FI88546B - Nytt foerfarande foer bestaemning av stabilt glukohemoglobin - Google Patents

Description

1 88546

Stabiilin glukohemoglobiinin uusi määritysmenetelmä

Kyseessä oleva keksintö koskee menetelmää stabiilin glukohemoglobiinin määrän määrittämiseksi kehon nesteistä. Tarkemmin sanottuna, kyseessä oleva keksintö koskee menetelmää glysito-lilysiiniä sisältävien epitooppien määrän määrittämiseksi pelkistyneestä glykohemoglobiinimolekyylistä.

Glykoidut hemoglobiinit (glykohemoglobiinit) ovat hemoglobiineja, jotka ovat kovalenttisesti sidotut sokeriosaan. Tämä merkitsee, että glykohemoglobiinit ovat hemoglobiinin ja sokerin välisen additioreaktion tuotteita (addukteja). Glukohe-moglobiinit ovat glykohemoglobiinin alaluokka joka koostuu glukoosiin sidotusta hemoglobiinista. Glykoituminen on epäspesifinen reaktio, josta on seurauksena erilaisten sokerei-den tai sokerifosfaattien lisäys humaanihemoglobiineihin A0, A2, C, D, E, F ja S.

Glukohemoglobiini Alc (HbAlc) on kaikkein runsain ja laajimmin tutkittu glykohemoglobiini. HbAlc tarkoittaa HbA0:aa, jossa D-glukoosi on sidottu yhden beeta-globiiniketjun tai molempien beeta-globiiniketjujen N-loppupään valiinin aminoryhmään. Kuitenkaan glukoosin lisäys hemoglobiiniin ei rajoitu beeta-ketjun N-loppupäähän, vaan se voi tapahtua myös sekä alfa-•A: että beetaglobiiniketjujen lysiinien epsilon-aminoryhmässä.

: Hemoglobiiniin tapahtuvan glukoosin lisäyksen reaktiomeka- "·_ nismi ja kinetiikka esitetään kaavamaisesti kuvassa l. D- .- ·. -glukoosi aldehydimuodossaan reagoi nopeasti ja reversiibe- listi aminoryhmän kanssa (jonka antaa käyttöön N-loppupäät-, . teen väliini tai ketjujen välisen lysiinitähteen epsilon- aminoryhmä), jotta muodostuu labiili aldimiini-välivaihe (Schiffin emäs). Tämä labiili välivaihe (labiili glukohemo-: : globiini) voi dissosioitua takaisin D-glukoosiksi ja hemo- globiiniksi, tai sille voi tapahtua irreversiibeli mutta hidas Amadori-uudelleenjärjestäytyminen stabiilin ketoamii-*’ 1 nin muodostumiseksi (stabiiliksi glukohemoglobiiniksi).

Ketoamiini vuorostaan on tasapainossa hemiketaali- tai rengasmuodon kanssa (erityisesti, deoksifruktosyyli-lysiinin kanssa) .

2 88546

Kestävän glukohemoglobiinin muodostuminen ei ole entsymaattinen tapahtuma, se on hidas ja jatkuu erytrosyytin koko eliniän ajan. Glukohemoglobiinin muodostumisnopeus riippuu suoraan yksilön kyvystä säädellä verensokerin (glukoosin) tasoa. Sen tähden HbAic:n kestävän glukohemoglobiinin kokonaiskonsentraatiota koskeva tieto on saavuttanut hyväksyntää objektiivisena, ajan suhteen keskimääräisesti arvioituna varoittimena diabetes mellitus potilaiden verensokerin säätelyssä.

Erilaisia menetelmiä kokonaisglykohemoglobiinin tai tiettyjen glukohemoglobiinilaatujen, kuten esimerkiksi HbAlc:n määrittämiseksi, sekä metodisia ongelmia, jotka liittyvät näihin menetelmiin, Goldstein et ai. ovat esittäneet julkaisussa Clin.

Chem., 31:1060-1067 (1985) ja Jovanovic et ai. ovat esittäneet julkaisussa Am. J. Med., 70:331-338 (1981). Esimerkiksi HbA. :n le radioimmunologisessa pitoisuusmäärityksessä (RIA), jota Javid et ai. kuvaavat julkaisussa Br. J. Haematology, 38:329-337 (1978), haittana on, että käytetään vasta-aineita, joilla on alhainen aktiivisuus ja jotka ristireagoivat glukoitumattoman hemoglobiinin kanssa.

Curtis et ai., julkaisussa J. Clin. Invest., 72:1427-38 (1983), kuvasivat monoklonaalisten vasta-aineiden käyttöä immunoreaktios-sa glusitolilysiinitähteen sisältävien epitooppien kanssa määritettäessä glukoituja plasmaproteiineja, joilla on suhteellisen lyhyet puoliintumisajät. Julkaisun tekijät raportoivat myös glusitolilysiinin aiheuttamasta inhibitiosta joidenkin käytettyjen monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumisessa glusitolilysiini-plasmaproteiineihin.

Glusitolilysiinitähde valmistetaan pelkistämällä edellä esitetty Amadori-uudelleenryhmittyrnistuote, siten että lysiinin glukoitu epsilonaminoryhmä (Amadori-tuote) pelkistetään veteen sekoittuvan boorihydridipelkistysaineen (pelkistimen), kuten esimerkiksi 3 88546 natriumboorihydridin tai natriumsyanoboorihydridin kanssa.

Curtiss et ai. osoittivat täten, että näytteeseen sisältyvä gluko-plasmaproteiini voidaan pelkistää ja muuttaa glusitolilysiiniä sisältäväksi plasmaproteiiniksi sekä tämän jälkeen määrittää käyttämällä glusitolilysiinin suhteen spesifisiä monoklonaali-sia vasta-aineita, minkä avulla voitetaan ongelma, joka kytkeytyy risti reaktiivisuuteen, joka havai ttiin glukoitumattomien plasma-proteiinien yhteydessä.

Kuitenkin, kuten voidaan nähdä kuvasta 1, in vitro suoritettu pelkistysmenettely tuottaa glusitolilysiinitähteitä, jotka ovat glukohemoglobiinin sekä labiileina että stabiileina muotoina. Täten, ilman muuta, Curtiss et al.:n esittämä menetelmä, supra, sovellettuna hemoglobiiniin plasmaproteiinin sijasta, ei voisi tehdä eroa näytteeseen sisältyvän glukohemoglobiinin labiilien ja stabiilien muotojen välillä.

Sekä Goldsteinin et ai., supra, ja Jovanovicin et ai., supra, esittämien katsausten mukaisesti, glukohemoglobiinin määrittämiseksi, jotta saadaan käyttöön pitkäaikaisen glukoosin säädön luotettava mitta, määritysmenetelmän tulee tehdä ero glukohemoglobiinin labiilien ja stabiilien muotojen välillä. Tähän on kaksi syytä.

Ensinnä, minä ajankohtana tahansa, erytrosyytissä läsnä olevan glukohemoglobiinin kokonaismäärä on sekä labiilien että stabiilien jakeiden summa. Toiseksi, erytrosyyteissä läsnä olevan labiilin glukohemoglobiinin määrä vaihtelee vasteena lyhytaikaisille glukoositasoilie. Tämä merkitsee sitä, että labiilin ja-keen muodostuminen on riittävän nopeaa verrattuna stabiilin ketoamiinin hitaaseen, irreversiibeliin muodostumiseen, jotta akuutit muutokset veren glukoositasossa käytännöllisesti katsoen johtuvat labiilin jakeen lisääntymisestä. Siksi labiilin jakeen sisällyttäminen glukohemoglobiinin mittaukseen voi heijastaa akuuttia tai lyhytaikaista vastetta veren glukoositasojen suhteen eikä se voi heijastaa pitkäaikaista glukoosin säädön astetta.

4 88546

Viime aikoina käytettävissä olevilla kromatografisilla, elektro-foreettisilla ja immunologisilla glykohemoglobiinin määritysmenetelmillä ei voida erottaa glukohemoglobiinin labiileja ja stabiileja muotoja, kun molempia on näytteessä. Niinpä on suoritettu huomattava määrä tutkimistyötä kehitettäessä määritysmenetelmiä, joihin sisältyy menettelytapa labiilin glukohemoglobiini-jakeen poistamiseksi näytteestä ennen määrittämisvaihetta.

Raportoidut menetelmät labiilin glukohemoglobiinin poistamiseksi näytteestä perustuvat tyypillisesti siihen, että näyte saatetaan olosuhteisiin, jotka suosivat labiilin muodon dissosioitumista glykoosiksi, kuten esimerkiksi glukoosiksi (aldoosi) sekä hemoglobiiniksi. Näihin menetelmiin sisältyy erytrosyyttien inkuboin-ti normaalissa keittosuolaliuoksessa 24 tunnin ajan ennen hemo-lyysiä _/Goldstein et ai., Diabetes 29:623-28 (1980^/, hemolysaa-tin dialysointi 48 tunnin ajan glukoositonta fosfaattipuskuria vastaan, /Widness et ai., J. Lab. Clin. Med. 95:386-394 (198C07, sekä hemolysaatin laimentaminen ja sitä seuraava konsentrointi ultrasuodatuksen avulla /Innanen et ai., Clin. Chem. 27:1478-79 (1981J7.

Kyseessä olevan keksinnön suhteen erityistä mielenkiintoa on menetelmillä, joissa käytetään hapanta inkubointivaihetta labiilin glykohemoglobiinin poistamiseksi. Nathan et ai., Diabetes, 30:700-701 (1981) kuvaavat määritysmenetelmää, jossa erytrosyyttejä inkuboidaan liuoksessa, joka sisältää semikarbatsidia ja analiinia pH 5:ssä, 30 minuutin ajan, 38°C:ssa, labiilin ja-keen loppuun kuluttamiseksi (poistamiseksi). Stabiili glyko-hemoglobiinijae, esimerkiksi glukohemoglobiinijae, määritetään sitten käyttämällä joko suurpainenestekromatografiaa (HPLC) tai sitraattiagargeelielektroforeesia erottamismenetelminä.

Menetelmällä, jota Bisse et ai. kuvaavat julkaisussa Diabetes, 31:630-633 (1982), määritettävästä näytteestä poistetaan labiili jae liuottamalla erytrosyyttejä 50 tilavuudessa liuosta, joka on O,05-molaarinen kaliumbiftalaatin suhteen, pH 5:ssä, 15 minuutin ajan, 37°C:ssa. Stabiilin glykohemoglobiinin määrä, joka jäi näytteeseen jäljelle, sen jälkeen kun labiili glyko- hemoglobiini oli näytteestä poistettu, määritettiin sitten HPLCrn avulla.

5 88546

Kuitenkaan ei tähän mennessä ole raportoitu labiilin qlykoosin, esimerkiksi glukoosin hapanta poistovaihetta, jossa käytetään biftaalihappoa tai muuta hapanta yhdistettä yhdistettynä pelkis-tysvaiheeseen, jossa pelkistimenä käytetään veteen sekoittuvaa boorihydridiä, jotta muodostuu glusitaalilysiini-hemoglobiini, joka voidaan määrittää immunologisesti.

Kyseessä oleva keksintö tarkastelee menetelmää stabiilin glyko-hemoglobiinin, kuten esimerkiksi glukohemoglobiinin määrän määrittämiseksi glykohemoglobiininäytteestä. Näytteeseen sisältyvä labiili glukohemoglobiini ensin poistetaan sekoittamalla gluko-hemoglobiinia sisältävä näyte ftaalihapon tai biftaalihapon kanssa, suhteessa, joka sisältää vähintään noin 1,5 millimoolia happoa milligrammaa kohti hemoglobiinia, vettä sisältävässä väliaineessa, noin pH 3-6:ssa, jotta muodostuu hapan reaktioseos. Tätä seosta pidetään ennalta määrätty aika ennalta määritellyissä olosuhteissa, jotta läsnäoleva labiili glukohemoglobiini dissosioituu glukoosiksi ja hemoglobiiniksi, samalla kun stabiili glukohemoglobiini säilyy alkuperäisessä näytteessä.

Hapan reaktioseos sekoitetaan sitten veden kanssa sekoituskel-poisen boorihydridin, mieluummin natrium- tai kaliumboorihydri-din kanssa, sellaisessa suhteessa, että siinä on ainakin noin 0,15 millimoolia boorihydridiä milligrammaa kohti hemoglobiinia, jotta muodostuu vettä sisältävä pelkistysreaktioseos. Pelkistys-reaktioseosta pidetään yllä ennalta määritetty aika ja sellaisissa olosuhteissa, että läsnä olevat glukoidut lysiinit muuttuvat glusitolilysiinitähteiksi ja muodostavat glusitolilysiini-hemoglobiinia.

Sen jälkeen kun reagoimaton boorihydridi on erotettu glusitoli-lysiinihemoglobiinista, jota on pelkistetyssä näytteessä, läsnä 6 68546 olevan glusitolilysiinihemoglobiinin määrä määritetään hyvin tunnetuin immunologisin määritysmenetelmin, joissa käytetään hyväksi glusitolilysiinille spesifisiä reseptorimolekyylejä. On ymmärrettävää, että tätä menetelmää glusitolilysiinihemoglobiinin immunologisen määrittämismenetelmän mukaisesti voidaan käyttää hyväksi myös glusitolilysiinihemoglobiinin valmistamiseen stabiilista glukohemoglobiinista, joka on glukohemoglobiininäytteessä, joka sisältää sekä labiilia glukohemoglobiinia että stabiilia hemoglobiinia.

Kyseessä olevassa menetelmässä tarkastellaan myös diagnostista järjestelmää, joka tyypillisesti on reagenssipakkauksen muodossa ja sisältää monia erilaisia kokonaisuuksia. Ensimmäinen kokonaisuus sisältää kiinteän faasin matriisin, kuten esimerkiksi mikrotiitterilevyn, jonka syvennyspinnoilla määritys voidaan suorittaa. Toinen kokonaisuus sisältää ennalta määritetyn määrän veden kanssa sekoituskelpoista boorihydridipelkistintä kiinteässä muodossa. Kolmas kokonaisuus sisältää sopivia, glusitolilysiinille spesifisiä reseptorimolekyylejä kuivina tai nestemäisessä muodossa. Neljäs kokonaisuus sisältää ftaali- tai biftaalihappoa. Järjestelmään voi edelleen sisältyä yksi tai useampia lisäkoko-naisuuksia, jotka sisältävät yhtä tai useampaa muuta lisäksi tulevaa, käyttökelpoista reagenssia.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Kyseessä olevaan keksintöön sisältyy useita hyötynäkökohtia ja etuja.

Eräs kyseessä olevan keksinnön suoma hyöty on, että stabiilin hemoglobiinin konsentraatio glukohemoglobiininäytteessä, joka sisältää sekä labiileja että stabiileja glukohemoglobiineja, voidaan määrittää suhteellisen nopeasti, helposti ja täsmällisesti.

