PT86150B - Metodo imunoquimico para ensaiar hemoglobina glicosilada estavel - Google Patents

Description

MEMORIA descritiva

Campo do Invento

Este invento refere-se a um processo para determinar a quantidade de glico-hemoglobina estável numa amostra de sangue. Mais especificamente, este invento refere-se a um processo para optimizar e analisar o número de epítopos contendo glicitolisina numa molécula de glico-hemoglobina reduzida.

Antecedentes do Invento

As hemoglobinas glicosiladas (glico-hemoglobinas) são hemoglobinas que estão covalentemente ligadas a um radical açú, car. Isto é, as glico-hemoglobinas são os produtos de adição (aductos) da reacção entre a hemoglobina e um açúcar. As gluco-hemoglobinas são uma subclasse da glico-hemoglobina que com preende hemoglobina ligada à glucose. A glicosilação ê uma reacção não específica que tem sido descrita como resultando na adição de diversos açúcares ou fosfatos de açúcar às hemoglobinas humanas Αθ, A^, C, D, E, F e S.

A gluco-hemoglobina Α^θ (HbA^) é a glico-hemoglobina mais abundante e a mais largamente estudada. A HbA_lc represe_n ta a HbAg possuindo glucose D ligada ao grupo amino da valina do N-terminal de uma ou de ambas as cadeias beta-globina. Co_n tudo, a adição de glucose à hemoglobina não está limitada ao N-terminal da cadeia beta e pode também ocorrer no grupo amino epsilon das lisinas em ambas as cadeias alfa- e beta-globina.

D mecanismo de reacção e a cinética da adição de glucose à hemoglobina está apresentada esquematicamente na Figura 1. A glucose D na sua forma aldeído reage rapidamente e reversivelmente com um grupo amino (munido de uma valina do N-terminal ou do grupo amino epsilon de um resíduo lisina da cadeia) para formar um intermediário aldimina lábil (base Schiff). Este in termediário lábil (gluco-hemoglobina lábil) pode-se dissociar para glucose D e hemoglobina, ou pode sofrer um reajustamento Amadori irreversível mas lento para formar uma cetoamina estável (gluco-hemoglobina estável). A cetoamina por sua vez exis

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-3te em equilíbrio com uma forma hemicetal ou de anel (especificamente desoxifructosil-lisina).

A formação de gluco-hemoglobina estável é um processo não enzimático que prossegue lenta e continuamente ao longo do tenj po de vida do eritrócito. A velocidade de formação da gluco-hemoglobina está directamente dependente da capacidade do indivíduo para controlar os níveis de açúcar (glucose) no sangue. Portanto, a informação em relação à concentração de gluco-hemo globina HbA. estável total, tem ganho aceitação como proporcionando uma monitorização objectiva em mádia de tempo para o controlo glucémico em doentes com diabetes mellitus.

Os diversos processos para determinar a quantidade de gli co-hemoglobina total ou uma espécie de gluco-hemoglobina parti cular tal como FlbA^, e os problemas metodológicos associados a estes processos, estão revistos por Goldstein e col., Clin. Chem., 31:1060-1067 (1985) e 3 ovanovic e col., Am. 3. Med., 70:331-338 (1981)_f Por exemplo, o radioimunoensaio (RIA) para a HbA^_c descrito por 3avid e col., Br. 3. Haematology, 38:329-337 (1978), sofre pelo uso de anticorpos possuindo baixa afini dade e reactividade cruzada com hemoglobina não glucosilada.

Mais recentemente, Curtisse col., 3. Clin, Invest., 72:1427-38 (1983) relatam o uso de anticorpos monoclonais que imunorreagem com epítopos contendo resíduo glucitolisina para ensaiar em relação à presença de proteínas plasmáticas glucosi. ladas possuindo semi-vidas relativamente curtas. Relatam também a inibição de ligação de alguns dos seus anticorpos monoclonais a glucitolisina-proteínas plasmáticas pela glucitolis.i na-hemoglobina.

Um resíduo glucitolisina é produzido pela redução do pro duto do reajustamento de Amadori acima discutido, quando a fo.r ma cetoamina do grupo amino epsilon glucosilado da lisina (pro duto Amadori) é reduzida por um agente redutor de boro-hidreto compatível com a água (redutor) tal como boro-hidreto de sódio ou cianoboro-hidreto de sódio. Assim, Curtiss e col., mostraram que a gluco-proteína plasmática numa amostra pode ser redu. zida e convertida em proteína plasmática contendo glucitolisi66 953

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À- ·* -4na, e subsequentemente ensaiada usando anticorpos monoclonais específicos para a glucitolisina, ultrapassando assim o proble ma da reactiuidade cruzada observada com proteínas plasmáticas não-glucosiladas.

Contudo, como se pode ver a partir da Figura 1, o proces: so de redução in vitro produz resíduos glucitolisina em ambas as formas lábil e estável da gluco-hemoglobina. Assim, o processo de Curtiss e col., supra, como aplicado à hemoglobina em vez de uma proteína plasmática, não conseguiu distinguir entre a quantidade de formas lábil e estável da gluco-hemoglobina, presente numa amostra.

De acordo com ambas as revisões de Goldstein e col., supra , e Jovanovic e col., supra, para que um ensaio de gluco-he moglobina proporcione um índice de confiança de controlo glucé mico a longo prazo, o processo de ensaio tem de distinguir entre as formas lábil e estável da gluco-hemoglobina. Há duas razões para isto.

Em primeiro lugar, em qualquer ponto dado, no tempo, a quantidade total de gluco-hemoglobina presente num eritrócito é a soma de ambas as fracções lábil e estável. Em segundo lugar, a quantidade de gluco-hemoglobina lábil presente nos eritrócitos flutua rapidamente em resposta a níveis de glucose de curta duração. Isto é, a formação da fracção lábil é suficien temente rápida em comparação com a formação irreversível, lenta, da cetoamina estável de que alterações agudas na glucose sanguínea resultarão num aumento da gluco-hemoglobina total, substancialmente como um resultado de um aumento da fracção lá bil. Portanto, a inclusão da fracção lábil em qualquer medição de gluco-hemoglobina pode reflectir uma resposta aguda ou a curto prazo aos níveis de glucose sanguínea e pode não refle ctir o grau de controlo glucémico a longo prazo.

Os métodos, correntemente disponíveis, cromatográficos, electroforéticos e imunolágicos para ensaiar a glico-hemoglobi na não conseguem distinguir entre as formas lábil e estável da gluco-hemoglobina quando ambas estão presentes na amostra. Coji sequentemente, tem havido uma pesquisa substancial no desenvoJL

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-5vimento de métodos de ensaio que incluam um processo para remo ver a fracção gluco-hemoglobina lábil da amostra antes da etapa de ensaio.

Os métodos descritos para eliminar a gluco-hemoglobina lábil de uma amostra baseiam-se tipicamente em submeter a amos, tra a condições que favorecem a dissociação da forma lábil numa glicose tal como glucose (uma aldose) e hemoglobina. Esses métodos incluem a incubação dos eritrocitos em solução salina normal durante 24 horas antes da hemolise 2C^°ldstein e col., Diabetes 29:623-28 (1980)__/, diálise do hemolisado durante 48 horas contra tampão fosfato isento de glucose, /”Widness e col., J. Lab, Clin. Med. 95:386-394 (1980)_7 e diluição e sub sequente concentração por ultrafiltração do hemolisado Innanen e col,, Clin, Chem, 27:1478-79 (1981)_/.

Com interesse particular em relação ao presente invento são aqueles métodos que usam uma etapa de incubação acídica p.a ra a remoção de glico-hemoglobina lábil. Nathan e col., Diabetes, 30:700-701 (1981) des creve um método de ensaio no qual os eritrocitos são incubados numa solução contendo semicarbazi da e anilina a pH 5 durante 30 minutos a 38 graus C para reduzir (remover) a fracção lábil. A fracção glico-hemoglobina es. tável, p.e., gluco-hemoglobina é então ensaiada usando as técni cas de separação de cromatografia líquida de elevada pressão (HPCL) ou electroforese em gel/^ágar de citrato.

método descrito por Bisse e col., Diabetes, 31:630-633 (1982) removeu a fracção lábil da amostra a ser ensaiada lisajn do os eritrocitos em 50 volumes de uma solução contendo biftalato de potássio 0,05 M a pH5 durante 15 minutos a 37 graus C. A quantidade de glico-hemoglobina estável permanecendo na amos, tra com pouca glico-hemoglobina lábil foi então determinada por HPLC.

Contudo, não tem havido quaisquer descrições, até à data, em relação ao uso de uma etapa acídica de depleção de glicose lábil, p.e., glucose, usando ácido biftálico ou outro, em combinação com uma etapa de redução usando um redutor boro-hidreto compatível com a água para formar glucitalisina-hemoglobina, que é imunologicamente estável.

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-6Sumário do Invento presente invento diz respeito a um processo para detejç minar a quantidade de glico-hemoglobina estável, tal como gluco-hemoglobina, numa amostra de glico-hemoglobina. A gluco-he moglobina lábil presente na amostra é removida em primeiro lugar misturando a amostra contendo gluco-hemoglobina com ácido ftálico ou biftálico a uma proporção de pelo menos cerca de

1,5 milimoles de ácido por miligrama de hemoglobina num meio aquoso a um valor de pH de cerca de 3 a cerca de 6, para formar uma mistura de reacção ácida. Essa mistura é mantida por um período predeterminado de tempo e sob condições predeterminadas de modo a permitir que a gluco-hemoglobina lábil presente se dissocie em glucose e hemoglobina, enquanto mantém a gluco-hemoglobina estável presente na amostra original.

A mistura de reacção ácida é então misturada com um boro -hidreto compatível com a água, de preferência boro-hidreto de sódio ou de potássio, a uma proporção âe pelo menos 0,15 milimo les de boro-hidreto por miligrama de hemoglobina para formar uma mistura aquosa de reacçõo de redução. A mistura de reacção die reduçõo é mantida por um período de tempo predeterminado e sob condições tais que converta as lisinas glucosiladas presentes em resíduos glucitolisina e forme glucitolisina-hemo globina.

Após separar qualquer boro-hidreto não reagido da glucitolisina-hemoglobina presente na amostra reduzida, a quantidade de glucitolisina-hemoglobina presente é determinada através de métodos de ensaio imunológico bem conhecidos que utilizam moléculas receptoras específicas para a glucitolisina. Entenda-se que este processo, até à determinação imunológica da gltj citolisina-hemoglobina, pode também ser utilizado para preparar glucitolisina-hemoglobina a partir de gluco-hemoglobina es. tável numa amostra de gluco-hemoglobina que contenha ambos glu co-hemoglobina lábil e hemoglobina estável.

invento diz também respeito a um sistema de diagnóstico que está tipicamente sob a forma de um equipamento e contém uma pluralidade de embalagens separadas. Uma primeira embala-

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-7gem contém uma matriz de fase sólida tal como uma placa de microtitulação em cujas superfícies do depósito o ensaio pode ser realizado. Uma segunda embalagem contém uma quantidade predeterminada do redutor de boro-hidreto compatível com a água na forma sólida. Uma terceira embalagem contém moléculas receptoras apropriadas específicas para a glucitolisina na fo.r ma seca ou líquida. Uma quarta embalagem contém ácidos ftálico ou biftálico. 0 sistema pode ainda incluir uma ou mais embalagens adicionais que contêm um ou mais reagentes úteis adicionais .

presente invento proporciona diversos benefícios e vaji tagens.

Um benefício é que a concentração de hemoglobina estável numa amostra de gluco-hemoglobina contendo ambos gluco-hemoglo binas lábil e estável pode ser ensaiada de modo relativamente rápido, fácil e rigoroso.

