JPS63277967A - 安定なグリコシル化ヘモグロビンの新規な免疫化学的アッセイ方法 - Google Patents
安定なグリコシル化ヘモグロビンの新規な免疫化学的アッセイ方法Info
- Publication number
- JPS63277967A JPS63277967A JP62291651A JP29165187A JPS63277967A JP S63277967 A JPS63277967 A JP S63277967A JP 62291651 A JP62291651 A JP 62291651A JP 29165187 A JP29165187 A JP 29165187A JP S63277967 A JPS63277967 A JP S63277967A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hemoglobin
- acid
- reaction mixture
- glucohemoglobin
- glucitollysine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 title claims description 111
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 title claims description 111
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 68
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 84
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 74
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N phthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 34
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 27
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 claims description 23
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 21
- 108091005995 glycated hemoglobin Proteins 0.000 claims description 21
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 20
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 19
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 claims description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 13
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 13
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 11
- JNFQXAUVKUQSKQ-FBDQPXRJSA-N (2s)-2-amino-6-[[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]amino]hexanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO JNFQXAUVKUQSKQ-FBDQPXRJSA-N 0.000 claims description 10
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims description 4
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000002764 solid phase assay Methods 0.000 claims description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical class OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 claims 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 69
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 69
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 47
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 37
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 23
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 17
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 17
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 9
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 8
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 6
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 6
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 6
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- ODUCDPQEXGNKDN-UHFFFAOYSA-N nitroxyl Chemical class O=N ODUCDPQEXGNKDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 4
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 3
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 3
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 3
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 3
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 3
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 3
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 2
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014663 Glycated Hemoglobin A Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;oxalate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)C([O-])=O IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- QQVIHTHCMHWDBS-UHFFFAOYSA-N isophthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC(C(O)=O)=C1 QQVIHTHCMHWDBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- IWZKICVEHNUQTL-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogen phthalate Chemical compound [K+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O IWZKICVEHNUQTL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 150000003680 valines Chemical group 0.000 description 2
- UOCLXMDMGBRAIB-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trichloroethane Chemical compound CC(Cl)(Cl)Cl UOCLXMDMGBRAIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABFYEILPZWAIBN-UHFFFAOYSA-N 3-(iminomethylideneamino)-n,n-dimethylpropan-1-amine;hydrochloride Chemical compound Cl.CN(C)CCCN=C=N ABFYEILPZWAIBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100328078 Bos taurus CL46 gene Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 240000008168 Ficus benjamina Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFUMBHCUWAMIBK-UHFFFAOYSA-N [B+3].[O-]B([O-])[O-] Chemical compound [B+3].[O-]B([O-])[O-] CFUMBHCUWAMIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 1
- 150000004705 aldimines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 description 1
- INJRKJPEYSAMPD-UHFFFAOYSA-N aluminum;silicic acid;hydrate Chemical compound O.[Al].[Al].O[Si](O)(O)O INJRKJPEYSAMPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000005250 beta ray Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001642 boronic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940075397 calomel Drugs 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000037516 chromosome inversion disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L dimercury dichloride Chemical compound Cl[Hg][Hg]Cl ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- AFLBAXPZSPPPIW-UHFFFAOYSA-N disodium;dioxidoboranylformonitrile Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]B([O-])C#N AFLBAXPZSPPPIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- -1 fluorescein isocyanate Chemical class 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940004975 interceptor Drugs 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000001019 normoglycemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000005498 phthalate group Chemical class 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N semicarbazide Chemical compound NNC(N)=O DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004905 short-term response Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 208000014001 urinary system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
崖栗上久剋朋公団
本発明は生体試料中の安定なグリコヘモグロビンの量を
アッセイする方法に関する。さらに詳細には、本発明は
還元グリコヘモグロビン分子上のグリシドールリジン含
有エピトープの数を最適化し分析する方法に関する。
アッセイする方法に関する。さらに詳細には、本発明は
還元グリコヘモグロビン分子上のグリシドールリジン含
有エピトープの数を最適化し分析する方法に関する。
光凱■ｉｕ
グリコジル化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン）は糖
部分に共有結合しているヘモグロビンである。即ち、グ
リコヘモグロビンはヘモグロビンと糖との反応の付加生
成物（アグクト、）である。
部分に共有結合しているヘモグロビンである。即ち、グ
リコヘモグロビンはヘモグロビンと糖との反応の付加生
成物（アグクト、）である。
グルコヘモグロビンはグルコースに結合したヘモグロビ
ンからなるグリコヘモグロビンのサブクラスである。グ
リコジル化は非特異的な反応であり各補糖または糖リン
酸のヒトヘモグロビンＡ０、Ａ２、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆおよ
びＳへの付加をもたらすものと報告されている。
ンからなるグリコヘモグロビンのサブクラスである。グ
リコジル化は非特異的な反応であり各補糖または糖リン
酸のヒトヘモグロビンＡ０、Ａ２、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆおよ
びＳへの付加をもたらすものと報告されている。
グルコヘモグロビンＡｒｃ （’Ｈｂ Ａｒｃ） ハ最
モｍ冨であり最も広汎に研究されているグリコへモグロ
ビンである。ＨｂＡ＋ｃはベーターグロビン鎖の１つま
たは両方のＮ−末端バリンのアミノ基に結合したＤ−グ
ルコースを有するＨ ｂ Ａｎを示す。
モｍ冨であり最も広汎に研究されているグリコへモグロ
ビンである。ＨｂＡ＋ｃはベーターグロビン鎖の１つま
たは両方のＮ−末端バリンのアミノ基に結合したＤ−グ
ルコースを有するＨ ｂ Ａｎを示す。
しかしなから、グルコースのヘモグロビンへの付加はベ
ーター鎮のＮ−末端に限らずアルファーおよびベーター
グロビン鎖双方のニブシロンアミノ基でも生じ得る。
ーター鎮のＮ−末端に限らずアルファーおよびベーター
グロビン鎖双方のニブシロンアミノ基でも生じ得る。
ヘモグロビンへのグルコース付加の反応機構および力学
は第１図に略図的に示されている。アルデヒド形にある
Ｄ−グルコースはアミノ基（Ｎ−末端バリンによりある
いは鋼内リシン残基のニブシロンアミノ基により与えら
れる）と急速かつ可逆的に反応して不安定なアルジミン
（シッフ塩基）中間体を形成する。この不安定中間体（
不安定グルコヘモグロビン）はＤ−グルコースおよびヘ
モグロビンに解離して戻りし得るかあるいは不可逆であ
るが緩慢なアマトリ転位を受けて安定なケトアミン（安
定なグルコヘモグロビン）を形成する。
は第１図に略図的に示されている。アルデヒド形にある
Ｄ−グルコースはアミノ基（Ｎ−末端バリンによりある
いは鋼内リシン残基のニブシロンアミノ基により与えら
れる）と急速かつ可逆的に反応して不安定なアルジミン
（シッフ塩基）中間体を形成する。この不安定中間体（
不安定グルコヘモグロビン）はＤ−グルコースおよびヘ
モグロビンに解離して戻りし得るかあるいは不可逆であ
るが緩慢なアマトリ転位を受けて安定なケトアミン（安
定なグルコヘモグロビン）を形成する。
ケトアミンはへミヶタールと平衡でまたは環状（特に、
デオキシフラクトシル−リシン）で存在する。
デオキシフラクトシル−リシン）で存在する。
安定なグルコヘモグロビンの形成は赤血球の寿命を通じ
て緩慢かつ連続的に進行する非酵素プロセスである。グ
ルコヘモグロビン形成速度は血糖（グルコース）値を調
節する個々の能力に直接依存している。従って、ＨｂＡ
ｒｃの総安定グルコヘモグロビン濃度に関する情報は糖
尿病患者の糖血調整（ｇｌｕｃｅｍｉｃ ｃｏｎｔｒｏ
ｌ ）用の客観的時間当りのモニターを与えるようなア
クセプタンスを得ている。
て緩慢かつ連続的に進行する非酵素プロセスである。グ
ルコヘモグロビン形成速度は血糖（グルコース）値を調
節する個々の能力に直接依存している。従って、ＨｂＡ
ｒｃの総安定グルコヘモグロビン濃度に関する情報は糖
尿病患者の糖血調整（ｇｌｕｃｅｍｉｃ ｃｏｎｔｒｏ
ｌ ）用の客観的時間当りのモニターを与えるようなア
クセプタンスを得ている。
総グリコヘモグロビンまたはＨｂＡ＊ｃのような特定の
グルコヘモグロビン種の量をアッセイする種々の方法お
よ′びこれら方法に付随する方法上の問題は“ゴールド
スティン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）等、Ｃｌ１ｎ。
グルコヘモグロビン種の量をアッセイする種々の方法お
よ′びこれら方法に付随する方法上の問題は“ゴールド
スティン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）等、Ｃｌ１ｎ。
Ｃｈｅｍ、 、３１ ：１０６０ １０６７（１９８５
）”および“ジョバノピック（Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ）等
、Ａｍ、Ｊ。
）”および“ジョバノピック（Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ）等
、Ａｍ、Ｊ。
Ｍｅｄ、、７０ ：３３１−３３８ （１９８１）”に
記載されている。例えば、“ジャピッド（Ｊａｖｉｄ）
等、Ｏｒ、Ｊ、 Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、 ３８
： ３２９−３３７（１９７８）”に記載されたＨｂＡ
ｘｃのラジオイムノア・ノセイ（ＲＩ Ａ）はグルコキ
シ化していないヘモグロビンとの低い親和性と交差反応
性を有する抗体の使用を余儀な（されている。
記載されている。例えば、“ジャピッド（Ｊａｖｉｄ）
等、Ｏｒ、Ｊ、 Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、 ３８
： ３２９−３３７（１９７８）”に記載されたＨｂＡ
ｘｃのラジオイムノア・ノセイ（ＲＩ Ａ）はグルコキ
シ化していないヘモグロビンとの低い親和性と交差反応
性を有する抗体の使用を余儀な（されている。
さらに最近、１カーチス（ｃｕｒｔｉｓｓ ）等、」工
Ｃｈｉｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、、７２：１４２７−３８（
１９８３）″はグルシトールリシン残基含有エピトープ
と免疫反応するモノクローナル抗体を用いて比較的短い
半減期を有するグルコキシ化血齋たん白の存在をアッセ
イすることについて報告している。これら研究者はまた
グルシトールリジン−ヘモグロビンによる上記モノクロ
ーナル抗体のグルシトールリジンー血漿たん白への結合
抑制についても報告している。
Ｃｈｉｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、、７２：１４２７−３８（
１９８３）″はグルシトールリシン残基含有エピトープ
と免疫反応するモノクローナル抗体を用いて比較的短い
半減期を有するグルコキシ化血齋たん白の存在をアッセ
イすることについて報告している。これら研究者はまた
グルシトールリジン−ヘモグロビンによる上記モノクロ
ーナル抗体のグルシトールリジンー血漿たん白への結合
抑制についても報告している。
グルコシトールリジン残基は、リジンのグルコキシ化ニ
ブシロンアミノ基のケトアミン形（アマトリ生成物）を
ほう化水素酸ナトリウムまたはシアノボロ水素酸ナトリ
ウムのような親木性ほう化水素酸塩（ボラハイドライド
）還元剤（還元剤）で還元したときの前記アマトリ転位
生成物の還元によって生成される。か（して、カーチス
等は試料中のグルコ−血漿たん白質を還元してグルシト
ールリシン含有血漿たん白に転化し、続いてグルコシト
ールリシン−特異性モノクローナル抗体を用いてアッセ
イし、それによってグルコキシ化なしの血脩たん白質で
観察される交差反応性の問題を克服している。
ブシロンアミノ基のケトアミン形（アマトリ生成物）を
ほう化水素酸ナトリウムまたはシアノボロ水素酸ナトリ
ウムのような親木性ほう化水素酸塩（ボラハイドライド
）還元剤（還元剤）で還元したときの前記アマトリ転位
生成物の還元によって生成される。か（して、カーチス
等は試料中のグルコ−血漿たん白質を還元してグルシト
ールリシン含有血漿たん白に転化し、続いてグルコシト
ールリシン−特異性モノクローナル抗体を用いてアッセ
イし、それによってグルコキシ化なしの血脩たん白質で
観察される交差反応性の問題を克服している。
しかしなから、第１図から理解できるように、インビト
ロの還元法はグルコヘモグロビンの不安定および安定形
の両方にグルコシトールリシンを産生さ廿ている。即ち
、明らかに、前出のカーチス等の方法は、血漿たん白の
代りにヘモグロビンに適用したとき、試料中に存在する
グルコヘモグロビンの不安定および安定形の量を区別す
ることはできなかった。
ロの還元法はグルコヘモグロビンの不安定および安定形
の両方にグルコシトールリシンを産生さ廿ている。即ち
、明らかに、前出のカーチス等の方法は、血漿たん白の
代りにヘモグロビンに適用したとき、試料中に存在する
グルコヘモグロビンの不安定および安定形の量を区別す
ることはできなかった。
前出のゴールドスティン等およびジオバノピッチ等の両
方法によれば、長時間の糖血調整の信顧できる係数を与
えるグルコヘモグロビンアッセイを行うためには、アッ
セイ法はグルコヘモグロビンの不安定形および安定形を
区別すべきである。
方法によれば、長時間の糖血調整の信顧できる係数を与
えるグルコヘモグロビンアッセイを行うためには、アッ
セイ法はグルコヘモグロビンの不安定形および安定形を
区別すべきである。
その理由は２つ存在する。
第１には、任意の与えられた時点において、赤血球中に
存在するグルコヘモグロビンの総量は不安定画分と安定
画分の両方の和である。第２に、赤血球中に存在する不