Eräs kyseessä olevaan keksintöön liittyvä etu on, että glusitoli-lysiinihemoglobiini voidaan valmistaa glukohemoglobiininäytteen stabiilista glukohemoglobiiniosasta siten, että suljetaan pois näytteen labiilista glukohemoglobiiniosasta muodostunut glusito- lilysiinihemoglobiini.

I ,

Vielä eräs kyseessä olevan keksinnön suoma etu on, että valmis tettu glusitolilysiini-hemoglobiini on antigeenisempi kuin muilla tavoin valmistettu glusitolilysiini-hemoglobiini.

7 88546

Muut kyseessä olevan keksinnön suomat hyödyt ja edut kyseessä olevaan aiheeseen perehtyneille käyvät ilmi seuraavana esitetystä kuvauksesta.

Kuvissa, jotka muodostavat osan kyseessä olevaa keksintöä:

Kuva 1 on kaaviomainen esitys, joka koskee reaktiosekvenssiä hemoglobiinin, joka kuvassa on merkitty "proteiiniksi", vapaiden alfa- (aminopäätteinen väliini) ja epsilon- (lysiini) amiinien ei entsymaattiseksi glukoimiseksi, jotta muodostuu labiileja ja stabiileja glukohemoglobiineja, sekä tätä seuraavaa välivaiheiden pelkistystä glusitolin substituoimien lopputuotteiden muodostamiseksi.

Kuva 2 sisältää kolme graafista esitystä, jotka valaisevat tuloksia kompetitiivistä inhibitiota koskevista tutkimuksista, jotka on suoritettu sekoittamalla piparjuuriperoksidaasilla merkattuja G6C9-reseptoreita (HRPO-G6C9) erilaisten konsentraatioiden kanssa G6C9 vasta-ainetta sitovan kohdan suhteen potentiaalisesti kilpailevia yhdisteitä. Kunkin graafisen esityksen abskissa esittää käytettyjen inhibiittoriliuosten konsentraatiota milligrammoina millilitraa kohti (^,ug/ml). Kunkin graafisen esityksen ordinaatta esittää maksimi sitoutumisen jaetta; se on, kompeti-tiivisen inhibiittorin poissa ollessa HRPO-G6C9:llä saavutettua sitoutumisen määrää, mikä jäi jäljelle tai saavutettiin erilaisten potentiaalisten inhibiittoreiden kanssa tapahtuneen reaktion jälkeen.

Kuva 2A valaisee tuloksia, jotka on saatu käyttämällä glusitoli-lysiiniä (A); pelkistettyä poly-L-lysiiniä (CU); pelkistettyä alfa-T-Boc-lysiiniä (#); pelkistettyä, glykoimatonta hemoglobiinia (A); sekä pelkistettyä poly-L-valiinia (fl) potentiaalisina kompetitiivisina inhibiittoreina. Nämä tulokset osoittavat, 8 88546 että tästä ryhmästä ainoastaan positiivinen kontrolli, glusitoli-lysiini, inhiboi HRPO-G6C9-reseptoreiden sitoutumista, ja sen tähden pelkistäminen yksinään, glukoosin poissaollessa, ei saa aikaan sitä, että HRPO-G6C9 tunnistaa epitoopin.

Kuva 2B valaisee tuloksia, jotka on saatu käyttämällä glusitoli-lysiiniä (A); glukoitua poly-L-lysiiniä ([li); glykoitua alfa-T-Boc-lysiiniä (0); glukoitua hemoglobiinia (A) sekä glukoitua poly-L-valiinia (f) potentiaalisina kompetitiivisina inhibiittoreina. Kyseessä olevan kuvan tulokset ilmaisevat, että ainoastaan positiivinen kontrolli glusitolilysiini inhiboi sitoutumisen. Täten glukointi yksinään ei saa aikaan sitä, että HRPO-G6C9 tunnistaa epitoopin.

Kuva 2C valaisee tuloksia, jotka on saatu, sen jälkeen kun on glukoitu ja pelkistetty poly-L-lysiini ([j ) ; alfa-T-Boc-lysiini (0); hemoglobiini (A) sekä poly-L-vali ini (|). Esitetyt tulokset ilmaisevat, että kun poly-L-lysiini ja hemoglobiini on glukoitu ja pelkistetty, ne molemmat voivat kilpailla HRPO-G6C9 vasta-aineen sitoutumiskohdista samalla tavalla kuin kilpailee positiivinen kontrolli glusitolilysiini. Vain glukoidun ja pelkistetyn poly-L-valiinin epäonnistui kilpailla merkittävästi, mikä ilmaisee sen, että HRPO-G6C9-reseptorit eivät immuno-reagoi hemoglobiinin N-terminaalisen, glukoidun valiinin kanssa.

Kuva 3 sisältää 2 graafista esitystä, jotka valaisevat odottamattomia tuloksia, jotka on saatu, kun glusitolilysiinin muodostuminen hemoglobiininäytteessä suoritetaan pelkistämällä ftaali-hapon läsnäollessa.

Kuvassa 3A, qlukohemoglobiinia sisältäviä hemoqlobiininäytteitä annettiin käyt töön lO mikrolitrana tiivistä RBC-sakkaa, joka oli saatu joko diabetespotilaan (kolmio) tai normaalin henkilön (neliöt) verestä. Näytteet pelkistettiin käyttämällä joko NaBH^: a (A.ij) tai KBH^: a (A,,®) veden kanssa sekoituskelpoi-sena boorihydridipelkistimenä, ja sitten määritettiin glusitoli- 9 88546 lysiini-hemoglobiinin muodostuminen. Hemoglobiinin konsentraa-tio kussakin pelkistysreaktioseoksessa oli 2,4 milligrammaa mil-lilitraa kohti (mg/ml). Kunkin seoksen boorihydridikonsentraa-tio esitetään abskissalla.

Kuva 3B kuvaa tuloksia, jotka on saatu samojen kahden hemoglobii-ninäytteen ja samojen kahden pelkistimen avulla, kun pelkistys suoritettiin sen jälkeen, kun näytteet olivat reagoineet ftaali-hapon kanssa. Kuvassa 3A esitettyjen tulosten vertailu kuvassa 3B esitettyjen tulosten kanssa ilmaisee, että ftaalihapon kanssa suoritettu reaktio ennen boorihydridillä suoritettua pelkistystä antaa tulokseksi merkittävän lisäyksen määritettävän glusitolily-siini-hemoglobiinin määrässä, HRPO-G6C9-reseptoreiden immunologisen sitoutumisen avulla määritettynä. Kuvatulla tavalla, ftaalihappoa ja boorihydridipelkistintä käyttämällä valmistetulla glusitolilysiini-hemoglobiinilla on täten lisääntynyttä antigeenisuutta. Tämä havaittu, lisääntynyt määritettävän glusitolily-siini-hemoglobiinin määrä (antigeenisuus) oli odottamatonta.

Kuva 4 valaisee pelkistysreaktioseoksen vaihtelevan ylläpitoajan vaikutusta. Hapan reaktioseos valmistettiin käyttämällä erilaisia laimennuksia kokoverta, joka saatiin joko diabetespotilaalta tai normaalilta, naispuoliselta henkilöltä, ja veri sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen O,lO-molaarista ftaalihappoa. Hemoglobiinin (Hb) konsentraatiot happamessa reaktioseoksessa, milligrammoina Hb:a/ml, olivat seuraavat: 27,0, 10,8, 5,4, 2,7, 1,08, 0,()75, 0,54, 0,415, 0,337 sekä 0,270. Hapon millimoolien suhde hemoglobiinin milligrammaa kohti oli kussakin yllä mainitussa seoksessa vastaavasti 1,85, 4,63, 9,26, 18,5, 46,3, 74,07, 92,6, 120,5, 148,5 sekä 185,2.

Hemolysaatin muodostamisen jälkeen valmistettiin pelkistysreaktio-seokset sekoittamalla kutakin hemolysaattia yhtä suuren tilavuuden kanssa 40O-millimolaarista NaBH^ia. Hemoglobiini näytteiden lopullisten laimennusten käänteisarvot esitetään abskissalla. Vasemmalta oikealle ja lisääntyvän hemoglobiinilaimennuksen järjestyksessä NaBH^rn millimoolien suhde kunkin esitetyn 10 88546 pelkistysseoksen hemoglobiinimilligrammaa kohti oli 0,0148, 0,037, 0,074, 0,148, 0,37, 0,593, 0,74, 0,964, 1,187 sekä 1,481.

Kuvassa 4 esitetyt tulokset ilmaisevat, että pelkistysreaktio-seosten säilyttäminen 30 minuutin ajan, sekä diabetespotilaan (Q) että normaalin näytteen (fl) ollessa kysymyksessä, tuotti enemmän määritettävää glusitolilysiini-hemoglobiinia kuin näiden seosten ylläpito 15 minuutin ajan, sekä diabetespotilaan (A) että normaalin (A.) näytteen ollessa kysymyksessä.

Kuva 5 on pylväsdiagrammi, joka kuvaa erilaisten happamien reak-tioseosten vaikutusta määritettävään glusitolilysiini-hemoglobii-niin reaktioseosten sisältämän hapon funktiona. Seokset valmistettiin sekoittamalla 10 mikrolitraa tiivistä RBC-sakkaa, joka oli saatu joko diabetes- (|) tai normaalin (Lj ) potilaan verinäytteestä, ja 615 mikrolitraa yhtä seuraavista 0,05-molaarisis-ta liuoksista, joiden pH-arvot ovat 4-5; ftaalihappo (A), sitraat-ti (E), etikkahappo (F), fosfaatti (G), D(+) glukosamiini (H), alfa-ketoglutaarihappo (I), oksaalietikkahappo (J), oksaalihapon dikaliumsuola (K), meripihkahappo (L) sekä palorypälehappo (M), jonka jälkeen suoritettiin pelkistys NaBH^rllä sekä glusitolily-siini-hemoglobiinipitoisuuden määritys ELISA:11a, jota kuvataan tässä yhteydessä myöhemmin. Kontrolleihin kuuluivat tislattu vesi (B), RBC:t, joita oli inkuboitu yön yli (noin 18 tuntia) keittosuolaliuoksessa ja tämän jälkeen tislatussa vedessä (C), tai ftaalihappo (D). Kontrollit määritettiin yllä kuvatulla tavalla. Muodostuneen, määritettävän glusitolilysiini-hemoglobiinin määrä ilmaistaan optisen tiheyden arvona (O.D.), joka mitataan 490 nm:ssä.

Kuvassa 5 esitetyt tulokset osoittavat, että klassinen menetelmä labiilin glukohemoglobiinin poistamiseksi näytteestä, esim.

RBC:n yli yön keittosuolassa suoritettu inkubointi (C), ei tehosta glysitolilysiinin muodostumista samalla tavalla kuin ftaalihappo. Nämä tulokset valaisevat myös määritettävissä olevan glusitolilysiinin tehostamista käyttämällä veden kanssa sekoituskelpoista boorihydridipelkistintä .

11 88546

Kuva 6 on graafinen esitys tuloksista, jotka on saatu, kun kyseessä olevan keksinnön mukaista määritysmenetelmää käytettiin hapDamien reaktioseosten kanssa, joiden konsentraatiot ftaa-lihapon suhteen olivat joko noin 0,05-molaarisia (O) tai noin 0,025-molaarisia (A). Kyseessä olevassa kuvassa esitetään myös tulokset, jotka on saatu siten, että hemolysaatteja, jotka on muodostettu käyttämällä hapanta reaktioseosta, jossa ftaalihapon konsentraatio on 0,05 moolia, ei ole pelkistetty· (fl ) . Muihin kontrolleihin sisältyvät tulokset, jotka on saatu, kun ennen NaBH^rllä suoritettua pelkistystä ei ole käytetty ftaalihappo-käsittelyä (Lj) ja kun RBCrtä on inkuboitu yli yön isotonisessa keittosuolaliuoksessa ennen pelkistystä, mutta ilman ftaalihappo-käsittelyä (A) .

Happamissa reaktioseoksissa hemoglobiinin konsentraatiot olivat milligrammoina millilitraa kohti ilmaistuina, 75, 50, 37,5, 30, 25 ja 21,4. Hemoglobiinin konsentraatiot kussakin vastaavassa pelkistysreaktioseoksessa olivat milligrammoina millilitrassa 37,5, 25, 18,75, 15, 12,5 ja 10,7. NaBH^rn konsentraatio pel-kistysreaktioseoksissa oli 200 millimoolia.

Kuva 7 esittää pylväsdiagrammia, joka koskee O.D. 490-arvoja, jotka on saatu käyttämällä happamien reaktioliuosten valmistamiseen ftaalihapon vesiliuoksia, joiden pH-arvot olivat 3,5, 4,5, 5,5 ja 6,5. Diabetespotilaiden näytteillä numero 1 (H) ja numero 2 (§) sekä normaaleilla näytteillä numero 1 ([~ ) sekä numero 2 ((¾ ) glykoidun hemoglobiinin kokonaistasot olivat vastaavasti 14,7 %, 10,7 %, 7,5 % ja 8,0 %, valmistajan ohjeiden mukaisesti, Gly-Affin-järjestelmällä (Isolab, Akron, OH) määritettyinä.

Kuva 8 on pylväsdiagrammi, joka esittää happamien reaktioseosten erilaisten ylläpitoaikojen vaikutusta. Seokset muodostettiin käyttämällä 0,05-molaarista ftaalihappoa, jonka säätämätön pH-arvo oli noin 4,3. Käytetyt näytteet olivat samat kuin ne, joita kuvataan kuvassa 7; se on, diabetespotilaan näyte numero 1 (), diabetespotilaan näyte numero 2 (§ ) , normaali näyte numero 1 (|_V ) ja normaali näyte numero 2 (¾ ) .

12 88546

Kuva 9 valaisee pelkistysreaktioseosten säilyttämisen vaikutusta, kun säilytys suoritetaan joko huoneenlämpötilassa tai 37°C:ssa ja kun hemoglobiinin konsentraatio happamissa reaktio-seoksissa on alueella 27,0-0,27 mg/ml ja pelkistysreaktioseoksis-sa se on 13,5-0,135 mg/ml. Happamet reaktiot suoritettiin käyttämällä noin 0,05-molaarista ftaalihapon konsentraatiota sekä säätämätöntä ftaalihapon pH-arvoa (noin 4,3). Pelkistysreaktiot suoritettiin noin 200-millimolaarisessa NaBH4:n konsentraatiossa.

Hemoglobiininäytteet annettiin käyttöön kokoverenä, joka oli saatu joko naispuoliselta diabetespotilaalta (avoin symboli) tai normaalilta naispuoliselta henkilöltä (suljettu symboli), ja niitä pidettiin pelkistysreaktioseoksessa, joko huoneenlämpötilassa (Aja 4^ , vastaavasti) tai 37°C:ssa (Li ja(| , vastaavasti).