Uma vantagem do presente invento é que a glucitolisina-hemoglobina pode ser preparada a partir da porção de gluco-he moglobina estável de uma amostra de gluco-hemoglobina pela exclusão de glucitolisina-hemoglobina preparada a partir da porção de gluco-hemoglobina lábil da amostra.

Ainda outro benefício do invento é que a glucitolisina-hemoglobina preparada é mais antigénica que a preparada por outros meios.

Outros benefícios e vantagens do presente invento serão evidentes para os entendidos na arte a partir da descrição que se segue.

Breve Descrição dos Desenhos

Nas Figuras, que formam uma parte desta descrição:

A Figura 1 é uma representação esquemática que ilustra a sequência de reacção para a glucosilação não enzimática das aminas livres alfa (com terminal amino valina) e epsilon (lisi. na) da hemoglobina, designadas por proteína na Figura, para formar gluco-hemoglobinas lábil e estável, e a subsequente redução de intermediários para formar os produtos finais gluci66 953

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-8tol-substituído.

A Figura 2 contám três gráficos que ilustram os resultados de estudos de inibição competitiva efectuados misturando receptores G6C9 marcados com peroxidase de rábano (HRP0-G6C9) com diversas concentrações de potenciais competidores para o local de combinação de anticorpo G6C9. A abcissa em cada painel gráfico mostra a concentração, em microgramas por mililitro (yng/ml), das soluções de inibidor usadas. A ordenada em cada painel gráfico mostra a fracção de ligação máxima; i.e., a quantidade de ligação conseguida por HRP0-G6C9 na ausência de inibidor competitivo» que permaneceu ou que foi conseguido após reacção com os diversos inibidores potenciais.

painel 2A ilustra os resultados obtidos usando glucito lisina (A) ; poli-L-lisina reduzida (□)! alfa-T-Boc-lisina reduzida (·); hemoglobina não-glucosilada reduzida (Δ)5 e poli-L-valina reduzida (H) como potenciais competidores. Aqueles resultados indicam que deste grupo, só o controlo posj. tivo, glucitolisina, inibiu a ligação dos receptores HRP0-G6C9, e portanto redução isolada, na ausência de glucose, não produz o epítopo reconhecido por HRP0-G6C9.

painel 2B ilustra os resultados obtidos usando glucito lisina (A) ; poli-L-lisina glucosilada (□) ; alfa-T-Boc-lisina glucosilada (·); hemoglobina glucosilada (/\) e poli-L-valina glucosilada (|) como potenciais competidores. Aqueles resultados indicam que só o controlo positivo glucitolisina inibiu a ligação. Assim, a glucosilação isolada não produz o epítopo reconhecido por HRP0-G6C9.

painel 2C ilustra os resultados obtidos após glucosilar e depois reduzir a poli-L-lisina (| | ); alfa-T-Boc-lisina (·); hemoglobina (A) e poli-L-valina (M)* Aqueles resultados in dicam que quando a poli-L-lisina e a hemoglobina são glucosila das e reduzidas podem ambas competir para os locais de combina ção de anticorpo HRP0-G6C9 de uma forma semelhante à do contro lo positivo glucitolisina. Só a poli-L-valina glucosilada e reduzida foi incapaz de competir significativamente, indicando assim que os receptores HRP0-G6C9 não imunorreagem com a valina

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-9glucosilada do N-terminal da hemoglobina.

A Figura 3 contém dois painéis de gráficos que ilustram os resultados inesperados obtidos quando a formação de glucito lisina numa amostra de hemoglobina é efectuada por redução na presença de ácido ftálico.

No painel 3A, as amostras de hemoglobina contendo gluco-hemoglobina foram fornecidas como 10 microlitros Çk1) de uma pelota de concentrado de GV obtida a partir do sangue de um i_n divíduo diabético (triângulo), ou de um indivíduo normal (quadrados). As amostras foram reduzidas usando NaBH^ (Δ. □) ou KBH^ (J^, ) como redutor de boro-hidreto compatível com a água e depois ensaiadas para a formação de glucitolisina-hemoglobina. A concentração de hemoglobina em cada uma das misturas de reacção de redução foi de 2,4 miligramas por mililitro (mg/ml). A concentração do boro-hidreto em cada uma das misturas está apresentada nas abcissas.

painel 3B ilustra os resultados obtidos para as mesmas duas amostras de hemoglobina e para os mesmos dois redutores quando a redução foi efectuada após a reacção das amostras com ácido ftálico. Uma comparação dos resultados do painel 3A com os do painel 3B indica que a reacção com ácido ftálico antes da redução com boro-hidreto resulta num aumento significativo em glucitolisina-hemoglobina ensaiável, como determinado por ligação imunológica dos receptores HRP0-G6C9. A glucitolisina -hemoglobina preparada da forma descrita usando ácido ftálico e um redutor de boro-hidreto apresenta assim uma antigenicidade aumentada. Não era esperada esta quantidade aumentada de glucitolisina-hemoglobina ensaiável (antigenicidade).

A Figura 4 ilustra o efeito da variação do período de tempo de permanência da mistura de reacção de redução. As mis turas de reacção preparadas usando diversas diluições de sangue total quer de uma fêmea diabética quer de uma fêmea normal foram misturadas com um volume igual de ácido ftálico 0,10 M. A concentração de hemoglobina (Hb) nas misturas de reacção áci. da foi, em mg Hb/ml, a seguinte: 27,0, 10,8, 5,4, 2,7, 1,08, 0,675, 0,54, 0,415, 0,337 e 0,270. A razão de milimoles de ácido por miligrama de hemoglobina em cada uma das misturas

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-10acima foi de 1,85, 4,63, 9,26, 18,5, 46,3, 74,07, 92,6, 120,5,

148,5 e 185,2, respectivamente.

Após a formação do hemolisado, as misturas de reacção de redução foram preparadas misturando cada hemolisado com um volume igual de NaBH^ 400 mM. Os recíprocos das diluiçães finais das amostras de hemoglobina estão apresentados no eixo das abcissas. Da esquerda para a direita e na ordem de aumento da diluição de hemoglobina, a razão de milimoles de NaBH^ por miligrama de hemoglobina de cada uma das misturas de redução apresentadas são 0,0148, 0,037, 0,074, 0,148, 0,37, 0,593, 0,74, 0,964, 1,187 e 1,481.

Os resultados apresentados na Figura 4 indicam que a manutenção das misturas de reacção de redução durante 30 minutos para amostras diabéticas (I I) e normais (H) produziram mais glucitolisina-hemoglobina ensaiável que uma manutenção durante 15 minutos dessas misturas tanto para amostras diabéticas (/\) como normais (J^).

A Figura 5 é um gráfico de barras ilustrando o efeito de diversas misturas de reacção ácidas sobre a formação de glucitolisina-hemoglobina ensaiável como uma função do ácido das mis turas de reacção. As misturas foram preparadas misturando 10 microlitros de uma pelota de concentrado de GU obtida a partir de uma amostra de sangue de diabético (H ) ou normal (ΓΊ ) e 615 microlitros de uma das seguintes soluçães 0,05 M e com pH de valor de 4 a 5: ácido ftálico (A), citrato (E), ácido acético (F), fosfato (G), glucosamina D(+)(H), ácido alfa-cetoglutárico (I), ácido oxalacético (J), ácido oxálico di-potáss_i co (K), ácido succínico (L), e ácido pirúvico (M), seguido de redução com NaBH^ e determinação do conteúdo em glucitolisina-hemoglobina pelo ELISA adiante descrito* 0s controlos incluem água destilada (B), incubação durante a noite (cerca de 18 horas) dos GV em solução salina isatúnica com água destilada (C) ou com ácido ftálico (D), 0s controlos foram ensaiados co mo acima descritos. A quantidade de glucitolisina-hemoglobina ensaiável formada é expressa como um valor de densidade óptica (0.0.) a 490 nm.

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-110s resultados apresentados na Figura 5 indicam que o método clássico para remover a gluco-hemoglobina lábil de uma amostra, i.e., incubação durante a noite dos GV em solução sali na (C), não potência a formação de glucitolisina da mesma forma que o ácido ftálico. Aqueles resultados ilustram também a potenciação de glucitolisina ensaiável usando uma combinação de ácido ftálico e um redutor de boro-hidreto compatível com a água.

A Figura 6 é um gráfico ilustrando os resultados obtidos quando o método de ensaio do presente invento foi efectuado com misturas de reacção ácidas possuindo concentrações de ácido ftálico de cerca de 0,05 M (O) ou de cerca de 0,025 M (. Estão também apresentados os resultados obtidos quando os hemolisados formados usando uma mistura de reacção ácida possuindo uma concentração 0,05 M de ácido ftálico não foram submetidos a redução (H ). Outros controlos incluem os resul. tados obtidos quando não se usou qualquer tratamento com ácido ftálico antes da redução com NaBH^ (|~~| ) e incubação durante a noite dos GV em solução isotónica salina antes da redução, mas sem tratamento com ácido ftálico (/\).

As concentrações de hemoglobina nas misturas de reacção ácida foram, em mg/ml, de 75, 50, 37,5, 30, 25 e 21,4. As co_n centrações da hemoglobina em cada uma das misturas de reacção de redução respectivas foram, em mg/ml, de 37,5, 25, 18,75, 15, 12,5 e 10,7. A concentração de NaBH^ nas misturas de reacção de redução foi de 200 mM.

A Figura 7 é um gráfico de barras ilustrando os valores de D.0. a 490 obtidos usando soluções aquosas de ácido ftálico possuindo valores de pH de 3,5, 4,5, 5,5 e 6,5 para preparar soluções de reacção ácida. Amostras de hemoglobina de diabéti co número 1 (H ) ^e número 2 (|==| ) e amostras de hemoglobina normal número 1 (| | ) e número 2 (E^|) tinham níveis de hemoglobina glicosilada total de 14,7 por cento, 10,7 por cento,

7,5 por cento e 8,0 por cento, respectivamente, como determina do usando o sistema Gly-Affin (Isolab, Akron, 0H) de acordo com as instruções do fabricante.

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-12A Figura 8 é um gráfico de barras ilustrando o efeito da variação dos períodos de tempo de manutenção da mistura de reacção ácida. As misturas foram formadas usando 0,05 M de ácido ftálico possuindo um valor de pH desajustado de cerca de 4,3. As amostras usadas foram as mesmas que as descritas na Figura 7; i.e., diabético número 1 (H), diabético número 2 (§), normal número 1 (I I ) normal número 2 (F^).

A Figura 9 ilustra o efeito de manter as misturas de rea£ ção de redução à temperatura ambiente ou a 37 graus C usando hemoglobina a concentrações variando de 27 mg/ml a 0,27 mg/ml nas misturas de reacção ácida e 13,5 mg/ml a 0,135 mg/ml nas misturas de reacção de redução. As reacções ácidas foram efe£ tuadas a uma concentração ftálica de cerca de 0,05 M e a um va lor de pH de ácido ftálico não ajustado (cerca de 4,3). As reacções de redução foram efectuadas a uma concentração de NaBH^ de cerca de 200 mM.

As amostras de hemoglobina fornecidas como sangue total quer de uma fêmea diabética (símbolo vazio) quer normal (símbo lo preenchido) foram mantidas na reacção de redução à temperatura ambiente (respectivamente /\ e j^) ou a 37 graus C (respectivamente □ e )·

A Figura 10 mostra os resultados do estudo do pico e da recuperação no qual foram ensaiadas as amostras de hemoglobina contendo as diversas proporções apresentadas de uma amostra de sangue normal e de diabético. Determinou-se a percentagem total de hemoglobina glicosilada na amostra de diabético não misturada e na amostra normal, usando o Sistema Gly-Affin (iso. lab) e verificou-se ser de 18,56 por cento e 5,45 por cento, respectivamente. Outros detalhes deste estudo são fornecidos no Exemplo 8.

