に希釈した希釈系列を用いて、これらの
１００μｌを各ウェルに添加し、４℃で一晩静置した。
各ウェルを洗浄液４００μｌで５回洗浄し、ビオチン化
抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗体を各ウェルに１０
０μｌ加え室温で１時間静置した。各ウェルを洗浄液４
００μｌで５回洗浄し、アビジン化ペルオキシダーゼを
各ウェルに１００μｌ加え、室温で１時間静置した。各
ウェルを洗浄液４００μｌで５回洗浄し、基質液を各ウ
ェルに１００μｌ加えた。発色が見られたところで、各
ウェルに反応停止液を１００μｌ加えた。反応停止後各
ウェルをマイクロプレートリーダー（東ソー株式会社、
ＭＰＲ Ａ４ｉ）で４５０nm（対照６００nm）の吸光度
を測定した。図１０〜１６は、本発明の測定方法（比色
法）において、各種動物血漿〔ウマ（図１０）、ヤギ
（図１１）、ウサギ（図１２）、ブタ（図１３）、ウシ
（図１４）、ヒツジ（図１５）〕及びＰＢＳ（図１６）
を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血清を使用し
た場合の希釈直線性試験を示すグラフである。横軸に各
種動物血漿によるヒトアルドラーゼＢ含有血清の希釈度
をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をとる。以上の
ように、血漿についても上記１１．での結果と同様に、
各種動物血漿のうち唯一ウマ由来のみが血清干渉の問題
を解決できた。

【００４４】１０．比色系サンドイッチＥＩＡ法による
血清中のアルドラーゼＢ濃度の測定 抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗体固定化プレート
に、測定すべき検体として健常人及び肝疾患患者からの
ヒト血清を各ウェルに１００μｌ加え、４℃で一晩静置
した。各ウェルを洗浄液４００μｌで５回洗浄し、ビオ
チン化抗アルドラーゼＢ Ｆ(ａｂ′)₂抗体を各ウェル
に１００μｌ加え室温で１時間静置した。各ウェルを洗
浄液４００μｌで５回洗浄し、アビジン化ペルオキシダ
ーゼを各ウェルに１００μｌ加え、室温で１時間静置し
た。各ウェルを洗浄液４００μｌで５回洗浄し、基質液
を各ウェルに１００μｌ加えた。発色が見られたところ
で、各ウェルに反応停止液を１００μｌ加えた。反応停
止後各ウェルをマイクロプレートリーダー（東ソー株式
会社、ＭＰＲ Ａ４ｉ）で４５０nm（対照６００nm）の
吸光度を測定した。

【００４５】ヒト血清中のアルドラーゼＢの濃度はアル
ドラーゼＢの標準曲線から算出した。図１７は、本発明
の測定方法（比色法）における血清中のアルドラーゼＢ
の濃度測定の一例を示すグラフである。横軸に健常人及
び肝疾患患者の血清検体番号をとり、縦軸に血清中のア
ルドラーゼＢ測定値(ng/ml)をとる。なお、図１７にお
いて、血清検体番号の１から５は健常人、また血清検体
番号の６から１５は肝疾患患者の測定結果を示す。以上
のように、健常人の血清中のアルドラーゼＢの濃度は、
全て１００ng/mlであるのに対し、肝疾患患者の濃度は
１００ng/ml以上であり、本発明の適用することによ
り、健常人と肝疾患患者を区別することができた。

【００４６】

【発明の効果】請求項１、２、３、４、５、６及び７記
載のアルドラーゼアイソザイムの測定方法は、血清干渉
の影響の少なく正確で信頼性が優れる。請求項８記載の
希釈溶媒は、血清干渉の影響が少なく正確で信頼性に優
れた測定を可能にする。請求項９、１０記載のアルドラ
ーゼアイソザイム標準品は、血清干渉の影響が少なく正
確で信頼性に優れた測定を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定方法（比色法）において、ウマ血
清を希釈溶媒として使用し作製したアルドラーゼＢ標準
液を用いた場合の標準曲線を示すグラフである。横軸に
アルドラーゼＢの濃度をとり、縦軸に吸光度をとる。

【図２】本発明の測定方法（比色法）において、ウマ血
漿を希釈溶媒として使用し作製したアルドラーゼＢ標準
液を用いた場合の標準曲線を示すグラフである。横軸に
アルドラーゼＢの濃度をとり、縦軸に吸光度をとる。

【図３】本発明の測定方法（比色法）において、ウシ血
清を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血清の希釈
に使用した場合の希釈直線性試験を示すグラフである。
横軸にウシ血清によるヒトアルドラーゼＢ含有血清の希
釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をとる。

【図４】本発明の測定方法（比色法）において、ヤギ血
清を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血清の希釈
に使用した場合の希釈直線性試験を示すグラフである。
横軸にヤギ血清によるヒトアルドラーゼＢ含有血清の希
釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をとる。

【図５】本発明の測定方法（比色法）において、ウサギ
血清を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血清の希
釈に使用した場合の希釈直線性試験を示すグラフであ
る。横軸にウサギ血清によるヒトアルドラーゼＢ含有血
清の希釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をと
る。