Kuva 10 esittää tuloksia maksimaalista määrää ja saantoa koskevista tutkimuksista, joissa määritettiin hemoglobiininäytteitä, jotka sisälsivät erilaiset, osoitetut suhteet normaalin henkilön ja diabetespotilaan verinäytettä. Täydellisesti glykoidun hemoglobiinin prosentuaalinen määrä diabetespotilaan ja normaalin potilaan sekoittamattomassa näytteessä määritettiin käyttämällä Gly-Affin-järjestelmää (Isolab), ja määrän havaittiin vastaavasti olevan 18,56 prosenttia ja 5,45 prosenttia. Kyseessä olevan tutkimuksen lähemmät yksityiskohdat annetaan käyttöön esimerkissä 8.

A. Määritelmät

Termillä "vasta-aine" tarkoitetaan molekyyliä, joka kuuluu imrauno-globuliineiksi nimitettyjen, glykoitujen proteiinien ryhmään ja joka voi spesifisesti liittyä antigeenin kanssa. Sellainen vasta-aine liittyy antigeeniinsä spesifisen, immunologisen sidosvuorovaikutuksen avulla, joka vallitsee antigeenin antigee-nideterminantin ja vasta-aineen vastaanottokohdan välillä.

"Vastaanottokohta" on vasta-ainemolekyylin rakenneosa, joka koostuu raskaan ja kevyen ketjun variaabeleista ja hypervariaabeleista 13 88546 alueista, jotka spesifisesti sitovat antigeenin. Jernen nimistön mukaisesti, (1974) Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 125C: 373-389, vasta-aineen vastaanottokohtaa nimitetään myös "paratoopiksi".

Vasta-aineiden vastaanottokohtia sisältävät (paratoopin sisältävät) polypeptidiosat ovat vasta-ainemolekyylien niitä osia, jotka sisältävät paratoopin ja sitoutuvat antigeeniin ja joihin kuuluvat esimerkiksi vasta-aineiden Fab-, Fab'-, F(ab')2- ja F(v)-osat. Vasta-aineiden Fab- ja F(ab')2-osat valmistetaan vastaavasti papaiinin ja pepsiinin proteolyyttisen reaktion avulla oleellisesti koskemattomien vasta-aineiden kanssa, menetelmin, jotka ovat hyvin tunnettuja. Kts. esimerkiksi US-patentti 4 342 566, jonka Theofilopoulos ja Dixon ovat julkaisseet. Vasta-aineen Fab'-osat ovat myös hyvin tunnettuja, ja niitä valmistetaan F(ab1)2~osista, minkä jälkeen seuraa kahden raskaan ketjun osia kytkevien disulfidisidosten pelkistäminen esimerkiksi merkaptoetanolilla, ja tämän jälkeen syntyvä proteiini-merkaptaani alkyloidaan jollain reagenssilla, kuten esimerkiksi jodiasetamidilla. Koskemattomat vasta-aineet ovat edullisia, ja niitä käytetään valaisemaan kyseessä olevan keksinnön mukaisia, monoklonaalisia ligandimolekyylejä.

Sanaa "antigeeni" on historiallisesti käytetty merkitsemään kokonaisuutta, jonka vasta-aine sitoo, ja sitä on käytetty myös merkitsemään kokonaisuutta, joka saa aikaan vasta-aineen muodostumisen. Nykyinen käytäntö rajoittaa antigeenin merkityksen vasta-aineeseen sidottuun itsenäiseen kokonaisuuteen, kun taas sanaa "immunogeeni" käytetään itsenäisesti kokonaisuudesta, joka saa aikaan vasta-aineen valmistuksen. Siinä tapauksessa, että tässä yhteydessä mainittu itsenäinen kokonaisuus on sekä immunogeeninen että antigeeninen, sitä nimitetään yleisesti antigeeni ksi..

ilmaisulla "antigeenideterminantti" tarkoitetaan antigeenin varsinaista rakenneosaa, joka immunologisesti sitoutuu vasta-aineen vastaanottokohtaan. Jernen nimistön mukaan antigeeni- 14 8 8 5 46 determinantti määritellään uudelleen "epitoopiksi".

Termillä "biologisesti aktiivinen" tarkoitetaan ainakin proteiini-molekyylin kykyä spesifisesti sitoa antigeeni tai vasta-aineen spesifinen vastaanottokohta, vaikka molekyylillä voi olla myös muuta yleistä tai effektorikykyä. Biologinen aktiivisuus reseo-torimolekyylillä, joka sisältää vasta-ainemolekyylirakenteen vastaanottokohdan, todistetaan paratoopin (vasta-ainemolekyylirakenteen vastaanottokohdan) immunologisen reaktion avulla epitoop-pinsa (antigeenideterminantin) kanssa niiden seoksessa, vettä sisältävässä väliaineessa, ainakin fysiologisissa pH-arvoi.ssa ja ionivahvuuksissa. Mieluummin, biologinen aktiivisuus ilmenee biologisissa määritysolosuhteissa, jotka määritellään tässä yhteydessä myöhemmin.

"ELISA":11a tarkoitetaan entsyymiin kytkettyä immunosorbenttimää-ritystä, jossa käytetään vasta-ainetta tai antigeeniä, joka on sidottu kiinteään jakeeseen, ja entsyymi-antigeeni- ja entsyymi-vasta-aine-konjugaattia, näytteeseen sisältyvän antigeenin tai vasta-aineen määrän havaitsemiseksi ja kvantitoimiseksi. D.P. Sites et ai. esittävät ELISA-tekniikkaa koskevan kuvauksen julkaisussa Basic and Clinical Immunology, kappaleessa 22, kyseessä olevan julkaisun neljännessä painoksessa (Lange Medical Publications of Los Altos, CA, 1982), ja ELISA:a kuvataan myös US-patenteissa 3 654 090; 3 850 752 ja 4 016 043, jotka kaikki on liitetty kyseessä olevan keksinnön yhteyteen viitteinä.

"Entsyymi" tarkoittaa proteiinia, joka katalyyttisen toiminnan avulla pystyy kiihdyttämään jotain muutosta substraatissa tai saamaan aikaan tällaisen muutoksen, jonka suhteen entsyymi usein on spesifinen.

Termillä "immunoreaktio" eri muodoissaan tarkoitetaan resepto-rimolekyylin ja epitoopin välistä sitoutumista.

"Immunoreaktantilla" tässä yhteydessä käytettynä tarkoitetaan immunologisen reaktion tuotetta, se on, kokonaisuutta, joka muodostuu, kun reseptorimolekyyli immunologisesti sitoutuu epi-tooppiin.

15 88 546

Termiä "leimaustapa","ilmaiseva ryhmä" tai "leima" käytetään tässä yhteydessä vaihtelevasti, ja mainitut ilmaisut sisältävät yksittäiset atomit ja molekyylit, jotka joko suoraan tai epäsuorasti liittyvät immunoreaktantin osoittamiseen käytettävän, havaittavan signaalin muodostamiseen. Mikä tahansa leimaustaoa voidaan liittää tai sisällyttää reseptoriin, tai sitä voidaan käyttää erillisenä, ja näitä atomeja tai molekyylejä voidaan käyttää yksinään tai muihin reagensseihin yhdistettynä. Sellaiset ilmaisevat ryhmät tai leimat ovat immunokemiassa sinänsä hyvin tunnettuja, ja ne muodostavat osan tätä keksintöä ainoastaan sikäli kuin niitä käytetään muissa suhteissa uusina menetelminä ja/tai järjestelminä.

Termiä "reseptori" käytetään tässä yhteydessä ilmaisemaan biologisesti aktiivista molekyyliä, joka käsittää vasta-aineen vastaanottokohdan, joka immunologisesti sitoutuu antigeeniin (tai jonka kanssa antigeeni sitoutuu). Sellainen sitoutuminen tapahtuu tyypillisesti affiniteetilla, joka on noin lcr - lo1 litraa moolia kohti, ja sitoutuminen on antigeenin epitoopin spesifinen vuorovaikutus reseptorin vasta-aineen vastaanottokohdan kanssa.

Sanoja "erittää" ja "tuottaa" käytetään usein samassa merkityksessä tarkoittamaan soluja, joista vasta-ainemolekyylit saadaan. Solut, jotka valmistavat vasta-aineita eivät kuitenkaan eritä näitä molekyylejä ympäristöönsä. Hybridomasolut, jotka tässä yhteydessä ovat mielenkiinnon kohteina, erittävät monoklonaalisia vasta-aineita ympäristöönsä. Kuitenkin sellaisia soluja tässä yhteydessä joskus nimitetään "vasta-ainetta tuottaviksi" soluiksi, ja niiden vasta-aineita nimitetään "tuotetuiksi" käytettäessä tutkimustyön piirissä yleistä ilmaisua. Yllä mainittujen vasta-aineiden (reseptoreiden) vastaanottokohtia samalla tavalla sanotaan "tuotetuiksi" tai "eritetyiksi", vaikka on ymmärrettävää, että sellaisia molekyylejä valmistetaan vasta-aineista, jotka itse ovat "tuotettuja" tai "eritettyjä".

ie 88546

Termillä "supernatantti" tässä yhteydessä käytettynä tarkoitetaan nestemäistä elatusainetta in vitro, jossa soluja viljellään. Monoklonaaliset vasta-aineet, joita tässä yhteydessä mielenkiinnon kohteena olevat hybridomaviljelmät valmistavat, erittyvät ympäröivään elatusaineeseen. Sen tähden, näiden solujen elatusaineen supernatantti on monoklonaalisten reseptori-molekyylien edullinen lähde, ja hybridomasolut voidaan siitä helposti poistaa hyvin tunnetuin menetelmin. Esimerkkinä sellaisista menetelmistä on sentrifugointi alhaisella nopeudella solujen sedimentoimiseksi nestemäisestä elatusaineesta. Vaihtoehtoisesti voidaan reseptorimolekyylit saada ascites-kasvainnesteestä (ascites-nesteestä) laboratorioeläimiltä, joihin hybridomakudosta on siirretty. Molemmat menetelmät ovat tutkimustyössä hyvin tunnettuja. Monospesifiset reseptorimolekyylit, joihin tässä yhteydessä on viitattu, erittyvät isäntäeläimen vereen, jossa niiden määrä nousee. Menetelmät sellaisten vasta-aineiden saamiseksi ovat tutkimustyön piirissä hyvin tunnettuja.

B. Glusitolilysiini-hemoglobiini Valmistusmenetelmät

Kyseessä olevassa keksinnössä tarkastellaan menetelmää glysitoli-lysiini-hemoglobiinin valmistamiseksi glykohemoglobiinista, käyttämällä esimerkiksi glusitolilysiini-hemoglobiinia tai gluko-hemoglobiinia. Tällä menetelmällä valmistetulla glusitolilysiini-hemoglobiinilla on odottamattomasti lisääntynyt antigeenisuus verrattuna glusitolilysiini-hemoglobiiniin, joka on valmistettu tutkimustyössä tunnetuin menetelmin. Syy havaittuun, lisääntyneeseen antigeenisuuteen on tuntematon.

Annetaan käyttöön glukohemoglobiininäyte, jossa on tunnettu määrä hemoglobiinia. Täten käyttöön annettu glukohemoglobiini voi olla läsnä erytrosyytteihin sisältyneenä (veren punasolut) tai vapaina molekyyleinä.

Menetelmät glukohemoglobiinin saamiseksi sekä glukohemoglobiinin määrittämiseksi ovat hyvin tunnettuja. Lisäksi hyvin tunnettuja ovat menetelmät glukoituja propteiineja ja polypeptidejä varten 17 88546 yleensä ja erityisesti menetelmät, jotka koskevat glukoitua hemoglobiinia. Katso esimerkiksi Mezcin et al.:n julkaisema US-patentti 4 478 744 sekä Curtiss et al.:n julkaisu, J. Clin. Invest., 72:1427-38 (1983), jotka molemmat julkaisut on tähän yhteyteen liitetty viitteinä.

Tyypillisesti annetaan glukohemoglobiininäyte käyttöön tunnettuna määränä kokoverta ja mieluummin tunnettuna määränä punasolu-tiivistettä (RBC). Menetelmät verinäytteiden ja punasolutiivis-teiden käyttöön ottamiseksi sekä menetelmät RBC:ien liuottamiseksi ovat tutkimustyön piirissä hyvin tunnettuja.

(a) Glukohemoglobiini-hemoglobiininäyte sekoitetaan vettä sisältävässä väliaineessa tunnetun määrän kanssa ftaalihappoa tai biftaalihappoa, jotta hapan reaktioseos muodostuu. Sekoitetun hapon määrä on sellainen määrä, joka on riittävä antamaan ftaali-hapon suhteeksi hemoglobiiniin ainakin noin 1,5 millimoolia/1 milligramma, mieluummin suhde on ainakin noin 15,0 millimoolia happoa milligrammaa kohti hemoglobiinia ja vielä mieluummin ainakin noin 45 millimoolia happoa milligrammaa kohti hemoglobiinia .

Happo annetaan käyttöön normaalisti vesiliuoksena, jonka pH-arvo on noin 3-6, mieluummin noin 4-5 ja vielä mieluummin noin 4,1-4,5. Hapon vesiliuos voi täten käsittää happamen reaktio-seoksen vesiliuoksen.

Menetelmät hemoglobiinin molaarisen määrän määrittämiseksi ovat tutkimustyön piirissä hyvin tunnetut.

(b) Saatua hapanta reaktioseosta pidetään yllä ennalta määrätty aika, jonka pituus on sekunneista tunteihin. Aika, jonka pituus on noin 10-15 minuuttia, riittää tavallisesti dissosioi-maan ja suurin piirtein poistamaan (kuluttamaan loppuun) läsnäolevan, labiilin glukohemoglobiinin, kun taas stabiili gluko-hemoglobiini, joka alunperin oli näytteessä, säilyy. Kuitenkin, is 88546 jos niin halutaan, seosta voidaan säilyttää noin 16-20 tuntia ilman haitallisia vaikutuksia.

Kun glukohemoglobiininäyte annetaan käyttöön kokonaisina RBCrinä, hapan liuos toimii punasoluja liuottavana liuoksena (agenssina), niin että happamen reaktioseoksen säilyttämisen aikana RBC:t liukenevat niiden sisältämän hemoglobiinin tällöin vapautuessa ja hemolysaatin muodostuessa. Näin muodostuneessa hemolysaatissa labiili hemoglobiini hajoaa, ja hemolysaatti sisältää stabiilia hemoglobiinia, joka oli läsnä alkuperäisessä RBC-näyte-erässä.

(c) Hapan rekatioseos sekoitetaan tämän jälkeen veden kanssa sekoituskelpoisen boorihydridipelkistimen kanssa, jotta muodostuu pelkistysreaktioseos, joka sisältää vettä. Pelkistysreaktio-seoksen vettä sisältävää osaa voidaan täydentää happamen reaktio-seoksen vedellä, boorihydridipelkistimen vesiliuoksella tai näillä erikseen. Hapan reaktioseos muodostaa mieluummin ainakin osan pelkistysreaktioseoksen vettä sisältävästä osasta.

