NO172708B - Fremgangsmaate for omdannelse av stabilt glucohemoglobin til glucitollysin-hemoglobin, mengdebestemmelse av stabilt glucohemoglobin, samt diagnostisk system for utfoerelse av mengdebestemmelsen - Google Patents
Fremgangsmaate for omdannelse av stabilt glucohemoglobin til glucitollysin-hemoglobin, mengdebestemmelse av stabilt glucohemoglobin, samt diagnostisk system for utfoerelse av mengdebestemmelsen Download PDFInfo
- Publication number
- NO172708B NO172708B NO874783A NO874783A NO172708B NO 172708 B NO172708 B NO 172708B NO 874783 A NO874783 A NO 874783A NO 874783 A NO874783 A NO 874783A NO 172708 B NO172708 B NO 172708B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hemoglobin
- glucitollysin
- acid
- glucohemoglobin
- reaction mixture
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title description 17
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 162
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 162
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 77
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 75
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N phthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 72
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims description 61
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 43
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 42
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 29
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 27
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 24
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 21
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 claims description 20
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 19
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 13
- QQVIHTHCMHWDBS-UHFFFAOYSA-N isophthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC(C(O)=O)=C1 QQVIHTHCMHWDBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 8
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 8
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 claims description 7
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 41
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 25
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 24
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 24
- JNFQXAUVKUQSKQ-FBDQPXRJSA-N (2s)-2-amino-6-[[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]amino]hexanoic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO JNFQXAUVKUQSKQ-FBDQPXRJSA-N 0.000 description 22
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 20
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 19
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 15
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 9
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 9
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 6
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 description 4
- 108010014663 Glycated Hemoglobin A Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- ODUCDPQEXGNKDN-UHFFFAOYSA-N nitroxyl Chemical compound O=N ODUCDPQEXGNKDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical class N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 3
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 3
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 3
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 238000003691 Amadori rearrangement reaction Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;oxalate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)C([O-])=O IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- IWZKICVEHNUQTL-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogen phthalate Chemical compound [K+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O IWZKICVEHNUQTL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101100328078 Bos taurus CL46 gene Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 102100027685 Hemoglobin subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101000582398 Staphylococcus aureus Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 1
- 150000004705 aldimines Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940075397 calomel Drugs 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L dimercury dichloride Chemical compound Cl[Hg][Hg]Cl ZOMNIUBKTOKEHS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- -1 fluorescein isocyanate Chemical class 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- MNQZXJOMYWMBOU-UHFFFAOYSA-N glyceraldehyde Chemical compound OCC(O)C=O MNQZXJOMYWMBOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010036302 hemoglobin AS Proteins 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000001019 normoglycemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N semicarbazide Chemical compound NNC(N)=O DUIOPKIIICUYRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004905 short-term response Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 150000003680 valines Chemical group 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for omdannelse av stabilt glucphemoglobin til glucitollysin-hemoglobin, mengdebestemmelse av stabilt glucohemoglobin, samt diagnostisk system for utførelse av mengdebestemmelsen.
Glycosylerte hemoglobiner (glycohemoglobiner) er hemoglobiner som er kovalent bundet til en sukkerhalvdel. Det vil si at glycohemoglobiner er addis jonsproduktene (adduktene) av reaksjonen mellom hemoglobin og et sukker. Glucohemoglobiner er en underklasse av glycohemoglobin som innbefatter hemoglobin bundet til glucose. Glycosylering er en ikke-spesifikk reaksjon som er innberettet å føre til addisjonen av forskjellige sukkere eller sukkerfosfater til humane hemoglobiner AQ, A2, C, D, E, F og S.
Glucohemoglobin Alc (HbA^c) er det mest vanlig forekommende og mest omfattende studerte glycohemoglobin. HbA^c tilsvarer HbAQ med D-glucose bundet til aminogruppen av det N-terminale valin i én eller begge beta-globin-kjeder. Addisjonen av glucose til hemoglobin er imidlertid ikke begrenset til N-terminalen av beta-kjeden, den kan også forekomme på epsilon-aminogruppen til lysiner i både alfa- og beta-globinkjedene.
Reaksjonsmekanismen og kinetikken for glucoseaddi-sjon til hemoglobin er vist skjematisk i figur 1. D-glucose i dens aldehydform reagerer hurtig og reversibelt med en aminogruppe (tilveiebragt av et N-terminalt valin eller av epsilon-aminogruppen på. en intrakjedet lysinrest) under dannelse av et labilt aldimin- (Schiff-base) mellomprodukt. Dette labile mellomprodukt (labilt glucohemoglobin) kan dissosiere tilbake til D-glucose og hemoglobin, eller det kan gjennomgå en irreversibel, men sakte Amadori-omleiring under dannelse av et stabilt ketoamin (stabilt glucohemoglobin) . Ketoaminet foreligger på sin side i likevekt med et hemiketal eller en ringform (nærmere bestemt deoxy-fructosyl-lysin).
Dannelsen av stabilt glucohemoglobin er en ikke-enzymatisk prosess som fortsetter sakte og kontinuerlig gjennom levetiden til erythrocytten. Hastigheten av glucohemoglobindannelse er direkte avhengig av et individs evne til å kontrollere blodsukker- (glucose) nivåer.
Derfor har informasjon som gjelder konsentrasjonen av totalt stabilt glucohemoglobin av typen HbA^c> oppnådd godkjennelse som en objektiv, tidsgjennomsnittlig monitor for glucemisk kontroll hos pasienter med diabetes mellitus.
De forskjellige fremgangsmåter for mengdebestemmelse av totalt glycohemoglobin eller en spesiell glucohemoglobintype som HbA^c, og de metodologiske problemer forbundet med disse fremgangsmåter, er redegjort for i Goldstein et al., Clin. Chem., 31:1060-1067 (1985) og Jovanovic et al., Am. J. Med., 70:331-338 (1981). Radio-immunanalysen (RIA) for mengdebestemmelse av HbA^c, beskrevet av Javid et al., lider f.eks. under anvendelsen av antistoffer med lav affinitet og kryss-reaktivitet med ikke-glucosylert hemoglobin.
Nylig innberettet Curtiss et al., J. Clin. Invest., 72:1427-38 (1983), anvendelsen av monoklonale antistoffer som immunreagerer med glucitollysinrest-inneholdende epitoper for å bestemme tilstedeværelsen av glucosylerte plasmaproteiner med forholdsvis korte halveringstider. Disse teknikere innberettet også at glucitollysin-hemoglobin hemmet bindingen av noen av deres monoklonale antistoffer til glucitollysin-plasmaproteiner.
En glucitollysinrest dannes ved reduksjon av det tidligere omtalte Amadori-omleiringsprodukt når ketoamin-formen av den glucosylerte epsilon-aminogruppe i lysin (Amadori-produkt) reduseres av et vannforenlig borhydrid-reduksjonsmiddel (reduktant) som natriumborhydrid eller natriumcyanoborhydrid. Således viste Curtiss et al. at gluco-plasmaproteinet i en prøve kan reduseres og omdannes til glucitollysin-inneholdende plasmaprotein, og deretter mengdebestemmes ved anvendelse av glucitollysin-spesifikke, monoklonale antistoffer, og derved overvinne problemet med kryss-reaktivitet som er iakttatt med ikke-glucosylerte plasmaproteiner.
Imidlertid, som det vises i figur 1, danner
in vitro-reduksjonsreaksjonen glucitollysinrester i både de labile og stabile former av glucohemoglobin. Fremgangsmåten ifølge Curtiss et al., supra, når den anvendes på hemoglobin istedenfor et plasmaprotein, kan således alene ikke skille mellom mengden av labile og stabile former av glucohemoglobin som er til stede i en prøve.
Ifølge publikasjonene til både Goldstein et al., supra og Jovanovic et al., supra, i den hensikt at en glucohemoglobinbestemmelse skal tilveiebringe et pålitelig uttrykk for langtids glucemisk kontroll, må fremgangsmåten for mengdebestemmelse skille mellom de labile og stabile former av glucohemoglobin. Det er to årsaker til dette.
For det første, ved ethvert gitt tidspunkt, er den totale mengde glucohemoglobin som er til stede i en erythrocytt, summen av både de labile og stabile fraksjoner. For det andre varierer mengden labilt glucohemoglobin som er til stede i erythrocytter hurtig som svar på korttids glucosenivåer. Dvs. at dannelsen av den labile fraksjon er tilstrekkelig hurtig sammenlignet med den sakte, irreversible dannelse av det stabile ketoamin slik at akutte forandringer i blodglucose vil føre til en økning i den totale mengde glucohemoglobin, vesentlig som et resul-tat av en økning av den labile fraksjon. Derfor kan inn-befatning av den labile fraksjon i enhver måling av glucohemoglobin gjenspeile et akutt eller korttidssvar på blodglucosenivåer og ikke graden av langtids glucemisk kontroll.
De nåværende tilgjengelige kromatografiske, elektroforetiske og immunologiske fremgangsmåter for mengdebestemmelse av glycohemoglobin kan ikke skille mellom de labile og stabile former av glucohemoglobin når begge er til stede i prøven. Følgelig er det utført en betydelig mengde forskning for å utvikle fremgangsmåter for mengdebestemmelse som innbefatter en fremgangsmåte for å fjerne den labile glucohemoglobinfraksjon fra prøven forut for mengdebestemmelsestrinnet.
Beskrevne fremgangsmåter for å fjerne labilt glucohemoglobin fra en prøve er avhengig av at prøven ut-settes for betingelser som begunstiger dissosiasjon av den labile form i en glycose slik som glucose (en aldose) og hemoglobin. Disse fremgangsmåter innbefatter inkubering av erythrocyttene i normal saltoppløsning i 24 timer forut for hemolyse [Goldstein et al., Diabetes 2J:623-28 (1980)], dialyse av hemolysatet i 48 timer mot glucose-fri fosfat-buffer, [Widness et al., J. Lab. Clin. Med. 9,5:386-394
(1980)], og fortynning og etterfølgende konsentrasjon ved ultrafiltrering av hemolysatet [Innanen et al., Clin. Chem. 27:1478-79 (1981)].
Av spesiell interesse med hensyn til den foreliggende oppfinnelse er de fremgangsmåter som anvender et surt inkubasjonstrinn for å fjerne labilt glycohemoglobin. Nathan et al., Diabetes, 30:700-701 (1981), beskriver en fremgangsmåte for mengdebestemmelse hvori erythrocytter inkuberes i en oppløsning som inneholder semicarbazid og analin ved pH 5 i 30 minutter ved 38°C for å redusere (fjerne) den labile fraksjon. Den stabile glycohemoglobin-, f.eks. glucohemoglobin-, fraksjon bestemmes deretter ved anvendelse av enten høytrykksvæskekromatografi (HPCL)
eller citratagargelelektroforese-separasjonsteknikker.
Fremgangsmåten beskrevet av Bisse et al., Diabetes, 31:630-633 (1982), fjernet den labile fraksjon fra prøven som skulle bestemmes ved lyse av erythrocyttene i 50 volumer av en oppløsning som inneholdt 0,05 M kaliumbifthalat ved pH 5 i 15 minutter ved 37°C. Mengden av stabilt glycohemoglobin som var gjenværende i den labile glycohemoglobin-reduserte prøve, ble deretter bestemt ved HPLC.
Det har imidlertid hittil ikke forekommet innbe-retninger angående anvendelse av et surt, labilt glycose-, f.eks. glucose-, reduseringstrinn som anvender bifthalsyre i forbindelse med et reduksjonstrinn som anvender et vannforenlig borhydrid-reduksjonsmiddel, for å danne glucitollysin-hemoglobin som kan bestemmes immunologisk.
Ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for omdannelse av stabilt glucohemoglobin til glucitollysin-hemoglobin i en glucohemoglobinprøve inneholdende både labile og stabile glucohemoglobiner, kjennetegnet ved trinnene: (a) blanding av denne prøve i et vandig medium med fthai- eller bifthalsyre med en pH verdi på 3 til 6, i et forhold på minst 1,5 millimol syre pr. milligram hemoglobin, under dannelse av en syrereaksjonsblanding; (b) vedlikehold av syrereaksjonsblandingen i en på forhånd bestemt tidsperiode ved en temperatur mellom 0 °C og 37 °C som er tilstrekkelig for å fjerne det tilstedeværende, labile glucohemoglobin i den originale prøve vedlikeholdes; (c) blanding av reaksjonsblandingen med en vannforenlig borhydridreduktant i et forhold på minst 0,015 millimol borhydrid pr. milligram hemoglobin, under dannelse av en reduksj ons-reaksj onsblanding; (d) vedlikehold av reduksjohs-reaksjonsblandingen i en på forhånd bestemt tidsperiode ved en temperatur mellom 0 "C og 37 °C tilstrekkelig for dannelse av glucitollysin-hemoglobin; og (e) adskillelse av glucitollysin-hemoglobinet fra enhver mengde ureagert borhydrid for å danne isolert glucitollysin-hemoglobin;
eventuelt etterfulgt av mengdebestemmelse ved,
(f) blanding av det isolerte glucitollysin-hemoglobin med glucitollysin-spesifikke reseptormolekyler under dannelse av en immunreaksjonsblanding; (g) vedlikehold av immunreaksjonsblandingen under biologiske betingelser for mengdebestemmelse i en tidsperiode tilstrekkelig for reseptormolekylene til å immunologisk binde seg til glucitollysin-hemoglobinet under dannelse av en immunreaktant; og (h) mengdebestemmelse av immunreaktanten som dannes 1 den vedlikeholdte immunreaksjonsblanding.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for mengdebestemmelse av stabilt glucohemoglobin i en glucohemoglobin-inneholdende prøve, kjennetegnet ved trinnene: (a) tilveiebringelse av et på forhånd bestemt volum av en sammenpakket pellet av røde blodceller; (b) blanding av det på forhånd bestemte pelletvolum med vandig 0,05 M fthalsyre ved en pH-verdi på 4 til 5 og ved et forhold på 1 volum pellet til 62,5 volumer vandig syre under dannelse av en syrereaksjonsblanding; (c) vedlikehold av syrereaksjonsblandingen i en tidsperiode på 15 minutter til 30 minutter og ved en temperatur på 20 °C til 37 °C under dannelse av et hemolysat; (d) blanding i en mikrotiterplatebrønn av et på forhånd bestemt volum av hemolysatet med et like stort volum av en vandig oppløsning med en natriumborhydrid- eller kaliumbor-hydridkonsentrasjon på 400 mM, under dannelse av en reduksjons-reaksjonsblanding inneholdende et forhold på minst 0,15 millimol borhydrid pr. milligram hemoglobin; (e) vedlikehold av reduksjons-reaksjonsblandingen i en tidsperiode på 15 til 30 minutter ved en temperatur på 20 °C til 37 °C, under dannelse av mikrotiterplatebrønnbundet glucitollysin-hemoglobin; (f) adskillelse av det brønn-bundne glucitollysin-hemoglobin fra borhydridet under dannelse av et brønn-bundet glucitollysin-hemoglobin; (g) blanding av det isolerte, brønn-bundne glucitollysin-hemoglobin med en på forhånd bestemt mengde enzymmerkede reseptorer utskilt av hybridomene med ATCC-deponeringsnummere HB 8356 eller HB 8358, under dannelse av en immunreaksjonsblanding; (h) vedlikehold av immunreaksjonsblandingen i en tidsperiode på 15 minutter til 30 minutter ved en temperatur på 20 °C til 37 °C, hvor tidsperioden er tilstrekkelig for reseptorene til å immunologisk binde seg til glucitollysin-hemoglobinet og danne en mikrotiterplatebrønn-bundet immunreaktant; og (i) mengdebestemmelse av mikrotiterplatebrønn-bundet immunreaktant som ble dannet i trinn (h).