安定グルコヘモグロビンの量は短時間でグルコース量に
応じて急速に変動する。即ち、不安定画分の形成は、血
中グルコースの鋭敏な変化が、不安定画分の増大の結果
として、実質的に総グルコヘモグロビンの増大をもたら
している安定ケトアミンの緩慢な不可逆的形成に比較し
たとき、十分に急速である。従って、グルコヘモグロビ
ンの測定における不安定画分の総括は血中グルコース量
に対する鋭敏なあるいは短時間応答を反映し得るが、長
時間糖血調整の程度を反映し得ない。
存在するグルコヘモグロビンの総量は不安定画分と安定
画分の両方の和である。第２に、赤血球中に存在する不
安定グルコヘモグロビンの量は短時間でグルコース量に
応じて急速に変動する。即ち、不安定画分の形成は、血
中グルコースの鋭敏な変化が、不安定画分の増大の結果
として、実質的に総グルコヘモグロビンの増大をもたら
している安定ケトアミンの緩慢な不可逆的形成に比較し
たとき、十分に急速である。従って、グルコヘモグロビ
ンの測定における不安定画分の総括は血中グルコース量
に対する鋭敏なあるいは短時間応答を反映し得るが、長
時間糖血調整の程度を反映し得ない。
グリコヘモグロビンをアッセイするための現在利用でき
るクロマトグラフィー、電気泳動および免疫学的方法は
試料中に両方が存在するときのグルコヘモグロビンの不
安定形および安定形を区別できない、従って、試料から
アッセイ工程前に不安定グルコヘモグロビン画分を除去
する手順を含むアッセイ方法を開発する研究が実質的な
量で行なわれている。
るクロマトグラフィー、電気泳動および免疫学的方法は
試料中に両方が存在するときのグルコヘモグロビンの不
安定形および安定形を区別できない、従って、試料から
アッセイ工程前に不安定グルコヘモグロビン画分を除去
する手順を含むアッセイ方法を開発する研究が実質的な
量で行なわれている。
試料から不安定グルコヘモグロビンを除去するための報
告された方法は、典型的には、試料を、不安定形のグル
コース（アルドース）のようなグリコースとヘモグロビ
ンへの分解を生ずる条件に付することに依存している。
告された方法は、典型的には、試料を、不安定形のグル
コース（アルドース）のようなグリコースとヘモグロビ
ンへの分解を生ずる条件に付することに依存している。
それらの方法には、溶血前の通常塩水中での２４時間の
赤血球のインキュベーション〔ゴールドスティン等、Ｄ
ｉａｂｅｔｅｓ２９Ｓ６２３−２８ （１９８０））、
溶血液のグルコース不含リン酸バッファーに対する４８
時間の透析〔ウィンドネス等、Ｊ、 Ｌａｂ、 Ｃｌ１
ｎ、 Ｍｅｄ、、９５ ： ３８６−’３９４ （１９
８０）） 、および溶血液の限外濾過による希釈および
引き続いての濃縮〔イナネン（１ｎｎａｎｅｎ ）等、
Ｃｌ１ｎ、、Ｃｈｅｓ、、２７：１４７８−７９ （
１９８１）〕がある。
赤血球のインキュベーション〔ゴールドスティン等、Ｄ
ｉａｂｅｔｅｓ２９Ｓ６２３−２８ （１９８０））、
溶血液のグルコース不含リン酸バッファーに対する４８
時間の透析〔ウィンドネス等、Ｊ、 Ｌａｂ、 Ｃｌ１
ｎ、 Ｍｅｄ、、９５ ： ３８６−’３９４ （１９
８０）） 、および溶血液の限外濾過による希釈および
引き続いての濃縮〔イナネン（１ｎｎａｎｅｎ ）等、
Ｃｌ１ｎ、、Ｃｈｅｓ、、２７：１４７８−７９ （
１９８１）〕がある。
本発明に関連して特に興味あるのは不安定グリコヘモグ
ロビンの除去に酸性インキュベーション工程を用いる方
法である。“ナーサン（Ｎａｔｈａｎ ）等、Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ、 ３０ ： ７００ ７０１、（１９８１）
’は赤血球をセミカルバジドとアナリンを含むｐＨ５の
溶液中で３０分間、３８℃でインキュベートして不安定
画分を除去するアッセイ法を記載している。安定グリコ
ヘモグロビン例えばグルコヘモグロビン画分は、その後
、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＣＬ）またはクエ
ン酸寒天ゲル電気泳動分離法のいずれかを用いてアッセ
イする。
ロビンの除去に酸性インキュベーション工程を用いる方
法である。“ナーサン（Ｎａｔｈａｎ ）等、Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ、 ３０ ： ７００ ７０１、（１９８１）
’は赤血球をセミカルバジドとアナリンを含むｐＨ５の
溶液中で３０分間、３８℃でインキュベートして不安定
画分を除去するアッセイ法を記載している。安定グリコ
ヘモグロビン例えばグルコヘモグロビン画分は、その後
、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＣＬ）またはクエ
ン酸寒天ゲル電気泳動分離法のいずれかを用いてアッセ
イする。
６ビーゼ（Ｂｉｓｓｅ）等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、 ３１
： ６３０−６３３、（１９８２） ”に開示され
た方法はアッセイすべき試料から不安定画分を、赤血球
を５０容量のｐＨ５の０．０５ Ｍビフタル酸カリウム
含有溶液中で１５分間、３７℃で溶解することによって
除去している。不安定グリコヘモグロビン除去試料中に
残存する安定グリコヘモグロビンの量はその後、ＨＰＬ
Ｃで測定している。
： ６３０−６３３、（１９８２） ”に開示され
た方法はアッセイすべき試料から不安定画分を、赤血球
を５０容量のｐＨ５の０．０５ Ｍビフタル酸カリウム
含有溶液中で１５分間、３７℃で溶解することによって
除去している。不安定グリコヘモグロビン除去試料中に
残存する安定グリコヘモグロビンの量はその後、ＨＰＬ
Ｃで測定している。
しかしなから、ビフタル酸を用いであるいはビフタル酸
を親木性ほう化水素酸塩還元剤を用い免疫学的にアッセ
イできるグルシトールリジン−ヘモグロビンを形成させ
る還元工程と組合せて用いて酸性の不安定グリコース例
えばグルコース除去する工程を用いることを明らかにし
た報告はない。
を親木性ほう化水素酸塩還元剤を用い免疫学的にアッセ
イできるグルシトールリジン−ヘモグロビンを形成させ
る還元工程と組合せて用いて酸性の不安定グリコース例
えばグルコース除去する工程を用いることを明らかにし
た報告はない。
血盟■立査
本発明はグリコヘモグロビン試料中のグルコヘモグロビ
ンのような安定グリコヘモグロビンの量をアッセイする
方法に関する。試料中に存在する不安定グルコヘモグロ
ビンは、先ず、グルコヘモグロビン含有試料をフタル酸
またはビフタル酸とヘモグロビン■当り少な（とも約１
．５ミリモルの比率で水性媒体中で約３〜約６のｐＨ値
で混合して酸反応混合物を形成させることによって除去
する。この混合物は、存在する不安定グルコヘモグロビ
ンをグルコースとヘモグロビンにｇｅｔ、一方元の試料
中に存在する安定グルコヘモグロビンを維持するような
所定の時間および所定の条件に保持される。
ンのような安定グリコヘモグロビンの量をアッセイする
方法に関する。試料中に存在する不安定グルコヘモグロ
ビンは、先ず、グルコヘモグロビン含有試料をフタル酸
またはビフタル酸とヘモグロビン■当り少な（とも約１
．５ミリモルの比率で水性媒体中で約３〜約６のｐＨ値
で混合して酸反応混合物を形成させることによって除去
する。この混合物は、存在する不安定グルコヘモグロビ
ンをグルコースとヘモグロビンにｇｅｔ、一方元の試料
中に存在する安定グルコヘモグロビンを維持するような
所定の時間および所定の条件に保持される。
次に、酸反応混合物は水親和性ほう化水素酸塩、好まし
くはほう化水素酸ナトリウムまたはカリウムとヘモグロ
ビン■当り少なくとも約０．１５ミリモルの比で混合し
て水性還元反応混合物を形成する。この還元反応混合物
を、所定の時間、存在するグルコキシ化リジンをグリシ
ドールリジン残基に転化させグリシドールリジン−ヘモ
グロビンを形成させるような条件に保持する。
くはほう化水素酸ナトリウムまたはカリウムとヘモグロ
ビン■当り少なくとも約０．１５ミリモルの比で混合し
て水性還元反応混合物を形成する。この還元反応混合物
を、所定の時間、存在するグルコキシ化リジンをグリシ
ドールリジン残基に転化させグリシドールリジン−ヘモ
グロビンを形成させるような条件に保持する。
還元試料中に存在するグルシトールリジン−ヘモグロビ
ンから未反応ほう化水素酸塩を分離したのち、存在する
グルシトールリジン−ヘモグロビンの量を、グルシトー
ルリジン特異性レセプター分子を用いる周知の免疫学的
アッセイ法によって測定する。理解すべきことは、グル
シトールリジン−ヘモグロビンの免疫学的測定までのこ
の方法が不安定グルコヘモグロビンと安定ヘモグロビン
の両方を含むグルコヘモグロビン試料中の安定グルコヘ
モグロビンからグルコシトールリジン−ヘモグロビンを
調製するのにも利用できるということマある。
ンから未反応ほう化水素酸塩を分離したのち、存在する
グルシトールリジン−ヘモグロビンの量を、グルシトー
ルリジン特異性レセプター分子を用いる周知の免疫学的
アッセイ法によって測定する。理解すべきことは、グル
シトールリジン−ヘモグロビンの免疫学的測定までのこ
の方法が不安定グルコヘモグロビンと安定ヘモグロビン
の両方を含むグルコヘモグロビン試料中の安定グルコヘ
モグロビンからグルコシトールリジン−ヘモグロビンを
調製するのにも利用できるということマある。
本発明はまた典型的にはキット形状にあり複数の別々の
パッケージを含んでいる診断薬系にも関する。第１のパ
ッケージはそのウェル表面でアッセイを行うマイクロタ
イタープレートのような面相マトリックスを含む。第２
パツケージは固形状の水親和性ほう化水素酸塩還元剤を
所定量含んでいる。第３パツケージは乾燥または液状の
適当なグルコシトールリシン特異性レセプター分子を含
んでいる。第４パツケージはフタル酸またはピッタル酸
を含んでいる。この診断薬系は、さらに、１種またはそ
れ以上の追加の有用な試剤を含む１種またはそれ以上の
パッケージを含み得る。
パッケージを含んでいる診断薬系にも関する。第１のパ
ッケージはそのウェル表面でアッセイを行うマイクロタ
イタープレートのような面相マトリックスを含む。第２
パツケージは固形状の水親和性ほう化水素酸塩還元剤を
所定量含んでいる。第３パツケージは乾燥または液状の
適当なグルコシトールリシン特異性レセプター分子を含
んでいる。第４パツケージはフタル酸またはピッタル酸
を含んでいる。この診断薬系は、さらに、１種またはそ
れ以上の追加の有用な試剤を含む１種またはそれ以上の
パッケージを含み得る。
本発明はいくつかの利点および特長を提供する。
１つの利点は不安定および安定グルコヘモグロビンの両
方を含むグルコヘモグロビン中の安定ヘモグロビンの濃
度を比較的迅速に、容易にかつ正確にアッセイできるこ
とである。
方を含むグルコヘモグロビン中の安定ヘモグロビンの濃
度を比較的迅速に、容易にかつ正確にアッセイできるこ
とである。
本発明の１つの利点はグルコシトールリジン−ヘモグロ
ビンを試料の不安定クルコヘモグロビン部分から調製し
たクリコシトールリジン−ヘモグロビン以外にグルコヘ
モグロビン試料の安定グルコヘモグロビン認容から調製
できることである。
ビンを試料の不安定クルコヘモグロビン部分から調製し
たクリコシトールリジン−ヘモグロビン以外にグルコヘ
モグロビン試料の安定グルコヘモグロビン認容から調製
できることである。
本発明のもう１つの利点は調製したグルシトールリジン
−ヘモグロビンが他の方法で調製したものよりも抗原性
があることである。
−ヘモグロビンが他の方法で調製したものよりも抗原性
があることである。
本発明のさらに別の利点および特長は以下の説明から当
業者にとって明らかとなるであろう。
業者にとって明らかとなるであろう。
Ａ、定義
“抗体”なる用語は一群のグリコジル化たん白質のｌ員
である分子いわゆる抗原と特異的に結合し得る免疫グロ
ブリンを称する。そのような抗体は、抗原の抗原決定基
と抗体の抗体結合サイト間の特異的免疫学的結合作用に
よって抗原と結合する。
である分子いわゆる抗原と特異的に結合し得る免疫グロ
ブリンを称する。そのような抗体は、抗原の抗原決定基
と抗体の抗体結合サイト間の特異的免疫学的結合作用に
よって抗原と結合する。
“抗体結合サイト”とは抗原を特異的に結合するＨ鎖お
よびＬ鎖の可変および高可変領域からなる抗体の構造的
部位である。“ジェーン（Ｊｅｒｎｅ ）、（１９７４
） Ａｎｎ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 （Ｉｎ５ｔ、 Ｐａ
５ｔａｕｌ ）、１２５Ｃ：３７３−３８９″の命名法
を用いると、抗体結合サイトはまた“パラトープ”とも
称せられる。 − 抗体の抗体結合サイト含有（パラトープ含有ポリペプチ
ド部分はパラトープを含み抗原に結合する抗体分子の部
分であって、例えば、抗体のＦａｂ、Ｆａｂ”、Ｆ （
ａｂ ’ ）ｔおよびＦ （ｖ）部位を包含する。
よびＬ鎖の可変および高可変領域からなる抗体の構造的
部位である。“ジェーン（Ｊｅｒｎｅ ）、（１９７４
） Ａｎｎ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 （Ｉｎ５ｔ、 Ｐａ
５ｔａｕｌ ）、１２５Ｃ：３７３−３８９″の命名法
を用いると、抗体結合サイトはまた“パラトープ”とも
称せられる。 − 抗体の抗体結合サイト含有（パラトープ含有ポリペプチ
ド部分はパラトープを含み抗原に結合する抗体分子の部
分であって、例えば、抗体のＦａｂ、Ｆａｂ”、Ｆ （
ａｂ ’ ）ｔおよびＦ （ｖ）部位を包含する。
抗体のＦａｂ部位とＦ＜ａｂ’）ｇ部位は、それぞれ、
パパインとペプシンのたん白質分解反応によって、周知
である方法による実質的完全抗体上に産生される。例え
ば、チオフィロポラスとディオクソンに付与された米国
特許第４．３４２．５６６号を参照されたい。Ｆａｂ’
抗体部位も周知であり、Ｆ（ａｂ’）ｇ部位から産生さ
れ次いでジスルフィド結合の還元により２つのＨ鎖部位
をメルカプトエタノールによるようにして結合し、次い
で得られたたん白質！ルカブタンのイオドアセトアミド
のような試剤によりアルキル化される。完全抗体が本発
明のモノクローナルリガンド分子の例として好ましく使
用される。
パパインとペプシンのたん白質分解反応によって、周知
である方法による実質的完全抗体上に産生される。例え
ば、チオフィロポラスとディオクソンに付与された米国
特許第４．３４２．５６６号を参照されたい。Ｆａｂ’
抗体部位も周知であり、Ｆ（ａｂ’）ｇ部位から産生さ
れ次いでジスルフィド結合の還元により２つのＨ鎖部位
をメルカプトエタノールによるようにして結合し、次い
で得られたたん白質！ルカブタンのイオドアセトアミド
のような試剤によりアルキル化される。完全抗体が本発
明のモノクローナルリガンド分子の例として好ましく使
用される。
“抗原”なる用語は抗体と結合する存在を指称しまた抗
体の産生を誘起する存在を指称するものとして歴史的に
使用されている。より普通の使用は抗体により結合する
存在物に対する抗原の意味に限定され、また“免疫原“
なる用語は抗体産生を誘起する存在として使用される。
体の産生を誘起する存在を指称するものとして歴史的に
使用されている。より普通の使用は抗体により結合する
存在物に対する抗原の意味に限定され、また“免疫原“
なる用語は抗体産生を誘起する存在として使用される。
上述した存在物が免疫原性と抗原性を有するときには、
一般に抗原と称される。
一般に抗原と称される。
“抗原決定基”なる用語は抗体結合サイトと免疫学的に
結合する抗原の実際の構造上の部位を称する。ジェーン
の命名法は抗原決定基を“エピトープ”として再定義し
ている。
結合する抗原の実際の構造上の部位を称する。ジェーン
の命名法は抗原決定基を“エピトープ”として再定義し
ている。
“生物学的に活性”なる用語は少なくともたん白質様分
子の抗原または特異的抗体結合サイトを特異的に結合す
る能力を称する。ただし、これら分子には他の一般的あ
るいはエフェクター能力も存在し得る。抗体結合サイト
を含むレセプター分子の生物学的活性はパラトープ（抗
体結合サイト）とそのエピトープ（抗体決定基）との水
性媒体中での混合時の少なくとも生理学的ＤＨ値とイオ
ン強度における免疫反応体を形成する免疫学的反応によ
って証明される。好ましいのは、生物学的活性は後で定
義する生物学的アッセイ条件下で生じることである。
子の抗原または特異的抗体結合サイトを特異的に結合す
る能力を称する。ただし、これら分子には他の一般的あ
るいはエフェクター能力も存在し得る。抗体結合サイト
を含むレセプター分子の生物学的活性はパラトープ（抗
体結合サイト）とそのエピトープ（抗体決定基）との水
性媒体中での混合時の少なくとも生理学的ＤＨ値とイオ
ン強度における免疫反応体を形成する免疫学的反応によ
って証明される。好ましいのは、生物学的活性は後で定
義する生物学的アッセイ条件下で生じることである。
° “ＥＬ Ｉ ＳＡ”とは固相に結合した抗体または
抗原と酵素−抗原または酵素−抗体コンジュゲートを用
いて試料中に存在する抗原または抗体の量を検出し定量
する酵素結合イムノソルベントアッセイを云う。ＥＬＩ
ＳＡ法の説明は１９８２年にカルホルニア州ロスアルト
スのランジメデカルパプリケイションズ社より刊行され
たり、Ｐ、サイテス等による“Ｂａ５ｉｃ ａｎｄ Ｃ
１１ｎｉｃａｌ Ｉｍｎ＋ｕｎｏｌｏｇ ”の第４版
、２２章；および米国特許第３．６５４．０９０号、第
３．８５０．７５２号および第４．０１６．０４３号に
見い出され、これらの記載はすべて参考として本明細書
に引用する。
抗原と酵素−抗原または酵素−抗体コンジュゲートを用
いて試料中に存在する抗原または抗体の量を検出し定量
する酵素結合イムノソルベントアッセイを云う。ＥＬＩ
ＳＡ法の説明は１９８２年にカルホルニア州ロスアルト
スのランジメデカルパプリケイションズ社より刊行され
たり、Ｐ、サイテス等による“Ｂａ５ｉｃ ａｎｄ Ｃ
１１ｎｉｃａｌ Ｉｍｎ＋ｕｎｏｌｏｇ ”の第４版
、２２章；および米国特許第３．６５４．０９０号、第
３．８５０．７５２号および第４．０１６．０４３号に
見い出され、これらの記載はすべて参考として本明細書
に引用する。
“酵素”とは触媒作用により多（の場合特異的である基
質中でのある種の変化を促進し産生ずる能力のあるたん
白質を称する。
質中でのある種の変化を促進し産生ずる能力のあるたん
白質を称する。
種々の形で用いる１免疫反応”なる用語はレセプター分
子とエピトープ間の結合を意味する。
子とエピトープ間の結合を意味する。
“標識手段”、“指示基”または“標識”なる用語は、
本明細書において、免疫反応体の存在を指示する検知可
能な信号の産生物中に直接または間接的に含まれる単一
原子および分子を含むものとして相互変化的に使用され
る。任意の標識手段をレセプターに結合あるいは混入で
き、あるいは別途に使用でき、これら原子または分子は
単独であるいは追加の試剤と組合せて使用できる。その
ような指示基または標識はそれ自体免疫化学において周
知であり、他の点で新規な方法および／または組成物と
共に用いる限りにおいてのみ本発明の一部を構成する。
本明細書において、免疫反応体の存在を指示する検知可
能な信号の産生物中に直接または間接的に含まれる単一
原子および分子を含むものとして相互変化的に使用され
る。任意の標識手段をレセプターに結合あるいは混入で
き、あるいは別途に使用でき、これら原子または分子は
単独であるいは追加の試剤と組合せて使用できる。その
ような指示基または標識はそれ自体免疫化学において周
知であり、他の点で新規な方法および／または組成物と
共に用いる限りにおいてのみ本発明の一部を構成する。
“レセプター”なる用語は、本明細書においては、抗原
と免疫学的に結合する抗体結合サイトを含む生物学的活
性分子を指称するものとして使用される。このような結
合は、典型的には、約１０’〜約１０’Ｊ！１モルのア
フィニティによって生じ抗原のエピトープとレセプター
の抗体結合サイトとの特異的な反応である。
と免疫学的に結合する抗体結合サイトを含む生物学的活
性分子を指称するものとして使用される。このような結
合は、典型的には、約１０’〜約１０’Ｊ！１モルのア
フィニティによって生じ抗原のエピトープとレセプター
の抗体結合サイトとの特異的な反応である。
“分泌する”および“産生する”なる用語は、多くの場
合、抗体分子を得る細胞を称するものとして当該技術に
おいて相互変化的に使用される。
合、抗体分子を得る細胞を称するものとして当該技術に
おいて相互変化的に使用される。
しかしなから、抗体を産生ずる細胞は抗体分子をその周
囲環境中には分泌し得ない。本発明において興味あるハ
イプリドーマ細胞はその周囲環境にモノクローナル抗体
を分泌する。にもかかわらず、そのような細胞はある場
合、“抗体産生性”細胞として称せられ、またこれらの
抗体は当該技術において用いられる意味に合せる点で“
産生”されるものとしである場合には使用する。上記抗
体（レセプター）の抗体結合サイト含有たん白質も、本
明細書においては、同様に“産生”または“分泌”され
るものとして使用するが、そのような分子はそれ自体“
産生”または“分泌”される抗体から産生されることを
理解すべきである。
囲環境中には分泌し得ない。本発明において興味あるハ
イプリドーマ細胞はその周囲環境にモノクローナル抗体
を分泌する。にもかかわらず、そのような細胞はある場
合、“抗体産生性”細胞として称せられ、またこれらの
抗体は当該技術において用いられる意味に合せる点で“
産生”されるものとしである場合には使用する。上記抗
体（レセプター）の抗体結合サイト含有たん白質も、本
明細書においては、同様に“産生”または“分泌”され
るものとして使用するが、そのような分子はそれ自体“
産生”または“分泌”される抗体から産生されることを
理解すべきである。
“上清”なる用語は、本明細書においては、細胞を培養
するインビボ液状培地を称するものとして使用される。
するインビボ液状培地を称するものとして使用される。
本発明において興味あるハイプリドーマ培養物から産生
したモノクローナル抗体はその培養培地環境に分泌され
る。従って、これら細胞用の培地上清はモノクローナル
レセプター分子の１つの好ましい源であり、周知の方法
によってハイプリドーマ細胞から容易に遊離状態で取得
し得る。そのような方法の例は液状培地から細胞を沈澱
させる低速遠心である。モノクローナルレセプター分子
はハイプリドーマ組織を導入した実験動物の腹水腫腸液
（腹水液）からも得ることができる０両方法は当該技術
において周知である。
したモノクローナル抗体はその培養培地環境に分泌され
る。従って、これら細胞用の培地上清はモノクローナル
レセプター分子の１つの好ましい源であり、周知の方法
によってハイプリドーマ細胞から容易に遊離状態で取得
し得る。そのような方法の例は液状培地から細胞を沈澱
させる低速遠心である。モノクローナルレセプター分子
はハイプリドーマ組織を導入した実験動物の腹水腫腸液
（腹水液）からも得ることができる０両方法は当該技術
において周知である。
本明細書に記載するモノ特異性レセプター分子もこれら
分子が生ずる宿主動物の血液中に分泌する。
分子が生ずる宿主動物の血液中に分泌する。
このような抗体を取得する方法も当該技術において周知
である。
である。
Ｂ、グルシトールリジン−ヘモグロビン 生抜
本発明方法は一例としてグルシトールリジン−ヘモグロ
ビンとグルコヘモグロビンを用いてグリシドールリジン
−ヘモグロビンをグリコヘモグロビンから産生ずる方法
に関する。この方法によって産生させたグルシトールリ
ジン−ヘモグロビンは当該技術で公知の方法によって産
生させたグルシトールリジン−ヘモグロビンに比し予想
外の増大した抗原性を有する。増大した抗原性が得られ
る理由は知られていない。
ビンとグルコヘモグロビンを用いてグリシドールリジン
−ヘモグロビンをグリコヘモグロビンから産生ずる方法
に関する。この方法によって産生させたグルシトールリ
ジン−ヘモグロビンは当該技術で公知の方法によって産
生させたグルシトールリジン−ヘモグロビンに比し予想
外の増大した抗原性を有する。増大した抗原性が得られ
る理由は知られていない。
公知量のヘモグロビンを含有するグルコヘモグロビンの
試料を調製する。かくして調製したグルコヘモグロビン