Veden kanssa sekoituskelpoiset boorihydridipelkistimet ovat hyvin tunnettuja, ja niihin kuuluvat natriumboorihydridi (NaBH^), kaliumboorihydridi (KBH^) sekä natriumsyanoboorihydridi (NaCNBH^). Sekoitettavan boorihydridin määrä on sellainen määrä, joka on riittävä muodostamaan suhteen, jossa on vähintään noin 0,015 millimoolia boorihydridiä (BH~) milligrammaa kohti hemoglobiinia, mieluummin määrä, joka on riittävä muodostamaan suhteen, jossa on ainakin noin 0,15 millimoolia boorihydridiä milligrammaa kohti hemoglobiinia, ja vielä mieluummin määrä, joka on riittävä muodostamaan suhteen, jossa on ainakin noin 0,35 millimoolia boorihydridiä milligrammaa kohti hemoglobiinia.

(d) Saatua pelkistysreaktioseosta pidetään yllä lämpötilassa, joka on noin 0-37°c, mieluummin noin 20-37°C, ennalta määrätyn ajan, jonka pituus on sekunneista tunteihin. Aika, joka on pituudeltaan noin 10 minuutista noin 16-20 tuntiin, mieluummin noin 15 minuutista noin 30 minuuttiin, tavallisesti riittää 19 88546 pelkistämään ketoryhmän (ryhmät), joka sisältyy (jotka sisältyvät) stabiiliin glukohemoglobiiniin, glusitolilysiinitähteen (tähteiden) hydroksyyliryhmään (ryhmiin) ja muodostaa (muodostavat ) glusitolilysiini-hemoglobiinin.

(e) Saatu glusitolilysiini-hemoglobiini erotetaan sitten jäljelle jääneestä reagoimattomasta boorihydridistä, jotta saadaan eristetty glusitolilysiini-hemoglobiini. Tässä erottamisvaiheessa mieluummin poistetaan myös solujen pirstaleet, jotka ovat peräisin RBC:iden hajoamisesta.

Menetelmät glusitolilysiini-hemoglobiinin erottamiseksi reagoimattomasta boorihydridistä sekä jäljelle jäävästä osasta pelkis-tysreaktioseosta ovat myös hyvin tunnettuja. Sellaisiin erottamis-menetelmiin kuuluvat geeliekskluusiokromatografia, elektroforeesi, affiniteettikromatografia yms. Siinä tapauksessa, että käytetään hyväksi kiinteäfaasimääritysmenetelmää, on edullista sitoa hemoglobiini johdannainen kiinteään faasimatriisiin, kiinteän tuen muodostamiseksi ja sen jälkeen yksinkertaisesti dekantoida nestemäinen pelkistysreaktioseos kiinteästä jakeesta, erottumisen aikaansaamiseksi. Kiinteää tukea, joka sisältää glusitoli-lysiinin, voidaan myös pestä dekantointivaiheen jälkeen.

Yllä kuvattua menetelmää voidaan käyttää valmistettaessa glusi-tolilysiini-hemoglobiinia, joka on käyttökelpoista diagnostisissa määritysmenetelmissä ja reagenssipakkauksissa, joita käytetään glukohemoglobiinin mittaukseen. Tätä menetelmää voidaan käyttää muiden haluttujen glysitolilysiini-hemoglobiinityyppien valmistukseen, riippuen läsnäolevasta, tietystä lysiinisokeri-adduktista.

C. Määritysmenetelmät

Kyseessä olevassa keksinnössä tarkastellaan myös määritysmenetel mää stabiilin glykohemoglobiinin määrittämiseksi hemoglobiini-näytteestä käyttäen jälleen glukohemoglobiinia esimerkkinä.

20 88546

Aiemmin kuvattua menetelmää glusitolilysiini-hemoglobiinin valmistamiseksi käytetään yllä esitetyn vaiheen (e) mukaisen, eristetyn glusitolilysiini-hemoglobiinin valmistamiseksi näytteestä, joka sisältää tunnetun määrän hemoglobiinia. Myöhemmin suoritetaan seuraavat vaiheet.

(f) Eristetty glusitolilysiini-hemoglobiini. sekoitetaan resep-toreiden kanssa, jotka immunoreagoivat glusitolilysiiniä sisältävien epitooppien kanssa muodostaakseen immunoreaktioseoksen, ja ne eivät oleellisesti reagoi hemoglobiinin kanssa, josta glusi-tolilysiini puuttuu. Käyttökelpoisia reseptoreita sekoitetaan odotetusti läsnäolevan glusitolilysiinin suhteen tyypillisesti stökiometrinen ylimäärä.

Reseptorimolekyylejä, joilla on yllä kuvattua immunoreaktiivi-suutta, nimitetään tässä yhteydessä "glusitolilysiinin suhteen spesifisiksi" reseptorimolekyyleiksi tai reseptoreiksi. On ymmärrettävää, että sellaiset reseptorimolekyylit voivat risti-reagoida muiden osien kanssa, kuten esimerkiksi muiden sokeri-hemoglobiiniadduktien pelkistettyjen Amadori-tuotteiden tai mannitolilysiinitähteiden kanssa. Ilmaisun yksinkertaistamiseksi kaikkia pelkistettyjä, stabiileja hemoglobiinin tuotteita (Amadori-tuotteita) nimitetään glusitolilysiinitähteiksi, ja täten reseptorimolekyylejä, jotka immunoreagoivat näiden pelkistettyjen tuotteiden kanssa nimitetään "glusitolilysiinin suhteen spesifisiksi". Käyttökelpoiset reseptorimolekyylit voivat myös risti reagoida muiden osasten, kuten esimerkiksi sorbitolin, mannitolin, plasman pelkistettyjen Amadori-tuotteiden sekä muiden proteiinien kanssa, samoin aminohappojen, kuten esimerkiksi lysiinin tai arginiinin kanssa. Kuitenkin, jos nämä muut osaset puuttuvat tässä yhteydessä käyttökelpoisesta immunoreaktioseok-sesta, käyttökelpoisten reseptorimolekyylien muu lisäksi tuleva ristireaktiokyky ei ole merkityksellistä kyseessä olevalle keksinnölle.

Valmistusmenetelmät käyttökelpoisille reseptoreille, jotka immunoreagoivat glusitolilysiini-hemoglobiinin kanssa ja joilla 2i 88546 ilmenee vähän tai ei ollenkaan immunologista ristireaktiokykyä hemoglobiinin kanssa, joka ei sisällä glusitolilysiinitähteitä; se on glusitolilysiinin suhteen spesifisten reseptoreiden valmistusmenetelmät ovat hyvin tunnettuja. Tyypillisesti nämä menetelmät edellyttävät, että ensin valmistetaan immunogeeni, joka sisältää glusitolilysiinitähteitä.

Kuten aiemmin on esitetty, proteiinien ja synteettisten proteiinien glykointimenetelmät yleensä ja näiden osien glukointi erityisesti on tutkimustyössä hyvin tunnettua. Lisäksi, menetelmät lysiinitähteiden, joissa glukoosi on sidottuna niiden epsilon-aminoryhmään, muuntaminen glusitolilysiinitähteiksi, kuten esimerkiksi pelkistämällä veden kanssa sekoitettavan boorihydridi-pelkistimen kanssa, on hyvin tunnettua tutkimustyön piirissä.

Katso Curtiss et ai., J. Clin. Invest, 72:1427-38 (1983).

Edelleen hyvin tunnettuja ovat menetelmät reseptoreiden valmistamiseksi käyttämällä proteiini- ja polypeptidi-immunogeeneja.

Esimerkiksi Curtiss et ai., supra, kuvaavat valmistusmenetelmää hybridomia varten, jotka tuottavat glusitolilysiinin suhteen spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita (reseptoreita), jossa menetelmässä käytetään immunogeenejä, jotka sisältävät glusitolilysiinitähteitä. Kaksi hybridomaa, jotka on valmistettu tällä menetelmällä ja jotka erittävät monoklonaalisia vasta-aineita, jotka immunoreagoivat glusitolilysiini-hemoglobiinin kanssa, mutta eivät reagoi glukohemoglobiinin tai hemoglobiinin kanssa, tallennettiin American Type Culture Collectioniin (ATCC), Rockville, MD, the Budapest Treatyn mukaisesti syyskuun 20. päivänä 1983, seuraavin ATCC-tulonumeroin:

Hybridoma Alaklooni ATCC-tulonumero G6C9 IC87G11 HB 8356 G8H9 2A1.5G8 HB 8358

Monospesifisiä antiseerumeita, jotka immunoreagoivat glusitolilysiini-hemoglobiinin kanssa, mutta jotka ristireagoivat vähän hemoglobiinin kanssa, joka ei sisällä glusitolilysiiniä, voidaan ·’ myös valmistaa käyttämällä tunnettuja immunoabsorptiotekniikoita.

22 88546

Esimerkiksi glusitolilysiini-hemoglobiini voi toimia HbAlc:n sijaisena, immunogeenina menetelmässä, jota kuvataan US-paten-tissa 4 247 533 ja jonka Cerami et ai. ovat julkaisseet ja joka sisällytetään tähän yhteyteen viitteenä. Vasta-aineet, jotka ovat immunospesifisiä glusitolilysiini-hemoglobiinille, voidaan sitten eristää; se on, voidaan valmistaa monospesifistä anti-seerumia käyttämällä pelkistämätöntä hemoglobiinia ja/tai glukohemoglobiinia immunoadsorbenttina poistamaan adsorption avulla ristireagoivat vasta-aineet. Testausmenettelytavoissa, valmistusmenetelmän seurannassa käytetään glusitolilysiini-hemoglobiinia kohdeantigeenina.

(g) Immunoreaktioseosta pidetään biologisissa määritysolosuh-teissa ennalta määrätty aika, joka on esimerkiksi 10 minuuttia -16-20 tuntia, mieluummin noin 15 minuuttia - 30 minuuttia, ja joka on reseptoreille riittävä, jotta ne immunologisesti sitoutuvat läsnäolevaan glusitolilysiini-hemoglobiinin ja muodostavat "immunoreaktantin".

Biologiset määritysolosuhteet ovat sellaiset olosuhteet, jotka säilyttävät reseptoreiden aktiivisuuden sekä halutun, määritettävän glusitolilysiini-hemoglobiinin. Näihin olsouhteisiin kuuluu lämpötila-alue, joka on noin 4-45°C, pH-arvoalue, joka on noin 5-9, sekä ionivahvuus, joka vaihtelee tislatun veden ioni-vahvuudesta noin yksimolaarisen natriumkloridin ionivahvuuteen. Menetelmät sellaisten ominaisuuksien optimoimiseksi ovat hyvin tunnettuja.

(h) "Immunoreaktantin" määrä, joka muodostui immunoreaktioseok-sessa, sitten määritetään ja tällöin määritetään näytteessä läsnäolevan stabiilin glukohemoglobiinin määrä.

Muodostuneen immunoreaktantin määrittäminen joko suoraan tai epäsuorasti voidaan suorittaa hyvin tunnetuin määritysmenetelmin. Esimerkiksi voidaan käyttää homologista määritys järjestelmää, kuten esimerkiksi sellaista, jota kuvataan US-patenteissa 4 536 479; 4 233 401; 4 233 402 ja 3 996 345, jotka julkaisut on sisällytetty kyseessä olevaan keksintöön viitteinä.

23 88 546

Edullisissa patentinsuoritusmuodoissa, yllä .vaiheessa (g) esitetyt reseptorit sisältävät ilmaisevan ryhmän tai leiman, joka pystyy antamaan signaalin merkatun reseptorin läsnäolosta immuno-reaktantissa. Määritysmenetelmät merkattujen reseptoreiden läsnäolon ja määrän suhteen riippuvat käytetystä leimasta, sellaisten leimojen ja määritysmenetelmien ollessa hyvin tunnettuja .

Spesifisten sitovien aineiden, jotka ovat proteiineja, kuten esimerkiksi reseptoreiden, merkkaus on hyvin tunnettua tutkimustyön piirissä. Esimerkiksi, hybridomien valmistamia reseptoreita voidaan merkata kudosviljelyelatusaineen komponentin, radio-isotoopilla leimatun aminohapon liittymisen avulla, joka tapahtuu metabolian kautta. Katso esimerkiksi Galfre et ai., Meth. Enzymol. 73, 3-46 (1981). Erityisen hyvin soveltuvat proteiinien konjugointi- tai kytkentätekniikat aktivoitujen, toiminnallisten ryhmien avulla. Katso esimerkiksi julkaisuja, Aurameas et ai., Scand. J. Immunol, osa 8, täydennysosa 7, 7-23 (1978), sekä US-patenttia 4 493 795, jotka julkaisut kyseessä olevaan keksintöön on liitetty viitteinä. Lisäksi, paikan suhteen ohjattu kytkentäreaktio voidaan suorittaa siten, että merkkaus ei oleellisesti häiritse toisen reseptorin immunoreaktiota kohde-antigeeninsa kanssa. Katso esimerkiksi julkaisua Rodwell et ai. Biotech 3., 889-894 (1985).

Merkkauskeinona voidaan käyttää fluoroivaa merkkausainetta, joka sitoutuu kemiallisesti vasta-aineisiin tai antigeeneihin, denaturoimatta niitä, jotta muodostuu fluorokromi (väri), joka on käyttökelpoinen immunofluoroivana merkkiaineena. Sopivia, fluoroivia merkkausaineita ovat fluorokromit, kuten esimerkiksi fluoreseiini-isosyanaatti (FIC), fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), 5-dimetyyliamiini-l-naftaleenisulfonyylikloridi (DANSC), tetrametyylirodamiini-isotiosyanaatti (TRITC), lissamiini, rodamiini 8200 sulfonyylikloridi (RB 200 SC) yms. Kuvaus, 24 88546 joka koskee immunofluoriloisteanalyysitekniikkaa, löytyy DeLucan artikkelista, "Immunofluorescence Analysis", joka on julkaistu kirjassa Antibody As A Tool, julkaisijat Marchalonis et ai., kustantaja John Wiley & Sons, Ltd. ss. 189231 (1982), ja joka artikkeli on sisällytetty viitteenä kyseessä olevaan keksintöön.

Edullisissa patentinsuoritusmuodoissa ilmaiseva ryhmä on entsyymi, kuten esimerkiksi piparjuuriperoksidaasi (HRPO), glukoosi-oksidaasi yms. Sellaisissa tapauksissa, joissa pääasiallinen ilmaiseva ryhmä on entsyymi, kuten esimerkiksi HPRO tai glukoosiok-sidaasi, tarvitaan lisäreagensseja muodostuneen reseptori-antigeenikompleksin (immunoreaktantin) havainnollistamiseksi. HRPO:lle käytettäviin sellaisiin lisäreagensseihin kuuluvat vetyperoksidi sekä hapettumisen väriprekursori, kuten esimer kiksi diaminobentsidiini tai o-fenyylidiamiini (OPD). Lisärea-genssi, joka on käyttökelpoinen glukoosioksidaasin kanssa, on 2,2'-atsino-di-(3-etyyli-bentstiatsoliini-G-sulfonihappo) (ABTS).

