JPS63277967A - 安定なグリコシル化ヘモグロビンの新規な免疫化学的アッセイ方法 - Google Patents

安定なグリコシル化ヘモグロビンの新規な免疫化学的アッセイ方法

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JPS63277967A
JPS63277967A JP62291651A JP29165187A JPS63277967A JP S63277967 A JPS63277967 A JP S63277967A JP 62291651 A JP62291651 A JP 62291651A JP 29165187 A JP29165187 A JP 29165187A JP S63277967 A JPS63277967 A JP S63277967A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 崖栗上久剋朋公団 本発明は生体試料中の安定なグリコヘモグロビンの量を
アッセイする方法に関する。さらに詳細には、本発明は
還元グリコヘモグロビン分子上のグリシドールリジン含
有エピトープの数を最適化し分析する方法に関する。
光凱■iu グリコジル化ヘモグロビン(グリコヘモグロビン)は糖
部分に共有結合しているヘモグロビンである。即ち、グ
リコヘモグロビンはヘモグロビンと糖との反応の付加生
成物(アグクト、)である。
グルコヘモグロビンはグルコースに結合したヘモグロビ
ンからなるグリコヘモグロビンのサブクラスである。グ
リコジル化は非特異的な反応であり各補糖または糖リン
酸のヒトヘモグロビンA0、A2、C,D、E、Fおよ
びSへの付加をもたらすものと報告されている。
グルコヘモグロビンArc (’Hb Arc) ハ最
モm冨であり最も広汎に研究されているグリコへモグロ
ビンである。HbA+cはベーターグロビン鎖の1つま
たは両方のN−末端バリンのアミノ基に結合したD−グ
ルコースを有するH b Anを示す。
しかしなから、グルコースのヘモグロビンへの付加はベ
ーター鎮のN−末端に限らずアルファーおよびベーター
グロビン鎖双方のニブシロンアミノ基でも生じ得る。
ヘモグロビンへのグルコース付加の反応機構および力学
は第1図に略図的に示されている。アルデヒド形にある
D−グルコースはアミノ基(N−末端バリンによりある
いは鋼内リシン残基のニブシロンアミノ基により与えら
れる)と急速かつ可逆的に反応して不安定なアルジミン
(シッフ塩基)中間体を形成する。この不安定中間体(
不安定グルコヘモグロビン)はD−グルコースおよびヘ
モグロビンに解離して戻りし得るかあるいは不可逆であ
るが緩慢なアマトリ転位を受けて安定なケトアミン(安
定なグルコヘモグロビン)を形成する。
ケトアミンはへミヶタールと平衡でまたは環状(特に、
デオキシフラクトシル−リシン)で存在する。
安定なグルコヘモグロビンの形成は赤血球の寿命を通じ
て緩慢かつ連続的に進行する非酵素プロセスである。グ
ルコヘモグロビン形成速度は血糖(グルコース)値を調
節する個々の能力に直接依存している。従って、HbA
rcの総安定グルコヘモグロビン濃度に関する情報は糖
尿病患者の糖血調整(glucemic contro
l )用の客観的時間当りのモニターを与えるようなア
クセプタンスを得ている。
総グリコヘモグロビンまたはHbA*cのような特定の
グルコヘモグロビン種の量をアッセイする種々の方法お
よ′びこれら方法に付随する方法上の問題は“ゴールド
スティン(Goldstein)等、Cl1n。
Chem、 、31 :1060 1067(1985
)”および“ジョバノピック(Jovanovic)等
、Am、J。
Med、、70 :331−338 (1981)”に
記載されている。例えば、“ジャピッド(Javid)
等、Or、J、 Haematology、  38 
: 329−337(1978)”に記載されたHbA
xcのラジオイムノア・ノセイ(RI A)はグルコキ
シ化していないヘモグロビンとの低い親和性と交差反応
性を有する抗体の使用を余儀な(されている。
さらに最近、1カーチス(curtiss )等、」工
Chin、 Invest、、72:1427−38(
1983)″はグルシトールリシン残基含有エピトープ
と免疫反応するモノクローナル抗体を用いて比較的短い
半減期を有するグルコキシ化血齋たん白の存在をアッセ
イすることについて報告している。これら研究者はまた
グルシトールリジン−ヘモグロビンによる上記モノクロ
ーナル抗体のグルシトールリジンー血漿たん白への結合
抑制についても報告している。
グルコシトールリジン残基は、リジンのグルコキシ化ニ
ブシロンアミノ基のケトアミン形(アマトリ生成物)を
ほう化水素酸ナトリウムまたはシアノボロ水素酸ナトリ
ウムのような親木性ほう化水素酸塩(ボラハイドライド
)還元剤(還元剤)で還元したときの前記アマトリ転位
生成物の還元によって生成される。か(して、カーチス
等は試料中のグルコ−血漿たん白質を還元してグルシト
ールリシン含有血漿たん白に転化し、続いてグルコシト
ールリシン−特異性モノクローナル抗体を用いてアッセ
イし、それによってグルコキシ化なしの血脩たん白質で
観察される交差反応性の問題を克服している。
しかしなから、第1図から理解できるように、インビト
ロの還元法はグルコヘモグロビンの不安定および安定形
の両方にグルコシトールリシンを産生さ廿ている。即ち
、明らかに、前出のカーチス等の方法は、血漿たん白の
代りにヘモグロビンに適用したとき、試料中に存在する
グルコヘモグロビンの不安定および安定形の量を区別す
ることはできなかった。
前出のゴールドスティン等およびジオバノピッチ等の両
方法によれば、長時間の糖血調整の信顧できる係数を与
えるグルコヘモグロビンアッセイを行うためには、アッ
セイ法はグルコヘモグロビンの不安定形および安定形を
区別すべきである。
その理由は2つ存在する。
第1には、任意の与えられた時点において、赤血球中に
存在するグルコヘモグロビンの総量は不安定画分と安定
画分の両方の和である。第2に、赤血球中に存在する不
安定グルコヘモグロビンの量は短時間でグルコース量に
応じて急速に変動する。即ち、不安定画分の形成は、血
中グルコースの鋭敏な変化が、不安定画分の増大の結果
として、実質的に総グルコヘモグロビンの増大をもたら
している安定ケトアミンの緩慢な不可逆的形成に比較し
たとき、十分に急速である。従って、グルコヘモグロビ
ンの測定における不安定画分の総括は血中グルコース量
に対する鋭敏なあるいは短時間応答を反映し得るが、長
時間糖血調整の程度を反映し得ない。
グリコヘモグロビンをアッセイするための現在利用でき
るクロマトグラフィー、電気泳動および免疫学的方法は
試料中に両方が存在するときのグルコヘモグロビンの不
安定形および安定形を区別できない、従って、試料から
アッセイ工程前に不安定グルコヘモグロビン画分を除去
する手順を含むアッセイ方法を開発する研究が実質的な
量で行なわれている。
試料から不安定グルコヘモグロビンを除去するための報
告された方法は、典型的には、試料を、不安定形のグル
コース(アルドース)のようなグリコースとヘモグロビ
ンへの分解を生ずる条件に付することに依存している。
それらの方法には、溶血前の通常塩水中での24時間の
赤血球のインキュベーション〔ゴールドスティン等、D
iabetes29S623−28 (1980))、
溶血液のグルコース不含リン酸バッファーに対する48
時間の透析〔ウィンドネス等、J、 Lab、 Cl1
n、 Med、、95 : 386−’394 (19
80)) 、および溶血液の限外濾過による希釈および
引き続いての濃縮〔イナネン(1nnanen )等、
Cl1n、、Ches、、27:1478−79  (
1981)〕がある。
本発明に関連して特に興味あるのは不安定グリコヘモグ
ロビンの除去に酸性インキュベーション工程を用いる方
法である。“ナーサン(Nathan )等、Diab
etes、 30 : 700 701、(1981)
’は赤血球をセミカルバジドとアナリンを含むpH5の
溶液中で30分間、38℃でインキュベートして不安定
画分を除去するアッセイ法を記載している。安定グリコ
ヘモグロビン例えばグルコヘモグロビン画分は、その後
、高圧液体クロマトグラフィー(HPCL)またはクエ
ン酸寒天ゲル電気泳動分離法のいずれかを用いてアッセ
イする。
6ビーゼ(Bisse)等、Diabetes、 31
 : 630−633、(1982)  ”に開示され
た方法はアッセイすべき試料から不安定画分を、赤血球
を50容量のpH5の0.05 Mビフタル酸カリウム
含有溶液中で15分間、37℃で溶解することによって
除去している。不安定グリコヘモグロビン除去試料中に
残存する安定グリコヘモグロビンの量はその後、HPL
Cで測定している。
しかしなから、ビフタル酸を用いであるいはビフタル酸
を親木性ほう化水素酸塩還元剤を用い免疫学的にアッセ
イできるグルシトールリジン−ヘモグロビンを形成させ
る還元工程と組合せて用いて酸性の不安定グリコース例
えばグルコース除去する工程を用いることを明らかにし
た報告はない。
血盟■立査 本発明はグリコヘモグロビン試料中のグルコヘモグロビ
ンのような安定グリコヘモグロビンの量をアッセイする
方法に関する。試料中に存在する不安定グルコヘモグロ
ビンは、先ず、グルコヘモグロビン含有試料をフタル酸
またはビフタル酸とヘモグロビン■当り少な(とも約1
.5ミリモルの比率で水性媒体中で約3〜約6のpH値
で混合して酸反応混合物を形成させることによって除去
する。この混合物は、存在する不安定グルコヘモグロビ
ンをグルコースとヘモグロビンにget、一方元の試料
中に存在する安定グルコヘモグロビンを維持するような
所定の時間および所定の条件に保持される。
次に、酸反応混合物は水親和性ほう化水素酸塩、好まし
くはほう化水素酸ナトリウムまたはカリウムとヘモグロ
ビン■当り少なくとも約0.15ミリモルの比で混合し
て水性還元反応混合物を形成する。この還元反応混合物
を、所定の時間、存在するグルコキシ化リジンをグリシ
ドールリジン残基に転化させグリシドールリジン−ヘモ
グロビンを形成させるような条件に保持する。
還元試料中に存在するグルシトールリジン−ヘモグロビ
ンから未反応ほう化水素酸塩を分離したのち、存在する
グルシトールリジン−ヘモグロビンの量を、グルシトー
ルリジン特異性レセプター分子を用いる周知の免疫学的
アッセイ法によって測定する。理解すべきことは、グル
シトールリジン−ヘモグロビンの免疫学的測定までのこ
の方法が不安定グルコヘモグロビンと安定ヘモグロビン
の両方を含むグルコヘモグロビン試料中の安定グルコヘ