Descrição Detalhada do Invento

A. Definições termo anticorpo refere-se a uma molécula que é um membro de uma família de proteínas glicosiladas denominadasimu noglobulinas que se pode combinar especificamente com um anti66 953

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génio. Um tal anticorpo combina-se com o seu antigénio através de uma interacção de ligação imunológica específica entre o de terminante antigénico do antigénio e o local de ligação de anticorpo do anticorpo.

Um local de ligação de anticorpo é aquela porção estru tural de uma molécula de anticorpo constituída por regiões variáveis e hipervariáveis de cadeias leves e pesadas que ligam especificamente o antigénio. Usando a nomenclatura de Oerne, (1974) Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 125C:373-389, um local de ligação de anticorpo é também referido como sendo um paratopo.

Porções polipéptidas de anticorpos contendo local de liga ção de anticorpo (contendo paratopo) são aquelas porções de mo léculas de anticorpo que contêm o paratopo e que se ligam a um antigénio, e incluem, por exemplo, as porções Fab, Fab’, F(ab')₂ e F(v) dos anticorpos. As porções Fab e F(ab')₂ ^dos anticorpos são preparadas pela reacção proteolítica da papafna e da pepsina, respectivamente, sobre antibióticos substanci almente intactos através de processos bem conhecidos. Ver, por exemplo, a Patente U.S.A. N9. 4 342 566 de Theofilopolous e Dixon. As porções Fab’ do anticorpo são também bem conhecidas e são produzidas a partir de porções F(ab’)₂ seguidas de redução das ligações dissulfureto que ligam as duas porções de cadeia pesada, como no mercaptoetanol e seguido de alquilação da proteína mercaptano resultante com um reagente tal como iodoacetamida. São preferidos os anticorpos intactos, e são uti lizados como ilustrativos das moléculas ligantes monoclonais deste invento.

A palavra antigénio tem sido usada historicamente para designar uma entidade que é ligada por um anticorpo, e também para designar a entidade que induz a produção do anticorpo. A utilização mais corrente limita o significado de antigénio à entidade ligada por um anticorpo, enquanto a palavra imunogénio é usada para a entidade que induz a produção de anticorpo. Quando uma entidade aqui referida é imunogénica e antigénica, será geralmente designada antigénio.

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-14A frase determinante antigénico refere-se a porreal ção estrutural/do antigénio que está imunologicamente ligada por um local de ligação de anticorpo. A nomenclatura de Oerne re-define um determinante antigénico como um epítopo.

termo biologicamente activo refere-se pelo menos à capacidade de uma molécula proteica de ligar especificamente o antigénio ou o local de ligação específico do anticorpo, embora possa estar também presente nessa molécula outra capacidade geral ou efectora. A actividade biológica de uma molécula receptora contendo um local de ligação de anticorpo é evidenciada pela reacção imunolégica do paratopo (local de ligação do anticorpo) com o seu epítopo (determinante antigénico) aquando da sua mistura num meio aquoso para formar um imunorreagente, pelo menos a valores de pH e forças iónicas fisiológicas. A actividade biológica ocorre, de preferência sob condições de ensaio biológicas que são definidas adiante.

••ELISA refere-se a um ensaio imunossorvente de ligação enzimática que utiliza um anticorpo ou antigénio ligado a uma fase sólida e um conjugado enzima-antigénio ou enzima-anticorpo para detectar e quantificar a quantidade de antigénio ou de anticorpo presente numa amostra. Uma descrição da técnica ELISA encontra-se no Capítulo 22 da 4^§. Edição do Basic and Clinicai Immunoloqy, por D.P. Sites e col., publicado por Lange Medicai Publications de Los Altos, CA em 1982 e nas Patentes E.U.A. N°s. 3 654 090; 3 850 752; e 4 016 043 as quais estão aqui incorporadas por referência.

Enzima refere-se a uma proteína capaz de acelerar ou produzir por acção catalítica uma alteração num substrato para o qual é usualmente específico.

termo imunorreagir nas suas diversas formas significa ligação entre uma molécula receptora e um epítopo.

termo imunorreagente como aqui usado refere-se ao produto de uma reacção imunológica, i.e., a entidade produzida quando uma molécula receptora se liga imunologicamente a um epítopo.

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-150s termos meio de marcação,grupo indicador ou marcador são aqui usados permutavelmente para incluir átomos is£ lados e moléculas que estão dirscta ou indirectamente envolvidos na produção de um sinal detectável para indicar a presença de um imunorreagente. Qualquer meio de marcação pode ser liga do ou incorporado num receptor ou usado separadamente, e aqueles átomos ou moléculas podem ser usados isoladamente ou em conjunto com reagentes adicionais. Tais grupos indicadores ou marcadores são eles próprios conhecidos em imunoquímica e cons tituem uma parte deste invento desde que sejam utilizados com métodos e/ou sistemas novos.

termo receptor é usado aqui para indicar uma molécula biologicamente activa compreendendo um local de ligação de anticorpo que se liga imunologicamente a (ou com) um antigénio. Tal ligação ocorre tipicamente com uma afinidade de cerca de

10 a cerca de 10 litros por mole e é uma interacção específica do epítopo do antigénio com o local de ligação do antico.r po do receptor.

As palavras segrega e produz são usadas frequentemeri te de forma permutável na arte para se referirem as células das quais se obtêm moléculas de anticorpo. As células que pro duzem anticorpos podem, contudo, não segregar aquelas moléculas para o seu meio circundante. As células de hibridoma com interesse aqui, segregam anticorpos monoclonais para o seu meio. Contudo, tais células são por vezes referidas como células produtoras de anticorpo e os seus anticorpos são por vazes referidos como sendo produzidos, para manter a frase utilizada na arte. As porçães contendo local de ligação de anticorpo dos anticorpos acima (receptores) são referidas aqui de forma semelhante como sendo produzidas ou segregadas, embora se deva entender que tais moléculas são preparadas a partir de anticorpos que são eles próprios produzidos ou se. gregados.

termo sobrenadante é aqui usado para referir o meio líquido in vitro no qual as células são cultivadas. Os anticorpos monoclonais produzidos pelas culturas de hibridoma com

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-16interesse aqui, são segregados para o seu meio de cultura. Portanto, o sobrenadante do meio de cultura para aquelas células é uma fonte preferida das moléculas receptoras monoclonais e é prontamente obtido liberto das células de hibridoma através de técnicas bem conhecidas. Exemplo de tais técnicas é a centrifugação a baixa velocidade para sedimentar as células para fora do meio líquido. As moléculas receptoras monoclonais podem ser obtidas alternativamente a partir de fluído ascítico tumoral (fluído ascítico) de animais laboratoriais nos quais se introduziu tecido de hibridoma. Ambos os métodos são bem conhecidos na arte. Moléculas receptoras monoespecíficas também aqui discutidas, são segregadas para o sangue dos animais hospedeiros nos quais são cultivadas. Os processos de obter tais anticorpos são também bem conhecidos na arte.

B. Processos de produção de glucitolisina-hemoglobina presente invento projecta um processo de produção de glicitolisina-hemoglobina a partir da glico-hemoglobina, usando glucitolisina-hemoglobina e gluco-hemoglobina como exemplo. A glucitolisina-hemoglobina produzida por este método tem uma inesperada antigenicidade aumentada em relação à glucitolisina -hemoglobina produzida por métodos conhecidos na arte. Desconhece-se a razão para a antigenicidade aumentada observada.

Fornece-se uma amostra de gluco-hemoglobina possuindo uma quantidade conhecida de hemoglobina. A gluco-hemoglobina assim fornecida, pode estar presente como estando contida em eritrócitos (glóbulos vermelhos) ou como moléculas livres.

São bem conhecidos na arte os processos para obter gluco-hemoglobina bem como para determinar a presença de gluco-he moglobina. Adicionalmente, são bem conhecidos na arte processos para glicosilar proteínas e polipéptidos em geral e hemoglobina em particular. Ver, por exemplo, a Patente E.U.A. N9 4 478 744 de Mezci e col., e Curtiss e col., 3. Clin. Invest., 72:1427-38 (1983), cujas revelaçães estão aqui incorporadas por referência.

Tipicamente, uma amostra de gluco-hemoglobina é fornecida

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-17como uma quantidade conhecida de sangue total, e mais preferivelmente como um volume conhecido de concentrado de glóbulos vermelhos (GV). São bem conhecidos na arte os processos para fornecer amostras de sangue e de concentrada de glóbulos verme lhos, bem como processos para lisar os GV nele contidos.

(a) A amostra de hemoglobina com gluco-hemoglobina é misturada num meio aquoso com uma quantidade conhecida de ácido ftâlico ou ácido biftálico para formar uma mistura de reacção ácida. A quantidade de ácido misturado é aquela quantidade suficiente para fornecer uma proporção de pelo menos cerca de 1,5 milimoles de ácido ftálico por miligrama de hemoglobina, de preferência uma proporção de pelo menos cerca de 15,0 milimoles de ácido por miligrama de hemoglobina e mais preferivelmente pelo menos cerca de 45,0 milimoles de ácido por miligrama de hemoglobina.

ácido é fornecido tipicamente como uma solução aquosa possuindo um valor de pH de cerca de 3 a cerca de 6, de preferência cerca de 4 a cerca de 5, e mais preferivelmente cerca de 4,1 a cerca de 4,5. 0 meio aquoso fornecido pela solução ácida pode assim fornecer o meio aquoso da mistura de reacção ácida.

São bem conhecidos na arte os processos para determinar ) a quantidade molar de hemoglobina numa amostra.

(b) A mistura de reacção ácida obtida é mantida por um período de tempo predeterminado de segundos a horas. Um perlo do de tempo de cerca de 10 minutos a cerca de 15 minutos é geralmente suficiente para dissociar e remover substancialmente (reduzir) qualquer gluco-hemoglobina lábil presente, enquanto mantém a gluco-hemoglobina estável originalmente presente na amostra. Contudo, se desejado, a mistura pode ser mantida por um período de tempo de cerca de 16 a cerca de 20 horas sem quaisquer consequências nocivas.

Quando a amostra de gluco-hemoglobina é fornecida como GV inteiros, a solução ácida actua como uma solução de lise dos glóbulos vermelhos (agente) de forma que durante o período

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-18de manutenção da reacção ácida os GV são lisados, libertando assim a hemoglobina contida neles para formar um hemolisado. 0 hemolisado assim formado está reduzido em gluco-hemoglobina lábil e contém a hemoglobina estável presente na porção da amostra de GV original.

(c) A mistura de reacção ácida é subsequentemente mistu rada com um redutor boro-hidreto compatível com a água para formar uma mistura de reacção de redução aquosa. A porção aquosa da mistura de reacção de redução pode ser fornecida pela água da mistura de reacção ácida, por uma solução aquosa do redutor de boro-hidreto, ou separadamente. A mistura de reacção ácida fornece, de preferência, pelo menos uma porção da porção aquosa da mistura de reacção de redução.

São bem conhecidos na arte os redutores de boro-hidreto compatíveis com a água e incluem boro-hidreto de sódio (NaBH^), boro-hidreto de potássio (KBH^) e cianoboro-hidreto de sódio (NaCNBH-j). A quantidade de boro-hidreto que é misturada é aque la quantidade suficiente para proporcionar uma proporção de p£ lo menos cerca de 0,015 milimoles de boro-hidreto (BH^) por mi ligrama de hemoglobina, de preferência uma quantidade suficien te para proporcionar uma proporção de pelo menos cerca de 0,15 milimoles de boro-hidreto por miligrama de hemoglobina, e mais preferivelmente uma quantidade suficiente para proporcionar uma proporção de pelo menos cerca de 0,35 milimoles de boro-hi dreto por miligrama de hemoglobina.