Foreliggende oppfinnelse angår også et diagnostisk system passende for utførelse av en fast fase-mengdebestem-meise av tilstedeværende, stabilt glucohemoglobin i en gluco-hemoglobinprøve , kjennetegnet ved (a) en første pakning inneholdende en fast fase-matriks på hvis overflate mengdenestemmelsen utføres; (b) en andre pakning inneholdende en på forhånd bestemt mengde av et vannforenlig borhydrid-reduksjonsmiddel; (c) en tredj e pakning inneholdende en kj ent mengde av glucitollysin-spesifikke reseptormolekyler; og (d) en fjerde pakning inneholdende en på forhånd bestemt mengde fthalsyre eller bifthalsyre;
innholdet av pakningene er til stede i tilstrekkelige mengder for å utføre mengdenestemmelsen.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer flere fordeler og fortrinn.
En fordel er at konsentrasjonen av stabilt hemoglobin i en glucohemoglobinprøve som inneholder både labile og stabile glucohemoglobiner, kan mengdebestemmes relativt hurtig, lett og nøyaktig.
Et av foreliggende oppfinnelses fortrinn er at glucitollysin-hemoglobin kan fremstilles fra den stabile glucohemoglobindel av en glucohemoglobinprøve med utelukk-else av glucitollysin-hemoglobin fremstilt fra den labile glucohemoglobindel av prøven.
En annen fordel med oppfinnelsen er at det frem-stilte glucitollysin-hemoglobin utviser en uventet større antigen virkning enn det som fremstilles på andre måter.
Ytterligere fortrinn og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå for dyktige fagfolk ut fra beskrivelsen som følger. Figurene som utgjør en del av den foreliggende patentsøknad, viser: Figur 1 er en skjematisk fremstilling som illustrerer reaksjonssekvensen for den ikke-enzymatiske glucosylering av de frie alfa- (amino-terminalt valin) og epsilon—(lysin) aminer i hemoglobin, betegnet som "protein" i figuren,
under dannelse av labile og stabile glucohemoglobiner, og
den etterfølgende reduksjon av mellomprodukter under dannelse av de glucitol-substituerte sluttprodukter.
Figur 2 inneholder tre diagrammer som illustrerer resultatene av konkurrerende hemningsundersøkelser utført ved blanding av pepperrotperoxydase-merkede G6C9-reseptorer (HRPO-G6C9) med forskjellige konsentrasjoner av potensielle konkurrenter for G6C9-antistoff-forbindelses-setet. Abscissen i hvert diagram viser konsentrasjonen,
i mikrogram pr. milliliter (ug/ml), av de anvendte inhi-bitoroppløsninger. Ordinaten i hvert diagram viser brøk-delen av maksimal binding; dvs. omfanget av oppnådd binding ved hjelp av HRPO-G6C9 i fravær av konkurrerende inhibitor, som var tilbake eller ble oppnådd etter reaksjon med de forskjellige potensielle inhibitorer.
Figur 2A illustrerer de erholdte resultater ved anvendelse av glucitollysin (A); redusert poly-L-lysin
(□); redusert alfa-T-Boc-lysin (0); redusert ikke-glucosylert hemoglobin (A); og redusert poly-L-valin som potensielle konkurrenter (■). Disse resultater angir at i denne gruppe hemmet bare den positive kontroll, glucitollysin, bindingen av HRPO-G6C9-reseptorer, og derfor danner ikke redusering alene, i fravær av glucose, epitopen som gjenkjennes av HRPO-G6C9. Figur 2B illustrerer de erholdte resultater ved anvendelse av glucitollysin (A); glucosylert poly-L-lysin (□); glucosylert alf a-T-Boc-lysin (#); glucosylert hemoglobin (A) og glucosylert poly-L-valin (■) som potensielle konkurrenter. Disse resultater viser at bare den positive kontroll, glucitollysin, hemmet binding. Således danner glucosylering alene ikke epitopen som gjenkjennes av HRPO-G6C9. Figur 2C illustrerer de erholdte resultater etter glucosylering og deretter redusering av poly-L-lysin (Q); alf a-T-Boc-lysin (#); hemoglobin (A) og po]y-L-valin (■). Disse resultater angir at når poly-L-lysin og hemoglobin er glucosylert og redusert, kan de begge konkurrere om
HRPO-G6C9-antistoff-forbindelsesseter på en måte som er lignende den som vises av den positive kontroll, glucitollysin. Bare glucosylert og redusert poly-L-valin kunne ikke konkurrere i noen betydelig grad, noe som således indikerte at HRPO-G6C9-reseptorer ikke immunreagerer med det N-terminale, glucosylerte valin i hemoglobin.
Figur 3 inneholder to diagrammer som illustrerer de uventede resultater erholdt når glucitollysindannelse i en hemoglobinprøve utføres ved reduksjon under tilstedeværelse av fthalsyre.
I figur 3A ble glucohemoglobin-inneholdende hemoglobinprøver tilveiebragt som 10 mikroliter (ul) av en sammenpresset RBC-pellet erholdt fra blodet til enten en diabetisk person (trekant), eller en normal person (kvadrat). Prøvene ble redusert under anvendelse av enten NaBH4 (A,D) eller KBH^ (A/H) som vannforenlig borhydrid-reduksjonsmiddel, og deretter mengdebestemt med henblikk på glucitollysin-hemoglobindannelse. Hemoglobinkonsentrasjonen i hver av reduksjons-reaksjonsblandingene var 2,4 milligram pr. milliliter (mg/ml). Konsentrasjonen av borhydridet i hver av blandingene er vist på abscissen. Figur 3B illustrerer de erholdte resultater for de samme to hemoglobinprøver og de samme to reduksjonsmidler når reduksjon ble utført etter reaksjon av prøvene med fthalsyre. En sammenligning av resultatene i figur 3A med de i figur 3B, angir at reaksjon med fthalsyre før reduksjon med borhydrid fører til en betydelig økning i glucitollysin-hemoglobin som kan mengdebestemmes, som bestemt ved immunologisk binding av HRPO-G6C9-reseptorene. Glucitollysin-hemoglobinet fremstilt som beskrevet ved anvendelse av fthalsyre og et borhydrid-reduksjonsmiddel, utviser således øket antigenisitet. Denne observerte, økede mengde av glucitollysin-hemoglobin som kan mengdebestemmes (antigenisitet), var uventet. Figur 4 illustrerer virkningen av å variere vedlikeholdstidsperioden av reduksjons-reaksjonsblandingen. Sure reaksjonsblandinger fremstilt ved anvendelse av forskjellige fortynninger av blod fra enten en diabetisk eller normal kvinne, ble blandet med samme volum av 0,10 M fthalsyre. Konsentrasjonen av hemoglobin (Hb) i den sure reaksjonsblanding var, i mg Hb/ml, som følger: 27,0, 10,8, 5,4, 2,7, 1,08, 0,675, 0,54, 0,415, 0,337 og 0,270. Forholdet mellom antall millimol syre pr. milligram hemoglobin i hver av de ovenfor beskrevne blandinger, var hhv. 1,85, 4,63, 9,26, 18,5, 46,3, 74,07, 92,6, 120,5, 148,5 og 185,2.
Etter dannelse av hemolysat ble reduksjons-reaksjonsblandingene fremstilt ved blanding av hvert hemolysat med et likt volum av 400 mM NaBH^. De resiproke verdier for de endelige fortynninger av hemoglobinprøvene er vist på abscissen. Fra venstre mot høyre, og i rekkefølge med økende hemoglobinfortynning, ble forholdet av antall millimol NaBH^ pr. milligram hemoglobin for hver av de viste reduksjonsblandinger 0,0148, 0,037, 0,074, 0,148, 0,37, 0,593, 0,74, 0,964, 1,187 og 1,481.
Resultatene vist i figur 4, angir at opprettholdelse av reduksjons-reaksjonsblandingene i 30 minutter for både de diabetiske (□) og de normale (■) prøver, dannet mer glucitollysin-hemoglobin som kunne mengdebestemmes,
enn en tilsvarende 15 minutters opprettholdelse av disse blandinger for både de diabetiske og de normale prøver
Figur 5 er et søylediagram som illustrerer virkningen av forskjellige sure reaksjonsblandinger på dannelsen av glucitollysin-hemoglobin som kan mengdebestemmes, som en funksjon av den anvendte syre i reaksjonsblandingene. Blandingene ble fremstilt ved blanding av 10 mikroliter av en sammenpresset RBC-pellet erholdt fra enten en diabetisk (■) eller en mormal (D) blodprøve med 615 mikroliter av en av de følgende (0,05 M, pH-verdi 4 til 5, oppløsninger: fthalsyre (A), citrat (E), eddiksyre (F), fosfat (G), D(+)-glucosamin (H), alfa-ketoglutarsyre (I), oxaleddiksyre (J), dikaliumoxalat (K), ravsyre (L) og pyrodruesyre (M), etterfulgt av reduksjon med NaBH^ og bestemmelse av glucitollysin-hemoglobin-innholdet ved hjelp av ELISA, beskrevet i det etterfølgende. Kontroller innbefattet destillert vann (B), inkubasjon av RBC over natten (18 timer) i isoton saltoppløsning etterfulgt av destillert vann (C), eller fthalsyre (D). Kontroller ble mengdebestemt som beskrevet ovenfor. Mengdebestemmelsen av glucitollysin-hemoglobin-dannelse er uttrykt som en optisk tetthetsverdi (O.D.) ved 490 nm.
Resultatene vist i figur 5, angir at den klassiske fremgangsmåte for fjernelse av det labile hemoglobin fra en prøve; dvs. inkubering over natten av RBC i saltoppløs-ning (C), ikke potensierer dannelsen av glucitollysin på den samme måte som fthalsyre. Disse resultater illustrerer også potensieringen av glucitollysin som kan mengdebestemmes ved anvendelse av en kombinasjon av fthalsyre og et vannforenlig borhydrid-reduksjonsmiddel.
Figur 6 er et diagram som illustrerer de erholdte resultater når fremgangsmåten for mengdebestemmelse ifølge den foreliggende oppfinnelse ble utført med syrereaksjonsblandinger med fthalsyrekonsentrasjoner på enten 0,05 M (O) eller 0,025 M (▲). Det vises også de erholdte resultater når hemolysatene dannet ved anvendelse av en
syrereaksjonsblanding med en konsentrasjon av 0,05 M fthalsyre, ikke ble utsatt for reduksjon (■). Andre kontroller innbefatter de erholdte resultater når det ikke ble anvendt fthalsyrebehandling forut for NaBH4~reduksjon (□), og inkubering av RBC over natten i isoton saltoppløsning forut for reduksjon, men uten fthalsyrebehandling (A).
Konsentrasjonene av hemoglobin i syrereaksjonsblandingene var i mg/ml, 75, 50, 37,5, 30; 25 og 21,4. Konsentrasjonene av hemoglobin i hver av de respektive reduksjons-reaksjonsblandinger var, i mg/ml 37,5, 25, 18,75, 15, 12,5 og 10,7. Konsentrasjonen av NaBH^ i reduksjons-reaksjonsblandingene var 200 mM.
Figur 7 er et søylediagram som illustrerer de erholdte O.D. 4 90-verdier ved anvendelse av vandige fthal-syreoppløsninger med pH-verdier på 3,5, 4,5, 5,5 og 6,5, for å fremstille syrereaksjonsoppløsninger. Diabetiske hemoglobinprøver nr. 1 (■) og nr. 2 (@) og normale prøver nr. 1 (Q) og nr. 2 (E2), viste totale glycosylerte hemoglobinnivåer på hhv. 14,7%, 10,7%, 7,5% og 8,0%, som bestemt ved anvendelse av "Gly-Affin"-systemet ifølge fabrikantens instruksjoner.
Figur 8 er et søylediagram som illustrerer virkningen av å variere vedlikeholdstidsperiodene for syrereak-sj onsblandingen. Blandingene ble dannet ved anvendelse av 0,05 M fthalsyre med en ikke-justert pH-verdi på 4,3.