モグロビンからグルコシトールリジン−ヘモグロビンを
調製するのにも利用できるということマある。
本発明はまた典型的にはキット形状にあり複数の別々の
パッケージを含んでいる診断薬系にも関する。第1のパ
ッケージはそのウェル表面でアッセイを行うマイクロタ
イタープレートのような面相マトリックスを含む。第2
パツケージは固形状の水親和性ほう化水素酸塩還元剤を
所定量含んでいる。第3パツケージは乾燥または液状の
適当なグルコシトールリシン特異性レセプター分子を含
んでいる。第4パツケージはフタル酸またはピッタル酸
を含んでいる。この診断薬系は、さらに、1種またはそ
れ以上の追加の有用な試剤を含む1種またはそれ以上の
パッケージを含み得る。
本発明はいくつかの利点および特長を提供する。
1つの利点は不安定および安定グルコヘモグロビンの両
方を含むグルコヘモグロビン中の安定ヘモグロビンの濃
度を比較的迅速に、容易にかつ正確にアッセイできるこ
とである。
本発明の1つの利点はグルコシトールリジン−ヘモグロ
ビンを試料の不安定クルコヘモグロビン部分から調製し
たクリコシトールリジン−ヘモグロビン以外にグルコヘ
モグロビン試料の安定グルコヘモグロビン認容から調製
できることである。
本発明のもう1つの利点は調製したグルシトールリジン
−ヘモグロビンが他の方法で調製したものよりも抗原性
があることである。
本発明のさらに別の利点および特長は以下の説明から当
業者にとって明らかとなるであろう。
A、定義 “抗体”なる用語は一群のグリコジル化たん白質のl員
である分子いわゆる抗原と特異的に結合し得る免疫グロ
ブリンを称する。そのような抗体は、抗原の抗原決定基
と抗体の抗体結合サイト間の特異的免疫学的結合作用に
よって抗原と結合する。
“抗体結合サイト”とは抗原を特異的に結合するH鎖お
よびL鎖の可変および高可変領域からなる抗体の構造的
部位である。“ジェーン(Jerne )、(1974
) Ann、 Immunol、 (In5t、 Pa
5taul )、125C:373−389″の命名法
を用いると、抗体結合サイトはまた“パラトープ”とも
称せられる。  − 抗体の抗体結合サイト含有(パラトープ含有ポリペプチ
ド部分はパラトープを含み抗原に結合する抗体分子の部
分であって、例えば、抗体のFab、Fab”、F (
ab ’ )tおよびF (v)部位を包含する。
抗体のFab部位とF<ab’)g部位は、それぞれ、
パパインとペプシンのたん白質分解反応によって、周知
である方法による実質的完全抗体上に産生される。例え
ば、チオフィロポラスとディオクソンに付与された米国
特許第4.342.566号を参照されたい。Fab’
抗体部位も周知であり、F(ab’)g部位から産生さ
れ次いでジスルフィド結合の還元により2つのH鎖部位
をメルカプトエタノールによるようにして結合し、次い
で得られたたん白質!ルカブタンのイオドアセトアミド
のような試剤によりアルキル化される。完全抗体が本発
明のモノクローナルリガンド分子の例として好ましく使
用される。
“抗原”なる用語は抗体と結合する存在を指称しまた抗
体の産生を誘起する存在を指称するものとして歴史的に
使用されている。より普通の使用は抗体により結合する
存在物に対する抗原の意味に限定され、また“免疫原“
なる用語は抗体産生を誘起する存在として使用される。
上述した存在物が免疫原性と抗原性を有するときには、
一般に抗原と称される。
“抗原決定基”なる用語は抗体結合サイトと免疫学的に
結合する抗原の実際の構造上の部位を称する。ジェーン
の命名法は抗原決定基を“エピトープ”として再定義し
ている。
“生物学的に活性”なる用語は少なくともたん白質様分
子の抗原または特異的抗体結合サイトを特異的に結合す
る能力を称する。ただし、これら分子には他の一般的あ
るいはエフェクター能力も存在し得る。抗体結合サイト
を含むレセプター分子の生物学的活性はパラトープ(抗
体結合サイト)とそのエピトープ(抗体決定基)との水
性媒体中での混合時の少なくとも生理学的DH値とイオ
ン強度における免疫反応体を形成する免疫学的反応によ
って証明される。好ましいのは、生物学的活性は後で定
義する生物学的アッセイ条件下で生じることである。
° “EL I SA”とは固相に結合した抗体または
抗原と酵素−抗原または酵素−抗体コンジュゲートを用
いて試料中に存在する抗原または抗体の量を検出し定量
する酵素結合イムノソルベントアッセイを云う。ELI
SA法の説明は1982年にカルホルニア州ロスアルト
スのランジメデカルパプリケイションズ社より刊行され
たり、P、サイテス等による“Ba5ic and C
11nical Imn+unolog  ”の第4版
、22章;および米国特許第3.654.090号、第
3.850.752号および第4.016.043号に
見い出され、これらの記載はすべて参考として本明細書
に引用する。
“酵素”とは触媒作用により多(の場合特異的である基
質中でのある種の変化を促進し産生ずる能力のあるたん
白質を称する。
種々の形で用いる1免疫反応”なる用語はレセプター分
子とエピトープ間の結合を意味する。
“標識手段”、“指示基”または“標識”なる用語は、
本明細書において、免疫反応体の存在を指示する検知可
能な信号の産生物中に直接または間接的に含まれる単一
原子および分子を含むものとして相互変化的に使用され
る。任意の標識手段をレセプターに結合あるいは混入で
き、あるいは別途に使用でき、これら原子または分子は
単独であるいは追加の試剤と組合せて使用できる。その
ような指示基または標識はそれ自体免疫化学において周
知であり、他の点で新規な方法および/または組成物と
共に用いる限りにおいてのみ本発明の一部を構成する。
“レセプター”なる用語は、本明細書においては、抗原
と免疫学的に結合する抗体結合サイトを含む生物学的活
性分子を指称するものとして使用される。このような結
合は、典型的には、約10’〜約10’J!1モルのア
フィニティによって生じ抗原のエピトープとレセプター
の抗体結合サイトとの特異的な反応である。
“分泌する”および“産生する”なる用語は、多くの場
合、抗体分子を得る細胞を称するものとして当該技術に
おいて相互変化的に使用される。
しかしなから、抗体を産生ずる細胞は抗体分子をその周
囲環境中には分泌し得ない。本発明において興味あるハ
イプリドーマ細胞はその周囲環境にモノクローナル抗体
を分泌する。にもかかわらず、そのような細胞はある場
合、“抗体産生性”細胞として称せられ、またこれらの
抗体は当該技術において用いられる意味に合せる点で“
産生”されるものとしである場合には使用する。上記抗
体(レセプター)の抗体結合サイト含有たん白質も、本
明細書においては、同様に“産生”または“分泌”され
るものとして使用するが、そのような分子はそれ自体“
産生”または“分泌”される抗体から産生されることを
理解すべきである。
“上清”なる用語は、本明細書においては、細胞を培養
するインビボ液状培地を称するものとして使用される。
本発明において興味あるハイプリドーマ培養物から産生
したモノクローナル抗体はその培養培地環境に分泌され
る。従って、これら細胞用の培地上清はモノクローナル
レセプター分子の1つの好ましい源であり、周知の方法
によってハイプリドーマ細胞から容易に遊離状態で取得
し得る。そのような方法の例は液状培地から細胞を沈澱
させる低速遠心である。モノクローナルレセプター分子
はハイプリドーマ組織を導入した実験動物の腹水腫腸液
(腹水液)からも得ることができる0両方法は当該技術
において周知である。
本明細書に記載するモノ特異性レセプター分子もこれら
分子が生ずる宿主動物の血液中に分泌する。
このような抗体を取得する方法も当該技術において周知
である。
B、グルシトールリジン−ヘモグロビン 生抜 本発明方法は一例としてグルシトールリジン−ヘモグロ
ビンとグルコヘモグロビンを用いてグリシドールリジン
−ヘモグロビンをグリコヘモグロビンから産生ずる方法
に関する。この方法によって産生させたグルシトールリ
ジン−ヘモグロビンは当該技術で公知の方法によって産
生させたグルシトールリジン−ヘモグロビンに比し予想
外の増大した抗原性を有する。増大した抗原性が得られ
る理由は知られていない。
公知量のヘモグロビンを含有するグルコヘモグロビンの
試料を調製する。かくして調製したグルコヘモグロビン
は赤血球に含まれるものとしてあるいは遊離分子として
存在し得る。
グルコヘモグロビンを取得しまたグルコヘモグロビンの
存在を検出する方法は当該技術において周知である。さ
らに、一般的にたん白質およびポリペプチド特にヘモグ
ロビンをグルコキシ化する方法も当該技術において周知
である。例えば、メヅシ(Mezci)等に付与された
米国特許第4,478.744号および“カーチス等、
J、 Cl1n、 Invest、、72:1427−
38、(1983)  ″を参照されたい、これらの記
載はすべて参考として本明細書に引用する。
典型的には、グルコヘモグロビン試料は公知量の全血液
として、より好ましくは、公知量のバック詰赤血球(R
B C)として調製する。血液およびパンク詰赤血球試
料の調製方法並びにこれら試料に含まれるRBC−t−
溶解する方法は当該技術において周知である。
(a)  グルコヘモグロビン試料を水性媒体で公知量
のフタル酸またはビフタル酸と混合して酸反応混合物を
調製する。混合する酸の量はヘモグロビンのミリグラム
当り少なくともフタル酸約1.5ミ!Jモルの比、好ま
しくはヘモグロビンのミリグラム当り少なくともフタル
酸約15.0ミリモノペより好ましくはへモグロビンミ
リグラム当り少なくとも45.Oミ!Jモルの比を与え
るのに十分な量である。
酸は、典型的には、約3〜約6、好ましくは約4〜約5
、より好ましくは約4.1〜約4.5のpH値を有する
水溶液として調製する。酸溶液により与えられる水性媒
体はかくして酸反応混合物の水性媒体を与える。
試料中のヘモグロビンのモル量を検出する方法は当該技
術において周知である。
(b)  得られた酸反応混合物を数秒〜数時間の所定
の時間保持する。約10分〜約15分の時間が、通常、
試料中に元々存在する安定グルコヘモグロビンを維持し
なからすべての存在するグルコヘモグロビンを実質的に
分解し除去するのに十分である。しかしなから、必要に
応じて、混合物は約16〜約20時間何らの有害な結果
なしに保持し得る。
グルコヘモグロビン試料を全血RBCとして調製したと
きには、酸溶液は赤血球溶解液(溶解剤)として作用し
、酸反応保持期間中、RBCを溶解しそれによって液中
に含まれるヘモグロビンを分離して溶血液を形成させる
。かくして形成した溶血液は不安定グルコヘモグロビン