は赤血球に含まれるものとしてあるいは遊離分子として
存在し得る。
試料を調製する。かくして調製したグルコヘモグロビン
は赤血球に含まれるものとしてあるいは遊離分子として
存在し得る。
グルコヘモグロビンを取得しまたグルコヘモグロビンの
存在を検出する方法は当該技術において周知である。さ
らに、一般的にたん白質およびポリペプチド特にヘモグ
ロビンをグルコキシ化する方法も当該技術において周知
である。例えば、メヅシ（Ｍｅｚｃｉ）等に付与された
米国特許第４，４７８．７４４号および“カーチス等、
Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、、７２：１４２７−
３８、（１９８３） ″を参照されたい、これらの記
載はすべて参考として本明細書に引用する。
存在を検出する方法は当該技術において周知である。さ
らに、一般的にたん白質およびポリペプチド特にヘモグ
ロビンをグルコキシ化する方法も当該技術において周知
である。例えば、メヅシ（Ｍｅｚｃｉ）等に付与された
米国特許第４，４７８．７４４号および“カーチス等、
Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、、７２：１４２７−
３８、（１９８３） ″を参照されたい、これらの記
載はすべて参考として本明細書に引用する。
典型的には、グルコヘモグロビン試料は公知量の全血液
として、より好ましくは、公知量のバック詰赤血球（Ｒ
Ｂ Ｃ）として調製する。血液およびパンク詰赤血球試
料の調製方法並びにこれら試料に含まれるＲＢＣ−ｔ−
溶解する方法は当該技術において周知である。
として、より好ましくは、公知量のバック詰赤血球（Ｒ
Ｂ Ｃ）として調製する。血液およびパンク詰赤血球試
料の調製方法並びにこれら試料に含まれるＲＢＣ−ｔ−
溶解する方法は当該技術において周知である。
（ａ） グルコヘモグロビン試料を水性媒体で公知量
のフタル酸またはビフタル酸と混合して酸反応混合物を
調製する。混合する酸の量はヘモグロビンのミリグラム
当り少なくともフタル酸約１．５ミ！Ｊモルの比、好ま
しくはヘモグロビンのミリグラム当り少なくともフタル
酸約１５．０ミリモノペより好ましくはへモグロビンミ
リグラム当り少なくとも４５．Ｏミ！Ｊモルの比を与え
るのに十分な量である。
のフタル酸またはビフタル酸と混合して酸反応混合物を
調製する。混合する酸の量はヘモグロビンのミリグラム
当り少なくともフタル酸約１．５ミ！Ｊモルの比、好ま
しくはヘモグロビンのミリグラム当り少なくともフタル
酸約１５．０ミリモノペより好ましくはへモグロビンミ
リグラム当り少なくとも４５．Ｏミ！Ｊモルの比を与え
るのに十分な量である。
酸は、典型的には、約３〜約６、好ましくは約４〜約５
、より好ましくは約４．１〜約４．５のｐＨ値を有する
水溶液として調製する。酸溶液により与えられる水性媒
体はかくして酸反応混合物の水性媒体を与える。
、より好ましくは約４．１〜約４．５のｐＨ値を有する
水溶液として調製する。酸溶液により与えられる水性媒
体はかくして酸反応混合物の水性媒体を与える。
試料中のヘモグロビンのモル量を検出する方法は当該技
術において周知である。
術において周知である。
（ｂ） 得られた酸反応混合物を数秒〜数時間の所定
の時間保持する。約１０分〜約１５分の時間が、通常、
試料中に元々存在する安定グルコヘモグロビンを維持し
なからすべての存在するグルコヘモグロビンを実質的に
分解し除去するのに十分である。しかしなから、必要に
応じて、混合物は約１６〜約２０時間何らの有害な結果
なしに保持し得る。
の時間保持する。約１０分〜約１５分の時間が、通常、
試料中に元々存在する安定グルコヘモグロビンを維持し
なからすべての存在するグルコヘモグロビンを実質的に
分解し除去するのに十分である。しかしなから、必要に
応じて、混合物は約１６〜約２０時間何らの有害な結果
なしに保持し得る。
グルコヘモグロビン試料を全血ＲＢＣとして調製したと
きには、酸溶液は赤血球溶解液（溶解剤）として作用し
、酸反応保持期間中、ＲＢＣを溶解しそれによって液中
に含まれるヘモグロビンを分離して溶血液を形成させる
。かくして形成した溶血液は不安定グルコヘモグロビン
を除去したものであり元のＲＢＣ試料部分中に存在する
安定ヘモグロビンを含んでいる。
きには、酸溶液は赤血球溶解液（溶解剤）として作用し
、酸反応保持期間中、ＲＢＣを溶解しそれによって液中
に含まれるヘモグロビンを分離して溶血液を形成させる
。かくして形成した溶血液は不安定グルコヘモグロビン
を除去したものであり元のＲＢＣ試料部分中に存在する
安定ヘモグロビンを含んでいる。
（ｃ） 酸反応混合物を、その後、水親和性ほう化水
素酸塩還元剤と混合して水性還元反応混合物を調製する
。還元反応混合物は酸反応混合物の水により、ほう化水
素酸塩還元剤の水溶液によりあるいは別途に調製できる
。好ましいのは、酸反応混合物が還元反応混合物の水性
部分の一部を与えることである。
素酸塩還元剤と混合して水性還元反応混合物を調製する
。還元反応混合物は酸反応混合物の水により、ほう化水
素酸塩還元剤の水溶液によりあるいは別途に調製できる
。好ましいのは、酸反応混合物が還元反応混合物の水性
部分の一部を与えることである。
水親和性ほう化水素酸塩還元剤は当該技術において周知
であり、ほう化水素酸ナトリウム（ＮａＢＩＩ４） 、
ほう化水素酸カリウム（にＢＨ＊ ）およびシアノほう
化水素酸ナトリウム（ＮａＣＮＢＨｚ ）がある。混合
するほう化水素酸塩の量はヘモグロビンのミリグラム当
り少なくともほう化水素酸（ＢＨ，−）約０．０１５ミ
リモル、好ましくはヘモグロビンのミリグラム当り少な
くともほう化水素酸約０．１５ミリモル、より好ましく
はヘモグロビンのミリグラム当り少なくともほう化水素
酸約０．３５ ミ！Ｊモルの比を与えるのに十分な量で
ある。
であり、ほう化水素酸ナトリウム（ＮａＢＩＩ４） 、
ほう化水素酸カリウム（にＢＨ＊ ）およびシアノほう
化水素酸ナトリウム（ＮａＣＮＢＨｚ ）がある。混合
するほう化水素酸塩の量はヘモグロビンのミリグラム当
り少なくともほう化水素酸（ＢＨ，−）約０．０１５ミ
リモル、好ましくはヘモグロビンのミリグラム当り少な
くともほう化水素酸約０．１５ミリモル、より好ましく
はヘモグロビンのミリグラム当り少なくともほう化水素
酸約０．３５ ミ！Ｊモルの比を与えるのに十分な量で
ある。
（６）得られた還元反応混合物を約り℃〜約３７℃、好
ましくは約２０℃〜約３７℃の温度に数秒〜数時間の所
定時間保持する。約１０、分〜約１６−２０時間、好ま
しくは約１５分〜約３０分の時間が、通常、安定グルコ
ヘモグロビン中に含まれるケト基をグルシトールリジン
残基のヒドロキシ基に還元しグルシトールリジン−ヘモ
グロビンを形成させるのに十分である。
ましくは約２０℃〜約３７℃の温度に数秒〜数時間の所
定時間保持する。約１０、分〜約１６−２０時間、好ま
しくは約１５分〜約３０分の時間が、通常、安定グルコ
ヘモグロビン中に含まれるケト基をグルシトールリジン
残基のヒドロキシ基に還元しグルシトールリジン−ヘモ
グロビンを形成させるのに十分である。
（ｅ） 次いで、得られたグルシトールリジン−ヘモ
グロビンを残存する未反応ほう化水素酸から分離して単
離したグルシトールリジン−ヘモグロビンを調製する。
グロビンを残存する未反応ほう化水素酸から分離して単
離したグルシトールリジン−ヘモグロビンを調製する。
ＲＢＣ溶解からの細胞デブリもこの分離工程で除去する
ことが好ましい。
ことが好ましい。
グルシトールリジン−ヘモグロビンヲ未反応ほう化水素
酸塩および還元反応混合物の残りから分離する方法もま
た当該技術において周知である。かかる分離法にはゲル
エキスクルジョンクロマトグラフィー、電気泳動、アフ
ィニティークロマトグラフィ等がある。固相アッセイ法
を用いるときには、ヘモグロビン誘轟体を使用する固相
マトリックスに結合して固形支持体を形成し、その後液
状還元反応混合物を固相から単純にデカンティションし
て分離を行うことが好ましい。精舎したクルジトールリ
ジンを含む固形支持′体はデカンティション工程後に洗
浄することもできる。
酸塩および還元反応混合物の残りから分離する方法もま
た当該技術において周知である。かかる分離法にはゲル
エキスクルジョンクロマトグラフィー、電気泳動、アフ
ィニティークロマトグラフィ等がある。固相アッセイ法
を用いるときには、ヘモグロビン誘轟体を使用する固相
マトリックスに結合して固形支持体を形成し、その後液
状還元反応混合物を固相から単純にデカンティションし
て分離を行うことが好ましい。精舎したクルジトールリ
ジンを含む固形支持′体はデカンティション工程後に洗
浄することもできる。
上述した方法はグルコヘモグロビンを測定するのに用い
る臨床検査法およびキットにおいて使用できるクルジト
ールリジンーヘモグロビンを調製するのにも使用できる
。この方法は、存在する特定のりジンー糖付加物にもよ
るが、他の必要なグルシトールリジン−ヘモグロビン種
を調製するのにも使用できる。
る臨床検査法およびキットにおいて使用できるクルジト
ールリジンーヘモグロビンを調製するのにも使用できる
。この方法は、存在する特定のりジンー糖付加物にもよ
るが、他の必要なグルシトールリジン−ヘモグロビン種
を調製するのにも使用できる。
Ｃ・ヱヱ土工友法
本発明はヘモグロビン試料中の安定グリコヘモグロビン
の量を検出する方法にも関し、こ−でもまた−例として
グルコヘモグロビンを使用する。
の量を検出する方法にも関し、こ−でもまた−例として
グルコヘモグロビンを使用する。
前述のクルジトールリジンーヘモグロビンを調製する方
法を公知量のヘモグロビンを含む試料から上述の工程（
ｅ）の単離クルジトールリジンーヘモグロビンを調製す
るのに用いる。その後、次の各工程を実施する。
法を公知量のヘモグロビンを含む試料から上述の工程（
ｅ）の単離クルジトールリジンーヘモグロビンを調製す
るのに用いる。その後、次の各工程を実施する。
（ｆ） 単離したクルジトールリジンーヘモグロビン
をクルジトールリジンーヘモグロビン含有エピトープと
免疫反応しクルジトールリジン不合ヘモグロビンと実質
的に交差反応性のないレセプターと混合して免疫反応混
合物を形成させる。
をクルジトールリジンーヘモグロビン含有エピトープと
免疫反応しクルジトールリジン不合ヘモグロビンと実質
的に交差反応性のないレセプターと混合して免疫反応混
合物を形成させる。
使用できるレセプターは、典型的には、存在することが
予想されるクルジトールリジンの量販上の化学量論的に
過剰に混合する。
予想されるクルジトールリジンの量販上の化学量論的に
過剰に混合する。
上述の免疫反応性を示すレセプター分子は本明細書にお
いては“クルジトールリジン特異性”レセプター分子ま
たはレセプターと称される。
いては“クルジトールリジン特異性”レセプター分子ま
たはレセプターと称される。
理解すべきことはそのようなレセプター分子は他の糖−
ヘモグロビンアダクトの還元アマトリ生成物またはマン
ニトールリジン残基のような他の分子とも交差反応し得
るということである。
ヘモグロビンアダクトの還元アマトリ生成物またはマン
ニトールリジン残基のような他の分子とも交差反応し得
るということである。
説明の都合上、還元した安定ヘモグロビン（アマトリ）
生成物はすべてクルジトールリジン残基と称し、これら
還元生成物と免疫反応するレセプター分子は“クルジト
ールリジン特異性”と称する。有用なレセプター分子は
またソルビトール、マンニトール、血漿および他のたん
白質の還元アマトリ生成物、並びにリジンまたはアルギ
ンのような遊離アミノ酸のような他の分子とも交差反応
し得る。しかしなから、これら他の分子は本発明におい
て使用する免疫反応混合物には存在せず、かくして、使
用できるレセプター分子のいかなる追加の交差反応性も
本発明においては関与しない。
生成物はすべてクルジトールリジン残基と称し、これら
還元生成物と免疫反応するレセプター分子は“クルジト
ールリジン特異性”と称する。有用なレセプター分子は
またソルビトール、マンニトール、血漿および他のたん
白質の還元アマトリ生成物、並びにリジンまたはアルギ
ンのような遊離アミノ酸のような他の分子とも交差反応
し得る。しかしなから、これら他の分子は本発明におい
て使用する免疫反応混合物には存在せず、かくして、使
用できるレセプター分子のいかなる追加の交差反応性も
本発明においては関与しない。
クルジトールリジンーヘモグロビンと免疫反応しクルジ
トールリジン残基、即ち、グルシト−シリジン特異性レ
セプター分子を含まないヘモグロビンと免疫学的交差反
応性を殆んどあるいは全く示さない有用なレセプターを
調製する方法は当該技術において周知である。典型的に
は、これら方法は先ずクルジトールリジン残基を含有す
る免疫原を必要とする。
トールリジン残基、即ち、グルシト−シリジン特異性レ
セプター分子を含まないヘモグロビンと免疫学的交差反
応性を殆んどあるいは全く示さない有用なレセプターを
調製する方法は当該技術において周知である。典型的に
は、これら方法は先ずクルジトールリジン残基を含有す
る免疫原を必要とする。
前述したように、一般にはたん白質および合成ポリペプ
チドをグリコキシ化する方法、特にこれら分子をグルコ
キシ化する方法は当該技術において周知である。さらに
、ニブシロンアミノ基に共有結合したグルコースを有す
るリジン残基を、クルジトールリジン残基に、水親和性
ほう化水素酸塩還先剤による還元によるようにして転化
する方法も当該技術において周知である。“カーチス等
、Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、、７２：１４２７
−２８、（１９８３）”″を参照されたい。さらにまた
、たん白質およびポリペプチド免疫原を用いてレセプタ
ーを産生させる方法も当該技術において周知である。
チドをグリコキシ化する方法、特にこれら分子をグルコ
キシ化する方法は当該技術において周知である。さらに
、ニブシロンアミノ基に共有結合したグルコースを有す
るリジン残基を、クルジトールリジン残基に、水親和性
ほう化水素酸塩還先剤による還元によるようにして転化
する方法も当該技術において周知である。“カーチス等
、Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、、７２：１４２７
−２８、（１９８３）”″を参照されたい。さらにまた
、たん白質およびポリペプチド免疫原を用いてレセプタ
ーを産生させる方法も当該技術において周知である。
例えば、前出のカーチス等はグルシトールリジン残基を
含む免疫原を用いてグルシト−シリジン特異性モノクロ
ーナル抗体（レセプター）を産生ずるハイブリドーマの
作製方法を開示している。この方法によって作製され、
クルシトールリジンーヘモグロビンと免疫反応するがグ
ルコヘモグロビンまたはヘモグロビンとは反応しないモ
ノクローナル抗体を分泌する２種類のハイブリドーマが
ロックビル（ＭＤ）のアメリカンタイプカルチャーコレ
クション（ＡＴＣＣ）に、１９８３年９月２０日付のブ
タペスト条約に従って、次のＡＴＣＣ寄託番号によって
寄託されている： Ｇ６Ｃ９１Ｃ８７Ｇ１１ ＨＢ８３５６Ｇ８Ｈ９
２Ａ１５Ｇ８ Ｈ８８３５８グルシトールリジン
−ヘモグロビンと免疫反応するがクルシトールリジンを
含まないヘモグロビンと殆んど交差反応しない単特異性
抗血清も周知の免疫吸収法を用いて調製できる。例えば
、クルシトールリジンーヘモグロビンはセラミ等に付与
された米国特許第４．２４７，５３３号に記載された方
法の免疫原としてのＨｂＡＩＣに置き換えることができ
、その記載は参考として本用細占に引用する。クルシト
ールリジンーヘモグロビンに対する免疫特異性抗体はそ
の後単離することができる、即ち、単特異性抗血清は還
元していないヘモグロビンおよび／またはグルコヘモグ
ロビンを免疫吸収剤として用いて交差反応性抗体を吸収
し去ることによって調製できる。
含む免疫原を用いてグルシト−シリジン特異性モノクロ
ーナル抗体（レセプター）を産生ずるハイブリドーマの
作製方法を開示している。この方法によって作製され、
クルシトールリジンーヘモグロビンと免疫反応するがグ
ルコヘモグロビンまたはヘモグロビンとは反応しないモ
ノクローナル抗体を分泌する２種類のハイブリドーマが
ロックビル（ＭＤ）のアメリカンタイプカルチャーコレ
クション（ＡＴＣＣ）に、１９８３年９月２０日付のブ
タペスト条約に従って、次のＡＴＣＣ寄託番号によって
寄託されている： Ｇ６Ｃ９１Ｃ８７Ｇ１１ ＨＢ８３５６Ｇ８Ｈ９
２Ａ１５Ｇ８ Ｈ８８３５８グルシトールリジン
−ヘモグロビンと免疫反応するがクルシトールリジンを
含まないヘモグロビンと殆んど交差反応しない単特異性
抗血清も周知の免疫吸収法を用いて調製できる。例えば
、クルシトールリジンーヘモグロビンはセラミ等に付与
された米国特許第４．２４７，５３３号に記載された方
法の免疫原としてのＨｂＡＩＣに置き換えることができ
、その記載は参考として本用細占に引用する。クルシト
ールリジンーヘモグロビンに対する免疫特異性抗体はそ
の後単離することができる、即ち、単特異性抗血清は還
元していないヘモグロビンおよび／またはグルコヘモグ
ロビンを免疫吸収剤として用いて交差反応性抗体を吸収
し去ることによって調製できる。
調製方法をモニターする試験方法はクルシトールリジン
ーヘモグロビンをターゲット抗原として用いる。
ーヘモグロビンをターゲット抗原として用いる。
（ｇ）免疫反応混合物を、生物学的アッセイ条件下に、
レセプターが存在するクルシトールリジンーヘモグロビ
ンと免疫学的に結合し免疫反応物を形成するのに十分で
ある約１０分〜約１６＝２０時間、好ましくは約１５分
〜約３０分間のような所定時間保持する。
レセプターが存在するクルシトールリジンーヘモグロビ
ンと免疫学的に結合し免疫反応物を形成するのに十分で
ある約１０分〜約１６＝２０時間、好ましくは約１５分
〜約３０分間のような所定時間保持する。
生物学的アッセイ条件はレセプターとアッセイすべきク
ルシトールリジンーヘモグロビンの活性を維持する条件
である。これらの条件には約り℃〜約４５℃の温度範囲
、約５〜約９のｐｉ値範囲、および蒸留水のイオン強度
から約１モル塩化ナトリウムのイオン強度で変化するイ
オン強度がある。そのような条件を最適化する方法は当
該技術において周知である。
ルシトールリジンーヘモグロビンの活性を維持する条件
である。これらの条件には約り℃〜約４５℃の温度範囲
、約５〜約９のｐｉ値範囲、および蒸留水のイオン強度
から約１モル塩化ナトリウムのイオン強度で変化するイ
オン強度がある。そのような条件を最適化する方法は当
該技術において周知である。
（ｈ）次に、免疫反応混合物中に形成された免疫反応物
の量を測定し、それによって試料中に存在する安定グル
コヘモグロビンの量を測定する。
の量を測定し、それによって試料中に存在する安定グル
コヘモグロビンの量を測定する。
形成した免疫反応物の量を直接また間接に測定するのは
当該技術で周知のアッセイ法によって実施し得る０例え
ば、米国特許第４．５３６．４７９号、第４．２３３，
４０１号、第４．２３３．４０２号および第３．９９６
．３４５号に記載されているようなホモジナスアッセイ
系を使用でき、これら米国特許の記載は参考として本明
細書に引用する。
当該技術で周知のアッセイ法によって実施し得る０例え
ば、米国特許第４．５３６．４７９号、第４．２３３，
４０１号、第４．２３３．４０２号および第３．９９６
．３４５号に記載されているようなホモジナスアッセイ
系を使用でき、これら米国特許の記載は参考として本明
細書に引用する。
好ましい実施態様においては、前述の工程（ｇ）のレセ
プターは指示基または標識を含んでおり、この標識は免
疫反応物中の標識レセプターの存在を信号し得るもので
ある。標識レセプターの存在および量をアッセイする方
法は使用する標識に依存しており、そのような標識およ
びアッセイ法は当該技術において周知である。
プターは指示基または標識を含んでおり、この標識は免
疫反応物中の標識レセプターの存在を信号し得るもので
ある。標識レセプターの存在および量をアッセイする方
法は使用する標識に依存しており、そのような標識およ
びアッセイ法は当該技術において周知である。
レセプターのようなたん白質様特異的結合剤の標識化は
当該技術において周知である。例えば、ハイブリドーマ
により産生じたレセプターは組織培養培地中の成分とし
て調製されたラジオアイソトープ含有アミノ酸の代謝導
入によって標識化できる。例えば、“ガルフレ（Ｇａｌ
ｆｒｅ）等、Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚ ａｎｏ１．７３．３
−４６、（１９８１）″を参照されたい、活性化官能性
基を介してのたん白質接合またはカップリング技術は特
に適用可能である０例えば、“アラミス（＾ｕｒａｍｅ
ａｓ）等、５ｃａｎｄ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｖ
ｏｌ、 ａｎ Ｓｕ １．７．７−２３、（１９７８
）”および米国特許第４．４９３．７９５号を参照され
たい、これらの記載は参考として本明細書に引用する。
当該技術において周知である。例えば、ハイブリドーマ
により産生じたレセプターは組織培養培地中の成分とし
て調製されたラジオアイソトープ含有アミノ酸の代謝導
入によって標識化できる。例えば、“ガルフレ（Ｇａｌ
ｆｒｅ）等、Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚ ａｎｏ１．７３．３
−４６、（１９８１）″を参照されたい、活性化官能性
基を介してのたん白質接合またはカップリング技術は特
に適用可能である０例えば、“アラミス（＾ｕｒａｍｅ
ａｓ）等、５ｃａｎｄ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｖ
ｏｌ、 ａｎ Ｓｕ １．７．７−２３、（１９７８
）”および米国特許第４．４９３．７９５号を参照され
たい、これらの記載は参考として本明細書に引用する。
さらに、サイト直接カンプリング反応も標識が第２レセ
プタ−とそのターゲット抗原との免疫反応を実質的に干
渉しないようにして実施し得る。例えば、“０７ドウエ
ル等、Ｂｉｏｔｅｃｈ、 ３．８８９−８９４（１９８
５） ”を参照されたい。
プタ−とそのターゲット抗原との免疫反応を実質的に干
渉しないようにして実施し得る。例えば、“０７ドウエ
ル等、Ｂｉｏｔｅｃｈ、 ３．８８９−８９４（１９８
５） ”を参照されたい。
標識化手段は抗原または抗体にこれら抗原または抗体を
変性させることなく化学的に結合して有用な免疫螢光体
トレーサーであるフルオロクロム（染料）を形成する螢
光標識剤であり得る。適当な螢光標識剤はフルオレセイ
ンイソシアネー）（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオ
シアネート（Ｆ ＩＴＣ） 、５−ジメチルアミン−１
−ナフタレンスルホニルクロライド、（ＤＡＮＳＣ）、
テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴ
Ｃ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニルクロラ
イド（ＲＢ２００ＳＣ）等のフルオロクロムである。免
疫螢光分析法の説明は、ジョンウィリーアンドサンズ社
発行、マルカロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ）等編集
の「＾ｎｔｉｂｏｄ Ａｓ Ａｔｏｏ ｌ、１８９２
３１頁のデル力（Ｄｅｌｕｃａ）により“Ｉｍｍｕｎｏ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ”にお
いて見い出され、その記載は参考として本明細書に引用
する。
変性させることなく化学的に結合して有用な免疫螢光体
トレーサーであるフルオロクロム（染料）を形成する螢
光標識剤であり得る。適当な螢光標識剤はフルオレセイ
ンイソシアネー）（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオ
シアネート（Ｆ ＩＴＣ） 、５−ジメチルアミン−１
−ナフタレンスルホニルクロライド、（ＤＡＮＳＣ）、
テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴ
Ｃ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニルクロラ
イド（ＲＢ２００ＳＣ）等のフルオロクロムである。免
疫螢光分析法の説明は、ジョンウィリーアンドサンズ社
発行、マルカロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ）等編集
の「＾ｎｔｉｂｏｄ Ａｓ Ａｔｏｏ ｌ、１８９２
３１頁のデル力（Ｄｅｌｕｃａ）により“Ｉｍｍｕｎｏ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ”にお
いて見い出され、その記載は参考として本明細書に引用
する。
好ましい実施態様においては、指示基はホースラディシ
二バーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、グルコースオキシダ
ーゼまたはその他の酵素である。主たる指示基がＨＲＰ
Ｏまたはグルコースオキシダーゼのような酵素である場
合には、レセプター−抗原複合体く免疫反応物）が形成
した事実を可視的にする追加の試剤を必要とする。ＨＲ
ＰＯ用のそのような追加の試剤には過酸化水素（Ｈ２０
ｇ）およびジアミノベンジジンまたは０−フ二二レンジ
アミン（ＯＰＤ）のような酸化染料先駆体がある。グル
コースオキシダーゼと使用できる追加の試剤は２．２’
−アジノージ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−〇−
スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
二バーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、グルコースオキシダ
ーゼまたはその他の酵素である。主たる指示基がＨＲＰ
Ｏまたはグルコースオキシダーゼのような酵素である場
合には、レセプター−抗原複合体く免疫反応物）が形成
した事実を可視的にする追加の試剤を必要とする。ＨＲ
ＰＯ用のそのような追加の試剤には過酸化水素（Ｈ２０
ｇ）およびジアミノベンジジンまたは０−フ二二レンジ
アミン（ＯＰＤ）のような酸化染料先駆体がある。グル
コースオキシダーゼと使用できる追加の試剤は２．２’
−アジノージ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−〇−
スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
放射性元素もまた有用な標識剤であり、本発明において
使用できる。例示的な放射性標識剤はガンマ−線を発生
する放射性元素である。それ自身でガンマ−線を発生す
る１２４■、＋２５ （，１ｚ・１１１３Ｉ１１Ｉ３２
Ｉおよび”Ｃｒ（７）ような元素は１群のガンマ−線発
射放射性元素指示基を代表している。特に好ましいのは
ｌ！ｓ■である。
使用できる。例示的な放射性標識剤はガンマ−線を発生
する放射性元素である。それ自身でガンマ−線を発生す
る１２４■、＋２５ （，１ｚ・１１１３Ｉ１１Ｉ３２
Ｉおよび”Ｃｒ（７）ような元素は１群のガンマ−線発
射放射性元素指示基を代表している。特に好ましいのは
ｌ！ｓ■である。
有用な標識手段のもう１つの群はそれ自体ポジトロンを
発出する”Ｃ％ ”Ｆ％ ＩＳＯおよび”Ｎのような元
素である。か（して発出したポジトロンはアッセイ混合
物中に存在する電子と出会ったときガンマ−線を発生す
る。また、ＩＩＩ １ｎまたは３Ｈのようなベータ線エ
ミッターも有用である。
発出する”Ｃ％ ”Ｆ％ ＩＳＯおよび”Ｎのような元
素である。か（して発出したポジトロンはアッセイ混合
物中に存在する電子と出会ったときガンマ−線を発生す
る。また、ＩＩＩ １ｎまたは３Ｈのようなベータ線エ
ミッターも有用である。
指示手段は本発明で有用なレセプター分子に直接結合で
きるかあるいは別個の分子からなり得る。指示手段はヤ
ギまたはウサギ抗マウス抗体のような有用なレセプター
分子に結合する抗体のような別個の分子であり得るｅス
えヱ土旦コツカスアウレウス（Ｓｔａ ｈ １ｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡもまた本発明の全
体または実質的に全体レセプター分子を使用するとき、
即ち、プロティンＡと結合するセレプター分子のＦｃ領
域の部位を含む分子を使用するときの別個の分子指示体
即ち標識剤として使用できる。そのような使用において
は、プロティンＡ自体が放射性元素またはフルオロクロ
ム染料のような標識を含む。
きるかあるいは別個の分子からなり得る。指示手段はヤ
ギまたはウサギ抗マウス抗体のような有用なレセプター
分子に結合する抗体のような別個の分子であり得るｅス
えヱ土旦コツカスアウレウス（Ｓｔａ ｈ １ｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロティンＡもまた本発明の全
体または実質的に全体レセプター分子を使用するとき、
即ち、プロティンＡと結合するセレプター分子のＦｃ領
域の部位を含む分子を使用するときの別個の分子指示体
即ち標識剤として使用できる。そのような使用において
は、プロティンＡ自体が放射性元素またはフルオロクロ
ム染料のような標識を含む。
特に好ましい実施においては、上述のアッセイは、クル
シトールリジン含有抗原を固相マトリックスに結合ある
いは固定して固相支持体を形成することからなるヘテロ
ジナス固相アッセイとして実施する。抗原は任意の周知
の化学または物理的手段によって固相マトリックスに結
合あるいは固定できる。吸着または免疫反応によるよう
な結合は固定の唯一の手段ではないけれども、“結合”
、“固定”またはその種々の表現上の変形は本明細書に
おいて相互変化的に使用する。
シトールリジン含有抗原を固相マトリックスに結合ある
いは固定して固相支持体を形成することからなるヘテロ
ジナス固相アッセイとして実施する。抗原は任意の周知
の化学または物理的手段によって固相マトリックスに結
合あるいは固定できる。吸着または免疫反応によるよう
な結合は固定の唯一の手段ではないけれども、“結合”
、“固定”またはその種々の表現上の変形は本明細書に
おいて相互変化的に使用する。
抗原の固相マトリックスとして使用されるマイクロタイ
タープレートウェル壁の吸着による物理的結合は後で例
示する。化学結合には、ヘモグロビンエピトープに結合
する第１抗体による結合があり、これは結合したとき、
グルシト−ルリジンエピトーブとレセプター分子との免
疫学的結合を実質的に干渉しないものである。
タープレートウェル壁の吸着による物理的結合は後で例
示する。化学結合には、ヘモグロビンエピトープに結合
する第１抗体による結合があり、これは結合したとき、
グルシト−ルリジンエピトーブとレセプター分子との免
疫学的結合を実質的に干渉しないものである。
このアッセイ法は通常“サンドウィッチ”アッセイと称
されている。もう１つの化学結合手段は１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイ
ドロクロライドのような水溶性カルボジイミド試剤を用
いてマトリックスのカルボン酸とレセプターのアミノ基
またはヒドロキシ基との間（またはその逆）で、それぞ
れ、アミドまたはエステルを形成することである。さら
に別の化学的結合手段はグルタルアルデヒドまたは塩化
シアヌルのような多価反応剤を用いるもので、これも周
知のことである。
されている。もう１つの化学結合手段は１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイ
ドロクロライドのような水溶性カルボジイミド試剤を用
いてマトリックスのカルボン酸とレセプターのアミノ基
またはヒドロキシ基との間（またはその逆）で、それぞ
れ、アミドまたはエステルを形成することである。さら
に別の化学的結合手段はグルタルアルデヒドまたは塩化
シアヌルのような多価反応剤を用いるもので、これも周
知のことである。
上記方法で使用できる固形マトリックスの例は当該技術
において周知であり、ファルコンマイクロテスト■フレ
キシブルアッセイプレート（ファルコンプラスチックス
、オックスナード、（Ａ）の名称で市販されている９６
ウエルマイクロタイタープレートのような固形マトリッ
クス、またはイムロン■及び■（グイナテック、アレキ
サンドリア、ＶＡ）の名称で市販されているマイクロタ
イターストリップのような１列に１２ケのウェルを有す
るマイクロタイターストリップがある。マイクロタイタ
ーストリップまたはプレートは透明プラスチック材料、
好ましくはポリ塩化ビニルまたはポリスチレンから作製
される。本発明の上述の方法で使用するための別の固形
マトリックスにはアボットラボラトリーズ社（ノースジ
カゴ、ＩＬ）より入手できる約１ミフロン〜約５１１＋
１直径のポリスチレンビーズ、任意の適当なサイズのポ
リスチレンチューブ、スティックまたはパドル（棒状物
）；およびポリスチレン粒子が約１ミクロンの大きさを
有しラテックスの他の成分から遠心的に分離し得るポリ
スチレンラテックスがある。
において周知であり、ファルコンマイクロテスト■フレ
キシブルアッセイプレート（ファルコンプラスチックス
、オックスナード、（Ａ）の名称で市販されている９６
ウエルマイクロタイタープレートのような固形マトリッ
クス、またはイムロン■及び■（グイナテック、アレキ
サンドリア、ＶＡ）の名称で市販されているマイクロタ
イターストリップのような１列に１２ケのウェルを有す
るマイクロタイターストリップがある。マイクロタイタ
ーストリップまたはプレートは透明プラスチック材料、
好ましくはポリ塩化ビニルまたはポリスチレンから作製
される。本発明の上述の方法で使用するための別の固形
マトリックスにはアボットラボラトリーズ社（ノースジ
カゴ、ＩＬ）より入手できる約１ミフロン〜約５１１＋
１直径のポリスチレンビーズ、任意の適当なサイズのポ
リスチレンチューブ、スティックまたはパドル（棒状物
）；およびポリスチレン粒子が約１ミクロンの大きさを
有しラテックスの他の成分から遠心的に分離し得るポリ
スチレンラテックスがある。
固形マトリックスはまたピスカタウェイ、ＮＪのファル
マシアファインケミカルズ社より入手できる架橋デキス
トラン例えばシェファデックスＧ−２５、−５０、−１
００、−２００等；および同じくファルマシアファイン
ケミカルズ社より入手できるアガロースおよび架橋アガ
ロース、例えば、シェファローズ６ＢＳＣＬ６Ｂ、４Ｂ
、ＣＬ４６等のような種々の材料からも作製し得る。
マシアファインケミカルズ社より入手できる架橋デキス
トラン例えばシェファデックスＧ−２５、−５０、−１
００、−２００等；および同じくファルマシアファイン
ケミカルズ社より入手できるアガロースおよび架橋アガ
ロース、例えば、シェファローズ６ＢＳＣＬ６Ｂ、４Ｂ
、ＣＬ４６等のような種々の材料からも作製し得る。
上述のアッセイ方法は、必要なとき、ヘモグロビン材料
中に存在する任意の特定のグリシドールリジン−ヘモグ
ロビン種の量を、所望のグリシドールリジン種に特異的
なレセプターを用いることによって測定するのに用いる
ことができる。
中に存在する任意の特定のグリシドールリジン−ヘモグ
ロビン種の量を、所望のグリシドールリジン種に特異的
なレセプターを用いることによって測定するのに用いる
ことができる。
Ｄ０葉ｌｕ１泉
本発明の別の局面は典型的にはキット形状であり前述の
アッセイ方法を実施するのに有用な診断薬系である。こ
の系は複数のパッケージ（包装単位）を含む。
アッセイ方法を実施するのに有用な診断薬系である。こ
の系は複数のパッケージ（包装単位）を含む。
第１のパッケージは上述したような固相マトリックスを
含む、このマトリックスは好ましくは複数のウェル例え
ば９６または１２ケのウェルを含むプラスチックマイク
ロタイタープレートまたはストリップであり、そのウェ
ル表面上で、前述のアッセイ法を実施する。
含む、このマトリックスは好ましくは複数のウェル例え
ば９６または１２ケのウェルを含むプラスチックマイク
ロタイタープレートまたはストリップであり、そのウェ
ル表面上で、前述のアッセイ法を実施する。
第２のパッケージは所定量の水親和性ほう化水素酸還元
剤を含む。この試剤は典型的には乾燥粉末として供給す
る。
剤を含む。この試剤は典型的には乾燥粉末として供給す
る。
第３のパッケージは公知量の適当なグリシドールリジン
特異性レセプター分子、好ましくはＡＴＣＣ寄託番号Ｈ
Ｂ８３５６およびＨＢ８３５８を有するハイブリドーマ
より分泌されたもののようなグルシトールリジン特異性
レセプターを含んでいる。これらのレセプター分子は典
型的には水性組成物としであるいは凍結乾燥粉末として
存在する。好ましい実施態様に右いては、レセプターは
前述したような指示基または標識に結合させて供給する
。
特異性レセプター分子、好ましくはＡＴＣＣ寄託番号Ｈ
Ｂ８３５６およびＨＢ８３５８を有するハイブリドーマ
より分泌されたもののようなグルシトールリジン特異性
レセプターを含んでいる。これらのレセプター分子は典
型的には水性組成物としであるいは凍結乾燥粉末として
存在する。好ましい実施態様に右いては、レセプターは
前述したような指示基または標識に結合させて供給する
。
第４のパッケージは所定量のフタル酸またはビフタル酸
を含む。この酸も水性媒体中に溶解しであるいは乾燥固
形分として供給できる。
を含む。この酸も水性媒体中に溶解しであるいは乾燥固
形分として供給できる。
好ましい実施態様はまた調製したレセプターと免疫反応
するグリシトールリジン二ヘモグロビン種を含む追加の
パッケージも含む。あるいは、好ましいのは、パッケー
ジが標準またはコントロールとして使用すべき公知割合
のクルシトールリジンを有するクルシトールリジンーヘ
モグロビンを含むことである。診断薬系においてさらに
含み得るパッケージには、ＰＢＳのようなバッファー塩
または溶液を含むもの、標識プロティンＡまたは標識抗
レセプター抗体のような別途にパッケージした指示手段
、別途にパッケージした過酸化水素および酸化性染料先
駆体のような酵素指示手段用の可視化用試剤、追加のコ
ントロール等がある。
するグリシトールリジン二ヘモグロビン種を含む追加の
パッケージも含む。あるいは、好ましいのは、パッケー
ジが標準またはコントロールとして使用すべき公知割合
のクルシトールリジンを有するクルシトールリジンーヘ
モグロビンを含むことである。診断薬系においてさらに
含み得るパッケージには、ＰＢＳのようなバッファー塩
または溶液を含むもの、標識プロティンＡまたは標識抗
レセプター抗体のような別途にパッケージした指示手段
、別途にパッケージした過酸化水素および酸化性染料先
駆体のような酵素指示手段用の可視化用試剤、追加のコ
ントロール等がある。
理解すべきことは診断薬系に含まれる各パッケージが適
当なコントロールを含む１つのアッセイを実施するのに
十分な量の内容物を含んでいるということである。好ま
しいのは、複数のアッセイを実施するのに十分な量が各
パッケージに含まれていることである。
当なコントロールを含む１つのアッセイを実施するのに
十分な量の内容物を含んでいるということである。好ま
しいのは、複数のアッセイを実施するのに十分な量が各
パッケージに含まれていることである。
日の ましい 誼
以下の実施例は例示を目的とするものであり、本発明を
限定するものではない。
限定するものではない。
実施例１
ヘモグロビン試料：
ヘモグロビン試料を年令１８〜８８才の範囲の男性と女
性の両方を含む１１８人の糖尿病患者から採取した。試
料は年令２４〜５２才の男性および女性を含む３５人の
正常成人〈血糖正常）からも採取した。これら試料はカ
ルホルニア州うジョラのエンドクリノロジーアンドジア
ベークスクリニックスオブスクリップスクリニックアン
トリサーチファンデーションおよびカルホルニア州すン
°ジェゴのカイザーパーマネントから採用した。
性の両方を含む１１８人の糖尿病患者から採取した。試
料は年令２４〜５２才の男性および女性を含む３５人の
正常成人〈血糖正常）からも採取した。これら試料はカ
ルホルニア州うジョラのエンドクリノロジーアンドジア
ベークスクリニックスオブスクリップスクリニックアン
トリサーチファンデーションおよびカルホルニア州すン
°ジェゴのカイザーパーマネントから採用した。
血液サンプルを抗凝集剤としてのエチレンジアミンテト
ラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むチューブに集め、ベツクマン
マイクロフニージ１２中で約１２．０００〜１３．００
０ｘｇで３分間遠心処理してバック詰赤血球（ＲＢＣ）
ペレットと血漿画分を調製した。血漿画分は廃棄しアッ
セイすべきヘモグロビン試料を典型的には１０〜１５マ
イクロリツターのペレット（パック詰ＲＢＣ）として調
製した。
ラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含むチューブに集め、ベツクマン
マイクロフニージ１２中で約１２．０００〜１３．００
０ｘｇで３分間遠心処理してバック詰赤血球（ＲＢＣ）
ペレットと血漿画分を調製した。血漿画分は廃棄しアッ
セイすべきヘモグロビン試料を典型的には１０〜１５マ
イクロリツターのペレット（パック詰ＲＢＣ）として調
製した。
バック詰ＲＢＣペレットのマイクロリッター当すノヘモ
グロビンのｍｇ数を測定するため、１容量のペレットを
１容量または３容量のアイソトン■（Ｉｓｏｔｏｎ ｍ
、コールタ−エレクトリック社、ヒーリー、ＦＬ）と混
合し、それぞれ１：２および１：４ペレツト希釈物を調
製した。各ペレット希釈物をヘモグロビン濃度について
モデルＳ−プラスＶｌコールターカウンター（コールタ
−エレクトリック社）を用い製造者の仕様書に従って分
析した。要するに、希釈物中に存在するヘモグロビンを
ドラプキン試薬（Ｄｒａｂｋｉｎ’ｓ ｒｅａｇｅｎ、
ｔ）を用いてシアンメトヘモグロビンに転化し、存在す
る量を５４０ノナメーター（ｎｍ）での吸収により分光
測光的に測定した。
グロビンのｍｇ数を測定するため、１容量のペレットを
１容量または３容量のアイソトン■（Ｉｓｏｔｏｎ ｍ
、コールタ−エレクトリック社、ヒーリー、ＦＬ）と混
合し、それぞれ１：２および１：４ペレツト希釈物を調
製した。各ペレット希釈物をヘモグロビン濃度について
モデルＳ−プラスＶｌコールターカウンター（コールタ
−エレクトリック社）を用い製造者の仕様書に従って分
析した。要するに、希釈物中に存在するヘモグロビンを
ドラプキン試薬（Ｄｒａｂｋｉｎ’ｓ ｒｅａｇｅｎ、
ｔ）を用いてシアンメトヘモグロビンに転化し、存在す
る量を５４０ノナメーター（ｎｍ）での吸収により分光
測光的に測定した。
パック詰ＲＢＣペレットのマイクロリッター（μｍ）当
りのヘモグロビン（Ｈｂ）のミリグラム（ｗ＋ｇ）の平
均数は０．２９４＋ｇＨｂ／μｌであることが判った。
りのヘモグロビン（Ｈｂ）のミリグラム（ｗ＋ｇ）の平
均数は０．２９４＋ｇＨｂ／μｌであることが判った。
しかしなから、計算をしやすくするために、この値は公
知容量のパック詰赤血球ペレフトとして調製したヘモグ
ロビン試料に基づくすべての比率決定のために０．３＋
ｗｇＨｂ／μｌに丸めた。
知容量のパック詰赤血球ペレフトとして調製したヘモグ
ロビン試料に基づくすべての比率決定のために０．３＋
ｗｇＨｂ／μｌに丸めた。
ヘモグロビン試料を公知容量の全血液として調製したと
きは、存在するヘモグロビンの量は男性から採取した試
料については１５５ｍｇＨｇ／ｖａｌおよび女性血液試
料については１３５＋＋＋ｇＨｂ／ｌａｌの平均値を用
いて決定した。
きは、存在するヘモグロビンの量は男性から採取した試
料については１５５ｍｇＨｇ／ｖａｌおよび女性血液試
料については１３５＋＋＋ｇＨｂ／ｌａｌの平均値を用
いて決定した。
実施例２
レセプターの富−１１および、＠ ヒ
ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８３５６を有するハイブリドーマ
は“カーチス等、Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 ＩｎｖｅｓＬ、
７２ ：１４２７−２８ （１９８３）”″に記載され
ているようにモノクローナル抗体Ｇ６Ｃ９を産生する。
は“カーチス等、Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 ＩｎｖｅｓＬ、
７２ ：１４２７−２８ （１９８３）”″に記載され
ているようにモノクローナル抗体Ｇ６Ｃ９を産生する。
Ｇ６Ｃ９レセプター分子を含む腹水腫腸液はｌＯ週令の
Ｂａ１ｂ／ｃマウスから取得し、これらマウスは各々０
．３ ｍ ｌの鉱油で感作し３−５０Ｘ１０’ＨＢ８３
５６細胞で腹空内注射したものであった。
Ｂａ１ｂ／ｃマウスから取得し、これらマウスは各々０
．３ ｍ ｌの鉱油で感作し３−５０Ｘ１０’ＨＢ８３
５６細胞で腹空内注射したものであった。
腹水の発育平均時間は１２日であった。１５． ＯＯＯ
ｘｇでの４℃、１時間の遠心による清澄化の後、腹水腫
腹液をプールし一２０℃で凍結保存した。
ｘｇでの４℃、１時間の遠心による清澄化の後、腹水腫
腹液をプールし一２０℃で凍結保存した。
Ｇ６Ｃ９レセプターは腹水腫瘍液をファルマシアＰＦＬ
Ｃシステム中のファルマシアモノＱＨＲ５１５アニオン
交換カラムでｌＱｍＭ）リス、ｐＨ８，０中の０−０．
５勾配を用いて急速たん白質液体クロマトグラフィーに
付しカラムに供給された流れを追跡することによって精
製した。
Ｃシステム中のファルマシアモノＱＨＲ５１５アニオン
交換カラムでｌＱｍＭ）リス、ｐＨ８，０中の０−０．
５勾配を用いて急速たん白質液体クロマトグラフィーに
付しカラムに供給された流れを追跡することによって精
製した。
精製Ｇ６Ｃ９レセプター分子は“ナカネ等、Ｊ、 ｔｌ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｎ＋０．２２： ｌ
Ｑ ３４−１０８９ （１９７４）”に記載された方
法を用いてホースラデッシ二パーオヰシダーゼに結合さ
せた。これらのレセプターは以後ＨＲＰ ０−Ｇ６Ｃ９
レセプターと称する。
ｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｎ＋０．２２： ｌ
Ｑ ３４−１０８９ （１９７４）”に記載された方
法を用いてホースラデッシ二パーオヰシダーゼに結合さ
せた。これらのレセプターは以後ＨＲＰ ０−Ｇ６Ｃ９
レセプターと称する。
実施例３
グルコシル化付加物の調製
次のたん白質と先駆体をグリコジル化および／または還
元せしめた：ポリーＬ−リジン、ポリーＬ−バリン（シ
グマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）、アルファーＴ
−Ｂｏｃ−リジン（バケム社、トランス、ＣＡ）、精製
ヒトヘモグロビン（シグマ社）、および“シュワルツ等
、Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
元せしめた：ポリーＬ−リジン、ポリーＬ−バリン（シ
グマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）、アルファーＴ
−Ｂｏｃ−リジン（バケム社、トランス、ＣＡ）、精製
ヒトヘモグロビン（シグマ社）、および“シュワルツ等
、Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
■肚社虹、１８１：５４２−５４９ （１９７７）
″により記載された方法により調製したクルシトールリ
ジン。
″により記載された方法により調製したクルシトールリ
ジン。
グルコシル化し還元した付加物はｇｌｃ −ＲＥ Ｄア
ダクトと称する。ｇｌｃ−ＲＥＤアダクトは上記各種た
ん白質と先駆体の１５ミリグラム／ミリリツター（ｍｇ
／ｍ ｐ ）溶液、２＋ｎＪをりん酸緩衝塩水（Ｐ Ｂ
Ｓ）中２４０ｍＭグルコース（シグマ社）、２＋ｌＩ
ｌおよびＰＢＳ （ｐＨ７，４）中３７．５ｍｇ／ｎ＋
ＩＮａＣＮＢＨｓ （Ｊ 、 Ｔ 、ベーカーケミカル
社、フィリップパーグ、ＮＪ） 、２＋＊ｌと混合する