(d) A mistura de reacção de redução obtida é mantida, a uma temperatura acima de cerca de 0 graus C a cerca de 37 graus C, de preferência cerca de 20 graus C a cerca de 37 graus C, por um período de tempo predeterminado de segundos a horas. Um período de tempo de cerca de 10 minutos a cerca de 16-20 ho ras, de preferência cerca de 15 minutos a cerca de 30 minutos, ê geralmente suficiente para reduzir o(s) grupo(s) ceto contido na gluco-hemoglobina estável em grupo(s) hidroxilo de resíduo(s) glucitolisina e de glucitolisina-hemoglobina.

(e) A glucitolisina-hemoglobina obtida é então separada

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-19do boro-hidreto não reagido restante para formar glucitolisina -hemoglobina isolada. Os restos celulares da lise dos G.V. são também removidos, de preferência, nesta etapa de separação.

São também bem conhecidos na arte processos de separação da glucitolisina-hemoglobina do boro-hidreto não reagido, e o restante da mistura de reacção de redução. Tais processos de separação incluem cromatografia de exclusão em gel, electroforese, cromatografia de afinidade e semelhantes. Quando se uti liza um processo de ensaio de fase sólida, é preferível ligar o derivado da hemoglobina à matriz de fase sólida utilizada p_a ra formar um suporte sólido, e simplesmente decantar depois a mistura de reacção de redução líquida da fase sólida para efeç. tuar a separação. 0 suporte sólido contendo a glucitolisina ligada pode também ser lavado após a etapa de decantação.

processo acima descrito pode ser usado para produzir glucitolisina-hemoglobina útil em métodos de ensaio diagnósticos e em aparelhos que são usados para medir a gluco-hemoglobi na. Esse método pode ser usado para produzir outras espécies de glicitolisina-hemoglobina desejadas, dependendo do aclucto lisina-açúcar particular presente.

C. Processos de ensaio presente invento contempla também um processo para determinar a quantidade de glico-hemoglobina estável numa amostra de hemoglobina, usando novamente a gluco-hemoglobina como exemplar.

processo atrás descrito de produção de glucitolisina-hemoglobina é usado para preparar glucitolisina-hemoglobina isolada da etapa (e), acima, a partir de uma amostra contendo uma quantidade conhecida de hemoglobina.

(f) a glucitolisina-hemoglobina isolada é misturada com receptores que imunorreagem com epítopos contendo glucitolisina e que estão substancialmente isentos de reacção cruzada com hemoglobina isenta de glucitolisina para formar uma mistura de imunorreacção. Os receptores úteis são tipicamente misturados em excesso estequiométrico em relação à quantidade de glucito lisina que se prevê estar presente.

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-2 0As moléculas receptoras apresentando as imunorreactivida des acima descritas são referidas aqui como moléculas receptoras ou receptoresespecíficos para a glucitolisina. Deve-se entender que tais moléculas receptoras podem ter reacção cruza da com outras porções tais como produtos reduzidos Amadori de outros aditivos açúcar-hemoglobina, ou resíduos manitolisina. Para conveniência de expressão, todos os produtos de hemoglobi. na estável (Amadori) são referidos como resíduos glucitolisina, e assim, as moléculas receptoras que imunorreagem com aqueles produtos reduzidos são referidas como específicos da glucitolisina. As moléculas receptoras úteis podem também reagir de forma cruzada com porções tais como sorbitol, manitol, produtos de plasma reduzidos por Amadori, e outras proteínas, bem como aminoácidos livres tais como lisina ou arginina. Contudo, aquelas outras porções estão ausentes da mistura de imunorreaç. ção útil aqui, e portanto quaisquer reactividades cruzadas adi. cionais das moléculas receptoras úteis não são relevantes para o presente invento.

São bem conhecidos na arte processos para produzir receptores úteis que imunorreagem com glucitolisina-hemoglobina e demonstram pouca ou nenhuma reactividade cruzada imunolégica com a hemoglobina que não contém resíduos glucitolisina; i.e., moléculas receptoras específicas para a glucitolisina. Típica mente, aqueles processos requerem inicialmente produção de um imunogénio contendo resíduos glucitolisina.

Como atrás dito, são bem conhecidos na arte processos p.a ra glicosilar proteínas e polipéptidos sintéticos em geral e glucosilar aquelas porções em particular. Em adição, são também bem conhecidos na arte processos para converter resíduos lisina possuindo glucose ligada covalentemente aos seus grupos amino epsilon em resíduos glucitolisina, por redução com um redutor boro-hidreto compatível com a água. Ver Curtiss e col., J. Clin. Invest, 72:1427-38 (1983). Além disso, são também bem conhecidos na arte processos para produzir receptores usaji do imunogénios proteína e polipéptido.

Por exemplo, Curtiss e col., supra, descrevem um proces66 953

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-21so para produzir hibridomas que produzem anticorpos monoclonais específicos para a glucitolisina (receptores) usando imunogéni os contendo resíduos glucitolisina. Dois hibridomas efectuados por esse processo que segregam anticorpos monoclonais que imunorreagem com glucitolisina-hemoglobina mas não com gluco-hemoglobina ou hemoglobina foram depositados no American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, em conformidade com o Tratado de Budapeste de 20 de Setembro de 1983 com os seguintes números de entrada ATCC:

Hibridoma

G6C9

Subclone

IC87G11

N°. de entrada ATCC

G8H9

2A1.5G8

HB 8356

HB 8358

Anti-soros monoespecíficos que imunorreagem com glucitolisina-hemoglobina mas que demonstram pouca reactividade cruzai da com hemoglobina que não contém glucitolisina podem também ser preparados usando técnicas de imunoabsorção bem conhecidas. Por exemplo, a glucitolisina-hemoglobina pode ser substituída por UbA^c como imunogénio no processo descrito na Patente E.U.A. |\|9. 4 247 533 de Cerami e col., cujo conteúdo está aqui incorporado por referência. Os anticorpos imunoespecíficos para a glucitolisina-hemoglobina podem então ser isolados, i.e.» pode, -se produzir um anti-soro monoespecífico usando hemoglobina não reduzida e/ou gluco-hemoglobina como um imunoabsorvente pa ra absorver anticorpos de reactividade cruzada. Os processos de teste para controlar o processo de produção usam glucitolisina-hemoglobina como antigénio alvo.

(g) A mistura de imunorreacção é mantida sob condições de ensaio biológicas por um período de tempo predeterminado, tal como cerca de 10 minutos a cerca de 16-20 horas, de preferência cerca de 15 minutos a cerca de 30 minutos, o que é sufi ciente para os receptores se ligarem imunologicamente à glucitolisina-hemoglobina presente e formar um imunorreagente.

As condições de ensaio biológicas são aquelas que mantêm a actividade dos receptores e da glucitolisina-hemoglobina pre tendida para ser ensaiada. Essas condições incluem uma gama de

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-22temperatura de cerca de 4 graus C a cerca de 45 graus C, uma gama de valor de pH de cerca de 5 a cerca de 9 e uma força 16nica variando da da água destilada à próxima do cloreto de sói dio um molar. São bem conhecidos na arte processos para optimizar tais condições.

(h) A quantidade de imunorreagente que se forma na mistura de imunorreacção é então determinada, e assim a quantidade de gluco-hemoglobina estável presente na amostra.

A determinação da quantidade de imunorreagente formado, directa ou indirectamente, pode ser conseguida por técnicas de ensaio bem conhecidas na arte. Por exemplo, pode ser usado um sistema de ensaio homogéneo tal como aqueles descritos nas Patentes E.U.A. NS. 4 536 479; Ne. 4 233 401; N°. 4 233 402 e

Ne. 3 996 345, cujos conteúdos estão aqui incorporados por referência.

Em concretizações preferidas, os receptores da etapa (g), acima, contêm um grupo ou marcador indicador capaz de sinalizar a presença do receptor marcado num imunorreagente. Os processos para ensaiar para a presença e quantidade de receptores marcados dependem do marcador usado, sendo tais marcadores e processos de ensaio bem conhecidos na arte.

A marcação de agentes de ligação específicos proteicos tais como receptores é bem conhecida na arte. Por exemplo, os receptores produzidos por hibridomas podem ser marcados por in corporação metabólica de aminoácidos contendo radioisótopos fornecidos como um componente no meio de cultura de tecido. Ver, por exemplo, Galfre e col., Meth. Enzymol. 73, 3-46 (1981). As técnicas de conjugação ou de ligação de proteína através de grupos funcionais activados, são particularmente aplicáveis. Ver, por exemplo, Aurameas, e col., Scand. 3. Immunol, Vol, 8, Suppl. 7, 7-23 (1978) e Patente E.U.A. N°. 4 493 795, cujos conteúdos estão aqui incorporados por referência. Em adição, pode ser efectuada uma reacção de ligação dirigida para um local de forma que o marcador não interfira substancialmente com a imunorreacção do segundo receptor com o seu antigénio alvo. Ver, por exemplo, Roduiell e col., Biotech. 3, 889-894 (1985).

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-230 meio de marcação pode ser um agente de marcação fluorescente que se liga quimicamente a anticorpos ou a antigénios, sem os desnaturar, para formar um fluorcromo (corante) que é um rasto imunofluorescente útil. Agentes marcadores fluores. centes adequados são fluorocromos tais como isocianato de fluo, resceína (FIC), isotiocianato de fluoresceína (FITC), cloreto de 5-dimetilamina-l-naftalenossulfonilo (DANSC), isotiocianato de tetrametilrodadna(TRITC), lissamina, cloreto de sulfonilo rodamina 8200 (RB 200 SC) e semelhantes. Uma descrição das técnicas de análise de imunofluorescência encontra-se em DeLuca, Immunofluorescence Analysis, em Antibody As A Tool, Marchalonis, e col., eds., Oohn Wiley & Sons, Ltd., pp. 189 231 (1982), o qual está aqui incorporado por referência.

Nas concretizações preferidas, o grupo indicador é uma enzima, tal como peroxidase de rábano (HRPO), glucose oxidase, ou semelhantes. Nos casos em que o grupo indicador principal é uma enzima tal como HRPO ou glucose oxidase, são necessários reagentes adicionais para visualizar o facto de que se formou um complexo receptor-antigénio (imunorreagente). Tais reagentes adicionais para HRPO incluem peróxido de hidrogénio e um precursor de corante de oxidação tal como diaminobenzidina ou .o-fenilenodiamina (OPD). Um reagente adicional útil com a glucose oxidase é 2,2^f-azino-di-(ácido 3-etil-benzotiazolina -G-sulfónico) (ABTS).

Os elementos radioactivos são também agentes marcadores úteis e são usados aqui de forma ilustrativa. Um agente de radiomarcação exemplar é um elemento radioactivo que produz emissão de raios gama. Os elementos que emitem eles próprios raios gama tais como I, I, I, I, I e Cr reprje sentam uma classe de grupos indicadores de elementos radioac/ tivos produzindo emissão de raios gama. E particularmente pre 125 ferido ο I. Um outro grupo de meios marcação úteis são

18 15 13 aqueles elementos tais como C, F, 0 e N que emitem eles próprios positrões. Os positrões assim emitidos produzem raios gama aquando do encontro com electrões presentes na mis^z 111 tura de ensaio. E também útil um emissor beta, tal como In ou ³H.