De anvendte prøver var de samme som beskrevet i figur 7; dvs. diabetisk nr. 1 (■), diabetisk nr. 2 (§3), normal nr. 1 (Q) og normal nr. 2 () .
Figur 9 illustrerer virkningen av vedlikehold
av reduksjons-reaksjonsblandingene ved enten romtemperatur eller ved 37°C under anvendelse av hemoglobin ved konsentrasjoner varierende fra 27,0 mg/ml til 0,27 mg/ml i syre-reaks jonsblandingene og 13,5 mg/ml til 0,135 mg/ml i reduksjons-reaksjonsblandingene. Syrereaksjonene ble ut-ført ved en fthalsyrekonsentrasjon på 0,05 M og ved en ikke justert pH-verdi for fthalsyre (4,3). Reduksjonsreaksjonene ble utført ved en NaBH^-konsentrasjon på 200 mM.
Tilveiebrakte hemoglobinprøver i form av helt blod fra enten en diabetisk (åpent symbol) eller en normal (lukket symbol) kvinne ble vedlikeholdt under reduksjons-reaks jonen ved enten romtemperatur (hhv. A og A ) eller ved 37°C (hhv. □ og ■ ).
Figur 10 viser resultatene av spisspotensial-
og gjenvinnelsesundersøkelsen hvori hemoglobinprøver med innhold av de forskjellige viste forhold av en normal og en diabetisk blodprøve, ble mengdebestemt. Prosentmengden av totalt glycosylert hemoglobin i den ikke-blandede, diabetiske prøve og i den normale prøve, ble bestemt ved anvendelse av "Gly-Affin"-systemet (Isolab) og funnet å være hhv. 18,56% og 5,45%. Videre detaljer for denne under-søkelse tilveiebringes i eksempel 8.
A. Definisjoner
Betegnelsen "antistoff" henviser til et molekyl som er et medlem av en familie av glycosylerte proteiner, benevnt immunoglobuliner, som kan spesifikt forbinde seg med et antigen. Et slikt antistoff forbinder seg med sitt antigen ved en spesifikk immunologisk bindings-vekselvirkning mellom antigenets antigene determinant og antistoffets antistoff-forbindelsessete.
Et "antistoff-forbindelsessete" er den strukturelle del av et antistoffmolekyl som omfatter tungkjedede og lett-kjedede, variable og hypervariable områder som spesifikt binder antigen. Ved anvendelse av nomenklaturen ifølge Jerne, (1974), Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 125C;373-389, henvises et antistoff-forbindelsessete også til som en "paratop".
Antistoff-forbindelsessete-inneholdende (paratop-inneholdende) polypeptiddeler av antistoffer er de deler av antistoffmolekyler som inneholder paratopen og som binder seg til et antigen, og omfatter, f.eks. Fab, Fab', F(ab')2- og F (v)-delene av antistoffene. Fab- og F(ab')2~ delene av antistoffer fremstilles ved den proteolytiske reaksjon av hhv. papain og pepsin med vesentlig intakte antistoffer, ved hjelp av velkjente fremgangsmåter. Se f.eks. U.S. patentskrift nr. 4.342.566. Fab'-antistoff-deler er også velkjente og dannes fra F(ab')2~deler, etterfulgt av reduksjon av disulfidbindingene som binder sammen de to tungkjedede deler, som kan utføres med mercaptoethanol, og etterfulgt av alkylering av det dannede proteinmercaptan med et reagens som jodacetamid. Intakte antistoffer foretrekkes og anvendes som illustrerende eksempler på de monoklonale ligandmolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse.
Ordet "antigen" er anvendt historisk for å betegne en enhet som er bundet av et antistoff, og også for å betegne enheten som induserer dannelsen av antistoffet. En mer aktuell anvendelse begrenser betydningen av antigen til den enhet som er bundet av et antistoff, mens ordet "immunogen" anvendes for enheten som induserer antistoffdannelse. Hvor en heri beskrevet enhet er både immunogen og antigen, vil den vanligvis betegnes som et antigen.
Betegnelsen "antigen determinant" henviser til den egentlige strukturelle del av antigenet som er immunologisk bundet ved et antistoff-forbindelsessete. Jerne-nomenklaturen redefinerer en antigen determinant som en "epitop".
Betegnelsen "biologisk aktiv" henviser i det
minste til et proteinaktig molekyls evne til spesifikt å binde til seg antigen eller spesifikt antistoff-forbindelsessete, selv om annen generell eller effektorevne også kan være til stede i dette molekyl. Biologisk aktivitet av et reseptormolekyl som inneholder et antistoff-forbindelsessete, vises ved den immunologiske reaksjon av paratopen (antistoff-forbindelsessete) med dens epitop (antigene determinant) ved deres sammenblanding i et vandig medium under dannelse av en immunreaktant, i hvert fall ved fysio-logiske pH-verdier og ionestyrker. Biologisk aktivitet finner fortrinnsvis sted under de biologiske betingelser for mengdebestemmelser som defineres i det følgende.
"ELISA" henviser til en enzymbundet immunosorbent mengdebestemmelse som anvender et antistoff eller et antigen bundet til en fast fase, og et enzym-antigen eller enzym-antistoffkonjugat, for å påvise og bestemme mengden av antigen eller antistoff som er tilstede i en prøve. En beskrivelse av ELISA-teknikken beskrives i kapittel 22 av den 4. utgave av Basic and Clinical Immunology av D.P. Sites et al., publisert av Lange Medical Publications
i Los Altos, CA, i 1982, og i U.S. patentskrifter nr. 3.654.090, 3.850.752 og 4.016.043.
"Enzym" henviser til et protein som er i stand til
å akselerere eller å danne ved katalytisk virkning, forandring i et substrat for hvilket det ofte er spesifikt.
Betegnelsen "immunreaksjon" i dens forskjellige former betyr binding mellom et reseptormolekyl og en epitop.
"Immunreaktant" som anvendt heri, henviser til prod-
uktet av en immunologisk reaksjon; dvs. den enhet som dannes når et reseptormolekyl binder seg immunologisk til en epitop.
Betegnelsene "merkingsmidler", "indikatorgruppe" eller "merke" anvendes vekslende heri for å innbefatte enkle atomer og molekyler som er enten direkte eller indirekte forbundet med dannelsen av et påvisbart signal for å indikere tilstedeværelsen av en immunreaktant. Ethvert merkingsmiddel kan bindes til eller inkorporeres i en reseptor eller anvendes adskilt, og disse atomer eller molekyler kan anvendes alene eller i forbindelse med tilleggsreagenser. Slike indikatorgrupper eller merker er velkjente i immunkjemi og utgjør en del av den foreliggende oppfinnelse bare i den utstrekning de anvendes sammen med ellers nye fremgangsmåter og/eller systemer.
Betegnelsen "reseptor" anvendes heri for å angi et biologisk aktivt molekyl som omfatter et antistoff-forbindelsessete som binder seg immunologisk til (eller med) et antigen. En slik binding finner vanligvis sted med en affinitet på 10 til 10 liter pr. mol og er en spesifikk vekselvirkning mellom antigenets epitop og reseptorens antistoff-forbindelsessete.
Ordene "utskille" og "danne" anvendes ofte vekslende i teknikken for å vise til celler fra hvilke antistoffmolekyler erholdes. Celler som danner antistoffer, utskiller imidlertid nødvendigvis ikke disse molekyler til omgivelsene. De hybridome celler som er av interesse heri, utskiller monoklonale antistoffer til omgivelsene. Slike celler henvises heri noen ganger likevel til som "anti-stof f-dannende" celler, og deres antistoffer henvises noen ganger til som å være "dannet" i overensstemmelse med betegnelsene som er anvendt i teknikken. Deler av de ovenfor beskrevne antistoffer som inneholder antistoff-forbind-elsesseter (reseptorer), er likeledes henvist til heri som å være "dannet" eller "utskilt", selv om det er underforstått at slike molekyler fremstilles fra antistoffer som selv er "dannet" eller "utskilt".
Betegnelsen "supernatant" anvendes heri som hen-visning til det in vitro flytende medium som celler dyrkes i. Monoklonale antistoffer som dannes av de hybridome kulturer som er av interesse heri, utskilles i deres om-givende dyrkningsmedium. Derfor er dyrkningsmedium-supernatanten for disse celler en foretrukken kilde for de monoklonale reseptormolekyler og kan lett erholdes uten innhold av hybridome celler ved hjelp av velkjente teknikker. Eksempler på slike teknikker er sentrifugering ved lav hastighet for å sedimentere celler ut fra det vandige medium. Monoklonale reseptormolekyler kan alternativt erholdes fra ascites tumor-væske (ascites-væske) fra labora-toriedyr, i hvilke det hybridome vev ble tilført. Begge fremgangsmåter er velkjente i teknikken. Monospesifikke reseptormolekyler som også er beskrevet her, utskilles i blodet til vertsdyrene i hvilke de er dyrket frem. Fremgangsmåter for erholdelse av slike antistoffer er også velkjente i teknikken.
B. Glucitollysin-hemoglobin-fremstillings-fremgangsmåter
Foreliggende oppfinnelse beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av glycitollysin-hemoglobin fra glycohemoglobin, ved anvendelse av glucitollysin-hemoglobin og glucohemoglobin som karakteristisk eksempel. Glucitollysin-hemoglobinet som fremstilles ved denne fremgangsmåte, oppviser en uventet, øket antigenisitet i forhold til glucitollysin-hemoglobin som er dannet ved fremgangsmåter kjente i teknikken. Årsaken til den observerte, økte antigenisitet er ukjent.
Det er tilveiebrakt en prøve av glucohemoglobin
med en kjent mengde hemoglobin. Det således tilveiebrakte glucohemoglobin kan være til stede som inneholdt i erythrocytter (røde blodceller) eller som frie molekyler.
Fremgangsmåter for erholdelse av glucohemoglobin såvel som bestemmelse av tilstedeværelsen av glucohemoglobin, er velkjente i teknikken. I tillegg er fremgangsmåter for glucosylering av proteiner og polypeptider generelt, og hemoglobin spesielt, velkjente i teknikken. Se f.eks. U.S. patentskrift nr. 4.478.744 og Curtiss et al., J. Clin. Invest. , 7_2:1427-38 (1983), hvilke patenter er innbefattet heri ved referanse.
En glucohemoglobinprøve tilveiebringes vanligvis som en kjent mengde blod og fortrinnsvis som et kjent volum sammenpressede, røde blodceller (RBC). Fremgangsmåter for å tilveiebringe blodprøver og sammenpressede, røde blodceller, såvel som fremgangsmåter for lyse av RBC inneholdt deri, er velkjente i teknikken. (a) Glucohemoglobin-hemoglobinprøven blandes i et vandig medium med en kjent mengde fthalsyre eller bifthalsyre for å danne en syrereaksjonsblanding. Mengden av tilblandet syre er den mengde som er tilstrekkelig for å tilveiebringe et forhold på minst 1,5 millimol fthalsyre pr. milligram hemoglobin, fortrinnsvis et forhold på minst 15,0 millimol syre pr. milligram hemoglobin, og mest hensiktsmessig minst 45,0 millimol syre pr. milligram hemoglobin.
Syren tilveiebringes vanligvis som en vandig opp-løsning med en pH-verdi på 3 til 6, fortrinnsvis 4 til 5, og mest hensiktsmessig 4,1 til 4,5. Det vandige medium tilveiebrakt av syreoppløsningen, kan således tilveiebringe det vandige medium for syrereaksjonsblandingen.
Fremgangsmåter for bestemmelse av den molare mengde av hemoglobin i en prøve er velkjente i teknikken.
(b) Den erholdte syrereaksjonsblanding vedlikeholdes i en på forhånd bestemt tidsperiode fra sekunder til timer. En tidsperiode på 10 minutter til 15 minutter er vanligvis tilstrekkelig for vesentlig å dissosiere og fjerne (redusere) enhver tilstedeværende mengde labilt glucohemoglobin, mens det stabile glucohemoglobin som opprinnelig er til stede i prøven, vedlikeholdes. Hvis ønskelig, kan blandingen imidlertid vedlikeholdes i en tidsperiode på
16 til 20 timer uten noen utslettende konsekvenser.
Når glucohemoglobinprøven tilveiebringes som hele
RBC, virker syreoppløsningen som en lysingsoppløsning (middel) for de røde blodceller, slik at de røde blodceller lyses i løpet av syrereaksjons-vedlikeholdsperioden, for derved å frigjøre hemoglobinet som inneholdes deri under dannelse av hemolysat. Det således dannede hemolysat tømmes for labilt glucohemoglobin og inneholder det stabile hemoglobin som er til stede i den opprinnelige RBC-prøvedel.
(c) Syrereaksjonblandingen blandes deretter med
et vannforenlig borhydrid-reduksjonsmiddel under dannelse av en vandig reduksjons-reaksjonsblanding. Den vandige del av reduksjons-reaksjonsblandingen kan tilveiebringes av vannet i syrereaksjonsblandingen, av en vandig oppløsning av borhydrid-reduksjonsmidlet, eller særskilt. Fortrinnsvis tilveiebringer syrereaksjonsblandingen minst en del av den vandige del av reduksjons-reaksjonsblandingen.