を除去したものであり元のRBC試料部分中に存在する
安定ヘモグロビンを含んでいる。
(c)  酸反応混合物を、その後、水親和性ほう化水
素酸塩還元剤と混合して水性還元反応混合物を調製する
。還元反応混合物は酸反応混合物の水により、ほう化水
素酸塩還元剤の水溶液によりあるいは別途に調製できる
。好ましいのは、酸反応混合物が還元反応混合物の水性
部分の一部を与えることである。
水親和性ほう化水素酸塩還元剤は当該技術において周知
であり、ほう化水素酸ナトリウム(NaBII4) 、
ほう化水素酸カリウム(にBH* )およびシアノほう
化水素酸ナトリウム(NaCNBHz )がある。混合
するほう化水素酸塩の量はヘモグロビンのミリグラム当
り少なくともほう化水素酸(BH,−)約0.015ミ
リモル、好ましくはヘモグロビンのミリグラム当り少な
くともほう化水素酸約0.15ミリモル、より好ましく
はヘモグロビンのミリグラム当り少なくともほう化水素
酸約0.35 ミ!Jモルの比を与えるのに十分な量で
ある。
(6)得られた還元反応混合物を約り℃〜約37℃、好
ましくは約20℃〜約37℃の温度に数秒〜数時間の所
定時間保持する。約10、分〜約16−20時間、好ま
しくは約15分〜約30分の時間が、通常、安定グルコ
ヘモグロビン中に含まれるケト基をグルシトールリジン
残基のヒドロキシ基に還元しグルシトールリジン−ヘモ
グロビンを形成させるのに十分である。
(e)  次いで、得られたグルシトールリジン−ヘモ
グロビンを残存する未反応ほう化水素酸から分離して単
離したグルシトールリジン−ヘモグロビンを調製する。
RBC溶解からの細胞デブリもこの分離工程で除去する
ことが好ましい。
グルシトールリジン−ヘモグロビンヲ未反応ほう化水素
酸塩および還元反応混合物の残りから分離する方法もま
た当該技術において周知である。かかる分離法にはゲル
エキスクルジョンクロマトグラフィー、電気泳動、アフ
ィニティークロマトグラフィ等がある。固相アッセイ法
を用いるときには、ヘモグロビン誘轟体を使用する固相
マトリックスに結合して固形支持体を形成し、その後液
状還元反応混合物を固相から単純にデカンティションし
て分離を行うことが好ましい。精舎したクルジトールリ
ジンを含む固形支持′体はデカンティション工程後に洗
浄することもできる。
上述した方法はグルコヘモグロビンを測定するのに用い
る臨床検査法およびキットにおいて使用できるクルジト
ールリジンーヘモグロビンを調製するのにも使用できる
。この方法は、存在する特定のりジンー糖付加物にもよ
るが、他の必要なグルシトールリジン−ヘモグロビン種
を調製するのにも使用できる。
C・ヱヱ土工友法 本発明はヘモグロビン試料中の安定グリコヘモグロビン
の量を検出する方法にも関し、こ−でもまた−例として
グルコヘモグロビンを使用する。
前述のクルジトールリジンーヘモグロビンを調製する方
法を公知量のヘモグロビンを含む試料から上述の工程(
e)の単離クルジトールリジンーヘモグロビンを調製す
るのに用いる。その後、次の各工程を実施する。
(f)  単離したクルジトールリジンーヘモグロビン
をクルジトールリジンーヘモグロビン含有エピトープと
免疫反応しクルジトールリジン不合ヘモグロビンと実質
的に交差反応性のないレセプターと混合して免疫反応混
合物を形成させる。
使用できるレセプターは、典型的には、存在することが
予想されるクルジトールリジンの量販上の化学量論的に
過剰に混合する。
上述の免疫反応性を示すレセプター分子は本明細書にお
いては“クルジトールリジン特異性”レセプター分子ま
たはレセプターと称される。
理解すべきことはそのようなレセプター分子は他の糖−
ヘモグロビンアダクトの還元アマトリ生成物またはマン
ニトールリジン残基のような他の分子とも交差反応し得
るということである。
説明の都合上、還元した安定ヘモグロビン(アマトリ)
生成物はすべてクルジトールリジン残基と称し、これら
還元生成物と免疫反応するレセプター分子は“クルジト
ールリジン特異性”と称する。有用なレセプター分子は
またソルビトール、マンニトール、血漿および他のたん
白質の還元アマトリ生成物、並びにリジンまたはアルギ
ンのような遊離アミノ酸のような他の分子とも交差反応
し得る。しかしなから、これら他の分子は本発明におい
て使用する免疫反応混合物には存在せず、かくして、使
用できるレセプター分子のいかなる追加の交差反応性も
本発明においては関与しない。
クルジトールリジンーヘモグロビンと免疫反応しクルジ
トールリジン残基、即ち、グルシト−シリジン特異性レ
セプター分子を含まないヘモグロビンと免疫学的交差反
応性を殆んどあるいは全く示さない有用なレセプターを
調製する方法は当該技術において周知である。典型的に
は、これら方法は先ずクルジトールリジン残基を含有す
る免疫原を必要とする。
前述したように、一般にはたん白質および合成ポリペプ
チドをグリコキシ化する方法、特にこれら分子をグルコ
キシ化する方法は当該技術において周知である。さらに
、ニブシロンアミノ基に共有結合したグルコースを有す
るリジン残基を、クルジトールリジン残基に、水親和性
ほう化水素酸塩還先剤による還元によるようにして転化
する方法も当該技術において周知である。“カーチス等
、J、 Cl1n、 Invest、、72:1427
−28、(1983)”″を参照されたい。さらにまた
、たん白質およびポリペプチド免疫原を用いてレセプタ
ーを産生させる方法も当該技術において周知である。
例えば、前出のカーチス等はグルシトールリジン残基を
含む免疫原を用いてグルシト−シリジン特異性モノクロ
ーナル抗体(レセプター)を産生ずるハイブリドーマの
作製方法を開示している。この方法によって作製され、
クルシトールリジンーヘモグロビンと免疫反応するがグ
ルコヘモグロビンまたはヘモグロビンとは反応しないモ
ノクローナル抗体を分泌する2種類のハイブリドーマが
ロックビル(MD)のアメリカンタイプカルチャーコレ
クション(ATCC)に、1983年9月20日付のブ
タペスト条約に従って、次のATCC寄託番号によって
寄託されている: G6C91C87G11    HB8356G8H9
2A15G8    H88358グルシトールリジン
−ヘモグロビンと免疫反応するがクルシトールリジンを
含まないヘモグロビンと殆んど交差反応しない単特異性
抗血清も周知の免疫吸収法を用いて調製できる。例えば
、クルシトールリジンーヘモグロビンはセラミ等に付与
された米国特許第4.247,533号に記載された方
法の免疫原としてのHbAICに置き換えることができ
、その記載は参考として本用細占に引用する。クルシト
ールリジンーヘモグロビンに対する免疫特異性抗体はそ
の後単離することができる、即ち、単特異性抗血清は還
元していないヘモグロビンおよび/またはグルコヘモグ
ロビンを免疫吸収剤として用いて交差反応性抗体を吸収
し去ることによって調製できる。
調製方法をモニターする試験方法はクルシトールリジン
ーヘモグロビンをターゲット抗原として用いる。
(g)免疫反応混合物を、生物学的アッセイ条件下に、
レセプターが存在するクルシトールリジンーヘモグロビ
ンと免疫学的に結合し免疫反応物を形成するのに十分で
ある約10分〜約16=20時間、好ましくは約15分
〜約30分間のような所定時間保持する。
生物学的アッセイ条件はレセプターとアッセイすべきク
ルシトールリジンーヘモグロビンの活性を維持する条件
である。これらの条件には約り℃〜約45℃の温度範囲
、約5〜約9のpi値範囲、および蒸留水のイオン強度
から約1モル塩化ナトリウムのイオン強度で変化するイ
オン強度がある。そのような条件を最適化する方法は当
該技術において周知である。
(h)次に、免疫反応混合物中に形成された免疫反応物
の量を測定し、それによって試料中に存在する安定グル
コヘモグロビンの量を測定する。
形成した免疫反応物の量を直接また間接に測定するのは
当該技術で周知のアッセイ法によって実施し得る0例え
ば、米国特許第4.536.479号、第4.233,
401号、第4.233.402号および第3.996
.345号に記載されているようなホモジナスアッセイ
系を使用でき、これら米国特許の記載は参考として本明
細書に引用する。
好ましい実施態様においては、前述の工程(g)のレセ
プターは指示基または標識を含んでおり、この標識は免
疫反応物中の標識レセプターの存在を信号し得るもので
ある。標識レセプターの存在および量をアッセイする方
法は使用する標識に依存しており、そのような標識およ
びアッセイ法は当該技術において周知である。
レセプターのようなたん白質様特異的結合剤の標識化は
当該技術において周知である。例えば、ハイブリドーマ
により産生じたレセプターは組織培養培地中の成分とし
て調製されたラジオアイソトープ含有アミノ酸の代謝導
入によって標識化できる。例えば、“ガルフレ(Gal
fre)等、Meth、 Enz ano1.73.3
−46、(1981)″を参照されたい、活性化官能性
基を介してのたん白質接合またはカップリング技術は特
に適用可能である0例えば、“アラミス(^urame
as)等、5cand、 J、 Immunol、 V
ol、 an Su  1.7.7−23、(1978
)”および米国特許第4.493.795号を参照され
たい、これらの記載は参考として本明細書に引用する。
さらに、サイト直接カンプリング反応も標識が第2レセ
プタ−とそのターゲット抗原との免疫反応を実質的に干
渉しないようにして実施し得る。例えば、“07ドウエ
ル等、Biotech、 3.889−894(198
5)  ”を参照されたい。
標識化手段は抗原または抗体にこれら抗原または抗体を
変性させることなく化学的に結合して有用な免疫螢光体
トレーサーであるフルオロクロム(染料)を形成する螢
光標識剤であり得る。適当な螢光標識剤はフルオレセイ
ンイソシアネー)(FIC)、フルオレセインイソチオ
シアネート(F ITC) 、5−ジメチルアミン−1
−ナフタレンスルホニルクロライド、(DANSC)、
テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRIT
C)、リサミン、ローダミン8200スルホニルクロラ
イド(RB200SC)等のフルオロクロムである。免
疫螢光分析法の説明は、ジョンウィリーアンドサンズ社
発行、マルカロニス(Marchalonis)等編集
の「^ntibod  As Atoo l、1892
31頁のデル力(Deluca)により“Immuno
fluorescence Analysis ”にお
いて見い出され、その記載は参考として本明細書に引用
する。
好ましい実施態様においては、指示基はホースラディシ