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-240s meios indicadores podem ser ligados directamente a uma molécula receptora útil neste invento ou pode compreender uma molécula separada. 0 meio indicador pode ser uma molécula separada tal como anticorpos que se ligam a moléculas receptoras úteis tal como anticorpos anti-rato de cabra ou coelho. A proteína A do Staphylococcusaureus, pode também ser usada como meio indicador ou de marcação de moléculas separadas onde são utilizadas moléculas receptoras inteiras ou substancial, mente inteiras deste invento; i.e., onde são usadas moléculas contendo a porção das regiSes Fc de moléculas receptoras que estão ligadas por uma proteína A. Em tais utilizaçães, a própria proteína A contém um marcador tal como um elemento radioactivo ou um corante fluorocromo.

Na prática particularmente preferida, o ensaio atrás dejs crito é efectuado como um ensaio de fase sólida, heterogéneo, no qual o antigénio contendo glucitolisina é ligado ou fixo a uma matriz de fase sólida para formar um suporte de fase sólida. 0 antigénio pode ser ligado ou fixo à matriz sólida através de qualquer um dos vários dos meios químicos ou físicos bem conhecidos. Embora a ligação por adsorção ou por imunorreacção seja só um dos meios de fixação, as palavras ligar e fi xar e as suas diversas variantes gramaticais são aqui utiliza, das de forma permutável.

A ligação física por adsorção do antigénio às paredes dos depósitos das placas de microtitulação utilizados como matrizes de fase sólida é ilustrada adiante. 0 meio de ligação química inclui ligação por um primeiro anticorpo que se liga a um epítopo de hemoglobina que, quando ligado, não interfere substancialmente com a ligação imunológica de epítopos glucito lisina pelas moléculas receptoras. Esta técnica de ensaio é geralmente referida como um ensaio em sanduíche. Outro meio de ligação química utiliza um reagente de carbodiimida solúvel em água tal como cloridrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida para formar uma amida ou um éster entre um ácido carboxílico da matriz e um grupo amino ou hidroxilo, respectivamente, do receptor ou vice-versa. Ainda outros meios de li66 953

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-25gação química utilizam reagentes polifuncionais tais como glutaraldeído ou cloreto cianúrico, como são bem conhecidos na ajc te.

São bem conhecidas na arte matrizes sólidas exemplares úteis nos processos acima e incluem uma matriz sólida tal como uma placa de microtitulação de 96 depósitos comercializada sob a designação de Falcon Microtest III Flexible Assay Plates (Fal. con Plastics, Oxnard, CA) ou uma tira de microtitulação conteri do doze depósitos em linha, tal como as tiras comercializadas sob a designação de Immulon I e II (Dynatech, Alexandria, VA). A tira ou placa de microtitulação é feita de um material plástico claro, de preferência cloreto de polivinilo ou polietileno. Matrizes sólidas alternativas para utilização num processo atrás descrito deste invento, incluem bolas de poliestireno, de cerca de 1 micron a cerca de 5 milímetros de diâmetro, disponíveis de Abbott Laboratories, North Chicago, IL; tubos, varas ou pás de qualquer tamanho conveniente; e látex de polis tireno cujas partículas de polistireno são de um tamanho de cerca de 1 micron e podem ser separadas por centrifugação a partir do restante do látex.

A matriz sólida pode também ser feita de uma variedade de materiais tais como dextrano de ligação cruzada, p.e. Sepha dex G-25, -50, -100, -200 ou semelhante, disponível de Pharmacia Fine Chemicals de Piscatauuay, N3, agarose e agarose de ligação cruzada, p.e. Sepharose 6B, CL6B, 4B, CL46 e semelhantes também disponíveis de Pharmacia Fine Chemicals.

processo de ensaio atrás descrito pode ser usado para determinar a quantidade de qualquer espécie particular de glicitolisina-hemoglobina presente numa amostra de hemoglobina co mo desejado, usando receptores imunoespecíficos para as espéci es de glucitolisina desejadas.

D. Sistemas de Diagnóstico

Outro aspecto do presente invento é um sistema de diagnós. tico que está tipicamente sob a forma de um equipamento, e é útil para efectuar um ensaio atrás descrito. 0 sistema contém

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-26uma variedade de embalagens.

Uma primeira embalagem contém uma matriz de fase sólida como atrás descrita. Essa matriz é, de preferência uma placa ou tira de microtitulação de plástico contendo uma variedade de depósitos, p.e., 96 ou 12, em cujas paredes dos depósitos é efectuado um processo de ensaio atrás descrito.

Uma segunda embalagem contém uma quantidade predetermina da de redutor de boro-hidreto compatível com a água. Este re.a gente é fornecido tipicamente como um pó seco.

I Uma terceira embalagem contém uma quantidade conhecida de moléculas receptoras específicas para a glicitolisina apropriada, de preferência receptores específicos para a glucitoli sina, tais como os segregados pelos hibridomas possuindo os nú meros de entrada ATCC HB 8356 e HB 8358. Estas moléculas receptoras estão tipicamente presentes como uma composição aquosa ou como um pó liofilizado, Em concretizações preferidas, os receptores são fornecidos ligados a um grupo indicador ou marcador como previamente discutido.

Uma quarta embalagem contém uma quantidade predeterminada de ácido ftálico ou de ácido biftálico. 0 ácido pode também ser fornecido dissolvido num meio aquoso ou como um sólido seco.

I

As concretizações preferidas incluem também urna embalagem adicional que contém uma espécie de glicitolisina-hemoglobina que imunorreage com os receptores fornecidos, Ou, preferivelmente, a embalagem contém glucitolisina-hemoglobina possuindo uma percentagem conhecida de glucitolisina para ser usada como um padrão ou controlo. Outras embalagens que podem também ser incluídas no sistema, incluem aqueles contendo sais ou soluções tampão tais como PBS, uma embalagem separada contendo mei. os indicadores tal como proteína A marcada ou anticorpos anti-receptor marcados, uma embalagem separada contendo reagentes visualizadores para meios indicadores de enzima tal como peróxido de hidrogénio e um percursor de corante oxidativo, contro los adicionais e semelhantes.

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-27Deve-se entender que cada embalagem incluída no sistema contém uma quantidade dos seus constituintes que é suficiente para efectuar um ensaio, incluindo controlos apropriados. De preferência, está contida em cada embalagem uma quantidade suficiente para efectuar uma pluralidade de ensaios.

Forma Preferida de Efectuar o Invento

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar, mas não li mitar, o presente invento.

Exemplo 1: Amostras de Hemoglobina

Obtiveram-se amostras de hemoglobina de 118 doentes diabéticos, tanto do sexo masculino como feminino, com idades variando entre os 18 e os 88 anos. Obtiveram-se também amostras de 35 adultos normais (normoglicémicos), do sexo masculino e feminino, com idades entre os 24 e 52 anos. As amostras foram obtidas a partir do Endocrinology and Diabetes Clinics of Scrijn ps Clinic and Research Foundation, La Oolla, Califórnia e de Kaiser Permanente, San Diego, Califórnia.

As amostras de sangue foram recolhidas em tubos contendo ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) como anticoagulante, e foram submetidas a centrifugação a cerca de 12 000-13 OOOxg dju rante 3 minutos num Microfuge 12 de Beckman para formar uma p_e lota de concentrado de glóbulos (GV) e uma fracção de plasma. A fracção de plasma foi rejeitada e a amostra de hemoglobina a ser ensaiada foi fornecida tipicamente como 10 ou 15 microlitros da pelota (concentrado de G.V.).

Para determinar o número de miligramas de hemoglobina por microlitro de uma pelota de concentrado de G.V. como acima obtida, um volume de uma pelota foi misturado com 1 volume ou com 3 volumes de Isoton III (Coulter Electronic, Inc., Hialeah, FL) para formar diluições de pelota 1:2 e 1:4 respectivamente. Cada diluição de pelota foi então analisada para determinar a concentração de hemoglobina usando Coulter Counter modelo S-Plus VI (Coulter Electronics) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente a hemoglobina presente nas diluições foi convertida em cianometa-hemoglobina usando reagente de

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J .......’* · -«A

-28Drabkin, e a quantidade presente foi determinada espectrofotometricamente pela absorção a 540 nanómeros (nm).

Verificou-se que o número médio de miligramas (mg) de he moglobina (Hb) por microlitro Çwl) de pelota de concentrado de G.V. era de 0,294 mg Hb^Al. Contudo, para facilidade na execu ção dos cálculos, esse valor foi arredondado para 0,3 mg Hb/ul para todas as determinações de razões baseadas em amostras de hemoglobina fornecidas como um volume conhecido de uma pelota de concentrado de glóbulos.

Quando as amostras de hemoglobina foram fornecidas como um volume conhecido de sangue total, a quantidade de hemoglobi na presente foi determinada usando um valor médio de 155 mg Hg/ml de sangue total para amostras obtidas a partir de machos e 135 mg Hb/ml para amostras de sangue de fêmeas.

Exemplo 2: Produção, Purificação e Marcação de Receptores hibridoma possuindo o número de entrada ATCC HB 8356 pro duz o anticorpo monoclonal G6C9 como descrito por Curtiss e col., 3. Clin. Invest. 72:1427-38 (1983). Fluídos de ascites tumorais contendo moléculas receptoras G6C9 foram obtidos a partir de ratos Balb/c com 10 semanas de idade, que tinham sido inoculados com 0,3 ml de óleo mineral e injectados intrape5 ritonealmente com 3-50x10 células H8 8356. 0 tempo médio para o desenvolvimento da ascite foi de 12 dias. Após clarifica, ção por centrifugação a 15 000xg durante 1 hora a 4 graus C, os fluídos da ascite tumoral foram recolhidos e armazenados congelados a -20 graus C.

Os receptores G6C9 foram purificados submetendo os fluídos da ascite tumoral a cromatografia líquida rápida de proteí. nas (FPLC) numa coluna de permuta aniónica Pharmacia Mono Q HR 5/5 num sistema Pharmacia PFLC usando um gradiente de 0-0,5 NaCl em 10 mM Tris, pH 8,0, e seguindo as instruções fornecidas com a coluna.

As moléculas receptoras G6C9 purificadas foram ligadas a peroxidase de rábano usando o processo descrito em Nakane e col., 3. Histochem. Cytochem., 22:1084-1089 (1974). Aqueles

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-29receptores são referidos daqui em diante como receptores HRPO-G6C9.

Exemplo 3* Preparação de Aductos Glucosilados

As proteínas e percursores seguintes foram submetidos a glucosilação e/ou redução: poli-L-lisina, poli-L-valina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ; Alfa-T-Boc-Lisina (Bachem, Torrance, CA); Hemoglobina Humana purificada (Sigma); e glucitolisina preparada pelo processo descrito por Schwartz e col., Arch. Biochem, Biophys., 181:542-549 (1977).

Os aductos glucosilados e reduzidos são referidos como aductos glc-RED. Os aductos glc-RED foram preparados misturajn do 2 mililitros (ml) de uma solução de 15 miligramas por mililitro (mg/ml) das diversas proteínas e percursores acima descritos com 2 ml de glucose 240 mM (Sigma) em fosfato tamponado salino (PBS) e 2 ml de 37,5 mg/ml de NaCNBH^ (3.T. Baker Chemi. cal Co, Phillipsburg, NJ) em PBS, pH 7,4. As misturas resultantes foram mantidas em tubos de vidro selados (16 x 100 mm) durante 120 horas a 37 graus C. Os aductos foram transferidos subsequentemente para sacos de diálise (Spectraphor, exclusão molecular 3 500 PM) e dialisado exaustivamente contra PBS durante 72 horas a 4 graus C, ajustado para uma concentração final de cerca de 5 mg/ml e armazenado a 4 graus C.

0s controlos de aductos glucosilados mas não reduzidos (glc-NR) foram preparados utilizando 2 ml PBS e nSo NaCNBH^ no processo acima.