ことによって調製した。得られた混合物を密閉ガラスチ
ューブ（１６Ｘ１００ｍ）中で１２０時間、３７℃に保
持した。アダクトを透析バッグ（スペクトラフォール社
、分子遮断３．５００ｍｗ）に移し、ＰＢＳに対し７２
時間、４℃で完全に透析し、最終温度約５ｎ＋ｇ／ｍＪ
に調整し、４℃で貯蔵した。
ダクトと称する。ｇｌｃ−ＲＥＤアダクトは上記各種た
ん白質と先駆体の１５ミリグラム／ミリリツター（ｍｇ
／ｍ ｐ ）溶液、２＋ｎＪをりん酸緩衝塩水（Ｐ Ｂ
Ｓ）中２４０ｍＭグルコース（シグマ社）、２＋ｌＩ
ｌおよびＰＢＳ （ｐＨ７，４）中３７．５ｍｇ／ｎ＋
ＩＮａＣＮＢＨｓ （Ｊ 、 Ｔ 、ベーカーケミカル
社、フィリップパーグ、ＮＪ） 、２＋＊ｌと混合する
ことによって調製した。得られた混合物を密閉ガラスチ
ューブ（１６Ｘ１００ｍ）中で１２０時間、３７℃に保
持した。アダクトを透析バッグ（スペクトラフォール社
、分子遮断３．５００ｍｗ）に移し、ＰＢＳに対し７２
時間、４℃で完全に透析し、最終温度約５ｎ＋ｇ／ｍＪ
に調整し、４℃で貯蔵した。
グルコシル化は行ったが還元してないアダクトコントロ
ール（ｇｌｃ−ＮＲ）を上記の手順においてＮａＣＮＢ
Ｈｉを２１１ＩｌのＰＢＳに置き換えて調製した。グル
コシル化なしの還元コントロール（ＲＥＤ−アダクト）
は上記手順において２４０ｍＭグルコースを２ｔａｌ
Ｐ Ｂ Ｓに置き換えて調製した。
ール（ｇｌｃ−ＮＲ）を上記の手順においてＮａＣＮＢ
Ｈｉを２１１ＩｌのＰＢＳに置き換えて調製した。グル
コシル化なしの還元コントロール（ＲＥＤ−アダクト）
は上記手順において２４０ｍＭグルコースを２ｔａｌ
Ｐ Ｂ Ｓに置き換えて調製した。
実施例４
ｓＩｌｌによる 寺 のゝ
実施例３で調製したｇｌｃ −ＲＥ Ｄ、 ｇｌｃ −
Ｎ ＲおよびＲＥＤ−アダクトを１０％の正常ヤギ血清
（ＮＧＳ）含有ＰＢＳ中で２００μｇ ／ｖａ １〜０
．３９μｇ／ｍｚで変化する濃度に希釈した。
Ｎ ＲおよびＲＥＤ−アダクトを１０％の正常ヤギ血清
（ＮＧＳ）含有ＰＢＳ中で２００μｇ ／ｖａ １〜０
．３９μｇ／ｍｚで変化する濃度に希釈した。
５００μｌの各種希釈物を実施例２で調製したＨＲＰＯ
−０６Ｃ９レセプター５００μｌとガラスチューブ内で
混合しく１０％ＮＧＳ含有ＰＢＳ中での希釈１：１５０
）、拮抗免疫反応混合物を調製した。混合物を１時間、
３７℃で保持して上記レセプターを任意のクルシトール
リジン残基含有またはクルシトールリジン不含有で交差
反応性のエピトープと免疫学的に結合せしめ液相免疫反
応体を形成させた。
−０６Ｃ９レセプター５００μｌとガラスチューブ内で
混合しく１０％ＮＧＳ含有ＰＢＳ中での希釈１：１５０
）、拮抗免疫反応混合物を調製した。混合物を１時間、
３７℃で保持して上記レセプターを任意のクルシトール
リジン残基含有またはクルシトールリジン不含有で交差
反応性のエピトープと免疫学的に結合せしめ液相免疫反
応体を形成させた。
次に、上記の保持した拮抗免疫反応混合物を結合してな
いＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９レセプターの量についてアッセイ
した。このアッセイは固相−固定クルシトールリジンー
ヘモグロビンをターゲットまたは捕獲用抗原として用い
ＥＬ Ｉ ＳＡ中で行った。
いＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９レセプターの量についてアッセイ
した。このアッセイは固相−固定クルシトールリジンー
ヘモグロビンをターゲットまたは捕獲用抗原として用い
ＥＬ Ｉ ＳＡ中で行った。
固相−固定クルシトールリジンーヘモグロビンは糖尿病
患者の血液を用いて実施例１の手順に従って調製したパ
ック詰ＲＢＣペレット、０．２４０ＩＩｌを０．０５ｍ
Ｍフタル酸含有蒸留水、１５ｍｆと混合（１：６２．５
容量希釈）することによって調製した。得られた酸反応
混合物を１５分間、３７℃に保持し溶血液を調製した。
患者の血液を用いて実施例１の手順に従って調製したパ
ック詰ＲＢＣペレット、０．２４０ＩＩｌを０．０５ｍ
Ｍフタル酸含有蒸留水、１５ｍｆと混合（１：６２．５
容量希釈）することによって調製した。得られた酸反応
混合物を１５分間、３７℃に保持し溶血液を調製した。
続いて、５０μｌの溶血液を５０μｌの４００ｍＭ Ｎ
ａＢＨｎとマイクロタイタープレートウェル（固形マト
リックス）中で混合した。得られた還元反応混合物を１
５分間、３７℃に保持してクルシトールリジンーへモダ
６ビンを形成せしめた。
ａＢＨｎとマイクロタイタープレートウェル（固形マト
リックス）中で混合した。得られた還元反応混合物を１
５分間、３７℃に保持してクルシトールリジンーへモダ
６ビンを形成せしめた。
このクルシトールリジンーヘモグロビンは、上記保持時
間の終了までに、固相マトリックスに固定して固相−固
定クルシトールリジンーへモグロビン（固形支持体）お
よび未反応ほう化水素酸塩と還元反応混合物の残余とを
含む液相とを形成した。
間の終了までに、固相マトリックスに固定して固相−固
定クルシトールリジンーへモグロビン（固形支持体）お
よび未反応ほう化水素酸塩と還元反応混合物の残余とを
含む液相とを形成した。
得られた混合物の固相および液相とを分離した。
次いで、固形マトリックスのウェル壁に固定した吸着ク
ルシトールリジンーヘモグロビンによって形成された固
形支持体を０．０５％トウィーン２０〔ポリオキシエチ
レン（２０）ソルビタンモノオレート〕含有ＰＢＳ、３
５０＃ｆで４回洗浄して単離した固相−固定クルシトー
ルリジンーヘモグロビンを調製した。
ルシトールリジンーヘモグロビンによって形成された固
形支持体を０．０５％トウィーン２０〔ポリオキシエチ
レン（２０）ソルビタンモノオレート〕含有ＰＢＳ、３
５０＃ｆで４回洗浄して単離した固相−固定クルシトー
ルリジンーヘモグロビンを調製した。
上記保持したＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９／アゲスト拮抗免疫反
応混合物の１００μ！容量を固相−固定クルシトールリ
ジンーヘモグロビンと混合した。
応混合物の１００μ！容量を固相−固定クルシトールリ
ジンーヘモグロビンと混合した。
かくして得られた第２の液／固相免疫反応混合物を１５
分間、３７℃に保持してアダクトインヒビターまたはコ
ントロールと免疫反応していない抗体分子を固相クルシ
トールリジンーヘモグロビンと免疫学的に結合せしめ固
相−固定免疫反応体を形成させた。
分間、３７℃に保持してアダクトインヒビターまたはコ
ントロールと免疫反応していない抗体分子を固相クルシ
トールリジンーヘモグロビンと免疫学的に結合せしめ固
相−固定免疫反応体を形成させた。
固相および液相を再び分離し、形成した固相−固定免疫
反応体をさらに液相からデカンティションにより分離し
、各ウェルを洗浄液（０，０５）ウィーン２０含有ＰＢ
Ｓ）で４回洗浄した。形成した固相−固定免疫反応体の
量をウェルに１００μｌの新しく調製したＨＲＰＯ基質
溶液〔蒸留水中の０．０１２５％Ｈｔ Ｏｔおよび０．
６７ｍｇ／ｍｊ！。
反応体をさらに液相からデカンティションにより分離し
、各ウェルを洗浄液（０，０５）ウィーン２０含有ＰＢ
Ｓ）で４回洗浄した。形成した固相−固定免疫反応体の
量をウェルに１００μｌの新しく調製したＨＲＰＯ基質
溶液〔蒸留水中の０．０１２５％Ｈｔ Ｏｔおよび０．
６７ｍｇ／ｍｊ！。
−フェニレンジアミン（ｏｐｐ））を混合することによ
って測定した。室温（約２０〜約２５℃）、５分間で発
色させた０次いで、基質転化（発色）反応を各ウェルに
５０μｌの４ Ｎ ｕｚｓｏ４を加えることによって停
止させた。溶液の光学密度（０，Ｄ、）を４９０ｎｍの
波長でダイナチックＭＲ６００（ダイナチック社、アレ
キサンドリア、ＶＡ）マイクロタイタープレートリーダ
ーを用いて測定した。この試験の結果は第２Ａ、Ｂおよ
び０図に示している。これらの結果は還元したがグルコ
シル化してないアダクト（第２Ａ図）およびグルコシル
化しているが還元していないアダクト（第２図）はＨＲ
ＰＯ−Ｇ６Ｃ９が固相−固定クルシトールリジンーヘモ
グロビンに結合するのを抑制してなかったことを示して
いる。しかしなから、第２Ｃ図に示しているように、グ
ルコシル化し還元したリジン含有たん白質および先駆体
、即ち、クルシトールリジンはＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９と固
相−固定クルシトールリジンーヘモグロビンの極めて効
果的なインヒビターであったが、グルコシル化し還元し
たポリーＬ−バリンは有効でなかった。面相免疫反応体
の形成を抑制するアダクトに共通する構造上の特徴はク
ルシトールリジン残基の存在であるので、この試験の結
果はＧ６Ｃ９レセプターがクルシトールリジン含有エピ
トープと、該エピトープを面相−固定クルシトールリジ
ンーヘモグロビンとして存在させたとき、免疫反応する
ことを示している。
って測定した。室温（約２０〜約２５℃）、５分間で発
色させた０次いで、基質転化（発色）反応を各ウェルに
５０μｌの４ Ｎ ｕｚｓｏ４を加えることによって停
止させた。溶液の光学密度（０，Ｄ、）を４９０ｎｍの
波長でダイナチックＭＲ６００（ダイナチック社、アレ
キサンドリア、ＶＡ）マイクロタイタープレートリーダ
ーを用いて測定した。この試験の結果は第２Ａ、Ｂおよ
び０図に示している。これらの結果は還元したがグルコ
シル化してないアダクト（第２Ａ図）およびグルコシル
化しているが還元していないアダクト（第２図）はＨＲ
ＰＯ−Ｇ６Ｃ９が固相−固定クルシトールリジンーヘモ
グロビンに結合するのを抑制してなかったことを示して
いる。しかしなから、第２Ｃ図に示しているように、グ
ルコシル化し還元したリジン含有たん白質および先駆体
、即ち、クルシトールリジンはＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９と固
相−固定クルシトールリジンーヘモグロビンの極めて効
果的なインヒビターであったが、グルコシル化し還元し
たポリーＬ−バリンは有効でなかった。面相免疫反応体
の形成を抑制するアダクトに共通する構造上の特徴はク
ルシトールリジン残基の存在であるので、この試験の結
果はＧ６Ｃ９レセプターがクルシトールリジン含有エピ
トープと、該エピトープを面相−固定クルシトールリジ
ンーヘモグロビンとして存在させたとき、免疫反応する
ことを示している。
実施例５
還元最適化
ａ、水親和性還元剤
前述したように、クルシトールリジンはリジンのニブシ
ロンアミノ基に共有結合した還元ヘキソースアルコール
形である。次の試験は種々の水親和性ほう化水素酸塩還
元剤をその種々の条件下でヘモグロビン上にクルシトー
ルリジン残基を形成させる能力について試験するために
行った。
ロンアミノ基に共有結合した還元ヘキソースアルコール
形である。次の試験は種々の水親和性ほう化水素酸塩還
元剤をその種々の条件下でヘモグロビン上にクルシトー
ルリジン残基を形成させる能力について試験するために
行った。
ヘモグロビン試料は正常人および糖尿病患者からの血液
を用い実施例１に記載したようにして調製した１０μｌ
のパック詰ＲＢＣペレット（約３ｍｇのヘモグロビン）
として調製した。各試料中のグルコシル化ヘモグロビン
のパーセントを市販のＧＬＹ−ＡＦＦＩＮ ＧＨｂア
ッセイシステム（Ｉｓｏｌａｂ社、アクロン、ＯＨ）を
用いて測定して正常試料において６．３％、糖尿病試料
において８．９％であることが判った。即ち、糖尿病試
料中のグルコシル化ヘモグロビンは正常人試料に較べ約
１．４倍であった。試料を、各々、６１５μｌの蒸留水
が０．０５Ｍフタル酸と混合した。これにより、約４．
８＋ｇ／■ｌの濃度でヘモグロビンを含む混合物が生じ
、酸を用いた場合には、ヘモグロビンのミリグラム当り
少なくとも約ｌＯマイクロモルの酸の比率が生じた。
を用い実施例１に記載したようにして調製した１０μｌ
のパック詰ＲＢＣペレット（約３ｍｇのヘモグロビン）
として調製した。各試料中のグルコシル化ヘモグロビン
のパーセントを市販のＧＬＹ−ＡＦＦＩＮ ＧＨｂア
ッセイシステム（Ｉｓｏｌａｂ社、アクロン、ＯＨ）を
用いて測定して正常試料において６．３％、糖尿病試料
において８．９％であることが判った。即ち、糖尿病試
料中のグルコシル化ヘモグロビンは正常人試料に較べ約
１．４倍であった。試料を、各々、６１５μｌの蒸留水
が０．０５Ｍフタル酸と混合した。これにより、約４．
８＋ｇ／■ｌの濃度でヘモグロビンを含む混合物が生じ
、酸を用いた場合には、ヘモグロビンのミリグラム当り
少なくとも約ｌＯマイクロモルの酸の比率が生じた。
得られた混合物を１５分間、３７℃に保持した。
この間に、各混合物中に存在する実質的にすべてのＲＢ
Ｃが溶解し、それによって混合物中に含まれるヘモグロ
ビンを溶液中に分離し溶血液を形成した。
Ｃが溶解し、それによって混合物中に含まれるヘモグロ
ビンを溶液中に分離し溶血液を形成した。
続いて、５０μｌの各溶血液（約０．２４μｌｇのヘモ
グロビン）をマイクロタイタープレートウェル中で５０
μｌの種々の濃度のＮａＢＩＩ４またはＫＢ）＋４と混
合して還元反応混合物を調製した。これらの混合物を１
５分間、３７℃に保持した。この間に、そのニブシロン
アミノ基に共有結合したグルコースを有するヘモグロビ
ンリジン残基が還元されてクルシトールリジン残基を形
成した。さらに、２形成したクルシトールリジンーヘモ
グロビンを吸着によりマイクロタイタープレートウェル
の壁に固定させた、即ち、面相結合クルシトールリジン
ーヘモグロビンを形成させた。
グロビン）をマイクロタイタープレートウェル中で５０
μｌの種々の濃度のＮａＢＩＩ４またはＫＢ）＋４と混
合して還元反応混合物を調製した。これらの混合物を１
５分間、３７℃に保持した。この間に、そのニブシロン
アミノ基に共有結合したグルコースを有するヘモグロビ
ンリジン残基が還元されてクルシトールリジン残基を形
成した。さらに、２形成したクルシトールリジンーヘモ
グロビンを吸着によりマイクロタイタープレートウェル
の壁に固定させた、即ち、面相結合クルシトールリジン
ーヘモグロビンを形成させた。
固相−および液相をデカンティシランにより分離した。
各ウェルを洗浄溶液で４回洗浄して固相−固定（マイク
ロタイタープレートウェル結合）クルシトールリジンー
ヘモグロビンから未°反応ほう化水素酸塩をさらに除去
した。
ロタイタープレートウェル結合）クルシトールリジンー
ヘモグロビンから未°反応ほう化水素酸塩をさらに除去
した。
次いで、各ウェルに、１００μｌの実施例２で得たホー
スラディツシュパーオキシダーゼ標識Ｇ６Ｃ９（ＨＲＰ
Ｏ−０６Ｃ９） レセプターを混合して免疫反応混合物
を調製した。この混合物を１５分間、３７℃に保持し、
それによって標識レセプターを存在する固相−固定（マ
イクロタイター７”レートウェル結合）クルシトールリ
ジンーヘモグロビンと免疫学的に反応させ固相−固定（
マイクロタイクープレートウェル結合）免疫反応体を形
成させた。未免疫反応（未結合）ＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９を
ウェルからデカンティションにより除去し次いで洗浄溶
液で５回洗浄した。次いで、形成した固相−結合免疫反
応体を実施例４に記載したようにして測定した。
スラディツシュパーオキシダーゼ標識Ｇ６Ｃ９（ＨＲＰ
Ｏ−０６Ｃ９） レセプターを混合して免疫反応混合物
を調製した。この混合物を１５分間、３７℃に保持し、
それによって標識レセプターを存在する固相−固定（マ
イクロタイター７”レートウェル結合）クルシトールリ
ジンーヘモグロビンと免疫学的に反応させ固相−固定（
マイクロタイクープレートウェル結合）免疫反応体を形
成させた。未免疫反応（未結合）ＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９を
ウェルからデカンティションにより除去し次いで洗浄溶
液で５回洗浄した。次いで、形成した固相−結合免疫反
応体を実施例４に記載したようにして測定した。
この試験の結果は第３ＡおよびＢ図に示しており、いく
つかの興味ある現象を示している。第１は、第３Ａおよ
びＢ図から明らかなように、水親和性ほう化水素酸塩還
元剤としてほう化水素酸ナトリウムまたカリウムのいず
れも用いても得られた結果に実質的差異はなかったこと
である。
つかの興味ある現象を示している。第１は、第３Ａおよ
びＢ図から明らかなように、水親和性ほう化水素酸塩還
元剤としてほう化水素酸ナトリウムまたカリウムのいず
れも用いても得られた結果に実質的差異はなかったこと
である。
第２は、第３Ａ図から、酸の不存在下での還元（クルシ
トールリジン形成）が、予期されたように、グルコヘモ
グロビンを多量に含む試料、即ち、糖尿病試料中ではよ
り多くの数のレセプター結合りルシトールリジン残基含
有エピトープを産生ずることを示していることである。
トールリジン形成）が、予期されたように、グルコヘモ
グロビンを多量に含む試料、即ち、糖尿病試料中ではよ
り多くの数のレセプター結合りルシトールリジン残基含
有エピトープを産生ずることを示していることである。
しかしなから、これらの結果を還元を酸の存在下で行っ
たときの結果（第３Ｂ図）と比較した場合ミより多数の
レセプター結合りルシトールリジン残基途、フタル酸不
存在下で生じた数に比較し、両方のヘモグロビン試料に
おいて生じている。しかも、還元をフタル酸の不存在下
で行った場合（第３Ａ図）に比較し、還元をフタル酸の
存在下で行った場合（第３Ｂ図）において正常試料と糖
尿病試料間のレセプター結合りルシトールリジン残基の
数に大きい差がある。これら２つの知見はフタル酸の存
在が水親和性ほう化水素酸塩還元剤のクルシトールリジ
ン残基含有エピトープの産生じかつ赤血球を溶解し不安
定グルコヘモグロビンを除去する能力を予想外に増強し
ていることを示している。
たときの結果（第３Ｂ図）と比較した場合ミより多数の
レセプター結合りルシトールリジン残基途、フタル酸不
存在下で生じた数に比較し、両方のヘモグロビン試料に
おいて生じている。しかも、還元をフタル酸の不存在下
で行った場合（第３Ａ図）に比較し、還元をフタル酸の
存在下で行った場合（第３Ｂ図）において正常試料と糖
尿病試料間のレセプター結合りルシトールリジン残基の
数に大きい差がある。これら２つの知見はフタル酸の存
在が水親和性ほう化水素酸塩還元剤のクルシトールリジ
ン残基含有エピトープの産生じかつ赤血球を溶解し不安
定グルコヘモグロビンを除去する能力を予想外に増強し
ていることを示している。
最後に、第３Ａ図の結果を第３Ｂ図の結果と比較した場
合、ヘモグロビン試料をフタル酸とヘモグロビンのミリ
グラム当り少なくとも約１０μＭの酸の比較で混合した
ときは、還元反応はヘモグロビンをほう化水素酸塩とｍ
ｇヘモグロビン当り少なくとも約２．６μＭのほう化水
素酸塩程の低い比率で混合したときでさえも増強されて
いることが理解できる。
合、ヘモグロビン試料をフタル酸とヘモグロビンのミリ
グラム当り少なくとも約１０μＭの酸の比較で混合した
ときは、還元反応はヘモグロビンをほう化水素酸塩とｍ
ｇヘモグロビン当り少なくとも約２．６μＭのほう化水
素酸塩程の低い比率で混合したときでさえも増強されて
いることが理解できる。
上記の知見は従来技術の教示と相反するものであり、従
って、予想外であった。前述したように、従来技術はＲ
ＢＣから得られたヘモグロビン試料中のグルコヘモグロ
ビンの総量は不安定および安定グルコヘモグロビン画分
の和であると教示している。′ビッセ（Ｂｉｓｓｅ）等
、Ｄｉａｂｅｔｅｓｓ ３１ ：６３０−６３３ （１
９８２） ”によれば、不安定画分はヘモグロビン試料
からビフタル酸による処理によって除去される、即ち、
アッセイ可能なグルコヘモグロビンの量はビフタル酸処
理試料においては減少する。従って、従来技術は、試料
中のグルコヘモグロビンの量を測定するアッセイにおい
ては、その除去した不安定画分を有す諷試料によって生
じた信号は匹敵する除去してない試料によって生じた信
号よりも小であるべきである。
って、予想外であった。前述したように、従来技術はＲ
ＢＣから得られたヘモグロビン試料中のグルコヘモグロ
ビンの総量は不安定および安定グルコヘモグロビン画分
の和であると教示している。′ビッセ（Ｂｉｓｓｅ）等
、Ｄｉａｂｅｔｅｓｓ ３１ ：６３０−６３３ （１
９８２） ”によれば、不安定画分はヘモグロビン試料
からビフタル酸による処理によって除去される、即ち、
アッセイ可能なグルコヘモグロビンの量はビフタル酸処
理試料においては減少する。従って、従来技術は、試料
中のグルコヘモグロビンの量を測定するアッセイにおい
ては、その除去した不安定画分を有す諷試料によって生
じた信号は匹敵する除去してない試料によって生じた信
号よりも小であるべきである。
ｂ・ ”５− 心ｍ −持ｌｌ ヨ酸反応混合物を
１人の糖尿病女性患者および１人の正常人女性の各々か
らの全血液試料として調製した。各混合物中のフタル酸
濃度は一定の０．０５Ｍであった。しかしなから、ヘモ
グロビン濃度は２７．０ｍｇ／ｎｊ！〜０．２７μｇ／
ｍｌｌに変化し、それによって１．８５〜１８５．２の
範囲のｍＭ酸ＺＩ１ｇＨｂ比を生じた。酸反応混合物は
すべて１５分間、３７℃に保持して溶血液を調製した。
１人の糖尿病女性患者および１人の正常人女性の各々か
らの全血液試料として調製した。各混合物中のフタル酸
濃度は一定の０．０５Ｍであった。しかしなから、ヘモ
グロビン濃度は２７．０ｍｇ／ｎｊ！〜０．２７μｇ／
ｍｌｌに変化し、それによって１．８５〜１８５．２の
範囲のｍＭ酸ＺＩ１ｇＨｂ比を生じた。酸反応混合物は
すべて１５分間、３７℃に保持して溶血液を調製した。
次に、還元反応混合物を、５０μｌの各溶血液と５０μ
ｌのＮａＢＨ４を混合することにより２通り調製し、そ
れによって０．０１４８＝’１．４８１の範囲のｍＭほ
う化水素酸塩／ｍｇＨｂ比を生じた。還元反応混合物の
１つのセントを１５分間、他のセットを３０分間、それ
ぞれ、３７℃に保持した。
ｌのＮａＢＨ４を混合することにより２通り調製し、そ
れによって０．０１４８＝’１．４８１の範囲のｍＭほ
う化水素酸塩／ｍｇＨｂ比を生じた。還元反応混合物の
１つのセントを１５分間、他のセットを３０分間、それ
ぞれ、３７℃に保持した。
各試料は、その後、未反応ほう化水素酸塩および残余の
還元反応混合物成分から分離し、洗浄し、実施例４に記
載したようにしてクルシトールリジンーヘモグロビンに
ついてアッセイした。
還元反応混合物成分から分離し、洗浄し、実施例４に記
載したようにしてクルシトールリジンーヘモグロビンに
ついてアッセイした。
第４図から明らかなように、この試験の結果は１５分ま
たは３０分間の還元反応保持時間が試験したすべてのヘ
モグロビン濃度において糖尿病および正常試料中で測定
可能な量のクルシトールリジンーヘモグロビンを産生し
ていることを示している。また、アッセイ可能なクルシ
トールリジン産生の最適比は、ヘモグロビンがそれぞれ
の反応において１．０・８ｍｇ／ｍ１と０．５４ｍｇ／
ｍｊ！の濃度で存在するとき、酸反応混合物において４
６．３ ｍＭ酸／ｍｇＨｂであり還元反応混合物におい
て０．３７ｍＭほう化水素酸塩／ａ＋ｇＨｂであること
が判明したことにも注目すべきである。
たは３０分間の還元反応保持時間が試験したすべてのヘ
モグロビン濃度において糖尿病および正常試料中で測定
可能な量のクルシトールリジンーヘモグロビンを産生し
ていることを示している。また、アッセイ可能なクルシ
トールリジン産生の最適比は、ヘモグロビンがそれぞれ
の反応において１．０・８ｍｇ／ｍ１と０．５４ｍｇ／
ｍｊ！の濃度で存在するとき、酸反応混合物において４
６．３ ｍＭ酸／ｍｇＨｂであり還元反応混合物におい
て０．３７ｍＭほう化水素酸塩／ａ＋ｇＨｂであること
が判明したことにも注目すべきである。
実施例６
不安定グルコヘモグロビンのグルコースとヘモグロビン
への分解は約５のｐｉ値を有する溶液中で酸触媒される
ことが報告されている。ビッセ等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、
３１ ： ６３０−６３３ （１９８２）不安定グル
コヘモグロビンの報告されたｐＨ依存安定性が使用する
酸の種類によって影響されるかどう、かを測定するため