二バーオキシダーゼ(HRPO)、グルコースオキシダ
ーゼまたはその他の酵素である。主たる指示基がHRP
Oまたはグルコースオキシダーゼのような酵素である場
合には、レセプター−抗原複合体く免疫反応物)が形成
した事実を可視的にする追加の試剤を必要とする。HR
PO用のそのような追加の試剤には過酸化水素(H20
g)およびジアミノベンジジンまたは0−フ二二レンジ
アミン(OPD)のような酸化染料先駆体がある。グル
コースオキシダーゼと使用できる追加の試剤は2.2’
−アジノージ−(3−エチル−ベンズチアゾリン−〇−
スルホン酸)(ABTS)である。
放射性元素もまた有用な標識剤であり、本発明において
使用できる。例示的な放射性標識剤はガンマ−線を発生
する放射性元素である。それ自身でガンマ−線を発生す
る124■、+25 (,1z・1113I11I32
Iおよび”Cr(7)ような元素は1群のガンマ−線発
射放射性元素指示基を代表している。特に好ましいのは
l!s■である。
有用な標識手段のもう1つの群はそれ自体ポジトロンを
発出する”C% ”F% ISOおよび”Nのような元
素である。か(して発出したポジトロンはアッセイ混合
物中に存在する電子と出会ったときガンマ−線を発生す
る。また、III 1nまたは3Hのようなベータ線エ
ミッターも有用である。
指示手段は本発明で有用なレセプター分子に直接結合で
きるかあるいは別個の分子からなり得る。指示手段はヤ
ギまたはウサギ抗マウス抗体のような有用なレセプター
分子に結合する抗体のような別個の分子であり得るeス
えヱ土旦コツカスアウレウス(Sta h 1ococ
cus aureus)プロティンAもまた本発明の全
体または実質的に全体レセプター分子を使用するとき、
即ち、プロティンAと結合するセレプター分子のFc領
域の部位を含む分子を使用するときの別個の分子指示体
即ち標識剤として使用できる。そのような使用において
は、プロティンA自体が放射性元素またはフルオロクロ
ム染料のような標識を含む。
特に好ましい実施においては、上述のアッセイは、クル
シトールリジン含有抗原を固相マトリックスに結合ある
いは固定して固相支持体を形成することからなるヘテロ
ジナス固相アッセイとして実施する。抗原は任意の周知
の化学または物理的手段によって固相マトリックスに結
合あるいは固定できる。吸着または免疫反応によるよう
な結合は固定の唯一の手段ではないけれども、“結合”
、“固定”またはその種々の表現上の変形は本明細書に
おいて相互変化的に使用する。
抗原の固相マトリックスとして使用されるマイクロタイ
タープレートウェル壁の吸着による物理的結合は後で例
示する。化学結合には、ヘモグロビンエピトープに結合
する第1抗体による結合があり、これは結合したとき、
グルシト−ルリジンエピトーブとレセプター分子との免
疫学的結合を実質的に干渉しないものである。
このアッセイ法は通常“サンドウィッチ”アッセイと称
されている。もう1つの化学結合手段は1−エチル−3
−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドハイ
ドロクロライドのような水溶性カルボジイミド試剤を用
いてマトリックスのカルボン酸とレセプターのアミノ基
またはヒドロキシ基との間(またはその逆)で、それぞ
れ、アミドまたはエステルを形成することである。さら
に別の化学的結合手段はグルタルアルデヒドまたは塩化
シアヌルのような多価反応剤を用いるもので、これも周
知のことである。
上記方法で使用できる固形マトリックスの例は当該技術
において周知であり、ファルコンマイクロテスト■フレ
キシブルアッセイプレート(ファルコンプラスチックス
、オックスナード、(A)の名称で市販されている96
ウエルマイクロタイタープレートのような固形マトリッ
クス、またはイムロン■及び■(グイナテック、アレキ
サンドリア、VA)の名称で市販されているマイクロタ
イターストリップのような1列に12ケのウェルを有す
るマイクロタイターストリップがある。マイクロタイタ
ーストリップまたはプレートは透明プラスチック材料、
好ましくはポリ塩化ビニルまたはポリスチレンから作製
される。本発明の上述の方法で使用するための別の固形
マトリックスにはアボットラボラトリーズ社(ノースジ
カゴ、IL)より入手できる約1ミフロン〜約511+
1直径のポリスチレンビーズ、任意の適当なサイズのポ
リスチレンチューブ、スティックまたはパドル(棒状物
);およびポリスチレン粒子が約1ミクロンの大きさを
有しラテックスの他の成分から遠心的に分離し得るポリ
スチレンラテックスがある。
固形マトリックスはまたピスカタウェイ、NJのファル
マシアファインケミカルズ社より入手できる架橋デキス
トラン例えばシェファデックスG−25、−50、−1
00、−200等;および同じくファルマシアファイン
ケミカルズ社より入手できるアガロースおよび架橋アガ
ロース、例えば、シェファローズ6BSCL6B、4B
、CL46等のような種々の材料からも作製し得る。
上述のアッセイ方法は、必要なとき、ヘモグロビン材料
中に存在する任意の特定のグリシドールリジン−ヘモグ
ロビン種の量を、所望のグリシドールリジン種に特異的
なレセプターを用いることによって測定するのに用いる
ことができる。
D0葉lu1泉 本発明の別の局面は典型的にはキット形状であり前述の
アッセイ方法を実施するのに有用な診断薬系である。こ
の系は複数のパッケージ(包装単位)を含む。
第1のパッケージは上述したような固相マトリックスを
含む、このマトリックスは好ましくは複数のウェル例え
ば96または12ケのウェルを含むプラスチックマイク
ロタイタープレートまたはストリップであり、そのウェ
ル表面上で、前述のアッセイ法を実施する。
第2のパッケージは所定量の水親和性ほう化水素酸還元
剤を含む。この試剤は典型的には乾燥粉末として供給す
る。
第3のパッケージは公知量の適当なグリシドールリジン
特異性レセプター分子、好ましくはATCC寄託番号H
B8356およびHB8358を有するハイブリドーマ
より分泌されたもののようなグルシトールリジン特異性
レセプターを含んでいる。これらのレセプター分子は典
型的には水性組成物としであるいは凍結乾燥粉末として
存在する。好ましい実施態様に右いては、レセプターは
前述したような指示基または標識に結合させて供給する
第4のパッケージは所定量のフタル酸またはビフタル酸
を含む。この酸も水性媒体中に溶解しであるいは乾燥固
形分として供給できる。
好ましい実施態様はまた調製したレセプターと免疫反応
するグリシトールリジン二ヘモグロビン種を含む追加の
パッケージも含む。あるいは、好ましいのは、パッケー
ジが標準またはコントロールとして使用すべき公知割合
のクルシトールリジンを有するクルシトールリジンーヘ
モグロビンを含むことである。診断薬系においてさらに
含み得るパッケージには、PBSのようなバッファー塩
または溶液を含むもの、標識プロティンAまたは標識抗
レセプター抗体のような別途にパッケージした指示手段
、別途にパッケージした過酸化水素および酸化性染料先
駆体のような酵素指示手段用の可視化用試剤、追加のコ
ントロール等がある。
理解すべきことは診断薬系に含まれる各パッケージが適
当なコントロールを含む1つのアッセイを実施するのに
十分な量の内容物を含んでいるということである。好ま
しいのは、複数のアッセイを実施するのに十分な量が各
パッケージに含まれていることである。
日の ましい  誼 以下の実施例は例示を目的とするものであり、本発明を
限定するものではない。
実施例1 ヘモグロビン試料: ヘモグロビン試料を年令18〜88才の範囲の男性と女
性の両方を含む118人の糖尿病患者から採取した。試
料は年令24〜52才の男性および女性を含む35人の
正常成人〈血糖正常)からも採取した。これら試料はカ
ルホルニア州うジョラのエンドクリノロジーアンドジア
ベークスクリニックスオブスクリップスクリニックアン
トリサーチファンデーションおよびカルホルニア州すン
°ジェゴのカイザーパーマネントから採用した。
血液サンプルを抗凝集剤としてのエチレンジアミンテト
ラ酢酸(EDTA)を含むチューブに集め、ベツクマン
マイクロフニージ12中で約12.000〜13.00
0xgで3分間遠心処理してバック詰赤血球(RBC)
ペレットと血漿画分を調製した。血漿画分は廃棄しアッ
セイすべきヘモグロビン試料を典型的には10〜15マ
イクロリツターのペレット(パック詰RBC)として調
製した。
バック詰RBCペレットのマイクロリッター当すノヘモ
グロビンのmg数を測定するため、1容量のペレットを
1容量または3容量のアイソトン■(Isoton m
、コールタ−エレクトリック社、ヒーリー、FL)と混
合し、それぞれ1:2および1:4ペレツト希釈物を調
製した。各ペレット希釈物をヘモグロビン濃度について
モデルS−プラスVlコールターカウンター(コールタ
−エレクトリック社)を用い製造者の仕様書に従って分
析した。要するに、希釈物中に存在するヘモグロビンを
ドラプキン試薬(Drabkin’s reagen、
t)を用いてシアンメトヘモグロビンに転化し、存在す
る量を540ノナメーター(nm)での吸収により分光
測光的に測定した。
パック詰RBCペレットのマイクロリッター(μm)当
りのヘモグロビン(Hb)のミリグラム(w+g)の平
均数は0.294+gHb/μlであることが判った。
しかしなから、計算をしやすくするために、この値は公
知容量のパック詰赤血球ペレフトとして調製したヘモグ
ロビン試料に基づくすべての比率決定のために0.3+
wgHb/μlに丸めた。
ヘモグロビン試料を公知容量の全血液として調製したと
きは、存在するヘモグロビンの量は男性から採取した試
料については155mgHg/valおよび女性血液試
料については135+++gHb/lalの平均値を用
いて決定した。
実施例2 レセプターの富−11および、@ ヒ ATCC寄託番号HB8356を有するハイブリドーマ
は“カーチス等、J、 Cl1n、 InvesL、 
72 :1427−28 (1983)”″に記載され
ているようにモノクローナル抗体G6C9を産生する。
G6C9レセプター分子を含む腹水腫腸液はlO週令の
Ba1b/cマウスから取得し、これらマウスは各々0
.3 m lの鉱油で感作し3−50X10’HB83
56細胞で腹空内注射したものであった。
腹水の発育平均時間は12日であった。15. OOO
xgでの4℃、1時間の遠心による清澄化の後、腹水腫
腹液をプールし一20℃で凍結保存した。
G6C9レセプターは腹水腫瘍液をファルマシアPFL
Cシステム中のファルマシアモノQHR515アニオン
交換カラムでlQmM)リス、pH8,0中の0−0.