Radioaktiiviset alkuaineet ovat myös käyttökelpoisia merkkaus-aineita, ja niitä käytetään tässä yhteydessä valaisevassa tarkoituksessa. Radiomerkkausaineen esimerkkinä voidaan mainita radioaktiivinen alkuaine, joka tuottaa gamma-säde-emissioita.

Alkuaineet, jotka itse emittoivat gamma-säteitä, kuten esimerkiksi 124 T 125, 128 , 131 , 132 , , 51_ . . . .. ... .

J, J, J, J, J seka Cr, edustavat erästä ryhmää gamma-säde-emissiota tuottavia radioaktiivisia alkuaineita, joita käytetään ilmaisevina ryhminä. Erityisen edullinen on 125 J. Erään toisen ryhmän käyttökelpoisia merkkauskeinoja muodostavat ne alkuaineet, kuten esimerkiksi ^C, ^F, ^0 ja ^N, jotka itse emittoivat positroneja. Siten emittoidut positronit tuottavat gamma-säteitä törmätessään määritysseoksessa läsnäoleviin elektroneihin. Myös jokin beeta-emitteri, kuten esimerkiksi * In tai V on käyttökelpoinen.

Ilmaisukeino voidaan kytkeä suoraan reseptorimolekyyliin, joka kyseessä olevassa keksinnössä on käyttökelpoinen, tai se voi 25 88546 muodostaa erillisen molekyylin. Täten ilmaisukeinona voi olla erillinen molekyyli, kuten esimerkiksi vasta-aine, joka sitoutuu käyttökelpoiseen reseptorimolekyyliin, kuten esimerkiksi vuohen tai kaniinin anti-hiiri-vasta-aineeseen. Staphylococcus aureuksen proteiini A:a voidaan myös käyttää erillisen molekyylin muodostamana ilmaisu- tai merkkauskeinona, jossa käytetään hyväksi kyseessä olevan keksinnön mukaisia reseptorimolekyylejä; se on, jossa käytetään molekyylejä, jotka sisältävät Fc-aluei-den osan reseptorimolekyyleistä, joita proteiini A sitoo. Sellaisten käyttötapojen ollessa kysymyksessä, proteiini A itse sisältää leiman, kuten esimerkiksi radioaktiivista alkuainetta tai fluorokromiväriä.

Erityisen edullisessa suoritusmuodossa edellä kuvattu määritys suoritetaan heterogeenisenä, kiinteäjaemäärityksenä, jossa glusitolilysiiniä sisältävä antigeeni sidotaan tai kiinnitetään kiinteäjaematriisiin, jotta muodostuu kiinteän jakeen kannatin. Antigeeni sidotaan tai kiinnitetään kiinteään matriisiin millä tahansa hyvin tunnetuista kemiallisista tai fysikaalisista keinoista. Vaikka sitominen adsorption tai immunoreaktion avulla on vain eräs kiinnittämiskeinoista, sanoja "sitoa" ja "kiinnittää" sekä niiden erilaisia kieliopillisia muunnoksiaan käytetään tässä yhteydessä vaihtovuoroisesti.

Antigeenin fysikaalista sitomista adsorption avulla mikrotiitte-rilevyn kammioiden seinämiin, joita käytetään kiinteänä jakeena valaistaan tässä yhteydessä myöhemmin. Kemiallisiin sitomiskei-noihin kuuluu sitominen käyttämällä ensimmäistä vasta-ainetta, joka sitoo hemoglobiinin epitooppiin, joka, kun se on sidottu, ei oleellisesti häiritse glusitolilysiiniepitooppien immunologista sitomista reseptorimolekyylien avulla. Tätä määritystekniikkaa nimitetään tavallisesti "voileipämääritysmenetelmäksi", "sandwich"-määritysmenetelmäksi. Eräässä toisessa kemiallisessa sitomistavassa käytetään hyväksi vesiliukoista karbodi-imidireagenssia, kuten esimerkiksi l-etyyli-3-(3-dimetyyliamino- • · propyyli)karbodi-imidin hydrokloridia, jotta amidi tai esteri • muodostuu matriisin karboksyylihapon ja vastaavasti reseptorin amino- tai hydroksyyliryhmän välille, tai kääntäen. Eräässä 26 88546 muussa kemiallisessa sitomistavassa käytetään hyväksi polyfunk-tionaalisia reagensseja, kuten esimerkiksi glutaarialdehydiä tai syanuurihapon kloridia, kuten on tunnettua.

Esimerkit kiinteistä matriiseista, jotka ovat yllä esitetyissä menetelmissä käyttökelpoisia, ovat tutkimustyössä hyvin tunnettuja, ja niihin sisältyy kiinteä matriisi, kuten esimerkiksi 96-kammioinen mikrotiitterilevy, jota myydään Falcon Microtest III Flexible Assay nimisenä tuotteena (Falcon Plastics, Oxnard, CA), tai mikrotiitterikaista, joka sisältää 12 kammiota rivissä, kuten esimerkiksi kaistat, joita myydään Immunolon I ja II nimisinä (Dynatech, Alexandria, VA). Mikrotiitterikaista tai -levy valmistetaan kirkkaasta muovimateriaalista, mieluummin polyvi-nyylikloridista tai polystyreenistä. Vaihtoehtoisiin, kiinteisiin matriiseihin, jotka soveltuvat käytettäviksi alla kuvatussa, kyseessä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä, kuuluvat polystyreenihelmet, joiden läpimitta on noin 1 mikronista noin 5 millimetriin ja jotka ovat saatavissa Abbott Laboratoriesilta, North Chicago, IL; polystyreeniputket, -puikot tai -laboratorio-lastat, jotka ovat mitä tahansa sopivaa kokoa; sekä polystyreeni-lateksi, jonka polystyreenipartikkelit ovat kooltaan noin yhden mikronin suuruisia ja jotka sentrifugoiden voidaan erottaa lateksin jäljelle jäävästä osasta.

Kiinteä matriisi voidaan valmistaa myös erilaisista materiaaleista, kuten esimerkiksi ristiinkytketystä destraanista, esimerkiksi Sephadex G-25:stä, -50:stä, -lOOrsta, -200:sta yms. materiaalista, jota on saatavissa Pharmacia Fine Chemicalsilta, Piscataway, NJ, agaroosista ja ristiinkytketystä agaroosista, kuten esimerkiksi Sepharose 6B:stä, CL6B:stä, 4B:stä, CL46:sta yms. materiaalista, jota myös on saatavilla Pharmacia Fine Chemicalsilta.

Edellä kuvattua määritysmenetelmää voidaan käyttää määritettäessä tiettyjen glysitolilysiini-hemoglobiinityyppien läsnäolo hemoglobiininäytteessä, jos niin halutaan, käyttämällä reseptoreita, jotka ovat immunospesifisiä haluttujen glysitolilysiini-tyyppien suhteen.

27 88546 D. Diagnostiikkajärjestelmät

Kyseessä olevan keksinnön eräänä toisena näkökohtana on diagnostiikkajärjestelmä, joka tyypillisesti on reagenssipakkauksen muodossa ja joka on käyttökelpoinen edellä kuvattua määritysmenetelmää suoritettaessa. Järjestelmään sisältyy monia paketteja.

Ensimmäinen paketti sisältää edellä kuvatun kiinteäjaematriisin. Tämä matriisi on mieluummin muovinen mikrotiitterilevy tai -kaistale, joka sisältää useita kammioita, esimerkiksi 96 tai 12 kammiota, joiden pinnalla edellä kuvattu määritysmenetelmä suoritetaan.

Toinen paketti sisältää ennalta määritetyn määrän veden kanssa sekoituskelpoista boorihydridipelkistintä. On tyypillistä antaa tämä reagenssi käyttöön kuivana jauheena.

Kolmas paketti sisältää tunnetun määrän sopivia glysitolilysii-nille spesifisiä reseptorimolekyylejä, mieluummin glusitolilysii-nille spesifisiä reseptoreita, kuten esimerkiksi sellaisia, joita erittävät hybridomat, joiden ATCC-tulonumerot ovat HB 8356 ja HB 8358. Tyypillisesti nämä reseptorimolekyylit ovat läsnä vesikoostumuksena tai jäädytyskuivattuna jauheena. Edullisissa patentinsuoritusmuodoissa reseptorit annetaan käyttöön edellä esitetyllä tavalla ilmaisevaan ryhmään tai leimaan kytkettyinä.

Neljäs paketti sisältää ennalta määritetyn määrän ftaalihappoa . : - tai biftaalihappoa. Happo voidaan antaa käyttöön myös veteen liuotettuna tai kuivana, kiinteänä aineena.

Edullisiin patentinsuoritusmuotoihin sisältyy myös lisäpakkaus, joka sisältää glysitolilysiini-hemoglobiinilajeja, jotka immuno-reagoivat käyttöön annettujen reseptoreiden kanssa. Tai mie-. . luummin, paketti sisältää glusitolilysiini-hemoglobiinia, jossa ; on tunnettu prosenttimäärä standardina tai kontrollina käytettä vää glusitolilysiiniä. Lisäpaketteihin, jotka myös voidaan • ; sisällyttää, kuuluvat paketit, jotka sisältävät ouskurisuoloja tai -liuoksia, kuten esimerkiksi PBS:a, erillisinä pakattuja 28 88546 ilmaisukeinoja, kuten esimerkiksi merkattua proteiini A:a tai merkattuja anti-reseptori-vasta-aineita, erillisesti pakattuja, näkyväksi tekeviä reagensseja entsyymin ilmaisua varten, kuten esimerkiksi vetyperoksidia ja hapettuvia värin prekursoreita, lisäkontrolleja yms.

On itsestään selvää, että kussakin järjestelmään kuuluvassa paketissa on sisällöltään sellainen määrä, että se riittää yhden määrityksen suorittamiseen, sopivien kontrollien määrittäminen mukaan luettuna. Mieluummin kuhunkin pakettiin sisältyy määrä, joka on riittävä määritysten suuren määrän suorittamiseen.

Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on valaista, mutta ei rajoittaa kyseessä olevaa keksintöä.

Esimerkki 1 Hemoglobiininäytteet

Hemoglobiininäytteet saatiin 118 diabetes-potilaalta, sekä mies-että naispuolisilta potilailta, joiden iät olivat 18-88 vuotta. Näytteitä saatiin myös 35 normaalilta aikuiselta (joiden veren glukoositaso oli normaali), sekä mies- että naispuolisilta henkilöiltä, joiden iät olivat 24-52 vuotta. Näytteet saatiin laitoksilta, Diabetes Clinics of Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, California sekä Kaiser Permanente, San Diego, California.

Verinäytteet koottiin putkiin, jotka sisälsivät etyleenidiamiini-tetraetikkahappoa (EDTA:a) antikoagulanttina, ja ne sentrifugoi-tiin nopeudella noin 12 000 - 13 000 x g, 3 minuutin ajan Beckman microfuge 12:ssa, jotta saatiin tiivis punasolujen (RBC) saostuma sekä plasmajae. Plasmajae heitettiin pois, määritettävä hemoglobiininäyte annettiin käyttöön joko 10 tai 15 mikrolitran erinä punasolusaostumaa (pakattuja RBC:a).

Hemoglobiinin milligrammamäärän määrittämiseksi mikrolitraa kohti tiivistä RBC-saostumaa, joka saatiin yllä esitetyllä tavalla, yksi tilavuusosa saostumaa sekoitettiin joko yhden tai i 29 88546 kolmen tilavuuden kanssa Isoton III:a (Coulter Electronic, Inc., Hialeah, FL), jotta saatiin vastaavasti saostuman laimennukset 1:2 ja 1:4. Saostuman kukin laimennus analysoitiin sitten hemo-globiinikonsentraation suhteen käyttämällä S-Plus VI Coulter Counteria (Coulter Electronics) laitteen valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna, laimennuksiin sisältyvä hemoglobiini muutettiin syanmethemoglobiiniksi Drabkinin reagenssia käyttämällä, ja tämän määrä määritettiin spektrofotometrisesti absorbanssin perusteella 540 nm:ssä (nm).

Keskimääräiseksi milligrammamääräksi (mg) hemoglobiinia (Hb) mikrolitraa (yul) kohti tiivistä RBC-sakkaa saatiin 0,294 mg Hb/^ul. Kuitenkin laskujen suorittamisen helpottamiseksi tämä arvo pyöristettiin arvoksi 0,3 mg Hb/^,ul kaikkia suhteiden määrityksiä varten, jotka perustuivat hemoglobiininäytteisiin, jotka annettiin käyttöön tunnettuna tilavuutena tiivistä puna-solusakkaa.

Kun hemoglobiininäytteet annettiin käyttöön tunnettuna tilavuutena kokoverta, läsnäolevan hemoglobiinin määrä määritettiin käyttäen keskimääräistä arvoa 155 mg Hb/ml kokoverta näytteille, jotka oli saatu miespuolisilta henkilöiltä, ja arvoa 135 mg Hb/ml naispuolisilta henkilöiltä saaduille näytteille.

Esimerkki 2 Valmistus, puhdistus sekä reseptorien merkkaus Hybridoma, jonka ATCC-tulonumero on HB 8356, valmistaa monokio-naalista vasta-ainetta G6C9, kuten Curtiss et ai. ovat kuvanneet julkaisussa J. Clin. Invest. 72:1427-38 (1983). Ascites-kasvain-nesteet, jotka sisälsivät G6C9-reseptorimolekyylejä, saatiin 10-viikon ikäisiltä Balb/c-hiiriltä, joita kutakin oli esikäsitelty 0,3 ml :11a mineraaliöljyä ja joihin oli ruiskutettu vatsaonte-lonsisäisesti 3-50 x 10^ HB 8356-solua. Keskimääräinen ascites-kasvaimien kehittymisaika oli 12 päivää. Sen jälkeen kun kirkastus oli suoritettu sentrifugoimalla nopeudella 15 000 x g, yhden tunnin ajan, 4°C:n lämpötilassa, ascites-kasvaimen nesteet koottiin ja yhdistettiin sekä varastoitiin jäädytettyinä -20°C:ssa.

30 88546 G6C9-reseptorit puhdistettiin suorittamalla ascites-kasvain-nesteille nopea proteiininestekromatografia (FPLC) Pharmacia Mono Q HR 5/5 anioninvaihtopylväässä, Pharmacia PPLC-järjestelmällä, käyttäen 0-0,5 NaCl-gradienttia 10-millimolaarisessa Tris:ssä, pH 8,0, sekä noudattamalla pylvään mukana seuraavia ohjeita.

Puhdistetut G6C9-reseptorimolekyylit kytkettiin piparjuuriperoksi-daasin kanssa käyttämällä Nakane et al.:n julkaisussa, J. Histochem. Cytochem., 22:1084-1089 (1974), kuvaamaa menetelmää. Näitä reseptoreita nimitetään tässä yhteydessä myöhemmin HRPO-G6C9-reseptoreiksi.