0s controlos reduzidos não-glucosilados (aductos RED) fo ram preparados utilizando 2 ml PBSe não glucose 240 mM no processo acima.

Exemplo 4: Determinação de Especificidade do Anticorpo por Inibição Competitiva

0s aductos glc-RED, glc-NR e RED preparados no Exemplo 3 foram diluídos para concentrações variando de 200 microgramas por mililitro (y^g/ml) a 0,39_/Vtg/ml em PBS contendo 10% de soro de cabra normal (NGS). Quinhentos microlitros Çnl) das diversas diluições foram então misturadas em tubos de vidro com 500

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-30yj. dos receptores HRP0-G6C9 preparados no Exemplo 2 (diluído 1:150 em ΡΒΞ contendo 10 por cento de NGS) para formar misturas de imunorreacção competitivas. As misturas foram mantidas durante uma hora a 37 graus C para permitir que os receptores ligassem imunologicamente quaisquer epítopos só de reacção cruzada contendo resíduo glucitolisina ou não contendo glucitolisina, e formassem uma fase líquida imunorreagente.

As misturas de imunorreacção competitiva mantida foram subsequentemente ensaiadas para a quantidade de receptores HRP0-G6C9 não ligados. Isto foi conseguido usando glucitolisi. na-hemoglobina fixa a fase sólida como um alvo ou como antigénio de captura num ELISA.

A glucitolisina-hemoglobina fixa à fase sólida foi prepa, rada misturando em primeiro lugar 0,240 ml de uma pelota de concentrado de GV preparado de acordo com o processo do Exemplo 1 usando o sangue de um diabético com 15 ml de água destilada contendo 0,05 mM de ácido ftálico (uma diluição 1:62,5 em volu. me). A mistura de reacção ácida resultante foi mantida durante 15 minutos a 37 graus C para formar um hemolisado.

Subsequentemente, 50 microlitros do hemolisado foram mis, turados com 50 microlitros de NaBH^ 400 mM, nos depósitos de uma placa de microtitulação (matriz sólida). A mistura de reacção de redução resultante foi mantida durante 15 minutos a 37 graus C para permitir a formação de glucitolisina-hemoglobi na, a qual no final de este tempo de permanência ficou fixa à matriz de fase sólida para formar glucitolisina-hemoglobina Pi xa à fase sólida (suporte sólido) e uma fase líquida contendo boro-hidreto não reagido e o restante da mistura de reacção de redução. As fases sólida e líquida da mistura resultante foram separadas. Os suportes sólidos formados pela glucitolisina-hemoglobina adsorvida fixa às paredes dos depósitos de matriz sólida foram então lavados 4 vezes com 350^1 de PBS contendo 0,05% de Tu/een 20 /*monolaurato sorbitano de polioxietileno (20).7 para formar glucitolisina-hemoglobina isolada fixa à fase sólida.

Um volume de 100 mJ. de cada uma das misturas mantidas de

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-31imunorreacção competitiva HRP0-G6C9/aducto, foi então misturado com glucitolisina-hemoglobina fixa à fase sólida. A segunda mistura de imunorreacção de fase líquida/sólida assim formai da foi mantida durante 15 minutos a 37 graus C para permitir que quaisquer moléculas de anticorpo que não tenham imunorreagido com um aducto-inibidor ou controlo se possam ligar imunologicamente à glucitolisina-hemoglobina de fase sólida e formar um imunorreagente fixo à fase sólida.

As fases sólida e líquida foram novamente separadas e quaisquer imunorreagentes fixos à fase sólida que se formaram foram novamente separados das fases líquidas por decantação e lavagem de cada um dos depósitos 4 vezes com solução de lavagem (PBS contendo 0,05 por cento de Tiueen 20). A quantidade de imunorreagente fixo à fase sólida que se formou foi então determinada misturando 100^1 de solução de substrato HRPO aca bada de preparar £~0,0125% ^2^2 ^e θ»⁶? mg/ml de £-fenilenodiamina (OPD) em água destilada_7 em cada depósito. Deixou-se a cor revelar à temperatura ambiente (cerca de 20 a cerca de 25 graus C) durante 5 minutos. A reacção de conversão do substra to (produtora de cor) foi então interrompida misturando 50^1 de 4 N em cada depósito. A densidade óptica (D.O.) das soluçães foi determinada a um comprimento de onda de 490 nm usando um leitor de placa de microtitulação Dynatech MR600 (Dynatech, Alexandria, VA).

Os resultados deste estudo estão ilustrados nas Figuras 2A, B e C. Aqueles resultados indicam que os aductos reduzidos mas não glucosilados (Figura 2A) e os aductos glucosilados mas não reduzidos (Figura 2B) não inibiram a ligação de HRPO-G6C9 à glucitolisina-hemoglobina fixa à fase sólida. Contudo, como ilustrado na Figura 2C, as proteínas glucosiladas e reduzidas e percursores contendo lisina, i.e., glucitolisina, foram inibidores muito eficazes da imunorreacção entre HRPO-G6C9 e a glucitolisina-hemoglobina fixa à fase sólida, mas a poli-L-valina glucosilada e reduzida não foi. Porque 0 facto estrutural comum àqueles aditivos que inibiram a formação de imunorreagentes de fase sólida foi a presença de um resíduo glucitolisina, os resultados deste estudo demonstram que os

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-32receptores G6C9 imunorreagem com um epítopo contendo glucitolisina quando esse epítopo é apresentado como glucitolisina-hemoglobina fixa à fase sólida.

Exemplo 5: Optimização da Redução z

a. Redutores Compatíveis com a Agua

Como previamente descrito, a glucitolisina é a forma alco ólica da hexose reduzida da glucose ligada covalentemente ao grupo amino epsilon da lisina. Os estudos seguintes foram efectuados para examinar diferentes redutores de boro-hidreto compatíveis com a água em relação às suas capacidades para pro duzir resíduos glucitolisina da hemoglobina sob diversas condi, çães.

As amostras de hemoglobina foram fornecidas como 10^mI de uma pelota de concentrado de GU preparada como descrito no Exemplo 1 (cerca de 3 mg de hemoglobina) usando sangue de um indivíduo normal e de um indivíduo diabético. A percentagem de hemoglobina glicosilada em cada amostra foi determinada usando o sistema de ensaio GLY-AFFIN GHb comercialmente disponível (Isolab, Akron, 0H) e mostrou ser de 6,3 por cento na amostra normal e 8,9 por cento na amostra havia cerca de 1,4 vezes mais hemoglobina tra diabética em comparação com a amostra tra foi misturada com 615de água destilada ou de ácido ftá lico 0,05 M uma do, por diabética. Assim, glucosilada na amosnormal. Cada amosIsto produziu misturas contendo hemoglobina a concentração de cerca de 4,8 mg/ml e, quando se usou ácia uma razão de pelo menos cerca de 10 micromcles de ácido miligrama de hemoglobina.

As misturas resultantes foram mantidas durante 15 minua 37 graus C. Durante esse período de tempo substancialtos mente todos os GU presentes em cada mistura foram lisados, libertando assim a hemoglobina contida neles para a solução e formando um hemolisado.

Subsequentemente, 50^1 de cada hemolisado (cerca de

0,24 mg de hemoglobina) foram misturados num depósito de placa de microtitulação com 50 microlitros de diversas concentra66 953

Ref: EPG:11-SCRF 111.0 % _;.....

-33çães de NaBH^ ou KBH^ para formar misturas de reacção de redução. Aquelas misturas foram mantidas durante 15 minutos a 37 graus C. Durante esse período de tempo os resíduos lisina da hemoglobina tendo glucose ligada covalentemente aos seus grupos amino epsilon foram reduzidos para formar resíduos glucitolisina. Em adição, a glucitolisina-hemoglobina que se formou foi fixa por adsorção às paredes do depósito da placa de microtitulação, i.e. formou-se glucitolisina-hemoglobina ligada à fase sólida.

As fases sólida e líquida foram separadas por decantação. Cada um dos depósitos foi então lavado 4 vezes com uma solução de lavagem para separar ainda o boro-hidreto não reagido de glucitolisina-hemoglobina fixa à fase sólida (ligada ao depósito da placa de microtitulação).

A cada depósito misturaram-se então 100 microlitros de receptores G6C9 (HRP0-G6C9) marcados com peroxidase de rábano obtidos no Exemplo 2 para formar uma mistura de imunorreacção. A mistura foi mantida durante 15 minutos a 37 graus C, permitindo assim que os receptores marcados se liguem imunologicamente à glucitolisina-hemoglobina presente fixa à fase sólida (ligada ao depósito da placa de microtitulação), e formem um imunorreagente fixo à fase sólida (ligado ao depósito da placa de microtitulação). D HRP0-G6C9 não imunorreagido (não ligado) foi removido dos depósitos por decantação, seguido de lavagem, 5 vezes, com solução de lavagem. A quantidade de imunorreageji te ligado à fase sólida formado foi então determinada como des. crito no Exemplo 4.

Os resultados deste estudo estão ilustradas nas Figuras 3A e B, e demonstram diversos fenómenos interessantes. Em pri meiro lugar, como se pode ver em ambas as Figuras 3A e 3B, não houve qualquer diferença substancial entre os resultados obtidos usando boro-hidretos de sódio ou de potássio como o redutor boro-hidreto compatível com a água.

Em segundo lugar, a Figura 3A demonstra que a redução, (formação de glucitolisina) na ausência de ácido produz, como esperado, um maior número de epítopos contendo resíduo glucito

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-34lisina ligados ao receptor na amostra contendo a maior quantidade de gluco-hemoglobina, i.e., a amostra de diabético. Contudo, quando aqueles resultados são comparados aos resultados obtidos quando se efectuam reduções na presença de ácido (Fig_u ra 3B), verifica-se que são produzidos um maior número de res.1 duos glucitolisina ligada ao receptor em ambas as amostras de hemoglobina em relação ao número produzido na ausência de ácido ftálico. Em adição, houve uma maior diferença no número de resíduos glucitolisina ligados ao receptor entre as amostras normal e de diabético quando a redução foi efectuada na prese_n ça de ácido ftálico (Figura 3B) em comparação com quando efectuada na ausência desse ácido (Figura 3A). Estes dois factos indicam que a presença de ácido ftálico potência, inesperadamente, a capacidade de um redutor de boro-hidreto compatível com a água de produzir epítopos contendo resíduos glucitolisina bem como lisar os glóbulos vermelhos e remover a gluco-hemo globina lábil.

Finalmente, quando os resultados da Figura 3A são comparados com aqueles apresentadas na Figura 3B, verifica-se que quando a amostra de hemoglobina foi misturada com ácido ftálico a uma razão de pelo menos cerca de 10 micromoles de ácido por miligrama de hemoglobina, a reacção de redução foi potenciada mesmo quando a hemoglobina foi misturada com boro-hidreto a uma razão tão baixa como pelo menos cerca de 2,6 micromoles de boro-hidreto por miligrama de hemoglobina.