5勾配を用いて急速たん白質液体クロマトグラフィーに
付しカラムに供給された流れを追跡することによって精
製した。
精製G6C9レセプター分子は“ナカネ等、J、 tl
istochem、Cytochen+0.22: l
 Q 34−1089 (1974)”に記載された方
法を用いてホースラデッシ二パーオヰシダーゼに結合さ
せた。これらのレセプターは以後HRP 0−G6C9
レセプターと称する。
実施例3 グルコシル化付加物の調製 次のたん白質と先駆体をグリコジル化および/または還
元せしめた:ポリーL−リジン、ポリーL−バリン(シ
グマケミカル社、セントルイス、MO)、アルファーT
−Boc−リジン(バケム社、トランス、CA)、精製
ヒトヘモグロビン(シグマ社)、および“シュワルツ等
、Arch、 Biochem。
■肚社虹、181:542−549 (1977)  
″により記載された方法により調製したクルシトールリ
ジン。
グルコシル化し還元した付加物はglc −RE Dア
ダクトと称する。glc−REDアダクトは上記各種た
ん白質と先駆体の15ミリグラム/ミリリツター(mg
/m p )溶液、2+nJをりん酸緩衝塩水(P B
 S)中240mMグルコース(シグマ社)、2+lI
lおよびPBS (pH7,4)中37.5mg/n+
INaCNBHs (J 、 T 、ベーカーケミカル
社、フィリップパーグ、NJ) 、2+*lと混合する
ことによって調製した。得られた混合物を密閉ガラスチ
ューブ(16X100m)中で120時間、37℃に保
持した。アダクトを透析バッグ(スペクトラフォール社
、分子遮断3.500mw)に移し、PBSに対し72
時間、4℃で完全に透析し、最終温度約5n+g/mJ
に調整し、4℃で貯蔵した。
グルコシル化は行ったが還元してないアダクトコントロ
ール(glc−NR)を上記の手順においてNaCNB
Hiを211IlのPBSに置き換えて調製した。グル
コシル化なしの還元コントロール(RED−アダクト)
は上記手順において240mMグルコースを2tal 
P B Sに置き換えて調製した。
実施例4 sIllによる  寺  のゝ 実施例3で調製したglc −RE D、 glc −
N RおよびRED−アダクトを10%の正常ヤギ血清
(NGS)含有PBS中で200μg /va 1〜0
.39μg/mzで変化する濃度に希釈した。
500μlの各種希釈物を実施例2で調製したHRPO
−06C9レセプター500μlとガラスチューブ内で
混合しく10%NGS含有PBS中での希釈1:150
)、拮抗免疫反応混合物を調製した。混合物を1時間、
37℃で保持して上記レセプターを任意のクルシトール
リジン残基含有またはクルシトールリジン不含有で交差
反応性のエピトープと免疫学的に結合せしめ液相免疫反
応体を形成させた。
次に、上記の保持した拮抗免疫反応混合物を結合してな
いHRPO−G6C9レセプターの量についてアッセイ
した。このアッセイは固相−固定クルシトールリジンー
ヘモグロビンをターゲットまたは捕獲用抗原として用い
EL I SA中で行った。
固相−固定クルシトールリジンーヘモグロビンは糖尿病
患者の血液を用いて実施例1の手順に従って調製したパ
ック詰RBCペレット、0.240IIlを0.05m
Mフタル酸含有蒸留水、15mfと混合(1:62.5
容量希釈)することによって調製した。得られた酸反応
混合物を15分間、37℃に保持し溶血液を調製した。
続いて、50μlの溶血液を50μlの400mM N
aBHnとマイクロタイタープレートウェル(固形マト
リックス)中で混合した。得られた還元反応混合物を1
5分間、37℃に保持してクルシトールリジンーへモダ
6ビンを形成せしめた。
このクルシトールリジンーヘモグロビンは、上記保持時
間の終了までに、固相マトリックスに固定して固相−固
定クルシトールリジンーへモグロビン(固形支持体)お
よび未反応ほう化水素酸塩と還元反応混合物の残余とを
含む液相とを形成した。
得られた混合物の固相および液相とを分離した。
次いで、固形マトリックスのウェル壁に固定した吸着ク
ルシトールリジンーヘモグロビンによって形成された固
形支持体を0.05%トウィーン20〔ポリオキシエチ
レン(20)ソルビタンモノオレート〕含有PBS、3
50#fで4回洗浄して単離した固相−固定クルシトー
ルリジンーヘモグロビンを調製した。
上記保持したHRPO−G6C9/アゲスト拮抗免疫反
応混合物の100μ!容量を固相−固定クルシトールリ
ジンーヘモグロビンと混合した。
かくして得られた第2の液/固相免疫反応混合物を15
分間、37℃に保持してアダクトインヒビターまたはコ
ントロールと免疫反応していない抗体分子を固相クルシ
トールリジンーヘモグロビンと免疫学的に結合せしめ固
相−固定免疫反応体を形成させた。
固相および液相を再び分離し、形成した固相−固定免疫
反応体をさらに液相からデカンティションにより分離し
、各ウェルを洗浄液(0,05)ウィーン20含有PB
S)で4回洗浄した。形成した固相−固定免疫反応体の
量をウェルに100μlの新しく調製したHRPO基質
溶液〔蒸留水中の0.0125%Ht Otおよび0.
67mg/mj!。
−フェニレンジアミン(opp))を混合することによ
って測定した。室温(約20〜約25℃)、5分間で発
色させた0次いで、基質転化(発色)反応を各ウェルに
50μlの4 N uzso4を加えることによって停
止させた。溶液の光学密度(0,D、)を490nmの
波長でダイナチックMR600(ダイナチック社、アレ
キサンドリア、VA)マイクロタイタープレートリーダ
ーを用いて測定した。この試験の結果は第2A、Bおよ
び0図に示している。これらの結果は還元したがグルコ
シル化してないアダクト(第2A図)およびグルコシル
化しているが還元していないアダクト(第2図)はHR
PO−G6C9が固相−固定クルシトールリジンーヘモ
グロビンに結合するのを抑制してなかったことを示して
いる。しかしなから、第2C図に示しているように、グ
ルコシル化し還元したリジン含有たん白質および先駆体
、即ち、クルシトールリジンはHRPO−G6C9と固
相−固定クルシトールリジンーヘモグロビンの極めて効
果的なインヒビターであったが、グルコシル化し還元し
たポリーL−バリンは有効でなかった。面相免疫反応体
の形成を抑制するアダクトに共通する構造上の特徴はク
ルシトールリジン残基の存在であるので、この試験の結
果はG6C9レセプターがクルシトールリジン含有エピ
トープと、該エピトープを面相−固定クルシトールリジ
ンーヘモグロビンとして存在させたとき、免疫反応する
ことを示している。
実施例5 還元最適化 a、水親和性還元剤 前述したように、クルシトールリジンはリジンのニブシ
ロンアミノ基に共有結合した還元ヘキソースアルコール
形である。次の試験は種々の水親和性ほう化水素酸塩還
元剤をその種々の条件下でヘモグロビン上にクルシトー
ルリジン残基を形成させる能力について試験するために
行った。
ヘモグロビン試料は正常人および糖尿病患者からの血液
を用い実施例1に記載したようにして調製した10μl
のパック詰RBCペレット(約3mgのヘモグロビン)
として調製した。各試料中のグルコシル化ヘモグロビン
のパーセントを市販のGLY−AFFIN  GHbア
ッセイシステム(Isolab社、アクロン、OH)を
用いて測定して正常試料において6.3%、糖尿病試料
において8.9%であることが判った。即ち、糖尿病試
料中のグルコシル化ヘモグロビンは正常人試料に較べ約
1.4倍であった。試料を、各々、615μlの蒸留水
が0.05Mフタル酸と混合した。これにより、約4.
8+g/■lの濃度でヘモグロビンを含む混合物が生じ
、酸を用いた場合には、ヘモグロビンのミリグラム当り
少なくとも約lOマイクロモルの酸の比率が生じた。
得られた混合物を15分間、37℃に保持した。
この間に、各混合物中に存在する実質的にすべてのRB
Cが溶解し、それによって混合物中に含まれるヘモグロ
ビンを溶液中に分離し溶血液を形成した。
続いて、50μlの各溶血液(約0.24μlgのヘモ
グロビン)をマイクロタイタープレートウェル中で50
μlの種々の濃度のNaBII4またはKB)+4と混
合して還元反応混合物を調製した。これらの混合物を1
5分間、37℃に保持した。この間に、そのニブシロン
アミノ基に共有結合したグルコースを有するヘモグロビ
ンリジン残基が還元されてクルシトールリジン残基を形
成した。さらに、2形成したクルシトールリジンーヘモ
グロビンを吸着によりマイクロタイタープレートウェル
の壁に固定させた、即ち、面相結合クルシトールリジン
ーヘモグロビンを形成させた。
固相−および液相をデカンティシランにより分離した。
各ウェルを洗浄溶液で4回洗浄して固相−固定(マイク
ロタイタープレートウェル結合)クルシトールリジンー
ヘモグロビンから未°反応ほう化水素酸塩をさらに除去
した。
次いで、各ウェルに、100μlの実施例2で得たホー
スラディツシュパーオキシダーゼ標識G6C9(HRP
O−06C9) レセプターを混合して免疫反応混合物
を調製した。この混合物を15分間、37℃に保持し、
それによって標識レセプターを存在する固相−固定(マ
イクロタイター7”レートウェル結合)クルシトールリ
ジンーヘモグロビンと免疫学的に反応させ固相−固定(
マイクロタイクープレートウェル結合)免疫反応体を形
成させた。未免疫反応(未結合)HRPO−G6C9を
ウェルからデカンティションにより除去し次いで洗浄溶
液で5回洗浄した。次いで、形成した固相−結合免疫反
応体を実施例4に記載したようにして測定した。
この試験の結果は第3AおよびB図に示しており、いく
つかの興味ある現象を示している。第1は、第3Aおよ
びB図から明らかなように、水親和性ほう化水素酸塩還