Vannforenlige borhydrid-reduksjonsmidler er velkjente i teknikken og innbefatter natriumborhydrid (NaBH4), kaliumborhydrid (KBH^) og natriumcyanoborhydrid (NaCNBH^). Mengden av borhydrid som tilblandes, er den mengde som er tilstrekkelig for å tilveiebringe et forhold på minst 0,015 millimol borhydrid (BH~) pr. milligram hemoglobin, fortrinnsvis en mengde tilstrekkelig for å tilveiebringe et forhold på minst 0,15 millimol borhydrid pr. milligram hemoglobin, og mest hensiktsmessig en mengde tilstrekkelig for å tilveiebringe et forhold på 0,35 millimol borhydrid pr. milligram hemoglobin. (d) Den erholdte reduksjons-reaksjonsblanding vedlikeholdes ved en temperatur over 0°C og opptil 37°C, fortrinnsvis 20°C til 37°C, i en på forhånd bestemt tidsperiode fra sekunder til timer. En tidsperiode på 10 minutter til 16-20 timer, fortrinnsvis 15 minutter til 30 minutter, er vanligvis tilstrekkelig for å redusere ketogruppen (grupper) som er inneholdt i det stabile glucohemoglobin, til hydroxylgruppe(r) av glucitollysin-rest(er) under dannelse av glucitollysin-hemoglobin. (e) Det erholdte glucitollysin-hemoglobin adskilles deretter fra det gjenværende, ureagerte borhydrid under dannelse av isolert glucitollysin-hemoglobin. Det cellulære debris fra RBC-lyse fjernes også fortrinnsvis i dette separasjonstrinn.
Fremgangsmåter for å adskille glucitollysin-hemoglobinet fra det ikke-reagerte borhydrid og fra resten av reduksjons-reaksjonsblandingen, er også velkjente i teknikken. Slike separasjonsfremgangsmåter innbefatter geleksklusjonskromatografi, elektroforese og affinitets-kromatografi. Hvor en fast fase-mengdebestemmelses-fremgangsmåte anvendes, er det foretrukket å binde hemo-globinderivatet til den fast fasede matriks som anvendes for å danne et fast fundament, og deretter kun dekantere den flytende reduksjons-reaksjonsblanding fra den faste fase for å utføre adskillelsen. Det faste fundament som inneholder det bundne glucitollysin, kan også vaskes etter dekanteringstrinnet.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåte kan anvendes for å fremstille glucitollysin-hemoglobin som er anvendelig i diagnostiske fremgangsmåter for mengdebestemmelse og i analysesett som anvendes for å måle glucohemoglobin. Denne fremgangsmåte kan anvendes for å fremstille andre, ønskede glycitollysin-hemoglobin-typer, avhengig av det spesielle lysin-sukkeraddukt som er til stede.
C. Fremgangsmåter for mengdebestemmelse
Foreliggende oppfinnelse beskriver også en fremgangsmåte for bestemmelse av mengden av stabilt glycohemoglobin i en hemoglobin prøve, igjen med anvendelse av glucohemoglobin som et karakteristisk eksempel.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for fremstilling av glucitollysin-hemoglobin anvendes for å fremstille isolert glucitollysin-hemoglobin ifølge trinn (e) ovenfor, fra en prøve som inneholder en kjent mengde hemoglobin. Deretter utføres de følgende trinn.
(f) Det isolerte glucitollysin-hemoglobin blandes med reseptorer som immunreagerer med glucitollysin-inneholdende epitoper og som ikke viser noen vesentlig kryss-reaktivitet med glucitollysin-fritt hemoglobin under
dannelse av en immunreaksjonsblanding. De anvendelige reseptorer blandes vanligvis i støkiometrisk overskudd i forhold til mengden glucitollysin som er forventet å være til stede.
Reseptormolekyler som utviser de ovenfor beskrevne immunreaktiviteter, henvises til heri som "glucitollysin-spesifikke" reseptormolekyler eller reseptorer. Det må underforstås at slike reseptormolekyler kan kryss-reagere med andre deler, slik som reduserte Amadori-produkter av andre sukker-hemoglobinaddukter, eller mannitollysin-rester. For å forenkle uttrykk betegnes alle de reduserte, stabile hemoglobin- (Amadori) produkter som glucitollysin-rester, og således benevnes reseptormolekyler som immunreagerer med disse reduserte produkter, som "glucitollysin-spesifikke". De anvendelige reseptormolekyler kan også kryss-reagere med andre deler som sorbitol, mannitol, reduserte Amadori-produkter av plasma og andre proteiner, likesom frie aminosyrer som lysin eller arginin. Imidlertid er disse andre deler fraværende fra immunreaksjonsblandingen som er anvendelig heri, slik at eventuelle ytterligere kryss-reaktiviteter av de anvendelige reseptormolekyler ikke er relevante for den foreliggende oppfinnelse.
Fremgangsmåter for fremstilling av anvendelige reseptorer som immunreagerer med glucitollysin-hemoglobin og som utviser liten eller ingen immunologisk kryss-reaktivitet med hemoglobin som ikke inneholder glucitollysin-rester; dvs. glucitollysin-spesifikke reseptormolekyler,
er velkjente i teknikken. Vanligvis krever disse fremgangsmåter innledningsvis fremstilling av en immunogen-inneholdende glucitollysin-rest.
Som beskrevet tidligere, er fremgangsmåter for glycosylering av proteiner og syntetiske polypeptider generelt, og glucosylering av disse deler spesielt, velkjente i teknikken. I tillegg er fremgangsmåter for omdannelse av lysinrester med glucose covalent bundet til deres epsilon-aminogrupper, til glucitollysin-rester, som ved reduksjon med et vannforenlig borhydrid-reduksjons-
middel, også velkjente i teknikken. Se Curtiss et al.,
J. Clin. Invest, 72.:1427-38 (1983). Enn videre er fremgangsmåter for fremstilling av reseptorer ved anvendelse av protein og polypeptid-immunogener også velkjente i teknikken.
F.eks. beskriver Curtiss et al., supra, en fremgangsmåte for fremstilling av hybridomer som danner glucitollysin-spesifikke, monoklonale antistoffer (reseptorer) ved anvendelse av immunogener som inneholder glucitollysin-rester. To hybridomer fremstilt ved denne fremgangsmåte, som utskiller monoklonale antistoffer som immunreagerer med glucitollysin-hemoglobin, men ikke med glucohemoglobin eller hemoglobin, ble deponert hos American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, i overensstemmelse med Budapesttraktaten den 20. september 1983, under de følgende ATCC-deponeringsnummere:
Monospesifikke antisera som immunreagerer med glucitollysin-hemoglobin, men viser liten kryss-reaktivitet med hemoglobin som ikke inneholder glucitollysin, kan også fremstilles ved anvendelse av velkjente immunabsorpsjons-teknikker. F.eks. kan glucitollysin-hemoglobin erstattes med HbA^c som immunogen ved fremgangsmåten beskrevet i U.S. patentskrift nr. 4.247.533, hvis patent er innbefattet heri ved referanse. Antistoffer som er immunspesifikke for glucitollysin-hemoglobin, kan deretter isoleres; dvs. at et monospesifikt antiserum kan fremstilles ved anvendelse av ikke-redusert hemoglobin og/eller glucohemoglobin som et immunabsorpsjonsmiddel for å absorbere kryss-reaktive antistoffer. Forsøksfremgangsmåtene for å kontrollere fremstillingsprosessen, anvender glucitollysin-hemoglobin som mål-antigen.
(g) Immunreaksjonsblandingen vedlikeholdes under
biologiske forsøksbetingelser i en på forhånd bestemt tidsperiode, slik som 10 minutter til 16-20 timer, fortrinnsvis 15 minutter til 30 minutter, som er tilstrekkelig for reseptorene til å immunologisk binde seg til det tilstedeværende glucitollysin-hemoglobin og danne en immunreaktant.
Biologiske forsøksbetingelser er de som vedlike-holder aktiviteten av reseptorene og av glucitollysin-hemoglobinet som skal mengdebestemmes. Disse betingelser innbefatter et temperaturområde fra 4°C til 45°C, et pH-verdi-område fra 5 til 9 og en ionestyrke som varierer fra ionestyrken i destillert vann til ionestyrken i en molar natriumklorid. Fremgangsmåter for optimalisering av slike betingelser er velkjente i teknikken. (h) Mengden av immunreaktant som dannes i immun-reaks jonsblandingen, bestemmes deretter, og derved bestemmes mengden av stabilt glucohemoglobin som er til stede i prøven.
Mengdebestemmelse av den dannede immunreaktant, enten direkte eller indirekte, kan gjennomføres ved fremgangsmåter for mengdebestemmelse som er velkjente i teknikken. F.eks. kan et homogent mengdebestemmelsessystem anvendes slik som de beskrevet i U.S. patentskrifter nr. 4.536.479, nr. 4.233.401, nr. 4.233.402 og nr. 3.966.345.
I foretrukne praktiske utforminger inneholder reseptorene ifølge trinn (g) som er nevnt ovenfor, en indikatorgruppe eller et merke som er i stand til å signalisere tilstedeværelsen av den merkede reseptor i en immunreaktant. Fremgangsmåter for bestemmelse av tilstedeværelsen og mengden av merkede reseptorer avhenger av det anvendte merke, slike merker og fremgangsmåter for mengdebestemmelse er velkjente i teknikken.
Merkingen av proteinaktige, spesifikke bindings-midler slik som reseptorer, er velkjente i teknikken. F.eks. kan reseptorer som er dannet av hybridomer, merkes ved metabolsk inkorporering av radioisotop-inneholdende aminosyrer som tilveiebringes som en bestanddel i vevs-kulturmediet. Se f.eks. Galfre et al., Meth. Enzymol. 73, 3-46 (1981) . Fremgangsmåtene for proteinkonjugering eller kobling gjennom aktiverte, funksjonelle grupper) er spesielt anvendelige. Se f.eks. Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., vol. 8, suppl. 7, 7-23 (1978) og U.S. patentskrift nr. 4.493.795, hvilke teknikker er innbefattet heri ved referanse. I tillegg kan en sete-styrt koblingsreaksjon ut-føres slik at merket ikke i vesentlig grad forstyrrer immunreaksjonen av den andre reseptor med dens mål-antigen. Se f.eks. Rodwell et al., Biotech. 3, 889-894 (1985).
Merkingsmidlet kan være et fluorescerende merkingsmiddel som binder seg kjemisk til antistoffer eller anti-gener uten at de denatureres under dannelse av et fluoro-krom (fargestoff) som er et anvendelig immunfluorescerende sporstoff. Passende fluorescerende merkingsmidler er fluorokromer som fluoresceinisocyanat (FIC), fluorescein-isothiocyanat (FITC), 5-dimethylamin-l-nafthalensulfonyl-klorid (DANSC), tetramethylrhodamin-isothiocyanat (TRITC), lissamin og rhodamin 8200 sulfonylklorid (RB 200 SC). En beskrivelse av fremgangsmåter for immunfluorescensanalyse beskrives i DeLuca, "Immunofluorescens Analysis", i Antibody As a Tool, Marchalonis, et al., John Wiley & Sons, Ltd., s. 189231 (1982), som er innbefattet heri ved referanse .
I foretrukne praktiske utforminger er indikator-gruppen et enzym som pepperrotperoxydase (HRPO) eller glucoseoxydase. I slike tilfeller hvor den viktigste indikatorgruppe er et enzym som HRPO eller glucoseoxydase, fordres det tilleggsreagenser for å visualisere det faktum at et reseptor-antigenkompleks (immunreaktant) er dannet. Slike tilleggsreagenser for HRPO innbefatter hydrogen-peroxyd (H202) og en oxydasjons-fargeforløper som diamino-benzidin eller o-fenylendiamin (OPD). Et tilleggsreagens som er anvendelig sammen med glucoseoxydase, er 2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-G-sulfonsyre) (ABTS).
Radioaktive grunnstoffer er også anvendelige som merkingsmidler og anvendes illustrerende heri. Et karakteristisk radiomerkingsmiddel er et radioaktivt grunnstoff som danner gammastråleemisjoner. Grunnstoffer som selv avgir gammastråler, slik som 124I, 125I, 128I, 131I, 132I
og <5>^Cr, representerer en klasse av gammastråle-emitterende indikatorgrupper som er radioaktive grunnstoffer. Spesielt
125
foretrukket er I. En annen gruppe av anvendelige merkingsmidler er de grunnstoffer som "^C, "^F, "^0 og "<*>"<3>N,
som selv sender ut positroner. De således utsendte positroner danner gammastråler ved sammenstøt med elektroner som er til stede i forsøksblandingen. En beta-emitter som <111> In eller <3>H, er også anvendelig.
Indikatormidlet kan kobles direkte til et reseptormolekyl som er anvendelig i den foreliggende oppfinnelse, eller det kan bestå av et adskilt molekyl. Indikatormidlet kan være et adskilt molekyl, slik som antistoffer som binder seg til anvendelige reseptormolekyler som geit-
eller kanin-anti-mus-antistoffer. Staphylococcus aureus protein A kan også anvendes som en adskilt, molekylær indikator eller merkingsmiddel hvor hele eller i det vesent-lige hele reseptormolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes; dvs. hvor molekyler som inneholder delen av Fc-områdene i reseptormolekyler som er bundet av protein A, anvendes. Ved slike anvendelser inneholder protein A selv et merke slik som et radioaktivt grunnstoff eller et fluorokromt fargestoff.
I en spesielt foretrukken praksis utføres den ovenfor beskrevne mengdebestemmelse som en heterogen, fast fase mengdebestemmelse, i hvilken det glucitollysin-inneholdende antigen bindes eller festes til en fast fase-matriks under dannelse av et fast fase-fundament. Antigenet kan bindes eller festes til den faste matriks ved hjelp av et antall kjemiske eller fysikalske midler. Selv om binding som ved adsorpsjon eller immunreaksjon er bare ett av midlene for festing, anvendes ordene "binde" og "feste"
og deres forskjellige grammatikalske varianter vekslende heri.