As descobertas acima feitas estavam contra os ensinamentos da arte, e portanto inesperados. Como atrás discutido, a arte ensina que a quantidade total de gluco-hemoglobina numa amostra de hemoglobina obtida a partir de GV é a soma das fra£ ções de gluco-hemoglobina lábil e estável. De acordo com Bisse e col., Diabetes ’31: 630-633 (1982), a fracção lábil é reti rada de uma amostra de hemoglobina através de tratamento com ácido biftálico, i.e., a quantidade de gluco-hemoglobina dispo, nível para ensaio está diminuída numa amostra tratada com ácido biftálico. Portanto, a arte ensina que, num ensaio que mede a quantidade de gluco-hemoglobina numa amostra, o sinal pro

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-35duzido por uma amostra possuindo a sua fracção lábil reduzida deveria ser menor que o produzido por uma amostra não reduzida comparável.

b. Período de Permanência da Mistura de Reacção de Redução

As misturas de reacção ácidas foram preparadas usando he moglobina fornecida como amestras de sangue total de cada um dos indivíduos de sexo feminino diabético e normal. A concentração de ácido ftálico em cada mistura foi uma constante de 0,05 M. Contudo, a concentração de hemoglobina variou dentro de uma gama de 27,0 mg/ml a 0,270^Ag/ml, produzindo assim razões de milimoles de ácido/mg de Hb variando de 1,85 a 185,2. As misturas de reacção ácida foram todas mantidas durante 15 minutos a 37 graus C para formar hemolisados.

Subsequentemente, as misturas de reacção de redução foram preparadas em duplicado misturando 50 microlitros de cada hemolisado e 50 microlitros de NaBH^ 400 mM, produzindo assim razões de milimoles de boro-hidreto/mg de Hb variando de 0,0148 a 1,481. Um conjunto das misturas de reacção de redução foi mantido durante 15 minutos e outro durante 30 minutos, cada um a 37 graus C. As amostras foram depois separadas do boro-hidreto não reagido e restantes composições de mistura de reacção de redução, lavadas, e ensaiadas em relação à glucitolisina-hemoglobina como descrito no Exemplo 4.

Como se vê na Figura 4, os resultados deste estudo indicam que um período de permanência de reacção de redução de 15 ou de 30 minutos produz quantidades mensuráveis de glucitolisi. na-hemoglobina em amostras normais e de diabéticos em todas as concentrações de hemoglobina examinadas. Deve-se notar que as razões óptimas para a produção de glucitolisina ensaiável mostraram ser 46,3 milimoles de ácido/mg Hb para as misturas de reacção ácida e 0,37 milimoles de boro-hidreto/mg Hb para as misturas de reacção de redução quando a hemoglobina estava pre sente em concentrações de 1,08 mg/ml e 0,54 mg/ml nas reacções respectivas.

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-36Exemplo 6: Deplecão de Gluco-hemoolobina Lábil z

a. Misturas de Reacção Acidas

A dissociação de gluco-hemoglobina lábil em glucose e hemoglobina tem sido relatada como sendo catalisada por ácido em soluções possuindo um valor de pH de cerca de 5. Bisse e col., Diabetes, 31:630-633 (1982). Para determinar se a estabilidade dependente do pH descrita da gluco-hemoglobina lábil foi afectada pelo tipo de ácido usado, soluções contendo ácido ftálico, citrato, ácido acético, fosfato, D(+) glucosamina, ácido alfa-cetoglutárico, ácido oxalacético, ácido oxálico di-potássico, ácido succínico ou ácido pirúvico foram preparadas a uma concentração de 0,05 M e a um valor de pH dentro da gama de 4 a 5. As amostras de hemoglobina fornecidas como dez micro litros de uma pelota de concentrado de GV fGram preparadas como descrito no Exemplo 1 a partir de sangue obtido de um indivíduo diabético e de um normal. Uma amostra de diabético e uma amos, tra normal de hemoglobina foram, cada uma, misturadas com 615 microlitros de cada uma das soluções acídicas acima para formar misturas de reacção ácida ou com 615 microlitros de água destilada como controlo.

Em adição, pelotas de concentrado de GV foram preparadas a partir de GV de indivíduos normais e diabéticos que tinham sido incubados durante a noite (cerca de 18 horas) em solução isotónica salina. Dez microlitros de cada uma dessas pelotas foram misturados com 615 microlitros de ácido ftálico 0,05 M ou água destilada como controlo.

As misturas de reacção ácida e as soluções de controlo as. sim formadas foram mantidas a 37 graus C durante 15 minutos pai ra formar hemolisados. A glucitolisina-hemoglobina foi subsequentemente formada e ensaiada usando porções de 50 microlitros de cada um dos hemolisados NaBH^ e receptores HRP0-G6C9 como descrito no Exemplo 4.

0s resultados deste estudo estão ilustrados na Figura 5. Aqueles resultados indicam que reagindo gluco-hemoglobina com ácido ftálico antes da redução com boro-hidreto potência signi,

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**u

-37ficativamente a formação de resíduos glucitolisina em comparação com os outros ácidos examinados.

b. Concentração de Acido

Para examinar o efeito da concentração do ácido ftálico, dentro da gama de pH 4-5, na produção de glucitolisina hemoglo bina e execução do ensaio, misturas de reacção ácida possuindo concentrações de ácido ftálico de 0,5 M ou de 0,025 M foram preparadas, possuindo concentrações de 75, 50, 37,5, 30, 25 ou 21,4 miligramas de hemoglobina por mililitro. Assim, nas misturas contendo 0,05 M de ácido ftálico havia uma gama de razão de milimoles de ácido ftálico por miligrama de hemoglobina de 0,66 a cerca de 2,34. De forma semelhante, na mistura de ácido ftálico de 0,025 M, a gama de razões era de 0,33 a 1,17. A hemoglobina foi fornecida como um volume predeterminado de pelota de concentrado de GV preparada a partir de sangue de um indivíduo diabético como descrito no Exemplo 1.

As misturas de reacção ácida resultantes foram mantidas durante 15 minutos a 37 graus C para formar hemolisados. A glucitolisina-hemoglobina foi subsequentemente formada e ensaia da usando 50 microlitros de cada um dos hemolisados, NaSH^ e receptores HRP0-G6C9 como descrito no Exemplo 4.

A Figura 6 ilustra os resultados deste estudo. Aqueles resultados indicam que ambas as misturas de reacção de ácido ftálico 0,05 M e 0,025 M potenciaram a formação de epítopos contendo resíduo glucitolisina ligados por receptores marcados quando a razão de milimoles por miligrama de hemoglobina estava entre cerca de 100 e cerca de 2,34.

Em adição, os resultados apresentados na Figura 6 demons tram que a reacção com ácido ftálico isolado não produz glucitolisina ensaiável.

c. Valor de pH Acido

Prepararam-se soluções de reserva contendo ácido ftálico 0,05 M possuindo valores de pH de 3,5, 4,5, 5,5 e 6,5. Prepararam-se então quatro misturas de reacção ácida usando cada sei

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-38lução de reserva . As amostras de hemoglobina fornecidas como 10 microlitros de pelota de concentrado de GV obtida como no Exemplo 1 usando cada uma amostras de sangue de dois diabéticos e dois normais, foram misturadas com 615 microlitros de ca da solução de reserva. As misturas de reacção ácida resultante foram mantidas durante 15 minutos a 37 graus C para formar hemolisados. A glucitolisina-hemoglobina foi subsequentemente formada e ensaiada usando 50 microlitros de cada um dos hemoli sados NaBH^ e receptores HRP0-G6C9 como descrito no Exemplo 4.

A Figura 7 ilustra os resultados deste estudo, e mostra que o maior número de resíduos glucitolisina ligável imunolégi, camente foram produzidos em ensaios efectuados em hemolisados formados usando ácido ftálico possuindo um valor de pH de cerca de 3,5. Contudo, o valor de pH produzindo a maior diferença no sinal (densidade óptica) entre as amostras normal e de diabético foi de 4,5. Além disso, o uso de soluçães de ácido ftálico possuindo valores de pH de 5,5 e 6,5 produziu também quantidades mensuráveis de resíduos glucitolisina.

Para examinar a variabilidade no valor de pH de solução aquosa de ácido ftálico 0,05 M, prepararam-se quatro soluçães 0,05 M e os seus valores de pH não ajustados foram determinados usando um medidor de pH digital Altex modelo 3500 (Beckman Instruments, Berkeley, CA) em combinação com um eléctrodo Calomel MicroProbe (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Os \je lores de pH obtidos para as quatro soluçães não ajustadas variaram de 4,13 a 4,5 e tinham uma média de cerca de 4,3.

d. Tempo de Permanência da Mistura de Reacção z

Acida

Uma finalidade da etapa de reacção ácida do processo de ensaio do presente invento consiste em diminuir a fracção de gluco-hemoglobina lábil (dissociar a gluco-hemoglobina lábil em hemoglobina e glucose) enquanto mantém a fracção estável. 0 efeito de variar o período de tempo de permanência da mistura de reacção ácida foi portanto examinado.

Foram estudados quatro grupos de misturas de reacção áci da. Cada grupo continha quatro misturas preparadas misturando

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-39uma amostra de hemoglobina de cada uma das 2 amostras de sangue de um indivíduo do sexo feminino diabético e 2 amostras de indivíduo normal com ácido ftálico 0,05 M como descrito no Exemplo 6c. Um dos grupos de mistura de reacção ácida foi então imediatamente misturado com NaBH^ e depois transformado e ensaiado como descrito no Exemplo 4. Os restantes 3 grupos fo ram mantidos por um período de tempo de 5, 10 ou 15 minutos ari tes de ser misturado com NaBH^ como no Exemplo 4.

Os resultados deste estudo, como se vê na Figura 8, indi. cam que um aumento no período de tempo de permanência da mistu ra de reacção ácida resultou na formação de menos glucitolisina ensaiável na amostra diabética número 1, indicando assim que essa amostra continha inicialmente uma quantidade substancial de gluco-hemoglobina lábil. 0 tempo de permanência de 15 minutos produziu também menos glucitolisina ensaiável na amostra diabética número 2 e na amostra normal número 1 em compara ção com o período de tempo inferior a um minuto. Estes resultados indicam que um período de tempo de permanência da mistura de reacção ácida tão curto como de cerca de 5 minutos pode resultar em depleção da fracção de gluco-hemoglobina lábil numa amostra de hemoglobina.

Exemplo 7: Temperatura de Ensaio

Os hemolisados possuindo concentrações de hemoglobina vja riando de 27 ^g/ml a 1,35^ug/ml foram preparados de acordo com o Exemplo 5b, usando sangue total de indivíduos do sexo femini no normais e diabéticos. Os hemolisados foram então reduzidos e ensaiados quer à temperatura ambiente (cerca de 20-25 graus C) quer a 37 graus C, como descrito no Exemplo 4 usando períodos de permanência de 30 minutos para as reacções de redução e de anticorpo.

A Figura 9 ilustra que enquanto a quantidade de glucitolisina-hemoglobina detectada era ligeiramente superior quando as misturas de redução e de imunorreacção foram mantidas a 37 graus C, não havia qualquer diferença substancial entre os resultados a 37 graus e os obtidos à temperatura ambiente.

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-40Exemplo 8: Avaliação ELISA

Embora o processo para optimizar a produção de resíduos glucitolisina ensaiável em gluco-hemoglobina usando ácido ftálico e boro-hidreto, como aqui descrito, é aplicável a qualquer formato de imunoensaio, a característica de execução de um ELISA usando esse processo foi avaliado em detalhe para determinar a utilidade clínica como abaixo descrito. 0 formato ELISA particular avaliado foi efectuado da seguinte forma:

Dez microlitros de uma pelota de concentrado de GV preparada como descrito no Exemplo 1 usando sangue de diversos in divíduos normais e diabéticos, foram misturados com 615y«,l de biftalato de potássio 0,05 Μ. A mistura de reacção ácida assim formada foi mantida durante 15 minutos a 37 graus C para formar um hemolisado. Subsequentemente, 50 microlitros do hemolisado foram pipetados para cada depósito da placa de microti tulação 3 NUNC Immuno I (placas de polistireno de fundo plano, Gibco Laboratory, Lau/rence, MA). Foi então misturado um volume de 50 microlitros de NaBH^ 400 mM a cada amostra de hemolisado para formar misturas de reacção de redução. As misturas de reacção de redução obtidas foram mantidas durante 15 minutos a 37 graus C para produzir glucitolisina hemoglobina ligada aos depósitos da placa de microtitulação. A glucitolisina-hemoglobina ligada ao depósito da placa da microtitulação foi separada do excesso de boro-hidreto decantando e lavando os d.e pósitos 4 vezes com 0,35 ml de PBS contendo 0,05% Tiveen 20.