に、フタル酸、クエン酸、酢酸、りん酸塩、Ｄ ｌＯ）
グルコサミン、アルファーケトグルグル酸、オキサロ
酸、シュー酸二カリウム酸、コハク酸またはピルビン酸
を含む溶液を０．０５ Ｍの濃度および４〜５の範囲の
ｐｉ値で調製した。
への分解は約５のｐｉ値を有する溶液中で酸触媒される
ことが報告されている。ビッセ等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、
３１ ： ６３０−６３３ （１９８２）不安定グル
コヘモグロビンの報告されたｐＨ依存安定性が使用する
酸の種類によって影響されるかどう、かを測定するため
に、フタル酸、クエン酸、酢酸、りん酸塩、Ｄ ｌＯ）
グルコサミン、アルファーケトグルグル酸、オキサロ
酸、シュー酸二カリウム酸、コハク酸またはピルビン酸
を含む溶液を０．０５ Ｍの濃度および４〜５の範囲の
ｐｉ値で調製した。
１０μｌのパック詰ＲＢＣペレットとして調製したヘモ
グロビン試料を糖尿°病および正常人から得た血液から
実施例１に記載したようにして調製した。？！！尿病試
料および正常人試料を、各々、６１５μｌの上記各酸溶
液と混合して酸反応混合物をまな６１５μｌの蒸留水と
混合してコントロールを調製した。
グロビン試料を糖尿°病および正常人から得た血液から
実施例１に記載したようにして調製した。？！！尿病試
料および正常人試料を、各々、６１５μｌの上記各酸溶
液と混合して酸反応混合物をまな６１５μｌの蒸留水と
混合してコントロールを調製した。
さらに、バック詰ＲＢＣペレットを等張塩水中で一夜（
約１８時間）インキュベートした糖尿病および正常人か
らのＲＢＣから調製した。これらペレットの各々からの
１０μｌを６１５μｌの０．０５７タル酸または蒸留水
とコントロールとして混合した。
約１８時間）インキュベートした糖尿病および正常人か
らのＲＢＣから調製した。これらペレットの各々からの
１０μｌを６１５μｌの０．０５７タル酸または蒸留水
とコントロールとして混合した。
かくして調製した酸反応溶液およびコントロールを３７
℃、１５分間保持して溶血液を調製した。
℃、１５分間保持して溶血液を調製した。
次いで、グルシトール−ヘモグロビンを形成し、実施例
４で記載したようにして各溶血液の５０ｐｇのアリコー
ト、ＮａＢＨ，およびＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９を用いてアッ
セイした。
４で記載したようにして各溶血液の５０ｐｇのアリコー
ト、ＮａＢＨ，およびＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９を用いてアッ
セイした。
この試験の結果は第５図に示しである。これらの結果は
グルコヘモグロビンをほう化水素酸塩による還元前にフ
タル酸と反応させると他の試験した酸に比しクルシトー
ルリジン残基の形成を著しく増強することを示している
。
グルコヘモグロビンをほう化水素酸塩による還元前にフ
タル酸と反応させると他の試験した酸に比しクルシトー
ルリジン残基の形成を著しく増強することを示している
。
ｂ−敢Ｉ度
クルシトールリジンーへモグロビン産生およびアッセイ
性能へのｐＨ４〜５範囲内でのフタル酸濃度の効果を試
験するために、フタル酸濃度０．０５Ｍまたは０．０２
５Ｍを有する酸反応混合物を、ヘモグロビン濃度７５．
５０．３７．５．３０．２５、または２１．４ｓｇＨｂ
／・ｌを有するようＣ５ｌ製した、即ち、０．０５ Ｍ
フタル酸を含む混合物には０．６６〜約２．３４のｍＭ
フタル酸／ｌｌ１ｇヘモグロビンの範囲の比が存在した
。同様に、０．０２５Ｍフタル酸混合物中には、比の範
囲は０．３３〜１．１７であった。ヘモグロビンは実施
例１で記載したようにして１人の糖尿病患者の血液から
調製した所定容量のパック詰ＲＢＣペレットとして調製
した。
性能へのｐＨ４〜５範囲内でのフタル酸濃度の効果を試
験するために、フタル酸濃度０．０５Ｍまたは０．０２
５Ｍを有する酸反応混合物を、ヘモグロビン濃度７５．
５０．３７．５．３０．２５、または２１．４ｓｇＨｂ
／・ｌを有するようＣ５ｌ製した、即ち、０．０５ Ｍ
フタル酸を含む混合物には０．６６〜約２．３４のｍＭ
フタル酸／ｌｌ１ｇヘモグロビンの範囲の比が存在した
。同様に、０．０２５Ｍフタル酸混合物中には、比の範
囲は０．３３〜１．１７であった。ヘモグロビンは実施
例１で記載したようにして１人の糖尿病患者の血液から
調製した所定容量のパック詰ＲＢＣペレットとして調製
した。
得られた酸反応混合物を１５分間、３７℃に保持して溶
血液を調製した。次いで、クルシトールリジンーへモグ
ロビシを形成し、実施例４で記載したようにして５０μ
ｌの各溶血液、ＮａＢＩＩａおよびＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９
レセプターを用いてアッセイした。
血液を調製した。次いで、クルシトールリジンーへモグ
ロビシを形成し、実施例４で記載したようにして５０μ
ｌの各溶血液、ＮａＢＩＩａおよびＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９
レセプターを用いてアッセイした。
第６図はこの試験の結果を示す。これらの結果は０．０
５Ｍおよび０．０２５Ｍフタル酸反応混合物は、共に、
ｍＭ酸／ｍｇヘモグロビンの比が約１．００約２．３４
の間にあるとき、標識レセプターが結合したクルシトー
ルリジン残基含有エピトープの形成を増強していたこと
を示している。
５Ｍおよび０．０２５Ｍフタル酸反応混合物は、共に、
ｍＭ酸／ｍｇヘモグロビンの比が約１．００約２．３４
の間にあるとき、標識レセプターが結合したクルシトー
ルリジン残基含有エピトープの形成を増強していたこと
を示している。
さらに、第６図に示された結果はフタル酸単独による反
応はアッセイ可能なクルシトールリジンを産生しないこ
とを示している。
応はアッセイ可能なクルシトールリジンを産生しないこ
とを示している。
Ｃ０敢ル位
ｐ１１値３．５．４．５．５．５および６．５を有する
０、０５Ｍフタル酸含有ストック溶液を調製した。次い
で、４種の酸反応混合物を各ストック溶液を用いて調製
した。２つの糖尿病試料と２つの正常試料の各々を用い
て実施例１におけるようにして得た１０μｌのパック詰
ＲＢＣペレットとして調製したヘモグロビン試料を各ス
トック溶液の６１５μｌと混合した。得られた酸反応混
合物を１５分間、３７℃に保持して溶血液を調製した。
０、０５Ｍフタル酸含有ストック溶液を調製した。次い
で、４種の酸反応混合物を各ストック溶液を用いて調製
した。２つの糖尿病試料と２つの正常試料の各々を用い
て実施例１におけるようにして得た１０μｌのパック詰
ＲＢＣペレットとして調製したヘモグロビン試料を各ス
トック溶液の６１５μｌと混合した。得られた酸反応混
合物を１５分間、３７℃に保持して溶血液を調製した。
次いで、クルシトールリジンーヘモグロビンを調製し、
実施例４で記載したようにして５０μｌの各溶血液、Ｎ
ａＢ）Ｉ４およびＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９レセプターを用い
てアッセイした。
実施例４で記載したようにして５０μｌの各溶血液、Ｎ
ａＢ）Ｉ４およびＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９レセプターを用い
てアッセイした。
第７図はこの試料の結果を示し、最大数の免疫学的に結
合可能なクルシトールリジン残基が約３．５のｐｏ値を
有するフタル酸を用いて調製した溶血液で行ったアッセ
イにおいて産生されていたことを示している。しかしな
から、正常試料と糖尿病試料との間の信号（光学密度）
の最大の差を生ずるｐＨ値は４．５であった。さらにま
た、ｐＨ値５．５および６．５を有するフタル酸溶液の
使用も測定可能な量のクルシトールリジン残基を産生じ
ていた。
合可能なクルシトールリジン残基が約３．５のｐｏ値を
有するフタル酸を用いて調製した溶血液で行ったアッセ
イにおいて産生されていたことを示している。しかしな
から、正常試料と糖尿病試料との間の信号（光学密度）
の最大の差を生ずるｐＨ値は４．５であった。さらにま
た、ｐＨ値５．５および６．５を有するフタル酸溶液の
使用も測定可能な量のクルシトールリジン残基を産生じ
ていた。
０．０５Ｍ水性フタル酸のｐｉ値の変化性を試験するた
めに、４ケの０．０５Ｍ溶液を調製し、その調整してな
いｐＨ値をアルテックスモデル３５００デジタルｐＨメ
ーター（ベックマンインスツルメンツ社、バークレイ、
ＣＡ）をカロメルマイクロプローブ電極（ファイザーサ
イエンティフィック社、ピッツバーグ、ＰＡ）と組合せ
て用いて測定した。
めに、４ケの０．０５Ｍ溶液を調製し、その調整してな
いｐＨ値をアルテックスモデル３５００デジタルｐＨメ
ーター（ベックマンインスツルメンツ社、バークレイ、
ＣＡ）をカロメルマイクロプローブ電極（ファイザーサ
イエンティフィック社、ピッツバーグ、ＰＡ）と組合せ
て用いて測定した。
４つの調整してない溶液のｐＨ値は４．１３〜４．５の
範囲であり平均約４．３を有していた。
範囲であり平均約４．３を有していた。
ｄ、 ・ｒＡ −日
本発明のアッセイ方法の酸反応工程の１つの目的は、安
定画分を維持しなから不安定グルコヘモグロビン画分を
除去すること（不安定グルコヘモグロビンをヘモグロビ
ンとグルコースに分解スルこと）である。従゛って、酸
反応混合物保持時間を変化させた効果を試験した。
定画分を維持しなから不安定グルコヘモグロビン画分を
除去すること（不安定グルコヘモグロビンをヘモグロビ
ンとグルコースに分解スルこと）である。従゛って、酸
反応混合物保持時間を変化させた効果を試験した。
４セツトの酸反応混合物を試験した。各セットは２人の
糖尿病患者および２人の正常人女性の血液試料の各々か
らのヘモグロビン試料を０．０５ Ｍのフタル酸と実施
例６Ｃで記載したようにして混合することによって調製
した４種の混合物を含んでいた０次いで、酸反応混合物
セットの１つを直ちにＮａＢＩｌ、と混合し、さらに実
施例４で記載したようにして処理しアッセイした。残り
の３つのセントは、実施例４におけるようなＮａＢＨｎ
と混合する前に５．１０または１５分間保持した。
糖尿病患者および２人の正常人女性の血液試料の各々か
らのヘモグロビン試料を０．０５ Ｍのフタル酸と実施
例６Ｃで記載したようにして混合することによって調製
した４種の混合物を含んでいた０次いで、酸反応混合物
セットの１つを直ちにＮａＢＩｌ、と混合し、さらに実
施例４で記載したようにして処理しアッセイした。残り
の３つのセントは、実施例４におけるようなＮａＢＨｎ
と混合する前に５．１０または１５分間保持した。
この試験の結果は、第８図から明らかなように、酸反応
混合物保持時間の増大は糖尿病試料！ｌｈｌでは少量の
アッセイ可能なクルシトールリジンの形成をもたらして
いることを示しており、かくしてこの試料は最初実質的
の不安定グルコヘモグロビンを含んでいたことを示して
いる。１５分間の保持時間は、また、１分以下の保持時
間に比較したとき、糖尿病試料嵐２および正常試料隘１
において少ないアッセイ可能なクルシトールリジンを産
生していた。これらの結果は約５分程の短い酸反応混合
物保持時間がヘモグロビン試料中の不安定グルコヘモグ
ロビン画分の除去をもたらしていることを示している。
混合物保持時間の増大は糖尿病試料！ｌｈｌでは少量の
アッセイ可能なクルシトールリジンの形成をもたらして
いることを示しており、かくしてこの試料は最初実質的
の不安定グルコヘモグロビンを含んでいたことを示して
いる。１５分間の保持時間は、また、１分以下の保持時
間に比較したとき、糖尿病試料嵐２および正常試料隘１
において少ないアッセイ可能なクルシトールリジンを産
生していた。これらの結果は約５分程の短い酸反応混合
物保持時間がヘモグロビン試料中の不安定グルコヘモグ
ロビン画分の除去をもたらしていることを示している。
実施例７
ヱヱ土工温度
ヘモプロビン９８度約２７μｇ／ｍβ〜１．３５μｇ／
Ｉｌｌを有する溶血液を糖尿病および正常女性からの血
液を用いて実施例５ｂに従って調製した。次いで、各溶
血液を還元し、３０分間の還元および抗体反応用の保持
時間を用い実施例４で記載したようにして室温（約２０
〜２５℃）または３７℃でアッセイした。
Ｉｌｌを有する溶血液を糖尿病および正常女性からの血
液を用いて実施例５ｂに従って調製した。次いで、各溶
血液を還元し、３０分間の還元および抗体反応用の保持
時間を用い実施例４で記載したようにして室温（約２０
〜２５℃）または３７℃でアッセイした。
第９図は検出したクルシトールリジンーヘモクロビンの
量が還元および免疫反応混合物を３７℃に保持したとき
わずかに大であったが、３７℃の結果と室温で得た結果
との間に実質的な差はなかったことを示している。
量が還元および免疫反応混合物を３７℃に保持したとき
わずかに大であったが、３７℃の結果と室温で得た結果
との間に実質的な差はなかったことを示している。
実施例８
旦旦土旦へ評負
前述したようなフタル酸およびほう化水素酸塩を用いて
グルコヘモグロビンのアッセイ可能なクルシトールリジ
ン残基の形成を最適化する方法は任意のイムノアッセイ
方式に適用可能であるけれども、該方法を用いるＥＬＩ
ＳＡの性能特性を詳細に評価して以下に述べるような臨
床使用を決定した。評価した特定のＥＬＩＳＡは次の如
くして実施した。
グルコヘモグロビンのアッセイ可能なクルシトールリジ
ン残基の形成を最適化する方法は任意のイムノアッセイ
方式に適用可能であるけれども、該方法を用いるＥＬＩ
ＳＡの性能特性を詳細に評価して以下に述べるような臨
床使用を決定した。評価した特定のＥＬＩＳＡは次の如
くして実施した。
種々の正常人および糖尿病患者からの血液を用いて実施
例１で記載したように調製した１０μｌのパック詰ＲＢ
Ｃベレントを６１５μｌの０．０５Ｍビフタル酸カリウ
ムと混合した。
例１で記載したように調製した１０μｌのパック詰ＲＢ
Ｃベレントを６１５μｌの０．０５Ｍビフタル酸カリウ
ムと混合した。
かくして調製した酸反応混合物を１５分間、３７℃に保
持して、溶血液を調製した。続いて、５０μｌの溶血液
を３ＮＵＮＣイノム■マイクロタイタープレートウエル
（平底ポリスチレンプレート、ギブコラポラトリー社、
ローレンス、ＭＡ）の各々にピペット注入した。５０μ
ｌ容量の４００ｍＭ ＮａＢｆｌａを各溶血液試料に混
合して還元反応混合物を調製した。得られた還元反応混
合物を１５分間、３７℃に保持してマイクロタイタープ
レートウェルに結合したクルシトールリジンーヘモグロ
ビンを生成させた。マイクロタイタープレートウェル結
合クルシトールリジンーヘモグロビンを、過剰のほう化
水素酸塩から、デカンティションし、ウェルを０．０５
％トウィーン２０含有ＰＢＳの０．３５ＩＩＩｆｆｉで
４回洗浄することによって分離した。
持して、溶血液を調製した。続いて、５０μｌの溶血液
を３ＮＵＮＣイノム■マイクロタイタープレートウエル
（平底ポリスチレンプレート、ギブコラポラトリー社、
ローレンス、ＭＡ）の各々にピペット注入した。５０μ
ｌ容量の４００ｍＭ ＮａＢｆｌａを各溶血液試料に混
合して還元反応混合物を調製した。得られた還元反応混
合物を１５分間、３７℃に保持してマイクロタイタープ
レートウェルに結合したクルシトールリジンーヘモグロ
ビンを生成させた。マイクロタイタープレートウェル結
合クルシトールリジンーヘモグロビンを、過剰のほう化
水素酸塩から、デカンティションし、ウェルを０．０５
％トウィーン２０含有ＰＢＳの０．３５ＩＩＩｆｆｉで
４回洗浄することによって分離した。
次に、ウェル結合クルシトールリジンーヘモグロビンの
量を、各ウェルにｌθ％正常ヤギ血清含有ＰＢＳ中で１
：３００希釈した実施例２のＩＩＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９，０
，１００＋ｗｆｆｉを混合し液／固相免疫反応混合物を
形成させることによって測定した。
量を、各ウェルにｌθ％正常ヤギ血清含有ＰＢＳ中で１
：３００希釈した実施例２のＩＩＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９，０
，１００＋ｗｆｆｉを混合し液／固相免疫反応混合物を
形成させることによって測定した。
免疫反応混合物を１５分間、３７℃に保持した。
固相および液相を分離し、各ウェルを０．０５％トウィ
ーン２０含有ＰＢＳ （ｐＨ７，４） 、０．３５＋ｗ
ｊｌで５回洗浄して、未結合レセプターを固相固定免疫
反応体から分離した。固相固定免疫反応体として存在す
るＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９レセプターを実施例４に記載した
ようなｏｐｂ基質溶液を用いて検出した。
ーン２０含有ＰＢＳ （ｐＨ７，４） 、０．３５＋ｗ
ｊｌで５回洗浄して、未結合レセプターを固相固定免疫
反応体から分離した。固相固定免疫反応体として存在す
るＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９レセプターを実施例４に記載した
ようなｏｐｂ基質溶液を用いて検出した。
実施例３で調製したＧｌｃ−ＲＥＤＨｂアダクトをＥＬ
Ｉ ＳＡ用の内部標準（カリブレーター）として用い
た。標準溶液は、１０％正常ヤギ血清含有０．１ Ｍ重
炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９，０）中に希釈した
Ｇｊ！ｃ −ＲＥＤヘモグロビンＨｂ濃度範囲３８０μ
ｇ ／ｙａ Ｉｔ〜８μｇ ／ ｍ １のものとして調
製した。標準曲線を作製するために、上記のＥＬ Ｉ
ＳＡを上記溶血液に代えて５０μｌの各標準溶液を用い
て実施した。
Ｉ ＳＡ用の内部標準（カリブレーター）として用い
た。標準溶液は、１０％正常ヤギ血清含有０．１ Ｍ重
炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９，０）中に希釈した
Ｇｊ！ｃ −ＲＥＤヘモグロビンＨｂ濃度範囲３８０μ
ｇ ／ｙａ Ｉｔ〜８μｇ ／ ｍ １のものとして調
製した。標準曲線を作製するために、上記のＥＬ Ｉ
ＳＡを上記溶血液に代えて５０μｌの各標準溶液を用い
て実施した。
ａ、ＬＪｌ
回復試験を、ＥＬＩＳＡが正常人からの溶血液に加えら
れた糖尿病赤血球溶血液から種々の量のグルコヘモグロ
ビンを正確に測定できるかどうかを調べるために行った
。これは糖尿病者からの溶血液の種々の増大割合の添加
（スパイク）を含んだ正常人からの溶血液を調製するこ
とによって行った。
れた糖尿病赤血球溶血液から種々の量のグルコヘモグロ
ビンを正確に測定できるかどうかを調べるために行った
。これは糖尿病者からの溶血液の種々の増大割合の添加
（スパイク）を含んだ正常人からの溶血液を調製するこ
とによって行った。
正常人の溶血液に加えた糖尿病グルコヘモグロビンの量
の回復は上述のＥＬＩＳＡを用いて測定した。第１０図
に示すように、得られた結果はアッセイしたパーセント
添加（スパイク）の範囲に亘って直線関係を示し、かく
して試料中に存在したグルコヘモグロビンの量とＥＬＩ
ＳＡによって測定したクルシトールリジンーヘモグロビ
ンの量との間の付加的関係を示している。
の回復は上述のＥＬＩＳＡを用いて測定した。第１０図
に示すように、得られた結果はアッセイしたパーセント
添加（スパイク）の範囲に亘って直線関係を示し、かく
して試料中に存在したグルコヘモグロビンの量とＥＬＩ
ＳＡによって測定したクルシトールリジンーヘモグロビ
ンの量との間の付加的関係を示している。
ｂ、ＥＬＩｓＡ結果の再現性
ＥＬＩＳＡの再現性をイントラ−アッセイ（ｉｎｔｒａ
−ａｓｓａｙ） およびインターアッセイ （ｉｎｔｅ
ｒ−ａｓｓａｙ）試験によって調べた。
−ａｓｓａｙ） およびインターアッセイ （ｉｎｔｅ
ｒ−ａｓｓａｙ）試験によって調べた。
イントラアッセイ測定では、３人の異なる人のヘモグロ
ビン試料を６０回、おのおのアッセイした。各個人で得
られた値の変化係数は１６６％〜６．４％の範囲であっ
た。
ビン試料を６０回、おのおのアッセイした。各個人で得
られた値の変化係数は１６６％〜６．４％の範囲であっ
た。
インターアッセイ測定では、３人の異なる人かラノヘモ
グロビンを１２の種々の場合についてアッセイした。イ
ンターアッセイ再現性は８．３％〜１０、４％であった
。
グロビンを１２の種々の場合についてアッセイした。イ
ンターアッセイ再現性は８．３％〜１０、４％であった
。
本発明を好ましい実施態様について説明して来た。述べ
て来た要旨の修正または変更は本発明の範囲内において
なし得ることは当業者にとって明白であろう。
て来た要旨の修正または変更は本発明の範囲内において
なし得ることは当業者にとって明白であろう。
第１図は不安定および安定グルコヘモグロビンを形成す
るための図中で“プロティン”として表示したヘモグロ
ビンのアルファ （アミノ末端バリン）およびニブシロ
ン（リジン）遊離アミンの非酵素グリコジル化、および
その後のクルシトール置換最終生成物を形成するための
中間体の還元の反応順序を示す略図である。 第２図はホースラディツシュ（西洋わさび）パーオキシ
ダーゼ標識０６Ｃ９レセプター（ＩＩＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９
）をＧ６Ｃ９抗体結合サイト用の各種濃度の潜在拮抗剤
と混合することによって行った拮抗抑制試験結果を示す
３つのグラフを示す。各グラフめ横座標は使用した抑制
剤（インヒビター）溶液のマイクログラム／ミリリッタ
ー（μｇ／ｍｌ１）の濃度を示す。各グラフの縦座標は
最高結合画分、即ち、残存したあるいは種々の潜在抑制
剤と反応したのにちに達成した、拮抗抑制剤の不存在下
でのＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９により達成した結合量を示す。 第２Ａ図はクルシトールリジン（ム）；還元ポリ−Ｌ−
リジン（ロ）；還元アルファーＴ−ＢｏｃＩＪジン（・
）；還元非グルコシル化ヘモグロビン（Δ） ；および
還元ポＩＪ −Ｌ−バリン（■）を潜在拮抗剤として使
用して得た結果を示す。これらの結果はこれらのグルー
プのうちポジチブコントローノヘクルシトールリジンの
みがＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９レセプターの結合を抑制し、従
って、グルコース不存在下の還元だけではＨＲＰＯ−Ｇ
６Ｃ９により認識されるエピトープを産生じないことを
示している。 第２Ｂ図はクルシトールリジン（ム）；グルコシル化ポ
リ−Ｌ−リジン（ロ）；グルコシル化アルファーＴ−Ｂ
ｏｃ−リジン（・）；グルコシル化ヘモグロビン（Δ）
；およびグルコシル化ポリ−Ｌ−バリン（■）を潜在拮
抗剤として用いて得た結果を示す。これらの結果はポジ
ティブコントロールのクルシトールリジンのみが結合を
抑制したことを示している。即ち、グルコシル化のみで
はＨＲ，ＰＯ−Ｇ６Ｃ９１こよって君忍識されるエピト
ープを産生じない。 第２Ｃ図はポリーＬ−リジン（ロ）；アルファーＴ−Ｂ
ｏｃ−リジン（・）；ヘモグロビン（Δ）およびポリ−
ムーバリン（■）をグルコシル化し、次いで還元したの
ちに得られた結果を示す。これらの結果はポリーＬ−リ
ジンとヘモグロビンをグルコシル化し還元したときはこ
れらは共にポジティブコントールのクルシトールリジン
と同様にＨＲＰＯ−Ｇ６ｄ９抗体結合サイトと拮抗し得
ることを示している。グルコシル化し還元したポリ−ム
ーバリンのみが有意に拮抗してなく、即ち、ＨＲＰＯ−
０６Ｃ９レセプターはヘモグロビンのＮ−末端グルコシ
ル化バリンと免疫反応しないことを示している。 第３図はヘモグロビン試料中のクルシトールリジン形成
をフタル酸の存在下の還元により行ったときに得た予期
しなかった結果を示す２つのグラフを示す。 第３Ａ図においては、グルコヘモグロビン含有ヘモグロ
ビン試料は糖尿病患者（三角形）または正常人（四角形
）から得た１０マイクロリツター（μＩｌ）の詰込みＲ
ＢＣペレットとして調製した。 各試料はＮａＢＬ （△、口）またはＫＢＨ４（ム、■
）を水親゛和性ほう化水素酸塩還元剤として用いて還元
シ、次いでクルシトールリジンーヘモグロビン形成につ