【図６】本発明の測定方法（比色法）において、ブタ血
清を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血清使の希
釈に用した場合の希釈直線性試験を示すグラフである。
横軸にブタ血清によるヒトアルドラーゼＢ含有血清の希
釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をとる。

【図７】本発明の測定方法（比色法）において、ウシ血
清を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血清の希釈
に使用した場合の希釈直線性試験を示すグラフである。
横軸にウシ血清によるヒトアルドラーゼＢ含有血清の希
釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をとる。

【図８】本発明の測定方法（比色法）において、ヒツジ
血清を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血清の希
釈に使用した場合の希釈直線性試験を示すグラフであ
る。横軸にヒツジ血清によるヒトアルドラーゼＢ含有血
清の希釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をと
る。

【図９】本発明の測定方法（比色法）において、ＰＢＳ
（pH７．２）を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有
血清の希釈に使用した場合の希釈直線性試験を示すグラ
フである。横軸にＰＢＳによるヒトアルドラーゼＢ含有
血清の希釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値を
とる。

【図１０】本発明の測定方法（比色法）において、ウシ
血漿を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血漿の希
釈に使用した場合の希釈直線性試験を示すグラフであ
る。横軸にウシ血漿によるヒトアルドラーゼＢ含有血漿
の希釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をと
る。

【図１１】本発明の測定方法（比色法）において、ヤギ
血漿を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血漿の希
釈に使用した場合の希釈直線性試験を示すグラフであ
る。横軸にヤギ血漿によるヒトアルドラーゼＢ含有血漿
の希釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をと
る。

【図１２】本発明の測定方法（比色法）において、ウサ
ギ血漿を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血漿の
希釈に使用した場合の希釈直線性試験を示すグラフであ
る。横軸にウサギ血漿によるヒトアルドラーゼＢ含有血
漿の希釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をと
る。

【図１３】本発明の測定方法（比色法）において、ブタ
血漿を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血漿の希
釈に使用した場合の希釈直線性試験を示すグラフであ
る。横軸にブタ血漿によるヒトアルドラーゼＢ含有血漿
の希釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をと
る。

【図１４】本発明の測定方法（比色法）において、ウシ
血漿を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血漿の希
釈に使用した場合の希釈直線性試験を示すグラフであ
る。横軸にウシ血漿によるヒトアルドラーゼＢ含有血漿
の希釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をと
る。

【図１５】本発明の測定方法（比色法）において、ヒツ
ジ血漿を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含有血漿の
希釈に使用した場合の希釈直線性試験を示すグラフであ
る。横軸にヒツジ血漿によるヒトアルドラーゼＢ含有血
漿の希釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値をと
る。

【図１６】本発明の測定方法（比色法）において、ＰＢ
Ｓ（pH７．２）を希釈溶媒としてヒトアルドラーゼＢ含
有血漿の希釈に使用した場合の希釈直線性試験を示すグ
ラフである。横軸にＰＢＳによるヒトアルドラーゼＢ含
有血漿の希釈度をとり、縦軸にアルドラーゼＢの測定値
をとる。

【図１７】本発明の測定方法（比色法）における血清中
のアルドラーゼＢの濃度測定の一例を示すグラフであ
る。横軸に健常人(No.１〜５)及び肝疾患患者(No.６〜
１５)の血清検体番号をとり、縦軸に血清中のアルドラ
ーゼＢ測定値(ng/ml)をとる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山木 光男 茨城県日立市東町四丁目13番１号 日立化 成工業株式会社医薬品研究所内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウマ由来の血清又は血漿の存在下にアル
   ドラーゼアイソザイムを検出又は定量することを特徴と
   するアルドラーゼアイソザイム測定方法。
2. 【請求項２】 ウマ由来の血清又は血漿を含む標準液を
   用いる請求項１記載のアルドラーゼアイソザイムの測定
   方法。
3. 【請求項３】 検体の希釈液としてウマ由来の血清又は
   血漿を含有する希釈溶媒を用いる請求項１又は２記載の
   アルドラーゼアイソザイムの測定方法。
4. 【請求項４】 測定原理が固相抗体及び酵素標識抗体を
   用いる酵素免疫測定法である請求項１、２又は３記載の
   アルドラーゼアイソザイムの測定方法。
5. 【請求項５】 比色系により酵素を検出する請求項４記
   載のアルドラーゼアイソザイムの測定方法。
6. 【請求項６】 化学発光系により酵素を検出する請求項
   ４記載のアルドラーゼアイソザイムの測定方法。
7. 【請求項７】 測定すべきアルドラーゼアイソザイムが
   アルドラーゼＢである請求項１、２、３、４、５又は６
   記載の測定方法。
8. 【請求項８】 アルドラーゼアイソザイムの測定におい
   て、検体の希釈又は標準液の希釈に用いるウマ由来の血
   清又は血漿を含む希釈溶媒。
9. 【請求項９】 希釈溶媒としてウマ由来の血清又は血漿
   を含有してなるアルドラーゼアイソザイムを測定するた
   めの標準液。
10. 【請求項１０】 アルドラーゼアイソザイムがアルドラ
    ーゼＢである請求項９記載のアルドラーゼＢを測定する
    ための標準液。