Esimerkki 3 Glykoitujen adduktien valmistus

Seuraaville proteiineille ja prekursoreille suoritettiin glykoin-ti ja/tai pelkistäminen: poly-L-lysiini, poly-L-valiini (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); alfa-T-Boc-Lysiini (Bachem,

Torrance, CA) ; puhdistettu humaani hemoglobiini, (Sigma); sekä glusitolilysiini, joka on valmistettu menetelmällä, jota Schwartz et ai. ovat kuvanneet julkaisussa Arch. Biochem.

Biophys., 181:542-549 (1977).

Glukoituja ja pelkistettyjä addukteja nimitetään glc-RED-adduk-teiksi. glc-RED-adduktit valmistettiin sekoittamalla 2 milli-litraa (ml) erilaisten yllä kuvattujen proteiinien ja prekurso-reiden liuoksia, joiden konsentraatio oli 15 milligrammaa milli-litrassa (mg/ml), 2 ml:n kanssa 240-millimolaarista glukoosia (Sigma), joka oli fosfaatilla puskuroidussa keittosuolaliuoksessa (PBS), sekä 2 ml:n kanssa liuosta, jossa oli 37,5 mg NaCNBH^:a (J.T. Baker Chemical Co. Phillipsburg, NJ) PBS:ssä, pH 7,4. Syntyviä seoksia säilytettiin suljetuissa lasiputkissa (16 x 100 mm), 120 tunnin ajan, 37°C:ssa. Adduktit siirrettiin tämän jälkeen dialyysipusseihin (Spectraphor, molekyylinen pois-sulkemisraja 3500 Mp), ja niitä dialysoitiin perusteellisesti PBS:a vastaan 72 tunnin ajan, 4°C:ssa, niiden lopulliseksi konsentraatioksi säädettiin noin 5 mg/ml, ja ne varastoitiin noin 4°C:ssa.

31 88546

Glukoituja ja pelkistämättömiä adduktikontrolleja (glc-NR) valmistettiin korvaamalla yllä esitetyssä menetelmässä NaCNBH^ 2 ml:11a PBS:a.

Ei-glukoituja, pelkistettyjä kontrolleja (RED-addukteja) valmistettiin korvaamalla yllä esitetyssä menetelmässä 240 mM:a glukoosia 2 ml:lla PBS:a.

Esimerkki 4 Vasta-aineen spesifisyyden määrittäminen kompeti- tiivisen inhibition avulla_ glc-RED-, glc-NR- ja RED-addukteja, jotka oli valmistettu esimerkissä 3, laimennettiin konsentraatioon, joka vaihteli 200 mikro-grammasta millilitrassa (^,ug/ml) 0,39 mikrogrammaan millilitras-sa PBS:a, joka sisälsi 10 %:a normaalia vuohen seerumia (NGS). Viisisataa mikrolitraa (^ul) erilaisia laimennuksia sekoitettiin sitten lasiputkissa 500 ^ul:n kanssa HRPO-G6C9-reseptoreita, jotka oli valmistettu esimerkissä 2 (laimennettu suhteessa 1:150 PBS:aan, joka sisälsi 10 %:a NGS:a), jotta muodostettiin kompeti-tiivisiä immunoreaktioseoksia. Seoksia pidettiin yhden tunnin ajan 37°C:ssa, jotta reseptorit sitoutuisivat immunologisesti kaikkiin glusitolilysiinitähteen sisältäviin epitooppeihin tai ei-glusitolilysiiniä sisältäviin, mutta risti reagoiviin epitooppeihin ja muodostaisivat nestejakeen immunoreaktantin.

37°C:ssa säilytetyt, kompetitiiviset immunoreaktioseokset määritettiin tämän jälkeen sitoutumattomien HRPO-G6C9-reseptoreiden suhteen. Määritys suoritettiin käyttämällä ELISA-menetelmässä kiinteään jakeeseen sidottua glusitolilysiini-hemoglobiinia kohde- ja tarttuvana antigeeninä.

Kiinteään jakeeseen sidottu glusitolilysiini-hemoglobiini valmistettiin ensin sekoittamalla 0,240 ml tiivistä RBC-sakkaa, joka oli valmistettu esimerkin 1 mukaisesti käyttämällä diabetespotilaan verta, 15 millilitran kanssa tislattua vettä, joka sisälsi 0,05 mmoolia ftaalihappoa (laimennus tilavuussuhteessa 1:62,5). Syntynyttä reaktioseosta pidettiin 15 minuutin ajan 37°C:ssa, jotta hemolysaatti muodostui.

32 88 546 Tämän jälkeen 50 ^ul:aa hemolysaattia sekoitettiin 50 ^ul:n kanssa 400-millimolaarista NaBH^ra mikrotiitterilevyn kammioissa (kiinteä matriisi). Muodostettua pelkistysreaktioseosta pidettiin 15 minuutin ajan 37°C:ssa, jotta muodostui glusitolilysiini-hemoglobiini, joka tämän säilytysajan päättymiseen mennessä oli sitoutunut kiinteään faasimatriisiin kiinteään faasiin sidotun glusitolilysiini-hemoglobiinin (kiinteä alusta) sekä nestejakeen muodostamiseksi, joka nestejae sisälsi reagoimattoman boorihydridin sekä jäljelle jääneen pelkistysreaktioseoksen. Syntyneen reaktioseoksen kiinteät ja nestejakeet erotettiin. Kiinteät alustat, jotka oli muodostettu käyttäen avuksi adsorboitunutta glusitolilysiini-hemoglobiinia, joka oli kiinnitetty kiinteän matriisin kammioiden seinämiin, pestiin sitten 4 kertaa 350 ^ulrlla PBS:a, joka sisälsi 0,05 %:a Tween 20 /polyoksietylee-ni(20)-sorbitaanimonolauraattia7, jotta saatiin eristetty, kiinteään faasiin sidottu glusitolilysiini-hemoglobiini.

100 ^ul:n tilavuus kutakin, 37°C:ssa pidettyä HRPO-G6C9/adduktin sisältävää, kompetitiivista immunoreaktioseosta sekoitettiin sitten kiinteään jakeeseen sidotun glusitolilysiini-hemoglobiinin kanssa. Toista nestemäisen ja kiinteän jakeen sisältävää immunoreaktioseosta, joka täten muodostui, pidettiin 15 minuutin ajan 37°C:ssa, jotta vasta-ainemolekyylit, jotka eivät olleet immunoreagoineet addukti-inhibiittorin tai kontrollin kanssa, immunologisesti sitoutuisivat kiinteän jakeen glusitolilysiini-hemoglobiinin kanssa ja muodostaisivat kiinteän jakeeseen sidotun immunoreaktantin.

Kiinteä ja nestemäinen jae erotettiin jälleen, ja kaikki kiinteään jakeeseen kiinnittyneet immunoreaktantit, jotka muodostuivat, erotettiin jälleen nestejakeesta dekantoimalla, ja kutakin kammiota pestiin 4 kertaa pesuliuoksella (PBS, joka sisälsi 0,05 %:a Tween 20:a). Kiinteään faasiin kiinnittyneen immunoreaktan-tin määrä, joka muodostui, määritettiin sitten sekoittamalla kussakin kammiossa 100 ^ul:aa juuri valmistettua HRPO-substraat-tiliuosta 7°.°125 % ^02^ ja 0,67 mg/ml o-fenyleenidiamiinia i 33 S 8 5 46 o-fenyleenidiamiinia (ODP) tislatussa vedessä/. Värin annettiin kehittyä huoneenlämpötilassa (noin 20-25°C:ssa) 5 minuutin ajan. Substraatin konversioreaktio (värin muodostuminen) pysäytettiin sitten sekoittamalla 50 ^ul:aa 4-normaalista H S04:a kuhunkin kammioon. Liuosten optinen tiheys (O.D.) määritettiin aallonpituudella 490 nm:ä, käyttämällä Dynatech MR600 (Dynatech, Alexandria, VA)-mikrotiitterilevyn lukijaa.

Kyseessä olevan tutkimuksen tuloksia valaistaan kuvissa 2A, B ja C. Nämä tulokset ilmaisevat, että pelkistyneet, mutta ei-glukoidut adduktit (kuva 2A) ja glukoidut, mutta ei-pelkistyneet adduktit (kuva 2B) eivät inhiboi HRP0-G6C9:n sitoutumista kiinteään jakeeseen kiinnittyneeseen glusitolilysiini-hemoglobiiniin. Kuitenkin, kuten kuvassa 2C esitetään, glukoidut ja pelkistyneet proteiinit ja prekursorit, jotka sisälsivät lysiiniä; se on, glusitoiilysiini, olivat hyvin tehokkaita inhibiittoreita HRPO-G6C9:n ja kiinteään jakeeseen kiinnittyneen glusitolilysiini-hemoglobiinin välisessä immunoreaktiossa, mutta glukoitunut ja pelkistynyt poly-L-valiini eivät toimineet inhibiittoreina.

Koska yhteinen rakenteellinen piirre addukteille, jotka inhiboivat kiintäen jakeen immunoreaktanttien muodostumista, oli glusi tolilysiinitähteen läsnäolo, kyseessä olevan tutkimuksen tulokset havainnollistavat, että G6C9-reseptorit immunoreagoivat glu-sitolilysiiniä sisältävän epitoopin kanssa, kun tämä epitooppi on läsnä kiinteään faasiin kiinnittyneenä glusitolilysiini-hemoglobiinina.

Esimerkki 5 Pelkistämisen optimointi a. Veden kanssa sekoituskelpoiset pelkistimet

Kuten aiemmin on kuvattu, glusitolilysiini on glukoosin pelkistetty heksoosialkoholimuoto, joka on kovalenttisesti sidottu lysiinin epsilon-aminoryhmään. Seuraavat tutkimukset suoritettiin tutkittaessa erilaisten veden kanssa sekoittuvien boori -hydridipelkistimien kykyä muodostaa hemoglobiinimolekyyliin sidottuja glusitolilysiinitähteitä erilaisissa olosuhteissa.

34 88546

Hemoglobiininäytteet annettiin käyttöön 10 ^ul:na tiivistä RBC-sakkaa, joka oli valmistettu siten, kuin on kuvattu esimerkissä 1 (noin 3 mg hemoglobiinia), käyttämällä normaalilta henkilöltä ja diabetes-potilaalta saatua verta. Glykoidun hemoglobiinin prosenttimäärä kussakin näytteessä määritettiin käyttämällä kaupallisesti saatavaa GLY-AFFIN GHb-määritysjärjestelmää (Isolab, Akron, OH), ja määräksi saatiin 6,3 prosenttia normaalissa näytteessä ja 8,9 prosenttia diabetesnäytteessä. Täten diabetes-potilaan näytteessä oli 1,4-kertaa niin paljon glukoi-tua hemoglobiinia kuin normaalissa näytteessä. Näytteet sekoitettiin 615 ^ul:n kanssa joko tislattua vettä tai 0,05-molaarista ftaalihappoa. Tällä tavalla saatiin seoksia, jotka sisälsivät hemoglobiinia konsentraationa noin 4,8 mg/ml, ja happoa oli tällöin käytetty vähintään 10 mikromoolia milligrammaa kohti hemoglobiinia.

Syntyviä seoksia säilytettiin 15 minuutin ajan 37°C:ssa. Tänä aikana suurin piirtein kaikki RBC:t, jotka olivat läsnä kussakin reaktioseoksessa, olivat hajonneet, jolloin niihin sisältynyt hemoglobiini vapautui reaktioseokseen ja hemolysaatti muodostui.

Tämän jälkeen 50 ^,ul:aa kutakin hemolysaattia (noin 0,24 mg hemoglobiinia) sekoitettiin mikrotiitterilevyn kammiossa 50 mikrolitran kanssa NaBH^rn tai KBH^:n erilaisia konsentraatioita, pelkistysreaktioseosten muodostamiseksi. Näitä seoksia pidettiin 15 minuutin ajan 37°C:ssa. Tänä aikana hemoglobiinilysii-nitähteet, joissa glukoosi oli sidottu niiden epsilon-amino-ryhmään, pelkistyivät, jolloin muodostui glusitolilysiinitäh-teitä. Lisäksi, muodostunut glusitolilysiini-hemoglobiini kiinnittyi adsorption avulla mikrotiitterilevyn kammioiden seinämiin; se on, muodostui kiinteään faasiin sidottu glusitolilysiini-hemoglobiini .

Kiinteät ja nestemäiset faasit erotettiin dekantoimalla. Kukin kammioista pestiin sitten neljä kertaa pesuliuoksella reagoimattoman boorihydridin edelleen erottamiseksi kiinteään faasiin sidotusta (mikrotiitterilevyn kammioon sidotusta) glusitoli-lysiinihemoglobiinista.

i 35 88 546

Kuhunkin kammioon sekoitettiin 100 mikrolitraa piparjuuriperoksi-daasilla merkattuja G6C9 (HRPO-G6C9)-reseptoreita, jotka oli saatu esimerkissä 2, jotta immunoreaktioseos muodostui. Tätä seosta pidettiin sitten 15 minuutin ajan 37°C:ssa, jolloin merkatut reseptorit immunologisesti sitoutuivat kiinteään faasiin kiinnitettyyn (mikrotiitterilevyn kammioon sidottuun) glusitolilysiini-hemoglobiiniin ja muodostivat kiinteään faasiin kiinnitetyn (mikrotiitteerilevyn kammioon sidotun) immunoreak-tantin. Ei-immunoreagoinut (sitoutumaton) HRPO-G6C9 poistettiin seinämistä dekantoimalla, minkä jälkeen pestiin viisi kertaa pesuliuoksella. Kiinteään faasiin sidotun immunoreaktantin määrä, joka muodostui, määritettiin sitten esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.

Kyseessä olevan tutkimuksen tuloksia valaistaan kuvissa 3A ja B, ja ne havainnollistavat useita mielenkiintoisia ilmiöitä. Ensinnäkin, kummassakaan kuvassa 3A ja 3B ei ole nähtävissä mitään oleellista eroa tulosten välillä, jotka on saatu käyttämällä joko natrium- tai kaliumboorihydridiä veden kanssa sekoituskel-poisena boorihydridipelkistimenä.

Toiseksi, kuva 3A havainnollistaa, että pelkistyminen (glusitoli-lysiinin muodostuminen) hapon puuttuessa antaa odotetusti suuremman määrän reseptoriin sidottuja glusitolilysiinitähteitä sisältäviä epitooppeja näytteessä, joka sisältää suuremman määrän glu-kohemoglobiinia; se on, diabetespotilaan näytteessä. Kuitenkin kun näitä tuloksia verrataan tuloksiin, jotka saatiin, kun pelkistykset suoritettiin hapon läsnäollessa (kuva 3B), on nähtävissä, että molemmissa hemoglobiininäytteissä muodostui suurempi määrä reseptoriin sidottuja glusitolilysiinitähteitä kuin muodostui ftaalihapon poissaollessa. Reseptoriin sidottujen glusitoli-lysiinitähteiden lukumäärässä oli lisäksi suurempi ero normaalien ja diabetesnäytteiden välillä, kun pelkistys tapahtui ftaalihapon läsnäollessa (kuva 3B) verrattuna siihen, että tämä pelkistys suoritettiin tämän hapon puuttuessa (kuva 3A). Nämä kaksi havaintoa ilmaisevat, että ftaalihapon läsnäolo odottamat-tomasti tehostaa veden kanssa sekoituskelpoisen boorihydridi- 36 8 8546 pelkistimen kykyä tuottaa glusitolilysiinitähteitä sisältäviä epitooppeja sekä hajoittaa punasoluja ja poistaa labiilia glukohemoglobiinia.