いてアッセイした。各還元反応混合物中のヘモグロビン
濃度は２．４ミリグラム／ミリリツター（ｍｇ／ｍβ）
であった。各混合物のほう化水素酸塩の濃度は横軸に示
しである。 第３Ｂ図は還元を試料とフタル酸の反応の後にび同じ２
種類の還元剤で得た結果を示す。第３Ａ図の結果と第３
Ｂ図の結果の比較はほう化水素酸による還元前の７タル
酸との反応が、ＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９レセプターの免疫学
的結合により測定したとき、アッセイ可能なクルシトー
ルリジンーヘモグロビンの有意な増加をもたらしている
ことを示している。かくして、フタル酸およびほう化水
素酸還元剤を用いて前述したようにして調製したグルシ
トールリジ、ンーヘモグロビンは増大した抗原性を示す
。この観察されたアッセイ可能なクルシトールリジンー
ヘモグロビン（抗原性）の増大量は予期されないもので
あった。 第４図は還元反応混合物の保持時間を変化させた効果を
示す。糖尿病または正常女性からの全血液の種々の希釈
物を用いて調製した酸反応混合物を等容量の０．ＯＩＭ
フクフタル酸合した。各酸反応混合物中のヘモグロビン
（Ｈｂ ）濃度は曜Ｈｂ／ｌｌ１１で次のとおりであっ
た：２７．０．１０．８．５．４．２．７．１．０８．
０．６７５．０．５４．０．４１５．０．３３７、およ
び０．２７０゜各上記混合物中のミリモルの酸／ミリグ
ラムヘモグロビン比は、それぞれ、１．８５．４．６３
．９．２６．１８．５．４６．３．７４、０ ？、９２
．６．１２０．５．１４８．５および１８５．２であっ
た。 溶血液形成後、還元反応混合物を各溶血液を等容量の４
００ ｍ Ｍ ＮａＢＨｎと混合することによって調製
した。ヘモグロビン試料の最終希釈の逆数が横軸上に示
されている。左から右方向においてまたヘモグロビン希
釈を増大させる順序において、各還元混合物のｍＭ Ｎ
ａＢＨａ ／■ヘモグロビン比は０．０１４８．０．０
３７．０．０７４．０．１４ Ｂ、０．３７．０．５９
３．０．７４．０．９６４．１．１８７、および１．４
８１であった。 第４図に示された結果は糖尿病（ロ）および正常（■）
試料の両方の還元反応混合物の３０分間保持が糖尿病（
Δ）および正常（ム）試料の両方の還元反応混合物の１
５分間保持よりもアッセイ可能なクルシトールリジンー
ヘモグロビンを産生じていた。 第５図はアッセイ可能なクルシトールリジンーヘモグロ
ビン形成においての各種酸反応混合物の効果を反応混合
物の酸の関数として示す棒グラフである。各ｐ合物は糖
尿病（■）または正常（ロ）血液試料から得たバック詰
ＲＢＣペレット１０μｌを次の０．０５Ｍ％ｐＨ値４〜
５の溶液の１種６１５μｌとを混合することによって調
製した：フタル酸（Ａ）、クエン酸（Ｅ）、酢酸（Ｆ）
、リン酸（Ｇ） 、Ｄ （＋）グルコサミン（Ｈ）、ア
ルファーケトグルタル酸（Ｉ）、オキサロ酢酸（Ｊ）、
シュー酸二カリウム（Ｋ）、コハク酸（Ｌ）、およびピ
ルビン酸（Ｍ）次いでＮａＢＬで還元し後述するＥＬＩ
ＳＡによりクルシトールリジンーヘモグロビン含有量
を測定した。コントロールとしては、蒸留水（Ｂ）、等
張塩水次いで蒸留水中での各ＲＢＣの一夜（約１８時間
）インキュベーション（ｃ）またはフタル酸（Ｄ）であ
った。各コントールも上述のようにしてアッセイした。 アッセイ可能なクルシトールリジンーヘモグロビン形成
量は４９０ｎｒｎでの光学密度値（０，Ｄ、 ）として
示した。 第５図の結果は試料から不安定グルコヘモグロビンを除
去する古典的方法、即ち、塩水中のＲＢＣの一夜インキ
二ベーション（ｃ）がフタル酸と同じ形でクルシトール
リジンの形成を増強しないことを示している。これらの
結果はまたフタル酸と水親和性ほう化水素酸還元剤の組
合せ使用によってアッセイ可能なグルシトールリ）ンの
増強を示している。 第６図は本発明のアッセイ法を約０．０５ Ｍ（０）ま
たは約０．０２５Ｍ（ム）フタル酸濃度を有する酸反応
混合物を用いて行ったときに得られた結果を示すグラフ
である。また、０．０５Ｍフタル酸濃変温有する酸反応
液を用いて調製した溶血液を還元させないで得た結果（
■）も示している。他のコントロールとしてはフタル酸
処理をＮａＢＩＩａ還元前に用いなかったとき（ロ）ま
たはＲＢＣの等張塩水中での一夜インキュベーションを
還元前に行いフタル酸処理を行わなかったとき（Δ）の
結果を含む。 酸反応混合物中のヘモグロビン濃度は■／１Ｉ１１で７
５．５０．３７．５．３０，２５および２１．４であっ
た。各々の還元反応混合物のヘモグロビン濃度は■／ｌ
ａｌで３７．５．２５．１Ｂ、７５．１５．１２．５お
よび１Ｏ０７であった。還元反応混合物中のＮａＢＨｚ
の濃度は２００ｍＭであった。 第７図はｐＨ値３．５．４．５．５．５および６．５を
有するフタル酸水溶液を用いて酸反応溶液を調製して得
たＯ、Ｄ、４９０値を示す棒グラフである。 糖尿病ヘモグロビン試料Ｎｏ、 １ （冒）および
Ｎｏ。 ２（目）、および正常試料Ｎｏ、 １ （ロ）およ
びＮｏ。 ２（巳）は、それぞれ、グライーアフィンシステム（Ｉ
５ｏｌａｂ＋＾ｋｒｏｎ、 ＯＲ）を用い製造者の使
用説明に従って測定したとき、１４．７％、１０．７％
、７．５％および８．０％の総グルコシル化ヘモグロビ
ン値を有していた。 第８図は酸反応混合物保持時間を変化させた効果を示す
棒グラフである。各混合物は約４．３の未調整ｐＨ値を
有する０、０５Ｍフタル酸を用いて調製した。用いた各
サンプルは第７図で記載したものと同じ、即ち、糖尿病
Ｎｏ、１（■）、糖尿病Ｎｏ。 ２ （目）、正常Ｎｏ、１（ロ）および正常Ｎｏ、 ２
（ｌｉｄ）であった。 第９図は、ヘモグロビンを酸反応混合物中で２７．０■
／ ｍ ｌ〜０．２７■／ｖａ １の濃度でまた還元反
応混合物中で１３．５■／ｌａ Ｉｔ〜０．１３５■／
ｌ１ｌｌの濃度で用いて、還元反応混合物を室温または
３７℃に維持した効果を示す。酸反応は約０．０５Ｍの
フタル酸濃度で未調整フタル酸ｐＨ値（約４．３）で行
った。還元反応は約２００ｍＭのＮａＢＨ４：ａ度で行
った。 糖尿病（白抜じるし）または正常（黒しるし）女性から
の全血液として調製したヘモグロビン試料を還元反応に
おいて室温（それぞれ、Δおよびム）または３７℃（そ
れぞれ、口および■）に維・たときのスパイクおよび回
復試験の結果を示す。 ％および５．４５％であることが判っていた。この試験
の詳細は実施例８でなされている。 ＨＦＩＰＯ−Ｇ６Ｃ９コンジュゲートに加え？！迎制剤
（ＪＪｇ／ｍ？）ＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９コンジュゲートに
加えた抑制剤（ｕｇ／ｍＦ）ＨＲＰＯ−０６Ｃ９コンヅ
ユケートに加えた抑制剤（ｕｇ／ｍｊ ）ＦＩＧ、２Ｇ 還元剤ｍ度（ｍＭ） ＦＩＧ、 ３Ａ 還元剤濃度（ｍＭ） 還元全血Ｍ静動１／希釈 ＦＩＧ、 ５ 還元溶血液の最終希釈Ｘ０．０１ ＦＩＧ、６ フタル蒙反応のｐＨ 還元全ｌ１１１溶ｗ４Ｗｔの希釈−ｏ、ｏｏｉＦＩＧ、
９ 正常溶血液に加えた糖尿＊溶血液Ｊ。 −ＦＩＧ、ＩＯ
るための図中で“プロティン”として表示したヘモグロ
ビンのアルファ （アミノ末端バリン）およびニブシロ
ン（リジン）遊離アミンの非酵素グリコジル化、および
その後のクルシトール置換最終生成物を形成するための
中間体の還元の反応順序を示す略図である。 第２図はホースラディツシュ（西洋わさび）パーオキシ
ダーゼ標識０６Ｃ９レセプター（ＩＩＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９
）をＧ６Ｃ９抗体結合サイト用の各種濃度の潜在拮抗剤
と混合することによって行った拮抗抑制試験結果を示す
３つのグラフを示す。各グラフめ横座標は使用した抑制
剤（インヒビター）溶液のマイクログラム／ミリリッタ
ー（μｇ／ｍｌ１）の濃度を示す。各グラフの縦座標は
最高結合画分、即ち、残存したあるいは種々の潜在抑制
剤と反応したのにちに達成した、拮抗抑制剤の不存在下
でのＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９により達成した結合量を示す。 第２Ａ図はクルシトールリジン（ム）；還元ポリ−Ｌ−
リジン（ロ）；還元アルファーＴ−ＢｏｃＩＪジン（・
）；還元非グルコシル化ヘモグロビン（Δ） ；および
還元ポＩＪ −Ｌ−バリン（■）を潜在拮抗剤として使
用して得た結果を示す。これらの結果はこれらのグルー
プのうちポジチブコントローノヘクルシトールリジンの
みがＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９レセプターの結合を抑制し、従
って、グルコース不存在下の還元だけではＨＲＰＯ−Ｇ
６Ｃ９により認識されるエピトープを産生じないことを
示している。 第２Ｂ図はクルシトールリジン（ム）；グルコシル化ポ
リ−Ｌ−リジン（ロ）；グルコシル化アルファーＴ−Ｂ
ｏｃ−リジン（・）；グルコシル化ヘモグロビン（Δ）
；およびグルコシル化ポリ−Ｌ−バリン（■）を潜在拮
抗剤として用いて得た結果を示す。これらの結果はポジ
ティブコントロールのクルシトールリジンのみが結合を
抑制したことを示している。即ち、グルコシル化のみで
はＨＲ，ＰＯ−Ｇ６Ｃ９１こよって君忍識されるエピト
ープを産生じない。 第２Ｃ図はポリーＬ−リジン（ロ）；アルファーＴ−Ｂ
ｏｃ−リジン（・）；ヘモグロビン（Δ）およびポリ−
ムーバリン（■）をグルコシル化し、次いで還元したの
ちに得られた結果を示す。これらの結果はポリーＬ−リ
ジンとヘモグロビンをグルコシル化し還元したときはこ
れらは共にポジティブコントールのクルシトールリジン
と同様にＨＲＰＯ−Ｇ６ｄ９抗体結合サイトと拮抗し得
ることを示している。グルコシル化し還元したポリ−ム
ーバリンのみが有意に拮抗してなく、即ち、ＨＲＰＯ−
０６Ｃ９レセプターはヘモグロビンのＮ−末端グルコシ
ル化バリンと免疫反応しないことを示している。 第３図はヘモグロビン試料中のクルシトールリジン形成
をフタル酸の存在下の還元により行ったときに得た予期
しなかった結果を示す２つのグラフを示す。 第３Ａ図においては、グルコヘモグロビン含有ヘモグロ
ビン試料は糖尿病患者（三角形）または正常人（四角形
）から得た１０マイクロリツター（μＩｌ）の詰込みＲ
ＢＣペレットとして調製した。 各試料はＮａＢＬ （△、口）またはＫＢＨ４（ム、■
）を水親゛和性ほう化水素酸塩還元剤として用いて還元
シ、次いでクルシトールリジンーヘモグロビン形成につ
いてアッセイした。各還元反応混合物中のヘモグロビン
濃度は２．４ミリグラム／ミリリツター（ｍｇ／ｍβ）
であった。各混合物のほう化水素酸塩の濃度は横軸に示
しである。 第３Ｂ図は還元を試料とフタル酸の反応の後にび同じ２
種類の還元剤で得た結果を示す。第３Ａ図の結果と第３
Ｂ図の結果の比較はほう化水素酸による還元前の７タル
酸との反応が、ＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９レセプターの免疫学
的結合により測定したとき、アッセイ可能なクルシトー
ルリジンーヘモグロビンの有意な増加をもたらしている
ことを示している。かくして、フタル酸およびほう化水
素酸還元剤を用いて前述したようにして調製したグルシ
トールリジ、ンーヘモグロビンは増大した抗原性を示す
。この観察されたアッセイ可能なクルシトールリジンー
ヘモグロビン（抗原性）の増大量は予期されないもので
あった。 第４図は還元反応混合物の保持時間を変化させた効果を
示す。糖尿病または正常女性からの全血液の種々の希釈
物を用いて調製した酸反応混合物を等容量の０．ＯＩＭ
フクフタル酸合した。各酸反応混合物中のヘモグロビン
（Ｈｂ ）濃度は曜Ｈｂ／ｌｌ１１で次のとおりであっ
た：２７．０．１０．８．５．４．２．７．１．０８．
０．６７５．０．５４．０．４１５．０．３３７、およ
び０．２７０゜各上記混合物中のミリモルの酸／ミリグ
ラムヘモグロビン比は、それぞれ、１．８５．４．６３
．９．２６．１８．５．４６．３．７４、０ ？、９２
．６．１２０．５．１４８．５および１８５．２であっ
た。 溶血液形成後、還元反応混合物を各溶血液を等容量の４
００ ｍ Ｍ ＮａＢＨｎと混合することによって調製
した。ヘモグロビン試料の最終希釈の逆数が横軸上に示
されている。左から右方向においてまたヘモグロビン希
釈を増大させる順序において、各還元混合物のｍＭ Ｎ
ａＢＨａ ／■ヘモグロビン比は０．０１４８．０．０
３７．０．０７４．０．１４ Ｂ、０．３７．０．５９
３．０．７４．０．９６４．１．１８７、および１．４
８１であった。 第４図に示された結果は糖尿病（ロ）および正常（■）
試料の両方の還元反応混合物の３０分間保持が糖尿病（
Δ）および正常（ム）試料の両方の還元反応混合物の１
５分間保持よりもアッセイ可能なクルシトールリジンー
ヘモグロビンを産生じていた。 第５図はアッセイ可能なクルシトールリジンーヘモグロ
ビン形成においての各種酸反応混合物の効果を反応混合
物の酸の関数として示す棒グラフである。各ｐ合物は糖
尿病（■）または正常（ロ）血液試料から得たバック詰
ＲＢＣペレット１０μｌを次の０．０５Ｍ％ｐＨ値４〜
５の溶液の１種６１５μｌとを混合することによって調
製した：フタル酸（Ａ）、クエン酸（Ｅ）、酢酸（Ｆ）
、リン酸（Ｇ） 、Ｄ （＋）グルコサミン（Ｈ）、ア
ルファーケトグルタル酸（Ｉ）、オキサロ酢酸（Ｊ）、
シュー酸二カリウム（Ｋ）、コハク酸（Ｌ）、およびピ
ルビン酸（Ｍ）次いでＮａＢＬで還元し後述するＥＬＩ
ＳＡによりクルシトールリジンーヘモグロビン含有量
を測定した。コントロールとしては、蒸留水（Ｂ）、等
張塩水次いで蒸留水中での各ＲＢＣの一夜（約１８時間
）インキュベーション（ｃ）またはフタル酸（Ｄ）であ
った。各コントールも上述のようにしてアッセイした。 アッセイ可能なクルシトールリジンーヘモグロビン形成
量は４９０ｎｒｎでの光学密度値（０，Ｄ、 ）として
示した。 第５図の結果は試料から不安定グルコヘモグロビンを除
去する古典的方法、即ち、塩水中のＲＢＣの一夜インキ
二ベーション（ｃ）がフタル酸と同じ形でクルシトール
リジンの形成を増強しないことを示している。これらの
結果はまたフタル酸と水親和性ほう化水素酸還元剤の組
合せ使用によってアッセイ可能なグルシトールリ）ンの
増強を示している。 第６図は本発明のアッセイ法を約０．０５ Ｍ（０）ま
たは約０．０２５Ｍ（ム）フタル酸濃度を有する酸反応
混合物を用いて行ったときに得られた結果を示すグラフ
である。また、０．０５Ｍフタル酸濃変温有する酸反応
液を用いて調製した溶血液を還元させないで得た結果（
■）も示している。他のコントロールとしてはフタル酸
処理をＮａＢＩＩａ還元前に用いなかったとき（ロ）ま
たはＲＢＣの等張塩水中での一夜インキュベーションを
還元前に行いフタル酸処理を行わなかったとき（Δ）の
結果を含む。 酸反応混合物中のヘモグロビン濃度は■／１Ｉ１１で７
５．５０．３７．５．３０，２５および２１．４であっ
た。各々の還元反応混合物のヘモグロビン濃度は■／ｌ
ａｌで３７．５．２５．１Ｂ、７５．１５．１２．５お
よび１Ｏ０７であった。還元反応混合物中のＮａＢＨｚ
の濃度は２００ｍＭであった。 第７図はｐＨ値３．５．４．５．５．５および６．５を
有するフタル酸水溶液を用いて酸反応溶液を調製して得
たＯ、Ｄ、４９０値を示す棒グラフである。 糖尿病ヘモグロビン試料Ｎｏ、 １ （冒）および
Ｎｏ。 ２（目）、および正常試料Ｎｏ、 １ （ロ）およ
びＮｏ。 ２（巳）は、それぞれ、グライーアフィンシステム（Ｉ
５ｏｌａｂ＋＾ｋｒｏｎ、 ＯＲ）を用い製造者の使
用説明に従って測定したとき、１４．７％、１０．７％
、７．５％および８．０％の総グルコシル化ヘモグロビ
ン値を有していた。 第８図は酸反応混合物保持時間を変化させた効果を示す
棒グラフである。各混合物は約４．３の未調整ｐＨ値を
有する０、０５Ｍフタル酸を用いて調製した。用いた各
サンプルは第７図で記載したものと同じ、即ち、糖尿病
Ｎｏ、１（■）、糖尿病Ｎｏ。 ２ （目）、正常Ｎｏ、１（ロ）および正常Ｎｏ、 ２
（ｌｉｄ）であった。 第９図は、ヘモグロビンを酸反応混合物中で２７．０■
／ ｍ ｌ〜０．２７■／ｖａ １の濃度でまた還元反
応混合物中で１３．５■／ｌａ Ｉｔ〜０．１３５■／
ｌ１ｌｌの濃度で用いて、還元反応混合物を室温または
３７℃に維持した効果を示す。酸反応は約０．０５Ｍの
フタル酸濃度で未調整フタル酸ｐＨ値（約４．３）で行
った。還元反応は約２００ｍＭのＮａＢＨ４：ａ度で行
った。 糖尿病（白抜じるし）または正常（黒しるし）女性から
の全血液として調製したヘモグロビン試料を還元反応に
おいて室温（それぞれ、Δおよびム）または３７℃（そ
れぞれ、口および■）に維・たときのスパイクおよび回
復試験の結果を示す。 ％および５．４５％であることが判っていた。この試験
の詳細は実施例８でなされている。 ＨＦＩＰＯ−Ｇ６Ｃ９コンジュゲートに加え？！迎制剤
（ＪＪｇ／ｍ？）ＨＲＰＯ−Ｇ６Ｃ９コンジュゲートに
加えた抑制剤（ｕｇ／ｍＦ）ＨＲＰＯ−０６Ｃ９コンヅ
ユケートに加えた抑制剤（ｕｇ／ｍｊ ）ＦＩＧ、２Ｇ 還元剤ｍ度（ｍＭ） ＦＩＧ、 ３Ａ 還元剤濃度（ｍＭ） 還元全血Ｍ静動１／希釈 ＦＩＧ、 ５ 還元溶血液の最終希釈Ｘ０．０１ ＦＩＧ、６ フタル蒙反応のｐＨ 還元全ｌ１１１溶ｗ４Ｗｔの希釈−ｏ、ｏｏｉＦＩＧ、
９ 正常溶血液に加えた糖尿＊溶血液Ｊ。 −ＦＩＧ、ＩＯ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）（ａ）グルコヘモグロビン含有試料をｐＨ値約３
〜約６を有するフタル酸またはビフタル酸含有水性媒体
とヘモグロビンのミリグラム当り少なくとも上記酸約１
．５ミリモルの比率で混合して酸反応混合物を調製する
こと； （ｂ）上記酸反応混合物を、約０℃〜約３７℃の温度で
、存在する不安定グルコヘモグロビンは除去するが、元
の試料中に存在する安定グルコヘモグロビンを維持する
のに十分な所定時間保持すること； （ｃ）上記反応混合物を水親和性ほう化水素酸塩還元剤
とヘモグロビンのミリグラム当り少なくともほう化水素
酸塩約０．０１５モルの比率で混合して還元反応混合物
を調製すること；（ｄ）上記還元反応混合物を、約０℃
〜約３７℃の温度で、グルシトールリジン−ヘモグロビ
ンを形成するのに十分な所定時間保持すること； （ｅ）上記グルシトールリジン−ヘモグロビンをすべて
の未反応ほう化水素酸塩から分離して単離したグルシト
ール−ヘモグロビンを調製すること； （ｆ）上記単離したグルシトールリジン−ヘモグロビン
をグルシトールリジン特異性レセプター分子と混合して
免疫反応混合物を形成させること； （ｇ）上記免疫反応混合物を生物学的アッセイ条件下に
レセプター分子が上記グルシトールリジン−ヘモグロビ
ンと免疫学的に結合して免疫反応体を形成するのに十分
な時間保持すること；および （ｈ）上記保持した免疫反応混合物中に形成した免疫反
応体の量を測定すること； の各工程を含むことを特徴とするグルコヘモグロビン含
有試料中の安定グルコヘモグロビンの量をアッセイする
方法。 （２）工程（ａ）の混合をヘモグロビンのミリグラム当
り少なくとも酸約１５．０ミリモルの比率で行う特許請
求の範囲第（１）項記載の方法。 （３）工程（ａ）の酸溶液が約４〜約５のｐＨ値を有す
る特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 （４）工程（ｃ）の混合をヘモグロビンのミリグラム当
り少なくともほう化水素酸塩約０．１５ミリモルの比率
で行う特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 （５）工程（ｆ）のレセプターがモノクローナル抗体の
形である特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 （６）モノクローナル抗体がＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８３
５６またはＨＢ８３５８を有するハイブリドーマにより
産生される特許請求の範囲第（５）項記載の方法。 （７）（ａ）所定容量のパック詰赤血球ペレットを調製
すること； （ｂ）上記所定容量のペレットを約４〜約５のｐＨ値の
水性０．０５Ｍフタル酸と約１容量のペレット対約６２
．５容量の水性酸の比率で混合して酸反応混合物を調製
すること； （ｃ）上記酸反応混合物を約１５〜約３０分間、約２０
℃〜約３７℃の温度に保持して溶血液を調製すること； （ｄ）マイクロタイタープレートウェル中で、所定容量
の上記溶血液を約４００ｍＭのほう化水素酸ナトリウム
またはほう化水素酸カリウム濃度を有する水溶液の等容
量と混合してヘモグロビンのミリグラム当り少なくとも
約 ０．１５ミリモルのほう化水素酸塩を含む還元反応混合
物を調製すること； （ｅ）上記還元反応混合物を約１５〜約３０分間、約２
０℃〜約３７℃の温度に保持してマイクロタイタープレ
ートウェルに結合したグルシトールリジン−ヘモグロビ
ンを形成させること； （ｆ）上記ウェル結合グルシトールリジン−ヘモグロビ
ンを上記ほう化水素酸塩から分離して単離したウェル結
合グルシトールリジン−ヘモグロビンを形成させること
； （ｇ）上記単離したウェル結合グルシトールリジン−ヘ
モグロビンをＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８３５６またはＨＢ
８３５８を有するハイブリドーマによって産生された所
定量の酵素標識レセプターと混合して免疫反応混合物を
調製すること； （ｈ）上記免疫反応混合物を約１５〜約３０分間、約２
０℃〜約３７℃の温度に保持すること、上記時間は上記
レセプターが上記グルシトールリジン−ヘモグロビンと
免疫学的に反応しマイクロタイタープレートウェル結合
免疫反応体を形成するのに十分であること；および（ｉ
）工程（ｈ）で形成したマイクロタイタープレートウェ
ル結合免疫反応体の量を測定すること；の各工程を含む
ことを特徴とするグルコヘモグロビン含有試料中の安定
グルコヘモグロビンの量をアッセイする方法。 （８）（ａ）不安定および安定グルコヘモグロビンを含
有するグルコヘモグロビン試料を、フタル酸またはビフ
タル酸を含み約３〜約６のｐＨ値を有する水性媒体と、
ヘモグロビンのミリグラム当り少なくとも約１．５ミリ
モルの上記酸の比率で混合して酸反応混合物を調製する
こと； （ｂ）上記酸反応混合物を、約０℃〜約３７℃の温度で
、存在する不安定グルコヘモグロビンは除去するが元の
試料中に存在する安定グルコヘモグロビンを維持するの
に十分な所定の時間保持すること； （ｃ）上記反応混合物を水親和性ほう化水素酸塩還元剤
とヘモグロビンのミリグラム当り少なくとも約０．０１
５ミリモルのほう化水素酸塩の比率で混合して還元反応
混合物を調製すること； （ｄ）上記還元反応混合物を、約０℃〜約３７℃の温度
で、グルシトールリジン−ヘモグロビンを形成するのに
十分な所定時間保持すること；および （ｅ）上記グルシトールリジン−ヘモグロビンを未反応
ほう化水素酸塩から分離して単離したグルシトールリジ
ン−ヘモグロビンを調製すること； の各工程を含むことを特徴とする不安定および安定グル
コヘモグロビンの両方を含有するグルコヘモグロビン試
料から安定グルコヘモグロビンをグルシトールリジン−
ヘモグロビンへ転化する方法。 （９）工程（ａ）の混合をヘモグロビンのミリグラム当
り少なくとも約１５ミリモルの酸の比率で行う特許請求
の範囲第（８）項記載の方法。 （１０）工程（ａ）の酸溶液が約４〜約５のｐＨ値を有
する特許請求の範囲第（８）項記載の方法。 （１１）工程（ｃ）の混合をヘモグロビンのミリグラム
当り少なくとも約０．１５ミリモルのほう化水素酸塩の
比率で行う特許請求の範囲第（８）項記載の方法。 （１２）試料が赤血球の形である特許請求の範囲第（８
）項記載の方法。 （１３）グルコヘモグロビン試料中に存在する安定グル
コヘモグロビンの量の固相アッセイを行うのに適する診
断薬系であって、 （ａ）固相マトリックスを含みその表面上で上記アッセ
イを行う第１のパッケージ； （ｂ）所定量の水親和性ほう化水素酸塩還元剤を含む第
２のパッケージ； （ｃ）公知量のグルシトールリジン特異性レセプター分
子を含む第３のパッケージ；および （ｄ）所定量のフタル酸またはビフタル酸を含む第３の