Fysikalsk binding ved adsorpsjon av antigenet til veggene av mikrotiterplatebrønner som anvendes som fast fase-matrikser, beskrives i det følgende. Midler for kjemisk binding innbefatter binding av et første antistoff som binder seg til en hemoglobinepitop som, når den er bundet, ikke vesentlig forstyrrer immunologisk binding av glucitollysin-epitoper ved reseptormolekylene. Denne ana-lysefremgangsmåte blir vanligvis henvist til som en "sandwich"-analyse. Et annet middel for kjemisk binding anvender et vannoppløselig carbodiimid-reagens som 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydroklorid, for å danne et amid eller en ester mellom en carboxylsyre i matriksen, og hhv. en amino- eller en hydroxylgruppe i reseptoren, eller omvendt. Ytterligere midler for kjemisk binding anvender flerfunksjonene reagenser som glutar-aldehyd eller cyanurinsyreklorid, som også er velkjente.
Karakteristiske, faste matrikser som er anvendelige
i de ovenfor beskrevne fremgangsmåter, er velkjente i teknikken og innbefatter en fast matriks som en 96-brønners mikrotiterplate solgt under betegnelsen "Falcon Microtest III Flexible Assay Plates", eller en mikrotiterstrimmel som inneholder 12 brønner i en rad, slik som de strimler som selges under betegnelsen "Immulon" I og II. Mikro-titerstrimmelen eller -platen er laget at et klart,
plastisk materiale, fortrinnsvis polyvinylklorid eller polystyren. Alternative faste matrikser for anvendelse i en ovenfor beskrevet fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefatter polystyrenkuler, 1 mikron til 5 millimeter i diameter, polystyrenrør, stenger eller røre-pinner av en passende størrelse; og polystyrenlatex hvor polystyrenpartiklene er av en størrelse på 1 mikron og hvor de kan adskilles ved sentrifugering fra resten av latexen.
Den faste matriks kan også være laget en av mengde materialer som kryss-bundet dextran, f.eks. "Sephadex"
G-25, -50, -100 og -200, agarose og kryss-bundet agarose, f.eks. "Sepharose" 6B, CL6B, 4B og CL46.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for mengdebestemmelse kan anvendes for å bestemme mengden av enhver bestemt glycitollysin-hemoglobin-art som er til stede i en ønsket hemoglobinprøve, ved anvendelse av reseptorer som er immunspesifikke for den ønskede glycitollysinart.
D. Diagnostiske systemer
Den foreliggende oppfinnelse angår også et diagnostisk system som foreligger i form av et sett, og som er anvendelig for utførelse av en ovenfor beskrevet mengdebestemmelse. Systemet inneholder et stort antall pakninger.
En første pakning inneholder en fast fase-matriks som ovenfor beskrevet. Denne matriks er fortrinnsvis en mikrotiterplate eller strimmel av plast som inneholder et stort antall brønner, f.eks. 96 eller 12. På disse brønn-overflater utføres den ovenfor beskrevne mengdebestemmelse.
En andre pakning inneholder en på forhånd bestemt mengde av det vannforenlige borhydrid-reduksjonsmiddel. Dette reagens foreligger vanligvis som et tørt pulver.
En tredje pakning inneholder en kjent mengde av passende glycitollysin-spesifikke reseptormolekyler, fortrinnsvis glucitollysin-spesifikke reseptorer, som de som utskilles av hybridomene med ATCC-deponeringsnummere HB 8356 og HB 8358. Disse reseptormolekyler foreligger vanligvis som en vandig blanding eller som et frysetørret pulver. I foretrukne, praktiske utforminger foreligger reseptorene bundet til en indikatorgruppe eller et merke som beskrevet tidligere.
En fjerde pakning inneholder en på forhånd bestemt mengde fthalsyre eller bifthalsyre. Syren kan også fore-ligge oppløst i et vandig medium eller som et tørt, fast stoff.
Foretrukne, praktiske utforminger innbefatter også
i tillegg en pakning som inneholder en glycitollysin-hemoglobin-art som immunreagerer med de tilveiebrakte reseptorer. Eller fortrinnsvis inneholder pakningen glucitollysin-hemoglobin med en kjent prosentdel glucitollysin til anvendelse som en standard eller en kontroll. Ytterligere pakninger som også kan innbefattes
i systemet, innbefatter pakninger som inneholder buffer-salter eller oppløsninger som PBS, et adskilt pakket indikatormiddel som merket protein A eller merkede anti-reseptor-antistoffer, adskilt pakkede visualiserings-reagenser for et enzym-indikeringsmiddel som hydrogen-peroxyd og en oxyderende fargeforløper og ytterligere kontroller.
Det er underforstått at hver pakning som er innbefattet i systemet, har en innholdsmengde som er tilstrekkelig for å utføre en mengdebestemmelse, innbefattende passende kontroller. Fortrinnsvis inneholder hver pakning en mengde som er tilstrekkelig for å utføre et stort antall mengdebestemmelser.
De følgende eksempler er tilsiktet å illustrere, men ikke begrense, den foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 1: Hemoglobinprøver
Hemogloginprøver ble erholdt fra 118 diabetes-pasienter, av både hannkjønn og hunnkjønn, med variasjon i alder mellom 18 og 88 år. Prøver ble også erholdt fra 35 normale, voksne personer (normoglucemiske), både av hannkjønn og hunnkjønn, med alder mellom 24 og 52 år. Prøvene ble erholdt fra endocrinologi og diabetes-klinikkene Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, California, og Kaiser Permanente, San Diego, California.
Blodprøver ble innsamlet i rør som inneholdt ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA) som et antikoagulerings-middel og ble utsatt for sentrifugering ved 12.000-13.OOOxg i 3 minutter i en Beckman mikrofuge 12 for å danne en pellet av sammenpakkede, røde blodceller (RBC) og en plasma-fraksjon. Plasmafraksjonen ble kassert, og den erholdte hemoglobinprøve for mengdebestemmelse ble vanligvis tilveiebrakt som enten 10 eller 15 mikroliter av pelleten (sammenpakkede, røde blodceller).
For å bestemme antall milligram hemoglobin pr. mikroliter av en sammenpakket RBC-pellet, erholdt som beskrevet ovenfor, ble 1 volumdel av en pellet blandet med enten 1 volum eller 3 volumer av "Isoton III" for å danne hhv. 1:2 og 1:4 pelletfortynninger. Hver pelletfortynning ble deretter analysert med henblikk på hemoglobinkonsentra-sjon ved anvendelse av en modell "S-Plus VI" Coulter-teller i henhold til fabrikantens instruksjoner. Det tilstedeværende hemoglobin i fortynningene ble omdannet til cyanmethemoglobin ved anvendelse av Drabkins reagens, og den tilstedeværende mengde ble bestemt spektrofotometrisk ved hjelp av absorbansen ved 540 nanometer (nm).
Det gjennomsnittlige antall milligram (mg) hemoglobin (Hb) pr. mikroliter (ul) sammenpakket RBC-pellet ble funnet å være 0,294 mg Hb/ul. Denne verdi ble imidlertid for å lette utførelsen av beregninger, avrundet til 0,3 mg Hb/ul for alle bestemmelser av forhold basert på hemoglobinprøver tilveiebrakt som et kjent volum av en sammenpakket pellet av røde blodceller.
Når hemoglobinprøver ble tilveiebrakt som et kjent blodvolum, ble den tilstedeværende mengde hemoglobin bestemt ved anvendelse av en gjennomsnittlig verdi på 155 mg Hb/ml helt blod for prøver erholdt fra menn, og 135 mg Hb/ml for blodprøver fra kvinner.
Eksempel 2: Fremstilling, rensing og merking av reseptorer
Hybridomet med ATCC-deponeringsnummer HB 8356 danner det monoklonale antistoff G6C9 som beskrevet i Curtiss et al., J. Clin. Invest. 7_2_:1427-38 (1983).
Ascites tumor-væsker som inneholder G6C9-reseptormolekyler, ble erholdt fra 10 uker gamle Balb/c-mus som hver ble preparert med 0,3 ml mineralolje og injisert intraperi-tonealt med 3-50x10 HB 8356-celler. Den gjennomsnittlige tid for utvikling av ascites var 12 dager. Etter klaring ved sentrifugering ved 15.000xg i 1 time ved 4°C ble ascites tumor-væsker slått sammen og lagret i frossen til-stand ved -20°C.
G6C9-reseptorer ble renset ved å utsette ascites
tumor-væskene for rask protein-væskekromatografi (FPLC)
på en Pharmacia "Mono Q HR 5/5" anionbytterkolonne i et Pharmacia "PFLC-System" under anvendelse av en 0-0,5 NaCl-gradient i 10 mM Tris, pH 8,0, og ved å følge bruksanvis-ningene som fulgte med kolonnen.
De rensede G6C9-reseptormolekyler ble koblet til pepperrotperoxydase ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i Nakane et al., J. Histochem. Cytochem., 22:1084-1089 (1974). Disse reseptorer henvises i det følg-ende til som HRPO-G6C9-reseptorer.
Eksempel 3: Fremstilling av glucosylerte addukter
De følgende proteiner og forløpere ble utsatt for glucosylering og/eller reduksjon: poly-L-lysin, poly-L-valin, alfa-T-Boc-lysin, renset, humant hemoglobin og glucitollysin fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet av Schwartz et al., Arch.-Biochem. Biophys., 181:542-549
(1977) .
Glucosylerte og reduserte addukter henvises til som glc-RED-addukter. glc-RED-adduktene ble fremstilt ved blanding av 2 milliliter (ml) av en oppløsning som inneholdt 15 milligram pr. milliliter (mg/ml) av de forskjellige ovenfor beskrevne proteiner og forløpere, med 2 ml 240 mM glucose (Sigma) i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) og 2 ml av 37,5 mg/ml NaCNBH^ i PBS, pH 7,4. De resulterende blandinger ble vedlikeholdt i forseglede glassrør (16 x 100 mm) i 120 timer ved 37°C. Adduktene ble deretter over-ført til dialyseposer ("Spectraphor", molekylær utelukk-else 3.500 mw) og grundig dialysert mot PBS i 72 timer ved 4°C, justert til en endelig konsentrasjon på 5 mg/ml, og lagret ved 4°C.
Glucosylerte, men ikke-reduserte adduktkontroller (glc-NR), ble fremstilt ved erstatning av 2 ml PBS med NaCNBHg ifølge den ovenfor beskrevne fremgangsmåte. Ikke-glucosylerte, reduserte kontroller (RED-addukter) ble fremstilt ved erstatning av 2 ml PBS med 240 mM glucose ifølge den ovenfor beskrevne fremgangsmåte.
Eksempel 4: Bestemmelse av antistoffspesifisitet ved konkurrerende hemning
glc-RED-, glc-NR-og RED-adduktene fremstilt i eksempel 3, ble fortynnet til konsentrasjoner varierende fra 200 mikrogram pr. milliliter (ug/ml) til 0,39 ug/ml i PBS som inneholdt 10% normalt geiteserum (NGS). 500 mikroliter (ul) av de forskjellige fortynninger ble deretter blandet i glassrør med 500 yl av HRPO-G6C9-reseptorene fremstilt i eksempel 2, (fortynnet 1:150 i PBS inneholdende 10% NGS), for å danne konkurrerende immunreaksjonsblandinger. Blandingene ble vedlikeholdt i 1 time ved 37°C for å tillate reseptorene å binde immunologisk enhver mengde glucitollysinrest-inneholdende eller ikke-glucitollysin-inneholdende, men kryss-reaktive epitoper, og danne en flytende fase-immunreaktant.
De vedlikeholdte, konkurrerende immunreaksjonsblandinger ble deretter analysert for å bestemme mengden av ikke-bundne HRPO-G6C9-reseptorer. Dette ble gjennomført ved anvendelse av fast fase-tilfestet glucitollysin-hemoglobin som et mål, eller ved å innfange antigen i en ELISA.
Fast fase-tilfestet glucitollysin-hemoglobin ble fremstilt ved først å blande 0,240 ml av en sammenpakket RBC-pellet fremstilt i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ved anvendelse av blodet fra en diabetes-pasient, med 15 ml destillert vann inneholdende 0,05 mM fthalsyre (en volumfortynning på 1:62,5). Den resulterende syrereaksjonsblanding ble vedlikeholdt i 15 minutter ved 3 7°C for å danne et hemolysat.
Deretter ble 50 mikroliter av hemolysatet blandet med 50 mikroliter av 400 mM NaBH^, i brønnene på en mikrotiterplate (fast matriks). Den resulterende reduksjons-reaks jonsblanding ble vedlikeholdt i 15 minutter ved 37°C for å tillate dannelse av glucitollysin-hemoglobin som ved slutten av denne vedlikeholdstid ble festet til den faste fase-matriks under dannelse av fast fase-tilfestet glucitollysin-hemoglobin (fast fundament), og en flytende fase inneholdende ureagert borhydrid og resten av reduksjons-reaksjonsblandingen. De faste og flytende faser i den resultererende blanding ble adskilt. De faste fundamenter dannet ved det adsorberte glucitollysin-hemoglobin festet til brønnveggene av fast matriks, ble deretter vasket 4 ganger med 350 ul PBS med innhold av 0,05% "Tween" 20 tpolyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat] under dannelse av isolert fast fase-tilfestet glucitollysin-hemoglobin.
100 ul av hver av de vedlikeholdte HRP0-G6C9/addukt-konkurrerende immunreaksjonsblandinger ble deretter blandet sammen med fast fase-tilfestet glucitollysin-hemoglobin.
Den således dannede andre væske/fast fase-immunreaksjonsblanding ble vedlikeholdt i 15 minutter ved 37°C for å tillate de antistoffmolekyler som ikke hadde immunreagert med en addukt-hemmer eller en kontroll, å immunologisk binde fast fase glucitollysin-hemoglobinet og danne en fast fase-tilfestet immunreaktant.