A quantidade de glucitolisina-hemoglobina ligada ao depó. sito foi então determinada misturando em cada depósito 0,100 ml dos receptores HRP0-G6C9 do Exemplo 2 diluído a 1:300 em PBS contendo 10 por cento de soro de cabra normal para formar uma mistura de imunorreacção de fase líquida/sólida. A mistura de imunorreacção foi mantida durante 15 minutos a 37 graus C. As fases sólida e líquida foram separadas e os depósitos foram então lavados 5 vezes com 0,35 ml de PBS (pH 7,4) conteri do 0,05 por cento de Tween 20 para separar os receptores não ligados dos imunorreagentes fixos à fase sólida. Os receptores HRP0-G6C9 presentes como imunorreagentes fixos à fase sóli

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da foram detectados usando a solução de substrato OPD como descrito no Exemplo 4.

aducto Glc-RED Hb preparado no Exemplo 3 foi usado como um padrão interno para o ELISfi. Prepararam-se soluções pa-

globina Hb Glc-RED diluída em tampão bicarbonato de sódio 0,1 M, pH 9,0, contendo 10 por cento de soro de cabra normal. Para produzir uma curva padrão, o ELISA acima descrito foi efectuado usando 50 microlitros de cada solução padrão em vez do hemo lisado.

a. Recuperação

Efectuaram-se estudos de recuperação para determinar se o ELISA poderia medir com exactidão diversas quantidades de gluco-hemoglobina de um hemolisado de eritro^itos de diabético adicionada a um hemolisado de um indivíduo normal. Isto foi conseguido preparando um hemolisado de um indivíduo normal que continha diversas adições com percentagem cada vez maior (picos) de um hemolisado de um indivíduo diabético.

A recuperação da quantidade de gluco-hemoglobina diabéti ca adicionada ao hemolisado do indivíduo normal foi então determinada usando o ELISA acima descrito. Como se mostra na Fj. gura 10, os resultados obtidos demonstram uma relação linear sobre a gama âe acliçOes percentuais (picos) ensaiada, indicando assim uma relação aditiva entre a quantidade de gluco-hemoglobina presente numa amostra e a quantidade de glucitolisina-hemoglobina determinada pelo ELISA.

b. Reprodutibilidade dos Resultados ELISA

A reprodutibilidade do ELISA foi determinada por estudos intra-ensaio e inter-ensaio. Para determinações intra-ensaio, amostras de hemoglobina de três indivíduos diferentes foram ers saiadas 60 vezes cada uma. 0 coeficiente de variação entre os valores obtidos para cada indivíduo variou de 1,6 por cento a 6,4 por cento.

Para determinações inter-ensaio, amostras de hemoglobina

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-42de 3 indivíduos diferentes foram ensaiadas em 12 ocasiões dife rentes. A reprodutibilidade do inter-ensaio foi determinada como variando de 8,3 por cento a 10,4 por cento.

presente invento foi descrito em relação a concretizações preferidas. E evidente para os entendidos na arte que se podem fazer modificações e/ou variações da matéria revelada sem se afastar do objecto do invento aqui apresentado.

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Claims (15)

1 - Método para determinar a quantidade de gluco-hemoglo bina estável numa amostra contendo gluco-hemoglobina, caracterizado por compreender os passos de:

(a) misturar a dita amostra num meio aquoso com ácido ftálico ou biftálico possuindo um valor pH de cerca de 3 a cer. ca de 6, numa proporção de pelo menos cerca de 1,5 milimoles do dito ácido por miligrama de hemoglobina para formar uma mis. tura reaccional ácida;

(b) manter a dita mistura reaccional ácida durante um período de tempo predeterminado, a uma temperatura acima de cerca de 0 graus C a cerca de 37 graus C, suficiente para remo, ver a gluco-hemoglobina lábil presente, enquanto se mantém pre sente na amostra original a gluco-hemoglobina estável;

(c) misturar a dita mistura reaccional com um redutor boro-hidreto compatível com a água a uma proporção de pelo menos cerca de 0,015 moles de boro-hidreto por miligrama de hemo, globina para formar uma mistura reaccional de redução;

(d) manter a dita mistura reaccional de redução por um período de tempo predeterminado a uma temperatura acima de cerca de 0 graus C até cerca de 37 graus C suficiente para fojo mar glucitolisina-hemoglobina;

(e) separar a dita glucitolisina-hemoglobina de qualquer boro-hidreto não reagido para formar glucitolisina-hemoglobina isolada;

(f) misturar a dita glucitolisina-hemoglobina isolada com moléculas receptoras específicas para glucitolisina para formar uma mistura de imunorreacção;

(g) manter a dita mistura de imunorreacção sob condiçães de ensaio biológico por um período de tempo suficiente para que as moléculas receptoras se liguem imunologicamente à dita glucitolisina-hemoglobina para formar um imunorreagente; e (h) determinar a quantidade de imunorreagente que se fox

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-44mou na mistura de imunorreacção mantida.

2 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita mistura do passo (a) ser efectuada a uma razão de pelo menos de cerca de 15,0 milimoles de ácido por miligrama de hemoglobina.

3 - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por a dita solução ácida do passo (a) ter um valor de pH de cerca de 4 a cerca de 5.

4 - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por a dita mistura do passo (c) ser efectuada a uma razão de pelo menos cerca de 0,15 milimoles de boro-hidreto por mili grama de hemoglobina.

5 - Método,de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os receptores do passo (f) estarem sob a forma de um ari ticorpo monoclonal.

6 - Método, de acordo com a reivindicação 5, caracteriza do por o dito anticorpo monoclonal ser segregado pelos hibrido^ mas possuindo os números de entrada ATCC HB 8356 ou HB 8358.

7 - Método, para determinar a quantidade de gluco-hemoglobina estável numa amostra contendo gluco-hemoglobina caracterizado por compreender os passos de:

(a) proporcionar um volume predeterminado de uma pelota de concentrado de glóbulos vermelhos;

(b) misturar o dito volume predeterminado de pelota com uma solução aquosa 0,05 M de ácido ftálico a um valor de pH de cerca de 4 a cerca de 5 a uma razão de cerca de 1 volume de pe. lota para cerca de 62,5 volumes de solução aqucsa de ácido para formar uma mistura reaccional ácida;

(c) manter a dita mistura reaccional ácida por um perío do de tempo de cerca de 15 minutos a cerca de 30 minutos a uma temperatura de cerca de 20 graus C a cerca de 37 graus C para

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Ref: EPG:11-SCRF 111.0 formar um hemolisadoj (d) misturar num depósito de placa de microtitulação um volume predeterminado do dito hemolisado com um volume igual de uma solução aquosa possuindo uma concentração de boro-hidreto de sódio ou boro-hidreto de potássio de cerca de 400 mM para formar uma mistura reaccional de redução contendo uma razão de pelo menos cerca de 0,15 milimoles de boro-hidreto por miligra ma de hemoglobina;

(e) manter a dita mistura reaccional de redução por um período de tempo de cerca de 15 minutos a cerca de 30 minutos a uma temperatura de cerca de 20 graus C a cerca de 37 graus C para formar glucitolisina-hemoglobina ligada ao depósito da placa de microtitulação;

(f) separar a dita glucitolisina-hemoglobina, ligada ao depósito, do dito boro-hidreto, para formar glucitolisina-hemo globina ligada ao depósito, isolada;

(g) misturar a dita glucitolisina-hemoglobina, ligada ao depósito isolada, com uma quantidade predeterminada de receptores enzimaticamente marcados segregados pelos hibridomas possjj indo os números de entrada ATCC HB 8356 ou HB 8358 para formar uma mistura de imunorreacção;

(h) manter a dita mistura de imunorreacção por um perío do de tempo de cerca de 15 minutos a cerca de 30 minutos a uma temperatura de cerca de 20 graus C a cerca de 37 graus C, sendo o dito período de tempo suficiente para que os ditos recepto res se liguem imunologicamente à dita glucitolisina-hemoglobina e formem um imunorreagente ligado ao depósito da placa de microtitulação; e (i) determinar a quantidade de imunorreagente ligada ao depósito da placa de microtitulação que se formou no passo (h).

8 - Método para converter gluco-hemoglobina estável em glucitolisina-hemoglobina de uma amostra de gluco-hemoglobina contendo hemoglobinas lábeis e estáveis caracterizado por compreender os passos de:

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Ref: EPG:11-SCRF 111.0 (a) misturar a dita amostra num meio aquoso com ácido ftálico ou biftálico possuindo um valor de pH de cerca de 3 a cerca de 6, a uma razão de pelo menos cerca de 1,5 milimoles do dito ácido por miligrama de hemoglobina para formar uma mis tura reaccional ácida;

(b) manter a dita mistura reaccional ácida por um perlo, do de tempo predeterminado, a uma temperatura superior a cerca de 0 graus C até cerca de 37 graus C, suficiente para remover a gluco-hemoglobina lábil mantendo-se presente a gluco-hemoglo. bina estável na amostra original;

(c) misturar a dita mistura reaccional com um redutor de boro-hidreto compatível com água a uma razão de pelo menos cerca de 0,015 milimoles de boro-hidreto por miligrama de hemo globina para formar uma mistura reaccional de redução?

(d) manter a dita mistura reaccional de redução por um período de tempo predeterminado a uma temperatura superior a cerca de 0 graus C até cerca de 37 graus C, suficiente para formar glucitolisina-hemoglobina; e (e) separar a dita glucitolisina-hemoglobina de qualquer boro-hidreto não reagido para formar glucitolisina-hemoglobina isolada.

9 - Método, de acordo com a reivindicação 8, caracteriza, do por a dita mistura do passo (a) ser efectuada a uma razão de pelo menos cerca de 15 milimoles de ácido por miligrama de hemoglobina.

10 - Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a dita solução ácida do passo (a) ter um valor de pH de cerca de 4 a cerca de 5.

11 - Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a dita mistura do passo (c) ser efectuada a uma razão de pelo menos cerca de 0,15 milimoles de boro-hidreto por mili. grama de hemoglobina.

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Ref: EPG:11-SCRF 111.0

12 - Método de acordo com a reivindicação 8, caracteriza^ do por a dita amostra estar sob a forma de glóbulos vermelhos.

13 - Sistema de diagnóstico adequado para efectuar um ejn saio de fase sólida para determinar a quantidade de gluco-hemo globina estável presente numa amostra de gluco-hemoglobina, ca racterizado por compreender:

(a) uma primeira embalagem contendo uma matriz de fase sólida em cuja superfície o dito ensaio é efectuado;

(b) uma segunda embalagem contendo uma quantidade prede. terminada de um redutor de boro-hidreto compatível com água;

(c) uma terceira embalagem contendo uma quantidade conhecida de moléculas rsceptoras específicas para a glucitolisi. na; e (d) uma quarta embalagem contendo uma quantidade predeterminada de ácido ftálico ou de ácido biftálico;

estando os conteúdos das ditas embalagens presentes em quantidades respectivas suficientes para efectuar o dito ensaio.

14 - Sistema de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por as ditas moléculas receptoras especjí ficas para a glucitolisina serem segregadas pelos hibridomas possuindo os números de entrada ATCC HB 8356 ou HB 8358.

15 - Sistema de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por as ditas moléculas receptoras estarem ligadas a um marcador.