パッケージ； とを含み、各パッケージの内容物が上記アッセイを行う
のにそれぞれ十分な量で存在することを特徴とする上記
診断薬系。 （１４）上記グルシトールリジン特異性レセプター分子
がＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８３５６またはＨＢ８３５８を
有するハイブリドーマによって産生される特許請求の範
囲第（１３）項の診断薬系。 （１５）上記レセプター分子が標識に結合している特許
請求の範囲第（１４）項記載の診断薬系。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US932442 | 1986-11-18 | ||
| US06/932,442 US4876188A (en) | 1986-11-18 | 1986-11-18 | Novel immunochemical method for assaying stable glycosylated hemoglobin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63277967A true JPS63277967A (ja) | 1988-11-15 |
| JP2656776B2 JP2656776B2 (ja) | 1997-09-24 |
Family
ID=25462330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62291651A Expired - Lifetime JP2656776B2 (ja) | 1986-11-18 | 1987-11-18 | 安定なグリコシル化ヘモグロビンの新規な免疫化学的アッセイ方法 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4876188A (ja) |
| EP (1) | EP0271996B1 (ja) |
| JP (1) | JP2656776B2 (ja) |
| AT (1) | ATE72337T1 (ja) |
| AU (1) | AU609746B2 (ja) |
| CA (1) | CA1285477C (ja) |
| DE (1) | DE3776525D1 (ja) |
| DK (1) | DK173095B1 (ja) |
| ES (1) | ES2032296T3 (ja) |
| FI (1) | FI88546C (ja) |
| GR (1) | GR3003870T3 (ja) |
| IE (1) | IE60775B1 (ja) |
| IL (1) | IL84487A (ja) |
| NO (1) | NO172708C (ja) |
| NZ (1) | NZ222560A (ja) |
| PT (1) | PT86150B (ja) |
| ZA (1) | ZA878508B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0779513A1 (en) | 1995-12-14 | 1997-06-18 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Method for immunological determination of hemoglobin derivative and treating reagent for use therein |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5206144A (en) * | 1985-03-29 | 1993-04-27 | Novo Industri A/S | Determination of glycated (glycosylated) hemoglobin in blood |
| DE3885021T2 (de) * | 1987-07-14 | 1994-05-19 | Kyoto Daiichi Kagaku Kyoto Kk | Automatische Messmethode für Glycohämoglobin. |
| CA1338348C (en) * | 1987-11-30 | 1996-05-28 | Kazutoshi Yamazaki | Eliminating agent for glycosylated hemoglobin |
| US5292663A (en) * | 1987-11-30 | 1994-03-08 | Sekisui Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Method of treating blood containing labile glycosylated hemoglobin A1C |
| US5110745A (en) * | 1989-06-01 | 1992-05-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of detecting glycated proteins |
| US5484735A (en) * | 1989-08-23 | 1996-01-16 | Northwestern University | Immunoassay of glycosylated proteins employing antibody directed to reductively glycosylated N-terminal amino acids |
| US5183739A (en) * | 1990-02-27 | 1993-02-02 | Exocell, Inc. | Monoclonal antibodies specific for non-a1c glycated hemoglobin and immunoassay methods |
| EP0595806A1 (en) * | 1991-07-22 | 1994-05-11 | Astroscan Limited | Analysis of carbohydrates and kits therefore |
| WO1994000592A1 (en) * | 1992-06-26 | 1994-01-06 | Exocell, Inc. | Monoclonal antibodies against glycated low density lipoprotein |
| JP3177863B2 (ja) * | 1992-07-17 | 2001-06-18 | 東ソー株式会社 | 不安定型糖化ヘモグロビンの除去方法 |
| WO1994029722A1 (en) * | 1993-06-08 | 1994-12-22 | Chronomed, Inc. | Two-phase optical assay method and apparatus |
| US6242417B1 (en) * | 1994-03-08 | 2001-06-05 | Somatogen, Inc. | Stabilized compositions containing hemoglobin |
| GB9508278D0 (en) * | 1995-04-24 | 1995-06-14 | Axis Biochemicals As | Haemoglobin standards |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2820310A1 (de) * | 1978-05-10 | 1979-11-15 | Univ Rockefeller | Radioimmunologische bestimmung von haemoglobin a tief 1c |
| JPS5640694A (en) * | 1979-09-06 | 1981-04-16 | Amicon Corp | Method of separating glycoprotein and chemical agent therefor |
| JPS5821167A (ja) * | 1981-06-26 | 1983-02-07 | イステイチユト・ジエロテラピコ・エ・バツチノジエノ・トスカノ・゛スクラボ゛ソチエタ・ペル・アツイオ−ニ | 生物学的液体中のグリコシル化蛋白質を測定するための方法及び試薬セツト |
| JPS59119264A (ja) * | 1982-12-06 | 1984-07-10 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テッド | 非酵素的にグルコシル化された蛋白質及び蛋白質フラグメントの測定用免疫試験方法、それに用いる試薬系、試験キツト、試験具及び抗体並びにそれに関連した免疫原 |
| DE3439610A1 (de) * | 1984-10-30 | 1986-04-30 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunogene, verfahren zu deren herstellung sowie damit gewonnene antikoerper gegen glykosiliertes haemoglobin |
| EP0201187A1 (en) * | 1985-03-29 | 1986-11-12 | Novo Nordisk A/S | Determination of glycated (glycosylated) hemoglobin in blood |
| JPS62215599A (ja) * | 1986-03-17 | 1987-09-22 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | グルシト−ルリジン誘導体 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1580318A (en) * | 1978-05-06 | 1980-12-03 | Univ Rockefeller | Antibodies active against human hemoglobin a1c |
| US4200435A (en) * | 1978-12-26 | 1980-04-29 | Abbott Laboratories | Determination of glycosylated hemoglobin in blood |
| FR2464475A1 (fr) * | 1979-08-30 | 1981-03-06 | Amicon Corp | Procede et produit pour la separation des glycoproteines et leur application notamment a la determination de l'hemoglobine glycosylee |
| US4349352A (en) * | 1980-08-14 | 1982-09-14 | Rockefeller University | Test for glucosylated hemoglobin and other glucosylated proteins |
| DE3119046C2 (de) * | 1981-05-13 | 1983-03-10 | Panchem Gesellschaft für chemische Produkte mbH, 8751 Kleinwallstadt | Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an glykosiliertem Hämoglobin bei der Langzeitkontrolle des Blutzuckerspiegels |
| US4727036A (en) * | 1985-08-08 | 1988-02-23 | Molecular Diagnostics, Inc. | Antibodies for use in determining hemoglobin A1c |
-
1986
- 1986-11-18 US US06/932,442 patent/US4876188A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-11-12 ZA ZA878508A patent/ZA878508B/xx unknown
- 1987-11-13 AT AT87310048T patent/ATE72337T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-13 ES ES198787310048T patent/ES2032296T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-13 EP EP87310048A patent/EP0271996B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-13 DE DE8787310048T patent/DE3776525D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-16 IL IL84487A patent/IL84487A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-11-16 NZ NZ222560A patent/NZ222560A/xx unknown
- 1987-11-17 CA CA000551976A patent/CA1285477C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-17 PT PT86150A patent/PT86150B/pt unknown
- 1987-11-17 DK DK198706030A patent/DK173095B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-11-17 IE IE309087A patent/IE60775B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-11-17 NO NO874783A patent/NO172708C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-11-17 FI FI875080A patent/FI88546C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-11-18 JP JP62291651A patent/JP2656776B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-18 AU AU81359/87A patent/AU609746B2/en not_active Expired
-
1992
- 1992-02-21 GR GR920400290T patent/GR3003870T3/el unknown
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2820310A1 (de) * | 1978-05-10 | 1979-11-15 | Univ Rockefeller | Radioimmunologische bestimmung von haemoglobin a tief 1c |
| JPS5640694A (en) * | 1979-09-06 | 1981-04-16 | Amicon Corp | Method of separating glycoprotein and chemical agent therefor |
| JPS5821167A (ja) * | 1981-06-26 | 1983-02-07 | イステイチユト・ジエロテラピコ・エ・バツチノジエノ・トスカノ・゛スクラボ゛ソチエタ・ペル・アツイオ−ニ | 生物学的液体中のグリコシル化蛋白質を測定するための方法及び試薬セツト |
| JPS59119264A (ja) * | 1982-12-06 | 1984-07-10 | マイルス・ラボラトリ−ズ・インコ−ポレ−テッド | 非酵素的にグルコシル化された蛋白質及び蛋白質フラグメントの測定用免疫試験方法、それに用いる試薬系、試験キツト、試験具及び抗体並びにそれに関連した免疫原 |
| DE3439610A1 (de) * | 1984-10-30 | 1986-04-30 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunogene, verfahren zu deren herstellung sowie damit gewonnene antikoerper gegen glykosiliertes haemoglobin |
| EP0201187A1 (en) * | 1985-03-29 | 1986-11-12 | Novo Nordisk A/S | Determination of glycated (glycosylated) hemoglobin in blood |
| JPS62215599A (ja) * | 1986-03-17 | 1987-09-22 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | グルシト−ルリジン誘導体 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0779513A1 (en) | 1995-12-14 | 1997-06-18 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Method for immunological determination of hemoglobin derivative and treating reagent for use therein |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI875080A0 (fi) | 1987-11-17 |
| AU609746B2 (en) | 1991-05-09 |
| JP2656776B2 (ja) | 1997-09-24 |
| FI88546B (fi) | 1993-02-15 |
| ES2032296T3 (es) | 1993-02-01 |
| ZA878508B (en) | 1988-07-27 |
| IE873090L (en) | 1988-05-18 |
| IL84487A (en) | 1992-11-15 |
| DK603087A (da) | 1988-05-19 |
| NO172708B (no) | 1993-05-18 |
| US4876188A (en) | 1989-10-24 |
| DK603087D0 (da) | 1987-11-17 |
| PT86150B (pt) | 1990-08-31 |
| DE3776525D1 (de) | 1992-03-12 |
| IE60775B1 (en) | 1994-08-10 |
| NZ222560A (en) | 1989-07-27 |
| NO874783L (no) | 1988-05-19 |
| DK173095B1 (da) | 2000-01-17 |
| GR3003870T3 (ja) | 1993-03-16 |
| IL84487A0 (en) | 1988-04-29 |
| NO874783D0 (no) | 1987-11-17 |
| EP0271996B1 (en) | 1992-01-29 |
| FI875080A (fi) | 1988-05-19 |
| NO172708C (no) | 1993-08-25 |
| EP0271996A1 (en) | 1988-06-22 |
| FI88546C (fi) | 1993-05-25 |
| PT86150A (en) | 1987-12-01 |
| AU8135987A (en) | 1988-05-19 |
| ATE72337T1 (de) | 1992-02-15 |
| CA1285477C (en) | 1991-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0782710B1 (en) | Method for detecting antibodies | |
| US5716791A (en) | Immunoassay for H. pylori in fecal specimens | |
| JP2656776B2 (ja) | 安定なグリコシル化ヘモグロビンの新規な免疫化学的アッセイ方法 | |
| EP0177531A1 (en) | ANTIBODIES, PRODUCTION AND USE. | |
| JPS61502417A (ja) | ポリクロナ−ル抗体、製法と用途 | |
| US5932430A (en) | Immunoassay for H. pylori in fecal specimens | |
| JPH0720437B2 (ja) | モノクロナ−ル抗体 | |
| EP0173375A1 (en) | Novel assay product and process | |
| EP0049277A1 (en) | Immunoassay for measurement of reticulocytes | |
| EP0166583A2 (en) | Compositions for enzyme immunoassay of prostaglandins | |
| Mehta et al. | DELISA: sensitive nonisotopic assay for GAD65 autoantibodies, a key risk-assessment marker for insulin-dependent diabetes mellitus | |
| EP1156331B1 (en) | Immunoassay for H. Pylori in fecal specimens using genus specific monoclonal antibody | |
| US5169937A (en) | Method for producing stable glycosylated hemoglobin | |
| JPH02141665A (ja) | 糞便中のヘモグロビンの検出方法 | |
| JP3341629B2 (ja) | ヘリコバクター・ピロリ除菌治療の診断用試薬 | |
| US5707878A (en) | Method for detecting blood component using conidiobolus hemagglutinin | |
| JPH0792454B2 (ja) | 抗原の測定方法 | |
| JPH0755804A (ja) | 活性なオステオカルシンの測定法 | |
| JPH0389165A (ja) | 酵素免疫測定用試薬及びその調製方法 | |
| JPS59224563A (ja) | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの酵素免疫測定用試薬組成物および測定方法 | |
| JPS62235566A (ja) | グルコ−ス−６−燐酸脱水素酵素標識複合体及びそれを用いるエリスロポエチンの酵素免疫測定法 | |
| JPH07140142A (ja) | γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有するタンパク質の測定法およびキット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080530 Year of fee payment: 11 |