De faste og flytende faser ble igjen adskilt, og
de fast fase — tilfestede immunreaktanter som dannet seg,
ble videre adskilt fra de flytende faser ved dekantering og ved vask av hver brønn 4 ganger med vaskeoppløsning (PBS inneholdende 0,05% "Tween" 20). Mengden av den dannede fast fase-tilfestede immunreaktant ble deretter bestemt ved tilblanding av 100 ul nylig tillaget HRPO sub-stratoppløsning [0,0125% H202 og 0,67 mg/ml o-fenylendiamin (OPD) i destillert vann] i hver brønn. Farge fikk utvikle seg ved romtemperatur (20 til 25°C) i 5 minutter. Den substratomdannende (fargedannende) reaksjon ble
deretter stoppet ved tilblanding av 50 ul 4 N svovelsyre i hver brønn. Den optiske tetthet (O.D.) av oppløsningene ble bestemt ved en bølgelengde på 490 nm under anvendelse av en "Dynatech" MR600 mikrotiterplate-avleser.
Resultatene av denne undersøkelse er illustrert i figurene 2A, B og C. Disse resultater angir at de reduserte, men ikke-glucosylerte addukter (figur 2A) og de glucosylerte, men ikke-reduserte addukter (figur 2B) ikke hemmet bindingen av HRPO-G6C9 til det fast fase-tilfestede glucitollysin-hemoglobin. Som illustrert i figur 2C, var imidlertid de glucosylerte og reduserte proteiner og forløpere som inneholder lysin; dvs. glucitollysin, meget effektive inhibitorer av immunreaksjonen mellom HRPO-G6C9 og fast fase-tilfestet glucitollysin-hemoglobin, mens dette ikke var tilfelle med glucosylert og redusert poly-L-valin. Fordi det felles, strukturelle trekk for adduktene som hemmet dannelsen av fast fase-immunreaktanter var tilstedeværelsen av en glucitollysinrest, viser resultatene av denne undersøkelse at G6C9-reseptorer immunreagerer med en glucitollysin-inneholdende epitop når denne epitop er til stede som fast fase-tilfestet glucitollysin-hemoglobin.
Eksempel 5: Reduksjonsoptimalisering
a. Vannforenlige reduksjonsmidler
Som tidligere beskrevet, er glucitollysin den reduserte hexose-alkoholform av glucose kovalent bundet til epsilon-aminogruppen i lysin. De påfølgende undersøkelser ble utført for å undersøke forskjellige vannforenlige borhydrid-reduksjonsmidler med henblikk på deres evne til å danne glucitollysinrester på hemoglobin under forskjellige betingelser.
Hemoglobinprøver ble tilveiebrakt som 10 ul av en sammenpakket RBC-pellet, fremstilt som beskrevet i eksempel 1 (3 mg hemoglobin) ved anvendelse av blod fra en normal person og en diabetisk person. Prosentdelen glycosylert hemoglobin i hver prøve ble bestemt ved anvendelse av det kommersielt tilgjengelige "Gly-Affin" GHb-mengdebestemmelsessystem og ble funnet å være 6,3% i den normale prøve og 8,9% i den diabetiske prøve. Således inneholdt den diabetiske prøve 1,4 ganger så mye glycosylert hemoglobin som den normale prøve. Hver av prøvene ble blandet med 615 ul av enten destillert vann eller 0,05 M fthalsyre. Dette dannet blandinger som inneholdt hemoglobin med en konsentrasjon på 4,8 mg/ml og, der hvor syre ble anvendt, et forhold på minst 10 mikromol syre pr. milligram hemoglobin.
De dannede blandinger ble vedlikeholdt i 15 minutter ved 37°C. I løpet av denne tidsperiode ble vesentlig alle de tilstedeværende, røde blodceller i hver blanding lyset, som derved frigjorde det inneholdte hemoglobin i oppløsning og under dannelse av et hemolysat.
Deretter ble 50 pl av hvert hemolysat (0,24 mg hemoglobin) blandet i en mikrotiterplatebrønn med 50 mikroliter av forskjellige konsentrasjoner av NaBH^ eller KBH^ under dannelse av reduksjons-reaksjonsblandinger. Disse blandinger ble vedlikeholdt i 15 minutter ved 37°C. I løpet av denne tidsperiode ble hemoglobin-lysinrestene med glucose kovalent bundet til deres epsilon-aminogrupper, redusert under dannelse av glucitollysin-rester. I tillegg ble det dannede glucitollysin-hemoglobin tilfestet ved adsorpsjon til veggene av mikrotiterplate-brønnen; dvs. at fast fase-bundet glucitollysin-hemoglobin ble dannet.
De faste og flytende faser ble adskilt ved dekantering. Hver av brønnene ble deretter vasket 4 ganger med vaskeoppløsning for videre å adskille ikke-reagert borhydrid fra det fast fase-tilfestede (mikrotiterplate-brønn-bundet) glucitollysin-hemoglobin.
Hver brønn ble deretter tilblandet 100 mikroliter pepperrotperoxydase-merkede G6C9 (HRPO-G6C9) reseptorer erholdt i eksempel 2 under dannelse av en immunreaksjonsblanding. Denne blanding ble vedlikeholdt i 15 minutter ved 37°C, derved tillates de merkede reseptorer å immunologisk binde seg til det tilstedeværende fast fase-tilfestede (mikrotiterplatebrønn-bundne) glucitollysin-hemoglobin under dannelse av en fast fase-tilfestet (mikro-titerplatebrønn-bundet) immunreaktant. Ikke-immunreagert (ikke-bundet) HRPO-G6C9 ble fjernet fra brønnene ved dekantering etterfulgt av 5 ganger vask med vaskeoppløsning. Mengden av den dannede fast fase-bundne immunreaktant ble deretter bestemt som beskrevet i eksempel 4.
Resultatene av denne undersøkelse er illustrert i figurene 3A og B og viser flere forhold av interesse. For det første, som vises i både figur 3A og 3B, er det ingen vesentlig forskjell mellom resultatene erholdt ved anvendelse av enten natrium- eller kalium-borhydrider som det vannforenlige borhydrid-reduksjonsmiddel.
For det andre viser figur 3A at reduksjon (glucitollysin-dannelse) i fravær av syre som ventet danner et større antall reseptorbundne glucitollysinrest-inneholdende epitoper i prøven som inneholder den større mengde glucohemoglobin; dvs. den diabetiske prøve. Når disse resultater sammenlignes med de erholdte resultater når reduksjoner ble utført under tilstedeværelse av syre (figur 3B), vises det imidlertid at et større antall reseptorbundne glucitollysinrester ble dannet i begge hemoglobinprøver i forhold til det antall som ble dannet under fravær av fthalsyre. I tillegg vises det en større forskjell mellom antall reseptorbundne glucitollysin-rester i de normale og de diabetiske prøver når reduksjon ble utført under tilstedeværelse av fthalsyre (figur 3B), sammenlignet med verdiene når reduksjonen ble utført under fravær av denne syre (figur 3A). Disse to resultater angir at tilstedeværelsen av fthalsyre uventet potensierer evnen til et vannforenlig borhydrid-reduksjonsmiddel å danne glucitollysinrest-inneholdende epitoper, og likeledes å lyse de røde blodceller og fjerne labilt glucohemoglobin.
Endelig, når resultatene i figur 3A og figur 3B sammenlignes, vises det at når hemoglobinprøven ble blandet med fthalsyre i et forhold på minst 10 mikromol syre pr. milligram hemoglobin, ble reduksjonsreaksjonen potensiert selv om hemoglobinet ble blandet med borhydrid i et så lavt forhold som minst 2,6 mikromol borhydrid pr. milligram hemoglobin.
De ovenfor beskrevne resultater står i motsetning til det som er kjent i teknikken, og var derfor uventet. Som tidligere beskrevet, viser erfaringene i kjent teknikk at den totale mengde glucohemoglobin i en hemoglobinprøve erholdt fra røde blodceller, er bestemt ved summen av de labile og de stabile glucohemoglobinfraksjoner. Ifølge Bisse et al., Diabetes 3_1: 630-633 (1982), blir den labile fraksjon uttømt fra en hemoglobinprøve ved behandling med bifthalsyre; dvs. at den mengde glucohemoglobin som kan mengdebestemmes, avtar i en bifthalsyre-behandlet prøve. Derfor viser erfaringene fra teknikken at, i en mengdebestemmelse som måler mengden av glucohemoglobin i en prøve, burde det signal som dannes av en prøve hvor dets labile fraksjon er uttømt, være mindre enn det signal som dannes av en sammenlignbar, ikke-uttømt prøve.
b. Reduksjons- reaksjonsblandings- vedlikeholdsperiode
Syrereaksjonsblandinger ble fremstilt ved anvendelse av hemoglobin tilveiebrakt som blodprøver fra både en diabetisk og en normal kvinne. Fthalsyrekonsentrasjonen i hver blanding var konstant 0,05 M. Imidlertid varierte hemoglobinkonsentrasjonen over et område på 27,0 mg/ml til 0,270 ug/ml, som derved ga millimol syre/mg Hb-forhold varierende fra 1,85 til 185,2. Syrereaksjonsblandingene ble alle vedlikeholdt i 15 minutter ved 37°C under dannelse av hemolysater.
Deretter ble reduksjons-reaksjonblandinger fremstilt i to eksemplarer ved å sammenblande 50 mikroliter av hvert hemolysat og 50 mikroliter av 400 mM NaBH^, dermed dannes millimol borhydrid/mg Hb-forhold varierende fra 0,0148 til 1,481. En serie av reduksjons-reaksjonsblandinger ble vedlikeholdt i 15 minutter og den andre i 30 minutter, begge ved 37°C. Prøvene ble deretter adskilt fra det ureagerte borhydrid, og de resterende bestanddeler i reduksjons-reaksjonsblandingen, etterfulgt av vask, og mengden av glucitollysin-hemoglobin ble bestemt som beskrevet i eksempel 4.
Som vist i figur 4, angir resultatene av denne undersøkelse at en reduksjons-reaksjons-vedlikeholdsperiode på enten 15 eller 30 minutter danner målbare mengder glucitollysin-hemoglobin i både diabetiske og normale prøver ved alle undersøkte hemoglobinkonsentrasjoner. Det bør også bemerkes at de optimale forhold for dannelse av en mengde glucitollysin som kan bestemmes, ble funnet å
være 46,3 millimol syre/mg Hb for syrereaksjonsblandingene og 0,37 millimol borhydrid/mg Hb for reduksjons-reaksjonsblandingene når hemoglobin var til stede i konsentrasjoner på 1,08 mg/ml og 0,54 mg/ml i de respektive reaksjoner.
Eksempel 6: Uttømming av labilt glucohemoglobin
a. Syrereaksjonsblandinger
Dissosiasjonen av labilt glucohemoglobin til glucose og hemoglobin er innberettet å være syrekatalysert i opp-løsninger med en pH-verdi på 5. Bisse et al., Diabetes, 3_1:630-633 (1982). For å bestemme hvorvidt den innbe-rettede pH-avhengige stabilitet av labilt glucohemoglobin påvirkes av typen anvendt syre, ble oppløsninger som inneholdt enten fthalsyre, citrat, eddiksyre, fosfat, D(+)-glucosamin, alfa-ketoglutarsyre, oxaleddiksyre, dikaliumoxalat, ravsyre eller pyrodruesyre, fremstilt med en konsentrasjon på 0,05 M og ved en pH-verdi innen området 4 til 5. Hemoglobinprøver tilveiebrakt som 10 mikroliter av en sammenpakket RBC-pellet, ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1 fra blod erholdt fra en diabetisk og en normal person. En diabetisk og en normal hemoglobinprøve ble begge blandet med 615 mikroliter av hver av de ovenfor beskrevne, sure oppløsninger under dannelse av syrereaksjonsblandinger, eller med 615 mikroliter destillert vann som en kontroll.
I tillegg ble sammenpakkede RBC-pellets fremstilt fra røde blodceller fra både de diabetiske og de normale personer hvor blodcellene var inkubert over natten
(18 timer) i isotonisk saltoppløsning. 10 mikroliter fra hver av disse pellets ble blandet med 615 mikroliter av enten 0,05 M fthalsyre eller destillert vann som en kontroll.
De således dannede syrereaksjonsblandinger og kontrolloppløsninger ble vedlikeholdt ved 37°C i 15 minutter under dannelse av hemolysater. Glucitollysin-hemoglobin ble deretter dannet og mengdebestemt ved anvendelse av 50 mikroliter aliquoter av hvert av hemolysatene, NaBH^ og HRPO-G6C9-reseptorer, som beskrevet i eksempel 4.
Resultatene av denne undersøkelse er illustrert i figur 5. Disse resultater angir at ved å reagere glucohemoglobin med fthalsyre forut for reduksjon med borhydrid, potensieres vesentlig dannelsen av glucitollysinrester sammenlignet med de andre undersøkte syrer.
b. Syrekonsentrasjon
For å undersøke virkningen av fthalsyrekonsentrasjon innen pH-området 4-5, på dannelsen av glucitollysin-hemoglobin og på utførelse av mengdebestemmelse, ble syrereaksjonsblandinger med fthalsyrekonsentrasjoner på enten 0,05 M eller 0,025 M fremstilt med hemoglobin-konsentras joner på 75, 50, 37,5, 30, 25 eller 21,4 milligram hemoglobin pr. milliliter. I blandingene som inneholdt 0,05 M fthalsyre, varierte således forholdsområdet for millimol fthalsyre pr. milligram hemoglobin fra 0,66 til 2,34. Likeledes var forholdsområdene i blandingene som inneholdt 0,025 M fthalsyre, fra 0,33 til 1,17. Hemoglobin ble tilveiebrakt som et på forhånd bestemt volum av en sammenpakket RBC-pellet fremstilt fra blodet til en diabetisk person, som beskrevet i eksempel 1.
De dannede syrereaksjonsblandinger ble vedlikeholdt i 15 minutter ved 37°C under dannelse av hemolysater. Glucitollysin-hemoglobin ble deretter dannet og mengdebestemt ved anvendelse av 50 mikroliter av hvert av hemolysatene, NaBH4 og HRPO-G6C9-reseptorer, som beskrevet i eksempel 4.