元剤としてほう化水素酸ナトリウムまたカリウムのいず
れも用いても得られた結果に実質的差異はなかったこと
である。
第2は、第3A図から、酸の不存在下での還元(クルシ
トールリジン形成)が、予期されたように、グルコヘモ
グロビンを多量に含む試料、即ち、糖尿病試料中ではよ
り多くの数のレセプター結合りルシトールリジン残基含
有エピトープを産生ずることを示していることである。
しかしなから、これらの結果を還元を酸の存在下で行っ
たときの結果(第3B図)と比較した場合ミより多数の
レセプター結合りルシトールリジン残基途、フタル酸不
存在下で生じた数に比較し、両方のヘモグロビン試料に
おいて生じている。しかも、還元をフタル酸の不存在下
で行った場合(第3A図)に比較し、還元をフタル酸の
存在下で行った場合(第3B図)において正常試料と糖
尿病試料間のレセプター結合りルシトールリジン残基の
数に大きい差がある。これら2つの知見はフタル酸の存
在が水親和性ほう化水素酸塩還元剤のクルシトールリジ
ン残基含有エピトープの産生じかつ赤血球を溶解し不安
定グルコヘモグロビンを除去する能力を予想外に増強し
ていることを示している。
最後に、第3A図の結果を第3B図の結果と比較した場
合、ヘモグロビン試料をフタル酸とヘモグロビンのミリ
グラム当り少なくとも約10μMの酸の比較で混合した
ときは、還元反応はヘモグロビンをほう化水素酸塩とm
gヘモグロビン当り少なくとも約2.6μMのほう化水
素酸塩程の低い比率で混合したときでさえも増強されて
いることが理解できる。
上記の知見は従来技術の教示と相反するものであり、従
って、予想外であった。前述したように、従来技術はR
BCから得られたヘモグロビン試料中のグルコヘモグロ
ビンの総量は不安定および安定グルコヘモグロビン画分
の和であると教示している。′ビッセ(Bisse)等
、Diabetess 31 :630−633 (1
982) ”によれば、不安定画分はヘモグロビン試料
からビフタル酸による処理によって除去される、即ち、
アッセイ可能なグルコヘモグロビンの量はビフタル酸処
理試料においては減少する。従って、従来技術は、試料
中のグルコヘモグロビンの量を測定するアッセイにおい
ては、その除去した不安定画分を有す諷試料によって生
じた信号は匹敵する除去してない試料によって生じた信
号よりも小であるべきである。
b・ ”5− 心m  −持ll  ヨ酸反応混合物を
1人の糖尿病女性患者および1人の正常人女性の各々か
らの全血液試料として調製した。各混合物中のフタル酸
濃度は一定の0.05Mであった。しかしなから、ヘモ
グロビン濃度は27.0mg/nj!〜0.27μg/
mllに変化し、それによって1.85〜185.2の
範囲のmM酸ZI1gHb比を生じた。酸反応混合物は
すべて15分間、37℃に保持して溶血液を調製した。
次に、還元反応混合物を、50μlの各溶血液と50μ
lのNaBH4を混合することにより2通り調製し、そ
れによって0.0148=’1.481の範囲のmMほ
う化水素酸塩/mgHb比を生じた。還元反応混合物の
1つのセントを15分間、他のセットを30分間、それ
ぞれ、37℃に保持した。
各試料は、その後、未反応ほう化水素酸塩および残余の
還元反応混合物成分から分離し、洗浄し、実施例4に記
載したようにしてクルシトールリジンーヘモグロビンに
ついてアッセイした。
第4図から明らかなように、この試験の結果は15分ま
たは30分間の還元反応保持時間が試験したすべてのヘ
モグロビン濃度において糖尿病および正常試料中で測定
可能な量のクルシトールリジンーヘモグロビンを産生し
ていることを示している。また、アッセイ可能なクルシ
トールリジン産生の最適比は、ヘモグロビンがそれぞれ
の反応において1.0・8mg/m1と0.54mg/
mj!の濃度で存在するとき、酸反応混合物において4
6.3 mM酸/mgHbであり還元反応混合物におい
て0.37mMほう化水素酸塩/a+gHbであること
が判明したことにも注目すべきである。
実施例6 不安定グルコヘモグロビンのグルコースとヘモグロビン
への分解は約5のpi値を有する溶液中で酸触媒される
ことが報告されている。ビッセ等、Diabetes、
 31 : 630−633 (1982)不安定グル
コヘモグロビンの報告されたpH依存安定性が使用する
酸の種類によって影響されるかどう、かを測定するため
に、フタル酸、クエン酸、酢酸、りん酸塩、D lO)
 グルコサミン、アルファーケトグルグル酸、オキサロ
酸、シュー酸二カリウム酸、コハク酸またはピルビン酸
を含む溶液を0.05 Mの濃度および4〜5の範囲の
pi値で調製した。
10μlのパック詰RBCペレットとして調製したヘモ
グロビン試料を糖尿°病および正常人から得た血液から
実施例1に記載したようにして調製した。?!!尿病試
料および正常人試料を、各々、615μlの上記各酸溶
液と混合して酸反応混合物をまな615μlの蒸留水と
混合してコントロールを調製した。
さらに、バック詰RBCペレットを等張塩水中で一夜(
約18時間)インキュベートした糖尿病および正常人か
らのRBCから調製した。これらペレットの各々からの
10μlを615μlの0.057タル酸または蒸留水
とコントロールとして混合した。
かくして調製した酸反応溶液およびコントロールを37
℃、15分間保持して溶血液を調製した。
次いで、グルシトール−ヘモグロビンを形成し、実施例
4で記載したようにして各溶血液の50pgのアリコー
ト、NaBH,およびHRPO−G6C9を用いてアッ
セイした。
この試験の結果は第5図に示しである。これらの結果は
グルコヘモグロビンをほう化水素酸塩による還元前にフ
タル酸と反応させると他の試験した酸に比しクルシトー
ルリジン残基の形成を著しく増強することを示している
b−敢I度 クルシトールリジンーへモグロビン産生およびアッセイ
性能へのpH4〜5範囲内でのフタル酸濃度の効果を試
験するために、フタル酸濃度0.05Mまたは0.02
5Mを有する酸反応混合物を、ヘモグロビン濃度75.
50.37.5.30.25、または21.4sgHb
/・lを有するようC5l製した、即ち、0.05 M
フタル酸を含む混合物には0.66〜約2.34のmM
フタル酸/ll1gヘモグロビンの範囲の比が存在した
。同様に、0.025Mフタル酸混合物中には、比の範
囲は0.33〜1.17であった。ヘモグロビンは実施
例1で記載したようにして1人の糖尿病患者の血液から
調製した所定容量のパック詰RBCペレットとして調製
した。
得られた酸反応混合物を15分間、37℃に保持して溶
血液を調製した。次いで、クルシトールリジンーへモグ
ロビシを形成し、実施例4で記載したようにして50μ
lの各溶血液、NaBIIaおよびHRPO−G6C9
レセプターを用いてアッセイした。
第6図はこの試験の結果を示す。これらの結果は0.0
5Mおよび0.025Mフタル酸反応混合物は、共に、
mM酸/mgヘモグロビンの比が約1.00約2.34
の間にあるとき、標識レセプターが結合したクルシトー
ルリジン残基含有エピトープの形成を増強していたこと
を示している。
さらに、第6図に示された結果はフタル酸単独による反
応はアッセイ可能なクルシトールリジンを産生しないこ
とを示している。
C0敢ル位 p11値3.5.4.5.5.5および6.5を有する
0、05Mフタル酸含有ストック溶液を調製した。次い
で、4種の酸反応混合物を各ストック溶液を用いて調製
した。2つの糖尿病試料と2つの正常試料の各々を用い
て実施例1におけるようにして得た10μlのパック詰
RBCペレットとして調製したヘモグロビン試料を各ス
トック溶液の615μlと混合した。得られた酸反応混
合物を15分間、37℃に保持して溶血液を調製した。
次いで、クルシトールリジンーヘモグロビンを調製し、
実施例4で記載したようにして50μlの各溶血液、N
aB)I4およびHRPO−G6C9レセプターを用い
てアッセイした。
第7図はこの試料の結果を示し、最大数の免疫学的に結
合可能なクルシトールリジン残基が約3.5のpo値を
有するフタル酸を用いて調製した溶血液で行ったアッセ
イにおいて産生されていたことを示している。しかしな
から、正常試料と糖尿病試料との間の信号(光学密度)
の最大の差を生ずるpH値は4.5であった。さらにま
た、pH値5.5および6.5を有するフタル酸溶液の
使用も測定可能な量のクルシトールリジン残基を産生じ
ていた。
0.05M水性フタル酸のpi値の変化性を試験するた
めに、4ケの0.05M溶液を調製し、その調整してな
いpH値をアルテックスモデル3500デジタルpHメ
ーター(ベックマンインスツルメンツ社、バークレイ、
CA)をカロメルマイクロプローブ電極(ファイザーサ
イエンティフィック社、ピッツバーグ、PA)と組合せ
て用いて測定した。
4つの調整してない溶液のpH値は4.13〜4.5の
範囲であり平均約4.3を有していた。
d、   ・rA  −日 本発明のアッセイ方法の酸反応工程の1つの目的は、安
定画分を維持しなから不安定グルコヘモグロビン画分を
除去すること(不安定グルコヘモグロビンをヘモグロビ
ンとグルコースに分解スルこと)である。従゛って、酸
反応混合物保持時間を変化させた効果を試験した。
4セツトの酸反応混合物を試験した。各セットは2人の
糖尿病患者および2人の正常人女性の血液試料の各々か
らのヘモグロビン試料を0.05 Mのフタル酸と実施
例6Cで記載したようにして混合することによって調製
した4種の混合物を含んでいた0次いで、酸反応混合物
セットの1つを直ちにNaBIl、と混合し、さらに実
施例4で記載したようにして処理しアッセイした。残り
の3つのセントは、実施例4におけるようなNaBHn
と混合する前に5.10または15分間保持した。
この試験の結果は、第8図から明らかなように、酸反応
混合物保持時間の増大は糖尿病試料!lhlでは少量の
アッセイ可能なクルシトールリジンの形成をもたらして
いることを示しており、かくしてこの試料は最初実質的
の不安定グルコヘモグロビンを含んでいたことを示して
いる。15分間の保持時間は、また、1分以下の保持時
間に比較したとき、糖尿病試料嵐2および正常試料隘1
において少ないアッセイ可能なクルシトールリジンを産
生していた。これらの結果は約5分程の短い酸反応混合
物保持時間がヘモグロビン試料中の不安定グルコヘモグ
ロビン画分の除去をもたらしていることを示している。
実施例7 ヱヱ土工温度 ヘモプロビン98度約27μg/mβ〜1.35μg/
Illを有する溶血液を糖尿病および正常女性からの血
液を用いて実施例5bに従って調製した。次いで、各溶
血液を還元し、30分間の還元および抗体反応用の保持
時間を用い実施例4で記載したようにして室温(約20
〜25℃)または37℃でアッセイした。
第9図は検出したクルシトールリジンーヘモクロビンの
量が還元および免疫反応混合物を37℃に保持したとき
わずかに大であったが、37℃の結果と室温で得た結果
との間に実質的な差はなかったことを示している。
実施例8 旦旦土旦へ評負 前述したようなフタル酸およびほう化水素酸塩を用いて
グルコヘモグロビンのアッセイ可能なクルシトールリジ
ン残基の形成を最適化する方法は任意のイムノアッセイ
方式に適用可能であるけれども、該方法を用いるELI
SAの性能特性を詳細に評価して以下に述べるような臨
床使用を決定した。評価した特定のELISAは次の如
くして実施した。
種々の正常人および糖尿病患者からの血液を用いて実施
例1で記載したように調製した10μlのパック詰RB
Cベレントを615μlの0.05Mビフタル酸カリウ
ムと混合した。
かくして調製した酸反応混合物を15分間、37℃に保
持して、溶血液を調製した。続いて、50μlの溶血液
を3NUNCイノム■マイクロタイタープレートウエル
(平底ポリスチレンプレート、ギブコラポラトリー社、
ローレンス、MA)の各々にピペット注入した。50μ
l容量の400mM NaBflaを各溶血液試料に混
合して還元反応混合物を調製した。得られた還元反応混
合物を15分間、37℃に保持してマイクロタイタープ
レートウェルに結合したクルシトールリジンーヘモグロ
ビンを生成させた。マイクロタイタープレートウェル結
合クルシトールリジンーヘモグロビンを、過剰のほう化
水素酸塩から、デカンティションし、ウェルを0.05
%トウィーン20含有PBSの0.35IIIffiで
4回洗浄することによって分離した。
次に、ウェル結合クルシトールリジンーヘモグロビンの
量を、各ウェルにlθ%正常ヤギ血清含有PBS中で1
:300希釈した実施例2のIIRPO−G6C9,0
,100+wffiを混合し液/固相免疫反応混合物を
形成させることによって測定した。
免疫反応混合物を15分間、37℃に保持した。
固相および液相を分離し、各ウェルを0.05%トウィ
ーン20含有PBS (pH7,4) 、0.35+w
jlで5回洗浄して、未結合レセプターを固相固定免疫
反応体から分離した。固相固定免疫反応体として存在す
るHRPO−G6C9レセプターを実施例4に記載した
ようなopb基質溶液を用いて検出した。
実施例3で調製したGlc−REDHbアダクトをEL
 I SA用の内部標準(カリブレーター)として用い
た。標準溶液は、10%正常ヤギ血清含有0.1 M重
炭酸ナトリウムバッファー(pH9,0)中に希釈した
Gj!c −REDヘモグロビンHb濃度範囲380μ
g /ya It〜8μg / m 1のものとして調
製した。標準曲線を作製するために、上記のEL I 
SAを上記溶血液に代えて50μlの各標準溶液を用い
て実施した。
a、LJl 回復試験を、ELISAが正常人からの溶血液に加えら
れた糖尿病赤血球溶血液から種々の量のグルコヘモグロ
ビンを正確に測定できるかどうかを調べるために行った
。これは糖尿病者からの溶血液の種々の増大割合の添加
(スパイク)を含んだ正常人からの溶血液を調製するこ
とによって行った。
正常人の溶血液に加えた糖尿病グルコヘモグロビンの量
の回復は上述のELISAを用いて測定した。第10図
に示すように、得られた結果はアッセイしたパーセント
添加(スパイク)の範囲に亘って直線関係を示し、かく
して試料中に存在したグルコヘモグロビンの量とELI
SAによって測定したクルシトールリジンーヘモグロビ
ンの量との間の付加的関係を示している。
b、ELIsA結果の再現性 ELISAの再現性をイントラ−アッセイ(intra
−assay) およびインターアッセイ (inte
r−assay)試験によって調べた。
イントラアッセイ測定では、3人の異なる人のヘモグロ
ビン試料を60回、おのおのアッセイした。各個人で得
られた値の変化係数は166%〜6.4%の範囲であっ
た。
インターアッセイ測定では、3人の異なる人かラノヘモ
グロビンを12の種々の場合についてアッセイした。イ
ンターアッセイ再現性は8.3%〜10、4%であった
本発明を好ましい実施態様について説明して来た。述べ
て来た要旨の修正または変更は本発明の範囲内において
なし得ることは当業者にとって明白であろう。
【図面の簡単な説明】
第1図は不安定および安定グルコヘモグロビンを形成す
るための図中で“プロティン”として表示したヘモグロ
ビンのアルファ (アミノ末端バリン)およびニブシロ
ン(リジン)遊離アミンの非酵素グリコジル化、および
その後のクルシトール置換最終生成物を形成するための
中間体の還元の反応順序を示す略図である。 第2図はホースラディツシュ(西洋わさび)パーオキシ
ダーゼ標識06C9レセプター(IIRPO−G6C9
)をG6C9抗体結合サイト用の各種濃度の潜在拮抗剤
と混合することによって行った拮抗抑制試験結果を示す
3つのグラフを示す。各グラフめ横座標は使用した抑制
剤(インヒビター)溶液のマイクログラム/ミリリッタ
ー(μg/ml1)の濃度を示す。各グラフの縦座標は
最高結合画分、即ち、残存したあるいは種々の潜在抑制
剤と反応したのにちに達成した、拮抗抑制剤の不存在下
でのHRPO−G6C9により達成した結合量を示す。 第2A図はクルシトールリジン(ム);還元ポリ−L−
リジン(ロ);還元アルファーT−BocIJジン(・
);還元非グルコシル化ヘモグロビン(Δ) ;および
還元ポIJ −L−バリン(■)を潜在拮抗剤として使
用して得た結果を示す。これらの結果はこれらのグルー
プのうちポジチブコントローノヘクルシトールリジンの
みがHRPO−G6C9レセプターの結合を抑制し、従
って、グルコース不存在下の還元だけではHRPO−G
6C9により認識されるエピトープを産生じないことを
示している。 第2B図はクルシトールリジン(ム);グルコシル化ポ
リ−L−リジン(ロ);グルコシル化アルファーT−B
oc−リジン(・);グルコシル化ヘモグロビン(Δ)
;およびグルコシル化ポリ−L−バリン(■)を潜在拮
抗剤として用いて得た結果を示す。これらの結果はポジ
ティブコントロールのクルシトールリジンのみが結合を
抑制したことを示している。即ち、グルコシル化のみで
はHR,PO−G6C91こよって君忍識されるエピト
ープを産生じない。 第2C図はポリーL−リジン(ロ);アルファーT−B
oc−リジン(・);ヘモグロビン(Δ)およびポリ−
ムーバリン(■)をグルコシル化し、次いで還元したの
ちに得られた結果を示す。これらの結果はポリーL−リ
ジンとヘモグロビンをグルコシル化し還元したときはこ
れらは共にポジティブコントールのクルシトールリジン
と同様にHRPO−G6d9抗体結合サイトと拮抗し得
ることを示している。グルコシル化し還元したポリ−ム
ーバリンのみが有意に拮抗してなく、即ち、HRPO−
06C9レセプターはヘモグロビンのN−末端グルコシ
ル化バリンと免疫反応しないことを示している。 第3図はヘモグロビン試料中のクルシトールリジン形成
をフタル酸の存在下の還元により行ったときに得た予期
しなかった結果を示す2つのグラフを示す。 第3A図においては、グルコヘモグロビン含有ヘモグロ
ビン試料は糖尿病患者(三角形)または正常人(四角形
)から得た10マイクロリツター(μIl)の詰込みR
BCペレットとして調製した。 各試料はNaBL (△、口)またはKBH4(ム、■
)を水親゛和性ほう化水素酸塩還元剤として用いて還元
シ、次いでクルシトールリジンーヘモグロビン形成につ
いてアッセイした。各還元反応混合物中のヘモグロビン
濃度は2.4ミリグラム/ミリリツター(mg/mβ)
であった。各混合物のほう化水素酸塩の濃度は横軸に示
しである。 第3B図は還元を試料とフタル酸の反応の後にび同じ2
種類の還元剤で得た結果を示す。第3A図の結果と第3
B図の結果の比較はほう化水素酸による還元前の7タル
酸との反応が、HRPO−G6C9レセプターの免疫学
的結合により測定したとき、アッセイ可能なクルシトー
ルリジンーヘモグロビンの有意な増加をもたらしている
ことを示している。かくして、フタル酸およびほう化水
素酸還元剤を用いて前述したようにして調製したグルシ
トールリジ、ンーヘモグロビンは増大した抗原性を示す
。この観察されたアッセイ可能なクルシトールリジンー
ヘモグロビン(抗原性)の増大量は予期されないもので
あった。 第4図は還元反応混合物の保持時間を変化させた効果を
示す。糖尿病または正常女性からの全血液の種々の希釈
物を用いて調製した酸反応混合物を等容量の0.OIM
フクフタル酸合した。各酸反応混合物中のヘモグロビン
(Hb )濃度は曜Hb/ll11で次のとおりであっ
た:27.0.10.8.5.4.2.7.1.08.
0.675.0.54.0.415.0.337、およ
び0.270゜各上記混合物中のミリモルの酸/ミリグ
ラムヘモグロビン比は、それぞれ、1.85.4.63
.9.26.18.5.46.3.74、0 ?、92
.6.120.5.148.5および185.2であっ
た。 溶血液形成後、還元反応混合物を各溶血液を等容量の4
00 m M NaBHnと混合することによって調製
した。ヘモグロビン試料の最終希釈の逆数が横軸上に示
されている。左から右方向においてまたヘモグロビン希
釈を増大させる順序において、各還元混合物のmM N
aBHa /■ヘモグロビン比は0.0148.0.0
37.0.074.0.14 B、0.37.0.59
3.0.74.0.964.1.187、および1.4
81であった。 第4図に示された結果は糖尿病(ロ)および正常(■)
試料の両方の還元反応混合物の30分間保持が糖尿病(
Δ)および正常(ム)試料の両方の還元反応混合物の1
5分間保持よりもアッセイ可能なクルシトールリジンー
ヘモグロビンを産生じていた。 第5図はアッセイ可能なクルシトールリジンーヘモグロ
ビン形成においての各種酸反応混合物の効果を反応混合
物の酸の関数として示す棒グラフである。各p合物は糖
尿病(■)または正常(ロ)血液試料から得たバック詰
RBCペレット10μlを次の0.05M%pH値4〜
5の溶液の1種615μlとを混合することによって調
製した:フタル酸(A)、クエン酸(E)、酢酸(F)
、リン酸(G) 、D (+)グルコサミン(H)、ア
ルファーケトグルタル酸(I)、オキサロ酢酸(J)、
シュー酸二カリウム(K)、コハク酸(L)、およびピ
ルビン酸(M)次いでNaBLで還元し後述するELI
 SAによりクルシトールリジンーヘモグロビン含有量
を測定した。コントロールとしては、蒸留水(B)、等
張塩水次いで蒸留水中での各RBCの一夜(約18時間
)インキュベーション(c)またはフタル酸(D)であ
った。各コントールも上述のようにしてアッセイした。 アッセイ可能なクルシトールリジンーヘモグロビン形成
量は490nrnでの光学密度値(0,D、 )として
示した。 第5図の結果は試料から不安定グルコヘモグロビンを除
去する古典的方法、即ち、塩水中のRBCの一夜インキ
二ベーション(c)がフタル酸と同じ形でクルシトール
リジンの形成を増強しないことを示している。これらの
結果はまたフタル酸と水親和性ほう化水素酸還元剤の組
合せ使用によってアッセイ可能なグルシトールリ)ンの
増強を示している。 第6図は本発明のアッセイ法を約0.05 M(0)ま
たは約0.025M(ム)フタル酸濃度を有する酸反応
混合物を用いて行ったときに得られた結果を示すグラフ
である。また、0.05Mフタル酸濃変温有する酸反応
液を用いて調製した溶血液を還元させないで得た結果(
■)も示している。他のコントロールとしてはフタル酸
処理をNaBIIa還元前に用いなかったとき(ロ)ま
たはRBCの等張塩水中での一夜インキュベーションを
還元前に行いフタル酸処理を行わなかったとき(Δ)の
結果を含む。 酸反応混合物中のヘモグロビン濃度は■/1I11で7
5.50.37.5.30,25および21.4であっ
た。各々の還元反応混合物のヘモグロビン濃度は■/l
alで37.5.25.1B、75.15.12.5お
よび1O07であった。還元反応混合物中のNaBHz
の濃度は200mMであった。 第7図はpH値3.5.4.5.5.5および6.5を
有するフタル酸水溶液を用いて酸反応溶液を調製して得
たO、D、490値を示す棒グラフである。 糖尿病ヘモグロビン試料No、  1  (冒)および
No。 2(目)、および正常試料No、  1  (ロ)およ
びNo。 2(巳)は、それぞれ、グライーアフィンシステム(I
 5olab+^kron、 OR)を用い製造者の使
用説明に従って測定したとき、14.7%、10.7%
、7.5%および8.0%の総グルコシル化ヘモグロビ
ン値を有していた。 第8図は酸反応混合物保持時間を変化させた効果を示す
棒グラフである。各混合物は約4.3の未調整pH値を
有する0、05Mフタル酸を用いて調製した。用いた各
サンプルは第7図で記載したものと同じ、即ち、糖尿病
No、1(■)、糖尿病No。 2 (目)、正常No、1(ロ)および正常No、 2
(lid)であった。 第9図は、ヘモグロビンを酸反応混合物中で27.0■
/ m l〜0.27■/va 1の濃度でまた還元反
応混合物中で13.5■/la It〜0.135■/
l1llの濃度で用いて、還元反応混合物を室温または
37℃に維持した効果を示す。酸反応は約0.05Mの
フタル酸濃度で未調整フタル酸pH値(約4.3)で行
った。還元反応は約200mMのNaBH4:a度で行
った。 糖尿病(白抜じるし)または正常(黒しるし)女性から
の全血液として調製したヘモグロビン試料を還元反応に
おいて室温(それぞれ、Δおよびム)または37℃(そ
れぞれ、口および■)に維・たときのスパイクおよび回
復試験の結果を示す。 %および5.45%であることが判っていた。この試験
の詳細は実施例8でなされている。 HFIPO−G6C9コンジュゲートに加え?!迎制剤
(JJg/m?)HRPO−G6C9コンジュゲートに
加えた抑制剤(ug/mF)HRPO−06C9コンヅ
ユケートに加えた抑制剤(ug/mj )FIG、2G 還元剤m度(mM) FIG、 3A 還元剤濃度(mM) 還元全血M静動1/希釈 FIG、 5 還元溶血液の最終希釈X0.01 FIG、6 フタル蒙反応のpH 還元全l111溶w4Wtの希釈−o、ooiFIG、
 9 正常溶血液に加えた糖尿*溶血液J。 −FIG、IO

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 (1)(a)グルコヘモグロビン含有試料をpH値約3
    〜約6を有するフタル酸またはビフタル酸含有水性媒体
    とヘモグロビンのミリグラム当り少なくとも上記酸約1
    .5ミリモルの比率で混合して酸反応混合物を調製する
    こと; (b)上記酸反応混合物を、約0℃〜約37℃の温度で
    、存在する不安定グルコヘモグロビンは除去するが、元
    の試料中に存在する安定グルコヘモグロビンを維持する
    のに十分な所定時間保持すること; (c)上記反応混合物を水親和性ほう化水素酸塩還元剤
    とヘモグロビンのミリグラム当り少なくともほう化水素
    酸塩約0.015モルの比率で混合して還元反応混合物
    を調製すること;(d)上記還元反応混合物を、約0℃
    〜約37℃の温度で、グルシトールリジン−ヘモグロビ
    ンを形成するのに十分な所定時間保持すること; (e)上記グルシトールリジン−ヘモグロビンをすべて
    の未反応ほう化水素酸塩から分離して単離したグルシト
    ール−ヘモグロビンを調製すること; (f)上記単離したグルシトールリジン−ヘモグロビン
    をグルシトールリジン特異性レセプター分子と混合して
    免疫反応混合物を形成させること; (g)上記免疫反応混合物を生物学的アッセイ条件下に
    レセプター分子が上記グルシトールリジン−ヘモグロビ
    ンと免疫学的に結合して免疫反応体を形成するのに十分
    な時間保持すること;および (h)上記保持した免疫反応混合物中に形成した免疫反
    応体の量を測定すること; の各工程を含むことを特徴とするグルコヘモグロビン含
    有試料中の安定グルコヘモグロビンの量をアッセイする
    方法。 (2)工程(a)の混合をヘモグロビンのミリグラム当
    り少なくとも酸約15.0ミリモルの比率で行う特許請
    求の範囲第(1)項記載の方法。 (3)工程(a)の酸溶液が約4〜約5のpH値を有す
    る特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 (4)工程(c)の混合をヘモグロビンのミリグラム当
    り少なくともほう化水素酸塩約0.15ミリモルの比率
    で行う特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 (5)工程(f)のレセプターがモノクローナル抗体の
    形である特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 (6)モノクローナル抗体がATCC寄託番号HB83
    56またはHB8358を有するハイブリドーマにより
    産生される特許請求の範囲第(5)項記載の方法。 (7)(a)所定容量のパック詰赤血球ペレットを調製
    すること; (b)上記所定容量のペレットを約4〜約5のpH値の
    水性0.05Mフタル酸と約1容量のペレット対約62
    .5容量の水性酸の比率で混合して酸反応混合物を調製
    すること; (c)上記酸反応混合物を約15〜約30分間、約20
    ℃〜約37℃の温度に保持して溶血液を調製すること; (d)マイクロタイタープレートウェル中で、所定容量
    の上記溶血液を約400mMのほう化水素酸ナトリウム
    またはほう化水素酸カリウム濃度を有する水溶液の等容
    量と混合してヘモグロビンのミリグラム当り少なくとも
    約 0.15ミリモルのほう化水素酸塩を含む還元反応混合
    物を調製すること; (e)上記還元反応混合物を約15〜約30分間、約2
    0℃〜約37℃の温度に保持してマイクロタイタープレ
    ートウェルに結合したグルシトールリジン−ヘモグロビ
    ンを形成させること; (f)上記ウェル結合グルシトールリジン−ヘモグロビ
    ンを上記ほう化水素酸塩から分離して単離したウェル結
    合グルシトールリジン−ヘモグロビンを形成させること
    ; (g)上記単離したウェル結合グルシトールリジン−ヘ
    モグロビンをATCC寄託番号HB8356またはHB
    8358を有するハイブリドーマによって産生された所
    定量の酵素標識レセプターと混合して免疫反応混合物を
    調製すること; (h)上記免疫反応混合物を約15〜約30分間、約2
    0℃〜約37℃の温度に保持すること、上記時間は上記
    レセプターが上記グルシトールリジン−ヘモグロビンと
    免疫学的に反応しマイクロタイタープレートウェル結合
    免疫反応体を形成するのに十分であること;および(i
    )工程(h)で形成したマイクロタイタープレートウェ
    ル結合免疫反応体の量を測定すること;の各工程を含む
    ことを特徴とするグルコヘモグロビン含有試料中の安定
    グルコヘモグロビンの量をアッセイする方法。 (8)(a)不安定および安定グルコヘモグロビンを含
    有するグルコヘモグロビン試料を、フタル酸またはビフ
    タル酸を含み約3〜約6のpH値を有する水性媒体と、
    ヘモグロビンのミリグラム当り少なくとも約1.5ミリ
    モルの上記酸の比率で混合して酸反応混合物を調製する
    こと; (b)上記酸反応混合物を、約0℃〜約37℃の温度で
    、存在する不安定グルコヘモグロビンは除去するが元の
    試料中に存在する安定グルコヘモグロビンを維持するの
    に十分な所定の時間保持すること; (c)上記反応混合物を水親和性ほう化水素酸塩還元剤
    とヘモグロビンのミリグラム当り少なくとも約0.01
    5ミリモルのほう化水素酸塩の比率で混合して還元反応
    混合物を調製すること; (d)上記還元反応混合物を、約0℃〜約37℃の温度
    で、グルシトールリジン−ヘモグロビンを形成するのに
    十分な所定時間保持すること;および (e)上記グルシトールリジン−ヘモグロビンを未反応
    ほう化水素酸塩から分離して単離したグルシトールリジ
    ン−ヘモグロビンを調製すること; の各工程を含むことを特徴とする不安定および安定グル
    コヘモグロビンの両方を含有するグルコヘモグロビン試
    料から安定グルコヘモグロビンをグルシトールリジン−
    ヘモグロビンへ転化する方法。 (9)工程(a)の混合をヘモグロビンのミリグラム当
    り少なくとも約15ミリモルの酸の比率で行う特許請求
    の範囲第(8)項記載の方法。 (10)工程(a)の酸溶液が約4〜約5のpH値を有
    する特許請求の範囲第(8)項記載の方法。 (11)工程(c)の混合をヘモグロビンのミリグラム
    当り少なくとも約0.15ミリモルのほう化水素酸塩の
    比率で行う特許請求の範囲第(8)項記載の方法。 (12)試料が赤血球の形である特許請求の範囲第(8
    )項記載の方法。 (13)グルコヘモグロビン試料中に存在する安定グル
    コヘモグロビンの量の固相アッセイを行うのに適する診
    断薬系であって、 (a)固相マトリックスを含みその表面上で上記アッセ
    イを行う第1のパッケージ; (b)所定量の水親和性ほう化水素酸塩還元剤を含む第
    2のパッケージ; (c)公知量のグルシトールリジン特異性レセプター分
    子を含む第3のパッケージ;および (d)所定量のフタル酸またはビフタル酸を含む第3の
    パッケージ; とを含み、各パッケージの内容物が上記アッセイを行う
    のにそれぞれ十分な量で存在することを特徴とする上記
    診断薬系。 (14)上記グルシトールリジン特異性レセプター分子
    がATCC寄託番号HB8356またはHB8358を
    有するハイブリドーマによって産生される特許請求の範
    囲第(13)項の診断薬系。 (15)上記レセプター分子が標識に結合している特許
    請求の範囲第(14)項記載の診断薬系。
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