Lopuksi, kun kuvassa 3A esitettyjä tuloksia verrataan kuvassa 3B esitettyihin tuloksiin, on nähtävissä, että kun hemoglobii ni -näyte sekoitettiin ftaalihapon kanssa suhteessa, jossa oli ainakin 10 mikromoolia happoa milligrammaa kohti hemoglobiinia, pelkistysreaktio tehostui, vieläpä, kun hemoglobiinin ja boorihydridin seossuhde oli niin alhainen, että siinä oli ainakin noin 2,6 mikromoolia boorihydridiä milligrammaa kohti hemoglobiinia.

Yllä esitetyt havainnot olivat vastakohtaisia aiemmin tutkimustyön piirissä esitetyille käsityksille. Kuten aiemmin on esitetty, aiemman tutkimuksen mukaisesti glukohemoglobiinin kokonaismäärä RBCriltä saadussa hemoglobiininäytteessä on labiilien ja stabiilien glukohemoglobiinijakeiden summa. Bissen et al.:n mukaisesti, Diabetes 31: 630-633 (1982), labiili jae poistetaan hemoglobiininäytteestä käsittelemällä sitä biftaalihapolla, se on, määritettävän glukohemoglobiinin määrä vähenee biftaalihapolla käsitellyssä näytteessä. Sen tähden, aiemman tutkimuksen mukaisesti määrityksessä, joka mittaa näytteeseen sisältyvän glukohemoglobiinin määrää, näyte, jonka labiili jae on kulutettu loppuun, antaisi alhaisemman signaalin kuin näyte, josta labiilia jaetta ei ole poistettu.

b. Pelkistysreaktioseoksen ylläpitojakso

Happamet reaktioseokset valmistettiin käyttämällä hemoglobiinia, joka oli saatu kokoverinäytteenä yhdeltä naispuoliselta diabetes-potilaalta ja yhdeltä normaalilta naispuoliselta henkilöltä. Ftaalihapon konsentraatio kussakin seoksessa oli vakio, 0,05 moolia. Hemoglobiinikonsentraatio vaihteli kuitenkin alueella 27,0 mg/ml - 0,270 ^ug/ml, jolloin suhteet millimooli haopoa/mg Hb:a olivat alueella 1,85-185,2. Kaikkia happamia reaktioseoksia säilytettiin 15 minuutin ajan 37°C:ssa hemolysaattien muodosta-mi seksi.

37 88 546 Tämän jälkeen pelkistysreaktioseoksia valmistettiin kahtena samanlaisena kappaleena sekoittamalla 50 mikrolitraa kutakin hemoly- saattia sekä 50 mikrolitraa 400-millimolaarista NaBH -a, nolloin

4 ' J

suhteeksi millimoolia boorihydridiä /mg Hb:a saatiin O,0148-1,481. Yhtä sarjaa pelkistysreaktioseoksia säilytettiin 15 minuutin ajan ja toista sarjaa säilytettiin 30 minuutin ajan, kutakin 37°C:ssa. Tämän jälkeen näytteet erotettiin reagoimattomasta pelkistysreaktioseoksesta ja jäljelle jääneistä pelkistysreaktio-seoskoostumuksista, ne pestiin ja määritettiin glusitolilysiinin suhteen esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.

Kuten kuvasta 4 voidaan nähdä, kyseessä olevan tutkimuksen tulokset ilmaisevat, että joko 15 tai 30 minuutin mittainen pelkis-tysreaktioseoksen ylläpitoaika tuottaa mitattavia määriä glusito-1i1ysiini-hemoglobiinia sekä diabetes- että normaalissa näytteessä, kaikilla tutkituilla hemoglobiinin konsentraatioilla. Olisi myös huomattava, että optimisuhteiksi määritettävän glusitolilysiinin muodostumiselle saatiin 46,3 millimoolia happoa/mg Hb:a, happamien reaktioseosten ollessa kysymyksessä, ja 0,37 millimoolia boorihydridiä/mg Hb:a pelkistysreaktioseoksilie, kun vastaavissa reaktioissa hemoglobiinia oli läsnä konsentraatioina 1,08 mg/ml ja 0,54 mg/ml.

Esimerkki 6 Labiilin glukohemoglobiinin poistaminen a. Happamet reaktioseokset

Labiilin glukohemoglobiinin dissosioitumisen glukoosiksi ja he~ moglobiiniksi on esitetty olevan hapon katalysoiman reaktion liuoksissa, joiden pH-arvo on noin 5. Bisse et ai., Diabetes, 31:630-633 (1982). Sen seikan määrittämiseksi, vaikuttiko käytetyn hapon määrä labiilin glukohemoglobiinin esitettyyn pH:sta riippuvaan stabilisuuteen, valmistettiin liuoksia, jotka sisälsivät joko ftaalihappoa, sitraattia, etikkahappoa, fosfaattia, D(+)-glukosamiinia, alfa-ketoglutaarihappoa, oksaalietikka-happoa, oksaalidi-kaliumhappoa, meripihkahappoa tai palorypäle-happoa O,05-molaarisina konsentraatioina, joiden pH-alue oli 4-5. Hemoglobiininäytteet annettiin käyttöön 10 mikrolitran erinä tiivistä punasolusakkaa, joka oli valmistettu esimerkissä 1 38 88546 kuvatulla tavalla verestä, joka oli saatu diabetespotilaalta tai normaalilta henkilöltä. Diabetes- ja normaali hemoglobiini-näyte sekoitettiin kukin 615 mikrolitran kanssa yllä mainittuja happamia liuoksia, happamien reaktioseosten valmistamiseksi, tai 615 mikrolitran kanssa tislattua vettä, joka toimi kontrollina .

Lisäksi, tiiviitä RBC-sakkoja valmistettiin sekä diabetes-potilaan sekä normaalin henkilön RBC:istä, joita oli inkuboitu yön yli (noin 18 tuntia) isotonisessa keittosuolaliuoksessa. Kymmenen mikrolitraa, jotka olivat peräisin kummastakin mainitusta sakasta, sekoitettiin 615 mikrolitran kanssa joko 0,05-molaaris-ta ftaalihappoa tai tislattua vettä, joka toimi kontrollina.

Happamia reaktioseoksia sekä kontrolliliuoksia, jotka olivat näin muodostettuja, pidettiin 37°C:ssa 15 minuutin ajan, hemoly-saattien muodostamiseksi. Tämän jälkeen muodostettiin glusitoli-lysiinihemoglobiinia, ja se määritettiin käyttämällä 50 mikro-litran eriä kutakin hemolysaattia, NaBH^ta sekä HRPO-G6C9-reseptoreita, kuten kuvataan esimerkissä 4.

Tämän tutkimuksen tuloksia valaistaan kuvassa 5. Nämä tulokset ilmaisevat, että glukohemoglobiinin reaktio ftaalihapon kanssa ennen boorihydridillä suoritettua pelkistystä merkittävästi tehostaa glusitolilysiinitähteiden muodostumista verrattuna muihin tutkittuihin happoihin.

b. Hapon konsentraatio

Ftaalihapon konsentraation vaikutuksen tutkimiseksi, pH-alueella 4-5, glusitolilysiini-hemoglobiinin muodostumisen ja määrittämisen suhteen, valmistettiin happamia reaktioseoksia, joiden kon-sentraatiot olivat joko 0,05-molaarisia tai 0,025-molaarisia ja joiden hemoglobiinikonsentraatiot olivat 75, 50, 37,5, 30, 25 tai 21,4 milligrammaa hemoglobiinia millilitraa kohti. Täten seoksissa, jotka sisälsivät 0,05 moolia ftaalihappoa ftaalihapon millimoolien suhde hemoglobiinin milligrammaa kohti oli 0,66:sta noin 2,34:ään. Samalla tavalla, O,025-molaarisissa ftaalihapon i 39 8 8 5 4 6 seoksissa suhteiden alue oli 0,33-1,17. Hemoglobiini annettiin käyttöön ennalta määritettynä tilavuutena RBC-sakkaa, joka oli valmistettu diabetespotilaan verestä esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Muodostettuja reaktioseoksia pidettiin 15 minuutin ajan 37°C:ssa hemolysaattien muodostamiseksi. Tämän jälkeen muodostettiin glusitolilysiini-hemoglobiini, ja se määritettiin käyttämällä 50 mikrolitraa kutakin hemolysaattia, NaBH^ra sekä HRP0-G6C9-reseptoreita, esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.

Kuva 6 valaisee kyseessä olevan tutkimuksen tuloksia. Nämä tulokset ilmaisevat, että sekä 0,05- että O,025-molaariset ftaalihapon reaktioseokset tehostavat glusitolilysiinitähteen sisältävien, merkattuihin reseptoreihin sidottujen epitooppien muodostumista, kun millimoolien suhde hemoglobiinin milligrammaa kohti oli noin 1,00-2,34.

Lisäksi, kuvassa 6 esitetyt tulokset havainnollistavat, että reaktio ftaalihapon kanssa yksinään ei tuota määritettävää glusi-tolilysiiniä.

c. Hapan pH-alue

Valmistettiin varastoliuoksia, jotka sisälsivät O,05-molaarista ftaalihappoa ja joiden pH-arvot olivat 3,5, 4,5, 5,5 ja 6,5. Käyttämällä kutakin varastoliuosta valmistettiin sitten neljä hapanta reaktioseosta. Hemoglobiininäytteet annettiin käyttöön 10 mikrolitrana tiiviitä RBC-sakkoja, jotka oli saatu esimerkissä 1 käyttämällä kumpaakin kahdesta diabetespotilaan ja kumpaakin kahdesta normaalin potilaan verinäytteestä, ja ne sekoitettiin 615 mikrolitran kanssa kutakin varastoliuosta. Syntyviä, happamia reaktioseoksia pidettiin 15 minuutin ajan 37°C:ssa, jotta hemolysaatteja muodostui. Tämän jälkeen muodostettiin glusitoli-lysiini-hemoglobiinia, ja se määritettiin käyttämällä 50 mikro-litraa kutakin hemolysaateista, NaBH^:a sekä HRPO-G6C9-resepto-reita esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.

40 8 8 546

Kuva 7 valaisee kyseessä olevan tutkimuksen tuloksia ja ilmaisee, että suurin määrä immunologisesti sidottuja glusitolilysii-nitähteitä syntyi määrityksissä, jotka suoritettiin hemolysaateil-la, jotka oli muodostettu käyttämällä ftaalihappoa, jonka pH-arvo oli noin 3,5. Kuitenkin pH-arvo 4,5 antoi suurimman eron signaaleissa (optisessa tiheydessä) normaalin henkilön ja diabetespotilaan näytteiden välillä. Edelleen, käytettäessä ftaali-happoliuoksia, joiden pH-arvot olivat 5,5 ja 6,5, saatiin mitattavia määriä glusitolilysiinitähteitä.

Ftaalihapon 0,05-molaaristen vesiliuosten pH-arvon vaihtelevuuden määrittämiseksi valmistettiin neljä 0,05-molaarista liuosta, ja määritettiin niiden pH-arvot, joita ei oltu säädetty, käyttämällä digitaalista pH-mittaria Altex 3500 (Beckman Instruments, Berkeley, CA) Calomel MicroProbe-elektrodiin (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) yhdistettynä. Neljälle liuokselle, joiden pH oli säätämättä, saatiin pH-arvoiksi 4,13-4,5 ja pH:n keskiarvoksi noin 4,3.

d. Happamien reaktioseosten ylläpitoaika

Kyseessä olevan keksinnön mukaisessa määritysmenetelmässä happa-men reaktiovaiheen eräänä tarkoituksena on poistaa labiili glukohemoglobiinijae (dissosioida labiili glukohemoglobiini hemoglobiiniksi ja glukoosiksi), samalla kun stabiili jae säilyy. Sen tähden tutkittiin happamen reaktioseoksen ylläpito-ajan vaihtelun vaikutusta.

Tutkittiin happamen reaktioseoksen neljä sarjaa. Kukin sarja, joka sisälsi neljä seosta, valmistettiin sekoittamalla hemoglo-biininäytteet kultakin kahdelta diabetespotilaalta sekä kahdelta normaalilta naispuoliselta henkilöltä O,05-molaarisen ftaalihapon kanssa esimerkissä 6c kuvatulla tavalla. Yksi näistä happamien reaktioseosten sarjoista sekoitettiin sitten välittömästi NaBH^:n kanssa, ja sitä käsiteltiin ja se määritettiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Jäljelle jääneitä kolmea sarjaa säilytettiin 5, 10 tai 15 minuutin mittaiset ajat, ennen kuin ne sekoitettiin NaBH^rn kanssa esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.

i 41 88546 Tämän tutkimuksen tulokset,kuten kuvasta 8 voidaan nähdä, ilmaisevat, että lisäys happamen reaktioseoksen ylläpitoajassa sai aikaan vähemmän määritettävissä olevan glusitolilysiinin muodostumista diabetespotilaan näytteessä 1, mikä ilmaisee sen, että näyte alunperin sisälsi huomattavan määrän labiilia glukohemo-globiinia. 15 minuutin mittainen ylläpitoaika myös tuotti vähemmän määritettävissä olevaa glusitolilysiiniä diabetesnäytteessä 2 sekä normaalissa näytteessä 1 verrattuna lyhyempään kuin yhden minuutin mittaiseen aikaan. Nämä tulokset ilmaisevat, että 5 minuutin mittainen happamen reaktioseoksen ylläpitoaika sai aikaan labiilin glukohemoglobiinijakeen hajoamista hemoglobiini-näytteessä .

Esimerkki 7 Määrityslämpötila

Esimerkin 5b mukaisesti valmistettiin hemolysaatit, joiden hemo-globiinikonsentraatiot olivat 27 ^,ug/ml - 1,35 ^ug/ml, käyttämällä naispuolisen diabetespotilaan ja normaalin naishenkilön koko verta. Hemolysaatit pelkistettiin, ja ne määritettiin joko huoneenlämpötilassa (noin 20-25°C) tai 37°C:ssa, esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, käyttämällä 30 minuutin mittaisia pelkistys- ja vasta-ainereaktioaikoja.

Kuva 9 valaisee sitä seikkaa, että havaitun glusitolilysiini-hemoglobiinin määrä oli vähän suurempi, kun pelkistys- ja immuno-reaktioseoksia pidettiin 37°C:ssa, kun taas mitään oleellista eroa ei havaittu tulosten välillä, jotka oli saatu 37°C:ssa ja huoneenlämpötilassa.

Esimerkki 8 ELISA - määrityksen arviointi

Vaikka menetelmä määritettävien glusitolilysiinitähteiden muodostumisen optimoimiseksi käyttämällä ftaalihappoa ja boorihydri-diä, kyseessä olevassa keksinnössä julkaistulla tavalla, soveltuu mihin tahansa immunologiseen pitoisuusmääritykseen, kliinisen käyttökelpoisuuden määrittämiseksi ELlSA:n suorittaminen kyseessä olevaa menetelmää käyttäen arvioitiin yksityiskohtaisesti, alla esitetyllä tavalla. Tietty, arvioitu ELISA.-n suoritustapa oli seuraava: 42 38 5 46 10 mikrolitraa tiivistä RBC-sakkaa, joka oli valmistettu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, käyttämällä verta, joka oli saatu normaaleilta henkilöiltä sekä diabetespotilailta, sekoitettiin 615 yUl:n kanssa 0,05-molaarista kaiiumbif ta 1aatti a. Näin valmistettua reaktioseosta pidettiin 15 minuutin ajan 37°C:ssa hemolysaatin muodostamiseksi. Tämän jälkeen 50 mikrolitraa hemo-lysaattia pipetoitiin kuhunkin kolmesta NUNC Immuno I-mikrotiitte-rilevyn kammiosta (litteäpoh jaisi.a polystyreenilevy ja , Gibco Laboratory, Lawrence, MA). Sitten kuhunkin hemolysaattinäytteeseen sekoitettiin 50 mikrolitraa 400-millimolaarista NaBH :a 4 pelkistysreaktioseosten muodostamiseksi. Saatuja pelkistysreak-tioseoksia pidettiin 15 minuutin ajan 37°C:ssa, jotta glusitoli-lysiini-hemoglobiini sitoutui mikrotiitterilevyn kammioihin. Mikrotiitterilevyn kammioon sidottu glusitolilysiini-hemoglobii-ni erotettiin boorihydridin ylimäärästä dekantoimalla ja pesemällä kammioita neljä kertaa 0,35 ml:lla PBS:a, joka sisälsi 0,05 %:a Tween 20:tä.

Kammioon sidotun glusitolilysiini-hemoglobiinin määrä määritettiin sekoittamalla kussakin kammiossa 0,100 ml esimerkin 2 HRP0-G6C9-reseptoreita, laimennettuina suhteessa 1:300 PBS:ssä, joka sisälsi 10 %:a normaalia vuohenseerumia, jotta muodostui immunoreaktioseos, jossa oli nestemäinen faasi ja kiinteä faasi. Immunoreaktioseosta säilytettiin 15 minuutin ajan 37°C:ssa.

Kiinteät ja nestemäiset jakeet erotettiin, ja kammiota pestiin viisi kertaa 0,35 ml:lla PBS:a (pH 7,4), joka sisälsi 0,05 %:a Tween 20:tä, jotta sitoutumattomat reseptorit erotettiin kiinteään faasiin sidotuista immunoreaktanteista. HRPO-G6C9-resep-torit, jotka olivat läsnä kiinteään faasiin sidottuina immuno-reaktantteina, ilmaistiin käyttämällä ODP-substraattiliuosta esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.

Glc-RED Hb-adduktia, joka oli valmistettu esimerkissä 3, käytettiin ELISA-määrityksen sisäisenä standardina (kalibraattorina). Valmistettiin standardi liuoksia, joiden Glc-RED-hemoglobiinin konsentraatioalue oli 380-8 ^ug/ml ja jotka oli laimennettu 0,1-molaariseen natriumbikarbonaattipuskuriin, pH 9,0, joka 43 88546 sisälsi 10 prosenttia normaalia vuohen seerumia. Standardi käyrä määritettiin yllä esitetyn ELISArn avulla käyttäen kutakin stan- dardiliuosta hemolysaatin tilalla.

a. Saanto

Saantotutkimukset suoritettiin sen seikan määrittämiseksi, voisiko ELISAin avulla täsmällisesti määrittää erilaisia määriä gluko-hemoglobiinia diabetespotilaan erytrosyyttien hemolysaatista, joka on lisätty normaalin henkilön punasoluista valmistettuun hemolysaattiin. Tämä suoritettiin valmistamalla normaalin henkilön punasoluista hemolysaatti, joka sisälsi erilaisia, prosentuaalisesti nousevia lisäyksiä (huippuja) hemolysaattia, joka oli peräisin diabetespotilaan punasoluista.

Normaalin henkilön hemolysaattiin lisätyn diabeteshemoglobiinin määrän saanto määritettiin sitten yllä kuvattua ELISA:a käyttämällä. Kuten esitetään kuvassa 10, saadut tulokset havainnollistavat linaarista suhdetta prosentuaalisten lisäysten (huippujen) koko määritetyllä alueella, mikä ilmaisee additiivista suhdetta näytteeseen sisältyvän glukohemoglobiinimäärän ja ELISA:lla määritetyn glusitolilysiini-hemoglobiinin määrän välillä.

b. ELISA-tulosten toistettavuus ELISA:n luotettavuus määritettiin määritysten sisäisen ja määritysten välisten tutkimusten (intra- ja inter-assay) avulla. Määrityksen sisäisiä tutkimuksia varten kolmelta eri henkilöltä saadut hemoglobiininäytteet määritettiin kukin 60 kertaa.

Saatujen arvojen välinen vaihtelukerroin oli 1,6-6,4 %:a.

Määritysten välisiä tutkimuksia varten kolmen eri henkilön hemoglobiininäytteet määritettiin 12 eri ajankohtana. Määritysten välinen toistettavuus oli alueella 8,3-10,4 %:a.

Kyseessä olevaa keksintöä on kuvattu edullisten patentinsuori-tusmuotojensa suhteen. Aiheeseen perehtyneille on selvää, että julkaistun aiheen muutoksia ja/tai muunnoksia voidaan tehdä poikkeamatta kyseessä olevan keksinnön piiristä, joka tässä yhteydessä julkaistaan.

Claims (14)

1. 44 88546 l. Menetelmä stabiilin glukohemoglobiinin määrän määrittämiseksi glukohemoglobiinia sisältävästä näytteestä, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) mainittu näyte sekoitetaan vettä sisältävän väliaineen kanssa, jossa on ftaalihappoa tai biftaalihappoa ja jonka pH-arvo on noin 3-6, suhteessa, jossa on ainakin 1,5 milli-moolia mainittua happoa milligrammaa kohti hemoglobiinia, jotta muodostuu hapan reaktioseos; (b) mainittua hapanta reaktioseosta pidetään ennalta määritetty aika lämpötilassa, joka on noin 0°C:n yläpuolella, aina noin 37°C:een saakka ja joka on riittävä poistamaan läsnäolevan labiilin glukohemoglobiinin, samalla kun alkuperäisessä näytteessä läsnäoleva, stabiili glukohemoglobiini säilyy; (c) mainittu reaktioseos sekoitetaan veden kanssa sekoitus-kelpoisen boorihydridipelkistimen kanssa suhteessa, jossa on ainakin noin 0,015 millimoolia boorihydridiä milligrammaa kohti hemoglobiinia, jotta pelkistysreaktioseos muodostuu; (d) mainittua hapanta reaktioseosta pidetään edeltäkäsin määritetty aika lämpötilassa, joka on noin 0°C:n yläpuolella aina noin 37°C:een saakka, riittävä aika, jotta glusitolily-siinihemoglobiinia muodostuu; (e) mainittu glusitolilysiinihemoglobiini erotetaan kaikesta reagoimattomasta boorihydridistä, jotta muodostetaan eristettyä glusitolilysiinihemoglobiinia; (f) mainittu eristetty glusitolilysiinihemoglobiini sekoitetaan glusitolilysiinille spesifisten reseptorimolekyylien kanssa immunoreaktioseoksen muodostamiseksi; (g) mainittua immunoreaktioseosta pidetään biologisissa mää-ritysolosuhteissa aika, joka on riittävä reseptorimolekyy-leille, jotta ne immunologisesti sitoutuvat mainittuun glusi-tolilysiinihemoglobiiniin mainitun immunoreaktantin muodostamiseksi; ja (h) määritetään immunoreaktantin määrä, joka muodostui ylläpidetyssä immunoreaktioseoksessa. i 45 38546
2. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että vaiheessa (a) suoritettu sekoitus tapahtuu suhteessa, jossa on ainakin 15,0 millimoolia happoa milligrammaa kohti hemoglobiinia.
3. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että vaiheen (a) mukaisen, mainitun happamen liuoksen pH-arvo on noin 4-5.
4. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että vaihe (c) suoritetaan käyttäen suhdetta, jossa on ainakin 0,15 millimoolia boorihydridiä milligrammaa kohti hemoglobiinia.
5. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että vaiheen (f) mukaiset reseptorit ovat mono-klonaalisen vasta-aineen muodossa.
6. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että mainittua monoklonaalista vasta-ainetta erittävät hybridomat, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 8356 tai HB 8358.
7. 7. Menetelmä stabiilin glukohemoglobiinin määrän määrittämi-...'· seksi glukohemoglobiinia sisältävässä näytteessä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat : vaiheet: (a) käytetään ennalta määritettyä määrää tiivistä punasolu- sakkaa ; .·.*. (b) mainittu, ennalta määritetty tilavuus sakkaa sekoitetaan ftaalihapon 0,05-molaarisen vesiliuoksen kanssa, jonka pH on . . noin 4-5, suhteessa, jossa on noin yksi tilavuus sakkaa ja 62,5 tilavuutta hapon vesiliuosta, jotta muodostuu hapan * reaktioseos; ·"*: (c) mainittua hapanta reaktioseosta pidetään noin 15-30 mi- ·:·· nuutin ajan lämpötilassa, joka on noin 20-3 7°C, jotta hemoly-. . saatti muodostuu; 46 88546 (d) mikrotiitterilevyn kuopassa sekoitetaan yhtä suuri tilavuus vesiliuosta, joka on noin 400-mmolaarinen natriumboori-hydridin tai kaiiumboorihydridin suhteen, jotta muodostuu pelkistysreaktioseos, jossa on ainakin noin 0-15 millimoolia boorihydridiä milligrammaa kohti hemoglobiinia; (e) mainittua pelkistysreaktioseosta pidetään noin 15-30 minuutin mittainen aika noin 20-37°C;n lämpötilassa, jotta mikrotiitterilevyn kuoppaan sidottu glusitolilysiini-hemoglobiini muodostuu; (f) mainittu kuoppaan sidottu glusitolilysiinihemoglobiini erotetaan mainitusta boorihydridistä, eristetyn, kuoppaan sidotun glusitolilysiinihemoglobiinin saamiseksi; (g) mainittu, kuoppaan sidottu glusitolilysiinihemoglobiini immunoreaktioseoksen muodostamiseksi sekoitetaan ennalta määritetyn määrän kanssa entsyymillä merkattuja reseptoreita, joita ovat erittäneet hybridomat, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 8356 tai HB 8358; (h) mainittua immunoreaktioseosta pidetään noin 15-30 minuutin ajan lämpötilassa, joka on noin 20-37°C, mainitun ajan ollessa riittävä siihen, että mainitut reseptorit immunologi-sesti sitoutuvat mainittuun glusitolilysiinihemoglobiiniin ja muodostavat mikrotiitterilevyn kuoppaan sidotun immunoreak-tantin; ja (i) määritetään mikrotiitterilevyn kuoppaan sidotun immuno-reaktantin määrä, joka on muodostunut vaiheessa (h).
8. 8. Menetelmä stabiilin glukohemoglobiinin muuttamiseksi glu-sitolilysiinihemoglobiiniksi glukohemoglobiininäytteestä, joka sisältää labiileja ja stabiileja glukohemoglobiineja, t u n n e t t u siitä, että menetelmä sisältää seuraavat vaiheet: (a) mainittu näyte sekoitetaan ftaalihapon tai biftaalihapon vesiliuoksen kanssa, jonka pH-arvo on noin 3-6, suhteessa, joka sisältää ainakin 1,5 millimoolia mainittua happoa milligrammaa kohti hemoglobiinia, jotta hapan reaktioseos muodostuu; (b) mainittua hapanta reaktioseosta pidetään ennalta määritetty aika lämpötilassa, joka on noin 0°C:n yläpuolella 47 38546 aina noin 37°C:een saakka ja on riittävä läsnäolevan labiilin glukohemoglobiinin poistamiseksi, samalla kun alkuperäisessä näytteessä läsnäoleva stabiili glukohemoglobiini säilyy; (c) mainittu reaktioseos sekoitetaan veden kanssa sekoitus-kelpoisen boorihydridipelkistimen kanssa suhteessa, jossa on ainakin noin 0,015 millimoolia boorihydridiä milligrammaa kohti hemoglobiinia, (d) mainittua pelkistysreaktioseosta pidetään ennalta määritetty aika lämpötilassa, joka on noin 0°C:n yläpuolella aina noin 37°C:een ja on riittävä glusitolilysiinihemoglobiinin muodostumiseksi; ja (e) mainittu glusitolilysiinihemoglobiini erotetaan reagoimattomasta boorihydridistä eristetyn glusitolilysiinihemoglobiinin saamiseksi.
9. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että vaiheessa (a) mainittu sekoittaminen suoritetaan suhteessa, jossa on ainakin noin 15 millimoolia happoa milligrammaa kohti hemoglobiinia.
10. 10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että vaiheesta (a) saadun, happamen liuoksen pH on noin 4-5.
11. 11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että vaiheen (c) mukainen sekoittaminen suoritetaan suhteessa, jossa on ainakin vähintään 0,15 millimoolia boorihydridiä milligrammaa kohti hemoglobiinia.
12. 12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että mainittu näyte on punasolujen muodossa. 1 Diagnostinen järjestelmä, joka soveltuu kiinteäfaasimää-rityksen suorittamiseen glukohemoglobiininäytteeseen sisäl-tyvän stabiilin glukohemoglobiinin määrittämiseksi jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukaisen menetelmän mukai- ; sesti, tunnettu siitä, että se käsittää: ·:*: (a) ensimmäisen pakkauksen, jossa on kiinteä faasimatriisi, jonka pinnalla määritys suoritetaan; 48 88546 (b) toisen pakkauksen, jossa on ennalta määritetty määrä veden kanssa sekoituskelpoista boorihydridipelkistintä; (c) kolmannen pakkauksen, jossa on tunnettu määrä glusitoli-lysiinille spesifisiä reseptorimolekyylejä; ja (d) neljännen pakkauksen, jossa on ennalta määritetty määrä ftaalihappoa tai biftaalihappoa; tällöin mainittujen pakettien sisältöjä on vastaavina määrinä, jotka riittävät mainitun määrityksen suorittamiseen.
13. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen diagnostinen järjestelmä, tunnettu siitä, että mainittuja glusitolilysiini-ille spesifisiä reseptorimolekyylejä erittävät hybridomat, joiden ATCC-talletusnumerot ovat HB 8356 tai HB 8358.
14. 15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen diagnostinen järjestelmä, tunnettu siitä, että mainitut reseptorimolekyylit ovat leimaan sidotut.