Figur 6 illustrerer resultatene av denne under-søkelse. Disse resultater angir at både 0,05 M og 0,025 M fthalsyre-reaksjonsblandingene potensierte dannelsen av glucitollysinrest-inneholdende epitoper bundet av merkede reseptorer, når forholdet av fhtalsyre pr. milligram hemoglobin var mellom 1,00 og 2,34.
I tillegg viser resultatene i figur 6 at reaksjon med fthalsyre alene ikke danner en mengde glucitollysin som kan bestemmes.
c. Syre pH- verdi
Lageroppløsninger inneholdende 0,05 M fthalsyre med pH-verdier på 3,5, 4,5, 5,5 og 6,5 ble fremstilt. Fire syrereaksjonsblandinger ble deretter fremstilt ved anvendelse av hver standardoppløsning. Hemoglobinprøver tilveiebrakt som 10 mikroliter sammenpakkede RBC-pellets, erholdt som i eksempel 1 ved anvendelse av hver av to diabetiske og to normale blodprøver, ble blandet med 615 mikroliter av hver standardoppløsning. De dannede syrereaksjonsblandinger ble vedlikeholdt i 15 minutter ved 37°C under dannelse av hemolysater. Glucitollysin-hemoglobin ble deretter dannet og mengdebestemt ved anvendelse av 50 mikroliter av hvert hemolysat, NaBH4 og HRPO-G6C9-reseptorer, som beskrevet i eksempel 4.
Figur 7 illustrerer resultatene av denne under-søkelse og viser at det største antall glucitollysin-rester som kan bindes immunologisk, ble dannet i prøver utført på hemolysater som dannes ved anvendelse av fthalsyre med en pH-verdi på 3,5. Imidlertid var pH-verdien som danner den største signalforskjell (optisk tetthet), mellom de normale og de diabetiske prøver, 4,5. Videre dannet også anvendelsen av fthalsyreoppløsninger med pH-verdier på 5,5 og 6,5 målbare mengder glucitollysin-rester.
For å undersøke variabiliteten i pH-verdien av 0,05 M vandig fthalsyre ble fire 0,05 M oppløsninger fremstilt og deres ikke-justerte pH-verdier bestemt ved anvendelse av en Altex modell 3500 digitalt pH-meter i forbindelse med en kalomel "MicroProbe"-elektrode. De målte pH-verdier for de fire ikke-justerte oppløsninger varierte fra 4,13 til 4,5 med en gjennomsnittsverdi på 4,3.
d. Vedlikeholdstid for syrereaksjonsblandinger
Et formål med syrereaksjonstrinnet i mengdebestemm-elsesfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er å tømme den labile glucohemoglobinfraksjon (dissosiere det labile glucohemoglobin i hemoglobin og glucose) mens den stabile fraksjon vedlikeholdes. Virkningen av å variere vedlikeholdstidsperioden for syrereaksjonsblandingen ble derfor undersøkt.
Fire sett av syrereaksjonsblandinger ble undersøkt. Hvert sett inneholdt fire blandinger fremstilt ved blanding av en hemoglobinprøve fra hver av de to diabetiske og to normale, blodprøver fra kvinner, med 0,05 M fthalsyre som beskrevet i eksempel 6c. Et av syrereaksjonsblandings-settene ble deretter umiddelbart blandet med NaBH^ og videre behandlet og mengdebestemt som beskrevet i eksempel 4.
De resterende 3 sett ble vedlikeholdt i en tidsperiode på
5, 10 eller 15 minutter før de ble blandet med NaBH^ som i eksempel 4.
Resultatene av denne undersøkelse, som vist i
figur 8, angir at en økning i vedlikeholdstidsperioden for syrereaksjonsblandingen førte til dannelse av mindre målbar mengde glucitollysin i diabetisk prøve nr. 1, noe som således angir at denne prøve opprinnelig inneholdt en vesentlig mengde labilt glucohemoglobin. Vedlikeholdstiden på 15 minutter dannet også mindre målbar mengde glucitollysin i diabetisk prøve nr. 2 og normal prøve nr. 1, sammenlignet med tidsperioden på mindre enn 1 minutt. Disse resultater angir at en vedlikeholdstidsperiode for syrereaksjonsblandingen som er så kort som 5 minutter, kan føre til uttømming av den labile glucohemoglobinfraksjon i en hemoglobinprøve.
Eksempel 7: MengdebestemmeIsestemperatur
Hemolysater med hemoglobinkonsentrasjoner varierende fra 27 ug/ml til 1,35 ug/ml, ble fremstilt ifølge eksempel 5b ved anvendelse av blod fra diabetiske og normale kvinner. Hemolysatene ble deretter redusert og mengdebestemt enten ved romtemperatur (20-25°C) eller ved 37°C, som beskrevet i eksempel 4, under anvendelse av ved-likeholdsperioder på 30 minutter for reduksjonsreaksjonene og antistoffreaksjonene.
Figur 9 illustrerer at ettersom den påviste mengde glucitollysin-hemoglobin var ubetydelig høyere når reduksjons- og immunreaksjonsblandingene ble vedlikeholdt ved 37°C, ga dette ingen vesentlig forskjell mellom de erholdte resultater ved 37°C og de ved romtemperatur.
Eksempel 8: ELISA- evaluering
Selv om fremgangsmåten for optimalisering av dannelsen av den mengde glucitollysinrester på glucohemoglobin som kan bestemmes ved anvendelse av fthalsyre og borhydrid som beskrevet heri er anvendelig for ethvert immunbestemm-elsesformat, ble utførelseskarakteristikken av en ELISA
ved anvendelse av denne fremgangsmåte evaluert i detalj for å bestemme klinisk anvendelighet som beskrevet i det følg-ende. Det spesielle ELISA-format som ble evaluert, ble utført som følger: 10 mikroliter av en sammenpakket RBC-pellet fremstilt som beskrevet i eksempel 1 ved anvendelse av blod fra forskjellige normale og diabetiske personer, ble blandet med 615 ul 0,05 M kaliumbifthalat. Den således dannede syrereaksjonsblanding ble vedlikeholdt i 15 minutter ved 37°C under dannelse av et hemolysat. Deretter ble 50 mikroliter av hemolysatet pipettert over i hver av 3 NUNC "Irnmuno" I mikrotiterplatebrønner (flatbunnede polystyren-plater). 50 mikroliter 400 mM NaBH^ ble deretter tilblandet hver hemolysatprøve under dannelse av reduksjons-reaksjonsblandinger. De erholdte reduksjons-reaksjonsblandinger ble vedlikeholdt i 15 minutter ved 37°C under dannelse av glucitollysin-hemoglobin bundet til mikro-titerplatebrønnene. Mikrotiterplatebrønn-bundet glucitollysin-hemoglobin ble adskilt fra overskuddet av borhydrid ved dekantering og vasking av brønnene 4 ganger med 0,35 ml PBS inneholdende 0,05% "Tween" 20.
Mengden av brønn-bundet glucitollysin-hemoglobin ble deretter bestemt ved tilblanding i hver brønn av 6,100 ml HRPO-G6C9-reseptorene ifølge eksempel 2, fortynnet 1:300 i PBS-inneholdende 10% normalt geiteserum, under dannelse av en væske/fast fase-immunreaksjonsblanding. Immunreaksjonsblandingen ble vedlikeholdt i 15 minutter ved 37°C. De faste og flytende faser ble adskilt, og brønnene ble deretter vasket 5 ganger med 0,35 ml PBS (pH 7,4) inneholdende 0,05% "Tween" 20 for å adskille ikke-bundne reseptorer fra de fast fase-tilfestede immunreaktanter. HRPO-G6C9-reseptorer tilstedeværende som fast fase-tilfestede immunreaktanter, ble påvist ved anvendelse av OPD-substratoppløs-ningen som beskrevet i eksempel 4.
Glc-RED Hb-adduktet fremstilt i eksempel 3, ble anvendt som en intern standard (kalibrator) for ELISA. Standardoppløsninger ble fremstilt med varierende konsentrasjoner fra 380 ug/ml til 8 ug/ml Glc-RED hemoglobin Hb, fortynnet i 0,1 M natriumbicarbonatbuffer, pH 9,0, inneholdende 10% normalt geiteserum. For å frembringe en standard-kurve ble den ovenfor beskrevne ELISA utført ved anvendelse av 50 mikroliter av hver standardoppløsning istedenfor hemolysatet.
a. Gjenvinning
Gjenvinningsforsøk ble utført for å bestemme hvorvidt ELISA var i stand til nøyaktig å måle forskjellige mengder glucohemoglobin fra et diabetisk erythrocytt-hemolysat tilsatt til et hemolysat fra en normal person. Dette ble oppnådd ved fremstilling av et hemolysat fra en normal person med innhold av forskjellige prosentvis økende tilsetninger (spisspotensialer) av et hemolysat fra en diabetisk person.
Gjenvinning av den tilsatte mengde diabetisk glucohemoglobin til hemolysatet fra den normale person ble deretter bestemt ved anvendelse av den ovenfor beskrevne ELISA. Som vist i figur 10, viser de erholdte resultater
en lineær forbindelse over det undersøkte område av prosent-vise tilsetninger (spisspotensialer), noe som således angir en tilleggsforbindelse mellom mengden tilstedeværende glucohemoglobin i en prøve, og mengden av glucitollysin-hemoglobin bestemt ved ELISA.
b. Reproduserbarhet av ELISA- resultater Reproduserbarheten av ELISA ble bestemt ved forsøk med intra-mengdebestemmelse og inter-mengdebestemmelse.
Ved intra-mengdebestemmelser ble hemoglobinprøver fra
tre forskjellige personer analysert 60 ganger hver. Varia-sjonskoeffisienten blant de erholdte verdier for hver person varierte fra 1,6% til 6,4%.
Ved inter-mengdebestemmelser ble hemoglobinprøver fra tre forskjellige personer analysert ved 12 forskjellige anledninger. Reproduserbarheten for inter-mengdebestemmelsen ble bestemt å variere fra 8,3% til 10,4%.
Foreliggende oppfinnelse er beskrevet med hensyn på foretrukne, praktiske utforminger. Det vil være tydelig for fagmannen at modifikasjoner og/eller variasjoner av det fremlagte emneinnhold kan utføres uten å avvike fra opp-finnelsens område fremsatt heri.
Claims (10)
1. Fremgangsmåte for omdannelse av stabilt glucohemoglobin til glucitollysin-hemoglobin i en glucohemoglobinprøve inneholdende både labile og stabile glucohemoglobiner, karakterisert ved trinnene: (a) blanding av denne prøve i et vandig medium med fthai- eller bifthalsyre med en pH verdi på 3 til 6, i et forhold på minst 1,5 millimol syre pr. milligram hemoglobin, under dannelse av en syrereaksjonsblanding; (b) vedlikehold av syrereaksjonsblandingen i en på forhånd bestemt tidsperiode ved en temperatur mellom 0 °C og 37 °C som er tilstrekkelig for å fjerne det tilstedeværende, labile glucohemoglobin i den originale prøve vedlikeholdes; (c) blanding av reaksjonsblandingen med en vannforenlig borhydridreduktant i et forhold på minst 0,015 millimol borhydrid pr. milligram hemoglobin, under dannelse av en reduksj ons-reaksj onsblanding; (d) vedlikehold av reduksjons-reaksjonsblandingen i en på forhånd bestemt tidsperiode ved en temperatur mellom 0 "C og 37 °C tilstrekkelig for dannelse av glucitollysin-hemoglobin; og (e) adskillelse av glucitollysin-hemoglobinet fra enhver mengde ureagert borhydrid for å danne isolert glucitollysin-hemoglobin;
eventuelt etterfulgt av mengdebestemmelse ved, (f) blanding av det isolerte glucitollysin-hemoglobin med glucitollysin-spesifikke reseptormolekyler under dannelse av en immunreaksjonsblanding; (g) vedlikehold av immunreaksjonsblandingen under biologiske betingelser for mengdebestemmelse i en tidsperiode tilstrekkelig for reseptormolekylene til å immunologisk binde seg til glucitollysin-hemoglobinet under dannelse av en immunreaktant ; og (h) mengdebestemmelse av immunreaktanten som dannes
1 den vedlikeholdte immunreaksjonsblanding.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at blandingen ifølge trinn (a) utføres ved et forhold på minst 15,0 millimol syre pr. milligram hemoglobin.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at syreoppløsningen som anvendes ifølge trinn (a) har en pH-verdi på 4 til 5.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at blandingen ifølge trinn (c) utføres ved et forhold på minst 0,15 millimol borhydrid pr. milligram hemoglobin.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reseptorene som anvendes ifølge trinn (f) er et monoklonalt antistoff.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det monoklonale antistoff som anvendes utskilles av hybridomene med ATCC-deponeringsnummere HB 8356 eller HB 8358.
7. Fremgangsmåte for mengdebestemmelse av stabilt glucohemoglobin i en glucohemoglobin-inneholdende prøve, karakterisert ved trinnene: (a) tilveiebringelse av et på forhånd bestemt volum av en sammenpakket pellet av røde blodceller; (b) blanding av det på forhånd bestemte pelletvolum med vandig 0,05 M fthalsyre ved en pH-verdi på 4 til 5 og ved et forhold på 1 volum pellet til 62,5 volumer vandig syre under dannelse av en syrereaksjonsblanding; (c) vedlikehold av syrereaksjonsblandingen i en tidsperiode på 15 minutter til 30 minutter og ved en temperatur på 20 °C til 37 °C under dannelse av et hemolysat; (d) blanding i en mikrotiterplatebrønn av et på forhånd bestemt volum av hemolysatet med et like stort volum av en vandig oppløsning med en natriumborhydrid- eller kaliumbor-hydridkonsentrasjon på 400 mM, under dannelse av en reduksjons-reaksjonsblanding inneholdende et forhold på minst 0,15 millimol borhydrid pr. milligram hemoglobin; (e) vedlikehold av reduksjons-reaksjonsblandingen i en tidsperiode på 15 til 30 minutter ved en temperatur på 20 "C til 37 °C, under dannelse av mikrotiterplatebrønnbundet glucitollysin-hemoglobin; (f) adskillelse av det brønn-bundne glucitollysin-hemoglobin fra borhydridet under dannelse av et brønn-bundet glucitollysin-hemoglobin; (g) blanding av det isolerte, brønn-bundne glucitollysin-hemoglobin med en på forhånd bestemt mengde enzymmerkede reseptorer utskilt av hybridomene med ATCC-deponeringsnummere HB 8356 eller HB 8358, under dannelse av en immunreaksjonsblanding; (h) vedlikehold av immunreaksjonsblandingen i en tidsperiode på 15 minutter til 30 minutter ved en temperatur på 20 °C til 37 °C, hvor tidsperioden er tilstrekkelig for reseptorene til å immunologisk binde seg til glucitollysin-hemoglobinet og danne en mikrotiterplatebrønn-bundet immunreaktant ; og (i) mengdebestemmelse av mikrotiterplatebrønn-bundet immunreaktant som ble dannet i trinn (h).
8. Diagnostisk system passende for utførelse av en fast fase-mengdebestemmelse av tilstedeværende, stabilt glucohemoglobin i en glucohemoglobinprøve,
karakterisert ved: (a) en første pakning inneholdende en fast fase-matriks på hvis overflate mengdebestemmelsen utføres; (b) en andre pakning inneholdende en på forhånd bestemt mengde av et vannforenlig borhydrid-reduksjonsmiddel; (c) en tredje pakning inneholdende en kjent mengde av glucitollysin-spesifikke reseptormolekyler; og (d) en fjerde pakning inneholdende en på forhånd bestemt mengde fthalsyre eller bifthalsyre;
innholdet av pakningene er til stede i tilstrekkelige mengder for å utføre mengdebestemmelsen.
9. Diagnostisk system ifølge krav 8, karakterisert ved at de glucitollysin-spesifikke reseptormolekyler utskilles av hybridomer med ATCC-deponeringsnummere HB 8356 eller HB 8358.
10. Diagnostisk system ifølge krav 9, karakterisert ved at reseptormolekylene er bundet til et merke.
I
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/932,442 US4876188A (en) | 1986-11-18 | 1986-11-18 | Novel immunochemical method for assaying stable glycosylated hemoglobin |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO874783D0 NO874783D0 (no) | 1987-11-17 |
| NO874783L NO874783L (no) | 1988-05-19 |
| NO172708B true NO172708B (no) | 1993-05-18 |
| NO172708C NO172708C (no) | 1993-08-25 |
Family
ID=25462330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO874783A NO172708C (no) | 1986-11-18 | 1987-11-17 | Fremgangsmaate for omdannelse av stabilt glucohemoglobin til glucitollysin-hemoglobin, mengdebestemmelse av stabilt glucohemoglobin, samt diagnostisk system for utfoerelse av mengdebestemmelsen |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4876188A (no) |
| EP (1) | EP0271996B1 (no) |
| JP (1) | JP2656776B2 (no) |
| AT (1) | ATE72337T1 (no) |
| AU (1) | AU609746B2 (no) |
| CA (1) | CA1285477C (no) |
| DE (1) | DE3776525D1 (no) |
| DK (1) | DK173095B1 (no) |
| ES (1) | ES2032296T3 (no) |
| FI (1) | FI88546C (no) |
| GR (1) | GR3003870T3 (no) |
| IE (1) | IE60775B1 (no) |
| IL (1) | IL84487A (no) |
| NO (1) | NO172708C (no) |
| NZ (1) | NZ222560A (no) |
| PT (1) | PT86150B (no) |
| ZA (1) | ZA878508B (no) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5206144A (en) * | 1985-03-29 | 1993-04-27 | Novo Industri A/S | Determination of glycated (glycosylated) hemoglobin in blood |
| EP0299419B1 (en) * | 1987-07-14 | 1993-10-20 | Kabushiki Kaisha Kyoto Daiichi Kagaku | Automatic measurement method of glycohemoglobin |
| US5292663A (en) * | 1987-11-30 | 1994-03-08 | Sekisui Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Method of treating blood containing labile glycosylated hemoglobin A1C |
| CA1338348C (en) * | 1987-11-30 | 1996-05-28 | Kazutoshi Yamazaki | Eliminating agent for glycosylated hemoglobin |
| US5110745A (en) * | 1989-06-01 | 1992-05-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of detecting glycated proteins |
| US5484735A (en) * | 1989-08-23 | 1996-01-16 | Northwestern University | Immunoassay of glycosylated proteins employing antibody directed to reductively glycosylated N-terminal amino acids |
| US5183739A (en) * | 1990-02-27 | 1993-02-02 | Exocell, Inc. | Monoclonal antibodies specific for non-a1c glycated hemoglobin and immunoassay methods |
| EP0595806A1 (en) * | 1991-07-22 | 1994-05-11 | Astroscan Limited | Analysis of carbohydrates and kits therefore |
| WO1994000592A1 (en) * | 1992-06-26 | 1994-01-06 | Exocell, Inc. | Monoclonal antibodies against glycated low density lipoprotein |
| JP3177863B2 (ja) * | 1992-07-17 | 2001-06-18 | 東ソー株式会社 | 不安定型糖化ヘモグロビンの除去方法 |
| WO1994029722A1 (en) * | 1993-06-08 | 1994-12-22 | Chronomed, Inc. | Two-phase optical assay method and apparatus |
| US6242417B1 (en) * | 1994-03-08 | 2001-06-05 | Somatogen, Inc. | Stabilized compositions containing hemoglobin |
| GB9508278D0 (en) * | 1995-04-24 | 1995-06-14 | Axis Biochemicals As | Haemoglobin standards |
| JP3269765B2 (ja) | 1995-12-14 | 2002-04-02 | 富士写真フイルム株式会社 | ヘモグロビン誘導体の免疫学的測定方法及びその方法に用いる処理試薬 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1580318A (en) * | 1978-05-06 | 1980-12-03 | Univ Rockefeller | Antibodies active against human hemoglobin a1c |
| DE2820310A1 (de) * | 1978-05-10 | 1979-11-15 | Univ Rockefeller | Radioimmunologische bestimmung von haemoglobin a tief 1c |
| US4200435A (en) * | 1978-12-26 | 1980-04-29 | Abbott Laboratories | Determination of glycosylated hemoglobin in blood |
| FR2464475A1 (fr) * | 1979-08-30 | 1981-03-06 | Amicon Corp | Procede et produit pour la separation des glycoproteines et leur application notamment a la determination de l'hemoglobine glycosylee |
| JPS5640694A (en) * | 1979-09-06 | 1981-04-16 | Amicon Corp | Method of separating glycoprotein and chemical agent therefor |
| US4349352A (en) * | 1980-08-14 | 1982-09-14 | Rockefeller University | Test for glucosylated hemoglobin and other glucosylated proteins |
| DE3119046C2 (de) * | 1981-05-13 | 1983-03-10 | Panchem Gesellschaft für chemische Produkte mbH, 8751 Kleinwallstadt | Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an glykosiliertem Hämoglobin bei der Langzeitkontrolle des Blutzuckerspiegels |
| IT1167460B (it) * | 1981-06-26 | 1987-05-13 | Sclavo Inst Sieroterapeut | Dosaggio delle proteine glicosilate in fluidi biologici e mezzi adatti allo scopo |
| US4629692A (en) * | 1982-12-06 | 1986-12-16 | Miles Laboratories, Inc. | Immunoassay for nonenzymatically glucosylated proteins and protein fragments an index of glycemia |
| US4727036A (en) * | 1985-08-08 | 1988-02-23 | Molecular Diagnostics, Inc. | Antibodies for use in determining hemoglobin A1c |
| DE3439610A1 (de) * | 1984-10-30 | 1986-04-30 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunogene, verfahren zu deren herstellung sowie damit gewonnene antikoerper gegen glykosiliertes haemoglobin |
| DK145385D0 (da) * | 1985-03-29 | 1985-04-01 | Novo Industri As | Monoklonalt antistof til immunkemisk analyse |
| JPH0674278B2 (ja) * | 1986-03-17 | 1994-09-21 | 大塚製薬株式会社 | グルシト−ルリジン誘導体 |
-
1986
- 1986-11-18 US US06/932,442 patent/US4876188A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-11-12 ZA ZA878508A patent/ZA878508B/xx unknown
- 1987-11-13 DE DE8787310048T patent/DE3776525D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-13 AT AT87310048T patent/ATE72337T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-13 ES ES198787310048T patent/ES2032296T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-13 EP EP87310048A patent/EP0271996B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-16 IL IL84487A patent/IL84487A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-11-16 NZ NZ222560A patent/NZ222560A/xx unknown
- 1987-11-17 IE IE309087A patent/IE60775B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-11-17 FI FI875080A patent/FI88546C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-11-17 CA CA000551976A patent/CA1285477C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-17 PT PT86150A patent/PT86150B/pt unknown
- 1987-11-17 NO NO874783A patent/NO172708C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-11-17 DK DK198706030A patent/DK173095B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-11-18 AU AU81359/87A patent/AU609746B2/en not_active Expired
- 1987-11-18 JP JP62291651A patent/JP2656776B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-02-21 GR GR920400290T patent/GR3003870T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI875080A0 (fi) | 1987-11-17 |
| ES2032296T3 (es) | 1993-02-01 |
| IL84487A (en) | 1992-11-15 |
| IE60775B1 (en) | 1994-08-10 |
| IL84487A0 (en) | 1988-04-29 |
| NO874783D0 (no) | 1987-11-17 |
| FI875080A (fi) | 1988-05-19 |
| DK603087D0 (da) | 1987-11-17 |
| DK603087A (da) | 1988-05-19 |
| JPS63277967A (ja) | 1988-11-15 |
| ZA878508B (en) | 1988-07-27 |
| IE873090L (en) | 1988-05-18 |
| JP2656776B2 (ja) | 1997-09-24 |
| PT86150B (pt) | 1990-08-31 |
| FI88546B (fi) | 1993-02-15 |
| ATE72337T1 (de) | 1992-02-15 |
| EP0271996B1 (en) | 1992-01-29 |
| GR3003870T3 (no) | 1993-03-16 |
| AU609746B2 (en) | 1991-05-09 |
| NO874783L (no) | 1988-05-19 |
| PT86150A (en) | 1987-12-01 |
| FI88546C (fi) | 1993-05-25 |
| CA1285477C (en) | 1991-07-02 |
| DE3776525D1 (de) | 1992-03-12 |
| US4876188A (en) | 1989-10-24 |
| NO172708C (no) | 1993-08-25 |
| EP0271996A1 (en) | 1988-06-22 |
| NZ222560A (en) | 1989-07-27 |
| DK173095B1 (da) | 2000-01-17 |
| AU8135987A (en) | 1988-05-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4247533A (en) | Hemoglobin A1c radioimmunoassay | |
| EP0782710B1 (en) | Method for detecting antibodies | |
| US4647654A (en) | Peptides useful in preparing hemoglobin A1c immunogens | |
| EP0111211B1 (en) | Immunoassay for nonenzymatically glucosylated proteins and protein fragments - an index of glycemia | |
| EP0316306B1 (en) | Monoclonal antibodies special for HB A1c | |
| US4727036A (en) | Antibodies for use in determining hemoglobin A1c | |
| Viitala et al. | Serum IgA, IgG, and IgM antibodies directed against acetaldehyde‐derived epitopes: relationship to liver disease severity and alcohol consumption | |
| JP5574977B2 (ja) | 糖化ヘモグロビン含有試料の前処理法 | |
| NO172708B (no) | Fremgangsmaate for omdannelse av stabilt glucohemoglobin til glucitollysin-hemoglobin, mengdebestemmelse av stabilt glucohemoglobin, samt diagnostisk system for utfoerelse av mengdebestemmelsen | |
| US20050037448A1 (en) | C-peptide specific assay procedure | |
| EP0166623A2 (en) | Antibody lectin sandwich assay | |
| JPH0720437B2 (ja) | モノクロナ−ル抗体 | |
| EP0049277A1 (en) | Immunoassay for measurement of reticulocytes | |
| Cohen et al. | Glycated LDL concentrations in non-diabetic and diabetic subjects measured with monoclonal antibodies reactive with glycated apolipoprotein B epitopes | |
| US5484735A (en) | Immunoassay of glycosylated proteins employing antibody directed to reductively glycosylated N-terminal amino acids | |
| Pal | Immunoassay Technology. Vol. 2 | |
| EP0166583A2 (en) | Compositions for enzyme immunoassay of prostaglandins | |
| EP0757795B1 (en) | Method for detecting hemoglobin advanced glycosylation endproducts | |
| Morin et al. | Nonenzymatic glycation of immunoglobulins does not impair antigen-antibody binding. | |
| US5169937A (en) | Method for producing stable glycosylated hemoglobin | |
| EP0061071B1 (en) | Activated apoglucose oxidase, method of preparing it, its use in specific binding assay methods and reagent means and test kits containing it | |
| NO175024B (no) | Agglutineringsreagens og dets anvendelse for detektering av et antigen, antistoffer eller andre analytter, samt prövesett omfattende reagensen | |
| JPH02141665A (ja) | 糞便中のヘモグロビンの検出方法 | |
| EP0318734A1 (en) | A highly sensitive method to detect bacteria by using antibody against bacterial cells | |
| Knowles et al. | Peptides useful in preparing hemoglobin A 1c immunogens |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |