JP3269765B2

JP3269765B2 - ヘモグロビン誘導体の免疫学的測定方法及びその方法に用いる処理試薬

Info

Publication number: JP3269765B2
Application number: JP34728995A
Authority: JP
Inventors: 浩篠木; 芳和天野
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1995-12-14
Filing date: 1995-12-14
Publication date: 2002-04-02
Anticipated expiration: 2015-12-14
Also published as: DE69617374D1; JPH09166594A; EP0779513B1; EP0779513A1; DE69617374T2; US6027907A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヘモグロビン誘導体、好
適にはヘモグロビン誘導体としてのグリコヘモグロビ
ン、特にヘモグロビンＡ_1Cの免疫学的測定方法に関す
る。またこの測定方法に使用する処理試薬に関するもの
である。

【０００２】

【発明の背景】ヘモグロビンＨｂは赤血球中に含まれ、
酸素の運搬にあずかる呼吸色素である。蛋白のグロビン
と鉄錯化合物であるヘムとが結合して構成され、グロビ
ンは４つのサブユニット（それぞれ２本のα鎖系とβ鎖
系）からなっている。成人溶血液中の９０％以上を占め
る主成分はサブユニット組成α₂β₂の成人ヘモグロビン
（ＨｂＡ：後記するグリコヘモグロビンＨｂＡ₁などと
区別するためＨｂＡ₀とも称される）であり、微量成分
としてＨｂＡ₂（α₂δ₂）などがある。

【０００３】ＨｂＡには種々のヘモグロビン誘導体が存
在し、血液中のヘモグロビン誘導体の量を測定すること
は、種々の医学的状況において重要なものとなってい
る。特に重要なヘモグロビン誘導体はグリコヘモグロビ
ン（glycated hemoglobin）である。このグリコヘモグ
ロビンは、ＨｂＡをイオン交換樹脂によりＨｂＡ_1a1、
ＨｂＡ_1a2、ＨｂＡ_1b、ＨｂＡ_1Cに分画されたものの総
称であり、ＨｂＡ₁と呼ばれる（グリコシル化ヘモグロ
ビンとも呼ばれる）。これらのグリコヘモグロビンはい
ずれも同じ一次構造を持つが、正常ヘモグロビンＨｂＡ
のβ鎖のＮ末端バリンのアミノ基がグルコース（または
グルコース−６−燐酸やフルクトースなど）とアルドイ
ミン（シッフの塩基）を形成し、さらにアマドリ(Amado
ri) 転位により、ケトアミンを形成して安定となったも
のである。

【０００４】特にグルコースが結合したグリコヘモグロ
ビンは、ＨｂＡ_1C（グルコヘモグロビン; glycosylated
hemoglobin，以下ヘモグロビンＡ_1Cとも称する）と呼
ばれ、グリコヘモグロビンの大部分を占める。その含量
は血糖値に比例し、正常人で総ヘモグロビンＨｂの約５
％を占めるが、糖尿病患者では８〜１６％まで上昇する
ことがある。このため、グルコヘモグロビンＨｂＡ_1C量
の測定は、糖代謝のコントロールのための良好な指標と
考えられている。また、血糖との非酵素的反応により生
じたケトアミンは安定であるので、このグルコヘモグロ
ビンＨｂＡ_1Cは赤血球寿命（平均１２０日間）中に分解
することはない。従って、血中ヘモグロビンＡ_1C量は過
去１〜２か月の血糖レベルを記録していると解釈され
る。そのため、総ヘモグロビンＨｂに対するＨｂＡ_1Cの
割合から過去２か月間程度の血中糖レベルを推定するこ
とができる。このように血中ヘモグロビンＡ_1Cの分析
は、食事後に一時的に短時間上昇する血糖値のような短
期的血糖値指標とは異なり、長期的な血糖管理を可能に
する指標として利用されている。

【０００５】ヘモグロビンＡ_1Cを分析するための方法と
して種々のものが開発されている。通常の方法は、電気
泳動法や、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィクロマトグラフィーのような技術に基づく。しかし、
これらの方法はいずれも、高価な分析機器が必要となっ
たり、分析に時間がかかり、多数の検体を処理する臨床
検査には適していない。この点、ヘモグロビンＡ_1Cに対
する抗体を用いるイムノアッセイなどの免疫学的測定方
法は、分析方法が比較的簡単で時間もかからないという
利点がある。特に、ＨｂＡ_1Cに対する特異抗体として、
ＨｂＡ_1Cのグリコシル化Ｎ末端残基に対する特異抗体
（例えば、特開平2-8743、特開昭61-172064、特開昭61-
280571）が開示された後、ＨｂＡ_1Cを検出するための種
々の免疫学的測定方法が開発されている（例えば特開昭
63-277967、特開平3-46566）。

【０００６】ＨｂＡ_1Cの免疫学的測定方法では、試料中
のＨｂＡ_1Cを処理試薬で処理することにより、より高感
度な分析を可能にすることが試みられている。しかしな
がら、これらの処理方法の多くは、糖蛋白質であるＨｂ
Ａ_1Cを変性するものであるため、エンザイムイムノアッ
セイに適用することが困難であった。

【０００７】例えば、特開平1-155268（対応、USP 4,97
0,171; EP-A-0315864）には、血中モグロビンをチオシ
アネートで変性させ、さらに酸化剤（例えばフェリシア
ニド）によりメトヘモグロビンに変換して、血中ＨｂＡ
_1Cを測定する方法が記載されている。この方法は、酸化
剤によるメト化により特徴的にあらわれる５４０ｎｍで
の測定を行って、全ヘモグロビン測定を容易化する一
方、この酸化剤の併用によりチオシアネート変性剤の変
性効率を上げて、ＨｂＡ_1C検出感度を向上させたもので
ある。しかしながらこの方法では、エンザイムイムノア
ッセイ（ＥＩＡ）でＨｂＡ_1Cを測定する場合には、標識
酵素がチオシアネートや酸化剤で失活することになり、
そのまま応用することができない。チオシアネート／酸
化剤による処理後に、これらを除去する操作を行えば、
エンザイムイムノアッセイも可能であるが、操作が煩雑
になる。また環境上有害なシアニド類を使用するこの方
法では、試薬の廃棄処理が問題となる。

【０００８】また、特開昭64-20452（対応、USP 4,800,
167; EP-A-0286915）には、シアニド類を使用しない全
ヘモグロビン測定方法が記載されている。この方法で
は、ｐＨ１２〜１４のアルカリ溶液としたポリビニルピ
ロリドン（ＰＶＰ）水溶液を変性試薬として使用する。
この変性試薬は、高アルカリで可溶化されたヘモグロビ
ンをＰＶＰにより安定化させて、最大吸収波長約575nm
を有する生成物を生成させるものである。この方法をＨ
ｂＡ_1C測定に応用することも考えられるが、強アルカリ
下ではＨｂＡ_1Cの糖部分が開裂されることがあるので、
ＨｂＡ_1C測定には不利である。またエンザイムイムノア
ッセイでＨｂＡ_1Cを測定する場合には、多くの酵素のｐ
Ｈ最適値は一般に中性領域（ｐＨ６〜８）であるので、
酵素標識抗体の酵素活性が抑制されるという不都合もあ
る。また免疫反応（抗原抗体結合反応）自体も、高いｐ
Ｈ値により抑制されることがあるので、この処理方法を
イムノアッセイ（免疫学的測定方法）に応用するのは困
難である。

【０００９】特開平6-11510 には、血液試料を5.0〜9.5
のｐＨを有するイオン性洗剤（界面活性剤）を含む溶血
試薬で処理し、全ヘモグロビン含量を溶血試料中で比色
測定する一方、ヘモグロビンＡ_1Cを溶血試料中で免疫学
的に測定する方法が記載されている。イオン性洗剤、例
えばＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）などのアニオン
性洗剤や、ＴＴＡＢ（テトラデシルトリメチルアンモニ
ウムブロミド）などのカチオン性洗剤は、溶血試薬とし
て既によく知られているものである。しかしながら、こ
のようなイオン性洗剤は蛋白変性作用もあるので、同じ
く蛋白質である標識酵素にも悪影響を与え、その酵素活
性を抑制することになる。Ｂ／Ｆ分離を行なう非均一系
エンザイムイムノアッセイであれば、抗原抗体結合反応
後に、Ｂ／Ｆ分離と共にイオン性洗剤を除去すれば、酵
素活性に対する影響を防止することもできるが、Ｂ／Ｆ
分離を行なわない均一系エンザイムイムノアッセイで
は、イオン性洗剤が酵素活性を抑制するので実用上の感
度を得ることができなかった。

【００１０】特公平7-23891には、ＨｂＡ_1Cを含む蛋白
質をカオトロピック試薬（chaotropic agent）を用いて
蛋白質を変性しそのエピトープを露出させ、抗体との親
和性を高くする方法が記載されている。しかしこの変性
工程は３７℃以下の温度では１から数時間を要し迅速な
測定に適さない。またここで使用する変性剤もグアニジ
ン塩酸、尿素、ＳＤＳやプロテアーゼなどであるので、
前述した従来技術と同じように酵素活性を失活させるこ
とになり、均一系エンザイムイムノアッセイでは実用上
ＨｂＡ_1Cを測定することはできなかった。

【００１１】

【発明の目的】本発明は、以上のような事情に鑑みなさ
れたものであり、簡便な操作で高感度にかつ迅速にヘモ
グロビン誘導体の分析ができ、特に均一系を含めてエン
ザイムイムノアッセイに適用することができるヘモグロ
ビン誘導体の免疫学的測定方法を提供することを第１の
目的とする。また本発明はこの測定方法に用いる処理試
薬を提供することを第２の目的とする。

【００１２】

【発明の構成】このような本発明の第１の目的は、ヘモ
グロビン誘導体含有試料を２−ブタノールで処理した
後、ヘモグロビン誘導体量を免疫学的に測定することを
特徴とするヘモグロビン誘導体の免疫学的測定方法、に
より達成される。

【００１３】また本発明の第２の目的は、ヘモグロビン
誘導体量の免疫学的測定の前処理に用いる処理試薬であ
って、２−ブタノールを含有することを特徴とするヘモ
グロビン誘導体処理用の処理試薬により達成される。

【００１４】本発明者らは、標識酵素活性を抑制するこ
となく高感度な均一系エンザイムイムノアッセイを可能
とするヘモグロビンＡ_1Cの処理試薬を探索した。多くの
水溶性有機溶媒について検討した結果、２−ブタノール
処理のみがＨｂＡ_1Cの均一系エンザイムイムノアッセイ
の検出感度を大きく向上させることを確認したものであ
る。また２−ブタノールは標識酵素の活性を抑制するこ
とはなかった。

【００１５】なお、このような有機溶媒処理による検出
感度上昇効果は、メタノール、エタノール、プロパノー
ル、イソプロパノール、1-ブタノール、t-ブチルアルコ
ール、1,2-ジヒドロキシブタン、1,3-ジヒドロキシブタ
ン、1,4-ジヒドロキシブタン、2,3-ジヒドロキシブタ
ン、1,5-ジヒドロキシペンタン、2,4-ジヒドロキシペン
タン、アセトニトリルなど他の水溶性有機溶媒では存在
しなかった。

【００１６】本発明のヘモグロビン誘導体処理試薬中の
２−ブタノール（CH₃CH(OH)CH₂CH₃，sec-BuOH）の濃度
は、処理時の終濃度で約２０重量％以下となる濃度で有
効であり、好ましくは約1.0〜約5.0 重量％の終濃度で
ある。この濃度範囲であれば、エンザイムイムノアッセ
イで通常用いられる多くの標識酵素の酵素活性に悪影響
を与えることもない。２−ブタノールによる処理は好ま
しくは約15〜約40℃、より好ましくは約20〜約38℃で行
う。この温度範囲での２−ブタノール処理は５分以内に
終了する。

【００１７】本発明の処理試薬は水系溶液で使用する。
この処理試薬水系溶液には、必要に応じて溶血試薬成分
を添加してもよい。またｐＨ緩衝剤、安定化剤などを含
有してもよい。

【００１８】ヘモグロビンＡ_1Cなどのヘモグロビン誘導
体を含有する試料は全血試料であってもよい。この場合
には、２−ブタノールによる溶血作用を利用してもよ
い。或いは、予め公知の溶血試薬を用いて処理して赤血
球よりヘモグロビンを溶出させ、その後に、２−ブタノ
ールによる変性処理を行なう。このためには、市販の溶
血剤や界面活性剤、サポニンなどで溶血させてもよい
し、非等張希釈液或いは高濃度緩衝液を使用して浸透圧
ショックで溶血させてもよい。また必要に応じ、超音波
処理で赤血球膜を破壊してもよい。凍結融解により溶血
させてもよい。

【００１９】或いは、処理試薬に２−ブタノールと溶血
試薬の両者を含有させ、溶血処理と２−ブタノール処理
とを同時に行ってもよい。通常の臨床検査などでは、こ
の方法の方が操作が簡便である。溶血試薬として界面活
性剤を使用する場合には、ノニオン系の界面活性剤が、
酵素標識抗体の酵素活性を低下させないので好ましい。
血液試料添加時（溶血処理時）の界面活性剤の濃度は、
0.01〜5％、好ましくは0.1〜0.5％である。

【００２０】好ましいノニオン系界面活性剤としては、
p-(1,1,3,3-テトラメチルブチル）フェノキシポリエト
キシエタノール（オキシエチレン単位平均 9〜10含有 T
riton X-100; オキシエチレン単位平均16含有 Triton X
-165; オキシエチレン単位平均40含有 Triton X-405、
いずれもChemical Abstract Registry No. 9002-93-1）
のようなアルキルフェノールポリエチレンオキシド縮合
物；p-ノニルフェノキシポリグリシドール（グリシドー
ル単位平均10含有）のようなアルキルフェノールポリグ
リシドール縮合物；ラウリルアルコールポリエチレンオ
キシド縮合物（例えばBrij 35 、Chemical Abstract Re
gistry No. 9002-92-0）；セチルアルコールポリエチレ
ンオキシド縮合物（例えばBrij 58、Chemical Abstract
Registry No. 9004-95-9）のような高級脂肪族アルコ
ールのポリエチレンオキシド縮合物；ステアリン酸エス
テルポリエチレングリコール縮合物（例えばMyrj 52、 M
yrj 59、いずれもChemical Abstract Registry No. 900
4-99-3）のようなポリエチレングリコールの高級脂肪酸
エステル縮合物；ソルビタンモノラウリン酸エステルの
ポリエチレングリコール縮合物（例えばTween 20、Chem
ical Abstract Registry No. 9005-64-5）のような高級
脂肪酸ソルビタンエステルのポリエチレングリコール縮
合物等がある。

【００２１】本発明の２−ブタノール処理試薬の緩衝液
としては、免疫反応及びその後の酵素反応を抑制しない
緩衝液であればよく、従来のものを広く使用できる。好
ましくは10〜200mM の濃度のＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔri
s 緩衝液を使用する。処理試薬のｐＨ値は、免疫反応に
悪影響を与えない中性域又はその近傍であって、また使
用する酵素標識抗体の酵素反応の最適ｐＨに一致するｐ
Ｈ値とするのが好ましい。一般に、ｐＨ約5.5〜約8.5の
範囲で選択するのが好ましい。また酵素標識抗体の安定
化剤としてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などを含有さ
せてもよい。

【００２２】２−ブタノールを含有する本発明の処理試
薬は、酵素反応を抑制することのないものであるから、
本発明の免疫学的測定方法としては、エンザイムイムノ
アッセイ（酵素免疫測定法）、特に免疫反応後にＢ／Ｆ
分離を行わない均一系エンザイムイムノアッセイが好適
である。しかしながら、これらＨｂＡ_1Cと抗ＨｂＡ_1C抗
体との間の免疫反応を利用した免疫学的測定方法であれ
ば、本発明は全て適用できる。例えば、酵素標識による
サンドイッチ法（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡ、ラテックス凝
集法、或いはＣＥＤＩＡ（Cloned Enzyme Donor Immuno
assay）またはＥＭＩＴ（Enzyme Multiplied Immuno Te
st)などのホモジニアス（均一系）イムノアッセイなど
がある。特に、特開昭60-171460 に記載された均一系エ
ンザイムイムノアッセイ法において、最も効果がある。
この場合、全血試料に界面活性剤と２−ブタノールとを
含有する処理試薬を加えて処理し、或いは全血試料を界
面活性剤で溶血処理後２−ブタノール含有処理試薬を加
えて処理し、この後、酵素標識した抗ＨｂＡ_1C抗体を添
加する。ＨｂＡ_1C濃度は酵素活性の減少から算出するこ
とができる。

【００２３】なお本発明の免疫学的測定方法は、上記の
ような湿式分析法に限定されず、乾式分析要素を使用す
る乾式分析方法であってもよい。例えば、均一系エンザ
イムイムノアッセイを適用した特開平04-276551 に記載
の乾式分析方法で行うことができる。乾式分析方法で
は、試料液を要素に点着することにより、要素内で免疫
反応、酵素反応を行う。試料液は、予め本発明の処理試
薬で２−ブタノール処理した後、乾式分析要素に点着さ
れる。湿式法の場合には、処理時の２−ブタノールは酵
素標識抗体溶液の添加により希釈されることになるが、
乾式法ではこのような希釈段階が無く、酵素反応時の２
−ブタノール濃度は処理時の濃度とほぼ同じになる。酵
素反応に対する２−ブタノールの影響を最小限にするた
めには、２−ブタノール濃度を下げることが好ましく、
例えば、約１〜約2.5 重量％の２−ブタノールとするの
が好ましい。ＨｂＡ_1C処理効果は2.5 重量％でほぼ飽和
するので、免疫反応の促進が損なわれることはない。な
お、処理時の好適濃度範囲約1.0〜約5.0重量％の上限約
5.0％の２−ブタノールが共存しても、酵素活性が半減
することはないので、標識酵素量を増やすことで、見か
けの酵素活性の減少を補填することができる。また本発
明の免疫学的測定方法は、標識酵素の活性測定のみを乾
式分析要素で測定する分析方法であってもよい。すなわ
ち、試料液を本発明の処理液で処理した後、酵素標識抗
体含有溶液を添加し、抗原抗体結合反応をさせる。抗原
抗体反応後の試料液を標識酵素アッセイ用の乾式分析要
素に点着して酵素活性を測定することになる。

【００２４】

【実施例１】ＧＭＢ化アミラーゼの調製 α−アミラーゼに以下のようにしてマレイミド基を導入
した。５mg/mLの枯草菌α−アミラーゼ溶液（0.1 M グ
リセロリン酸緩衝，pH 7.0) の１mLに、ＧＭＢＳ（ N-
(γ-maleimidobutyryloxy)succinimide; 同仁化学製）
の100mg/mL 溶液(DMF) 100μL を加えて、室温で１時間
反応させた。この反応液をセファデックスＧ−２５のカ
ラムでゲル濾過にかけ、0.1 M グリセロ燐酸緩衝液（pH
7.0）で溶出し、素通り分画を分取、Ｎ-(γ-マレイミ
ドブチリロキシ）アミド化アミラーゼ（ＧＭＢ化アミラ
ーゼ）を得た。得られたＧＭＢ化アミラーゼ溶液の濃度
は1.35 mg/mLであった。

【００２５】（Ａ）抗ヒトＨｂＡ_1Cモノクローナル抗体
の調製ヒトＨｂＡ_1Cに対するモノクローナル抗体IgＧは、マウ
スに免疫して得られた免疫細胞（脾臓細胞）をマウスミ
エローマ細胞と融合し、クローニング後得られた抗体で
あり、常法により得たものである。すなわち、1mM ＫＣ
Ｎ（pH7.45）に溶解した７μgの天然ヒトヘモグロビン
Ａ_1Cと、143μLのＲＰＭＩ−１６４０培地（1g/L 炭酸
ナトリウム, 600mg/L L-グルタミン、 10mM ＨＥＰＥＳ
を含有: pH6.8）及び200μLのフロイント完全アジュバ
ントを混合し、これをマウスに皮下注射により免疫し
た。２週間ごとに追加免疫を行い、最後にマウス脾臓か
らＢリンパ球を採取して、これをマウスミエローマ細胞
と融合し、クローン化した。得られたクローンからヒト
ＨｂＡ_1Cと特異的に反応し、他のヘモグロビン・サブク
ラスと実質的にまったく交差反応しない抗体を産生する
細胞系を選別した。得られた抗体産生細胞を培養し、抗
体精製によりヒトＨｂＡ_1Cに対するモノクローナル特異
抗体、すなわち抗ヒトＨｂＡ_1c・マウスIgＧを得た。

【００２６】（Ｂ）抗ヒトＨｂＡ_1c・IgＧＦab' の調
製得られた抗ヒトＨｂＡ_1CマウスIgＧ 20mg を、10 mLの
0.1 M 酢酸緩衝液(pH5.5) に溶解し、これに活性化パパ
イン600μgを加え37℃で２時間攪拌した。この反応液
を、予め0.1 M 燐酸緩衝液(pH 6.0; 1 mM EDTA含有）で
平衡化したスーパーデックス−200 ゲルカラムにアプラ
イし、同燐酸緩衝液で溶出した。分子量10万付近に溶出
したピーク部分を分取し、抗ヒトＨｂＡ_1C・マウスIgＧ
Ｆ(ab')₂を得た。得られた抗ヒトＨｂＡ_1C・IgＧＦ(a
b')₂10 mg を含む0.1 M 燐酸緩衝液(pH 6.0)２mLに、1
0 mg/mLの２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液を2
00μL加え、37℃で90分間攪拌した。この反応液を予め
0.1 M 燐酸緩衝液(pH 6.0）で平衡化したセファデック
スＧ−２５でゲル濾過し素通り分画を分取して、抗ヒト
ＨｂＡ_1C・IgＧＦab'（以下単にＦab'という）を得
た。

【００２７】（Ｃ）α−アミラーゼ／Ｆab' 結合物の調
製（Ｂ）で得た抗ＨｂＡ_1C・IgＧＦab'（Ｆab'）の1.5 m
g/mL 溶液6.5 mL に、（Ａ）で調製したＧＭＢ化アミラ
ーゼ２mgを加えて４℃で一晩反応させた。この反応液
を、予め20 mM グリセロ燐酸（pH7.0; 10 mM CaCl₂含
有）で平衡化したスーパーデックス-200にゲル濾過して
分子量30万以上の分画を集め、目的の酵素標識抗体（α
−アミラーゼ／Ｆab'結合物）を得た。

【００２８】

【実施例２】ＨｂＡ_1Cの測定得られた酵素標識抗体を用いて、ヒトＨｂＡ_1Cの均一系
酵素免疫分析を行なった。下記の溶液を使用した。処理試薬１（比較例）： 0.1 M ＭＥＳ緩衝液（pH 6.
0）、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、0.01％ア
ジ化ナトリウム、0.05％ Triton X-100処理試薬２（本発明の処理試薬）： 0.1 M ＭＥＳ緩衝液
（pH 6.0）、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、0.0
1％アジ化ナトリウム、0.05％ Triton X-100 5.0％２−ブタノール反応緩衝液：50 mM マレイン酸（pH 6.5）α−アミラーゼ／Ｆab'結合物の希釈緩衝液： 20 mM グ
リセロ燐酸（pH 7.0）、10 mM CaCl₂ 、0.85％ NaCl、
0.05％アジ化ナトリウム

【００２９】ＨｂＡ_1C溶液（13 mg/mL PBS; Exocell社
製) を処理試薬１及び２で希釈して、ＨｂＡ_1C濃度0〜3
00 μg/mLの範囲で３倍づつ希釈した溶液を調製した。
希釈操作から約５分後（すなわち処理時間は約５分）
に、各溶液50μL に、実施例１で調製したα−アミラー
ゼ／Ｆab'結合物の２００倍希釈液を加え、37℃で20分
間反応させた。一方、ネオ・アミラーゼテスト「第一」
（第一化学薬品製）の錠剤１錠（45mg不溶性青色澱粉、
3mg ＢＳＡ含有）を反応緩衝液４mLで懸濁し、この懸濁
液１mLを、上記反応液に加えて、37℃でさらに１時間反
応させた。0.5mLの0.5 N Na₂CO₃緩衝液（pH 9.0）を加
えて反応を停止させ、これを3,000 rpm で５分間遠心
し、上清を得た。酵素反応により上清中に可溶化した青
色色素量を620 nmにおける吸光度測定により測定した。
得られた吸光度とヒトＨｂＡ_1Cの濃度との関係を示す検
量線を図１に示す。

【００３０】２−ブタノールを含まない処理試薬１（比
較例；図中−■−）に比べ、２−ブタノールを含有する
処理試薬２（本発明の処理試薬；図中−△−）は、被検
物であるＨｂＡ_1C添加により、標識酵素の活性低下が大
きくなっている。ＨｂＡ_1C未添加時の吸光度約1.0 から
その半分の値になるまでに要するＨｂＡ_1C量から感度を
計算すると、本発明の処理試薬により約２０倍の感度上
昇が認められた。またＨｂＡ_1C濃度変動に対し、より大
きな吸光度変化を観測することができ、本発明の処理試
薬により、よりＳ／Ｎ比の高い、すなわちより高感度な
ＨｂＡ_1C定量が可能であることがわかった。なお、Ｈｂ
Ａ_1C未添加時の吸光度からわかるように、本発明で使用
した２−ブタノールは、標識酵素の酵素活性には影響を
与えていない。

【００３１】

【実施例３】実施例２で使用した処理試薬２の２−ブタ
ノール濃度を、１％及び２．５％に変えて、その他は実
施例２と全く同様にエンザイムイムノアッセイを行っ
た。図２に示すように、２−ブタノール濃度上昇に伴い
感度はより上昇するが、１〜２．５％の濃度範囲の２−
ブタノールでも十分な感度上昇があることが認められ
た。

【００３２】

【実施例４】ＨｂＡ_1C定量分析用乾式分析要素の作成ゼラチン下塗層が設けられている厚さ180μｍの無色透
明ポリエチレンテレフタレート（PET）シート（支持
体）上に下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬溶液
を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。アルカリ処理ゼラチン 14.5 g/m² ノニルフェノキシポリエトキシエタノール 0.2 g/m² （オキシエチレン単位平均 9〜10含有）グルコースオキシダーゼ 5000 IU/m² ペルオキシダーゼ 15000 IU/m² グルコアミラーゼ 5000 IU/m² 2-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシフェニル-4-[4-(ジメチルアミノ) フェニル]-5-フェネチルイミダゾール（ロイコ色素）酢酸塩 0.38 g/m² ビス[(ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン 0.1 g/m²

【００３３】この試薬層の上に下記の被覆量になるよう
に接着層水溶液を塗布、これを乾燥して接着層を設け
た。アルカリ処理ゼラチン 14.5 g/m² ノニルフェノキシポリエトキシエタノール 0.2 g/m² （オキシエチレン単位平均 9〜10含有）

【００３４】ついで接着層の表面に下記の被覆量になる
ように下記試薬含有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤
させ、その上に50デニール相当のPET 紡績糸36ゲージ編
みした厚さ約250 μｍのトリコット編物布地をほぼ一様
に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層（編物
布地層）を設けた。ノニルフェノキシポリエトキシエタノール 0.2 g/m² （オキシエチレン単位平均 9〜10含有）ビス[(ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン 0.1 g/m²

【００３５】次に、展開層の上から下記の被覆量になる
ように基質含有水溶液を塗布し、これを乾燥することに
より、多孔性展開層（編物布地層）を基質層とし、Ｈｂ
Ａ_1C分析用多層分析要素を調製した。メガファックＦ１４２Ｄ（大日本インキ製) 0.1 g/m² (フッ素界面活性剤）（オキシエチレン単位平均10含有）カルボキシメチル化澱粉 5 g/m² マンニトール 2 g/m² アミラーゼ阻害剤 100万 U/m² （富士レビオ製アミラーゼ阻害剤"I-1001C" :特開昭61-74587）次いでこの分析要素を15mm四方のチップに裁断し、特開
昭57-63452に記載のスライドの枠に収めて、ＨｂＡ_1C定
量分析スライドとした。なおここで使用したアミラーゼ
阻害剤"I-1001C"は、検体中に含まれることがある同種
のアミラーゼに対する阻害剤であって、標識酵素として
使用している枯草菌α−アミラーゼの酵素活性は阻害し
ないものである（特開平05-122112参照）。

【００３６】ＨｂＡ_1C溶液（13 mg/mL PBS; Exocell社
製) を処理試薬１及び２でそれぞれ希釈して、ＨｂＡ_1C
濃度7.5〜240 mg/dLの範囲で２倍づつ希釈した溶液を調
製した。なお、ＨｂＡ_1C濃度 0 mg/dLの溶液として処理
試薬１及び２そのままをそれぞれ使用した。希釈操作か
ら約５分後（すなわち処理時間は約５分）に、各溶液50
μL に、実施例１で調製したα−アミラーゼ／Ｆab'結
合物の３０倍希釈液を加え、37℃で20分間反応させた。
この後、各反応溶液10μL を前記ＨｂＡ_1C定量分析スラ
イドに点着し、37℃に保って、ＰＥＴ支持体側から650n
m の反射光学濃度を測定した。点着から４分後および６
分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ_6-4）を求めて、検量
線を作成した。検量線を図３に示す。

【００３７】２−ブタノールを含まない処理試薬１（比
較例；図中−△−）に比べ、２−ブタノールを含有する
溶血試薬２（本発明の処理試薬；図中−○−）は、被検
物であるＨｂＡ_1C添加により標識酵素の活性低下が大き
くなり感度上昇が認められた。感度比の定量的評価のた
め、ここでは、ＨｂＡ_1C未添加時の吸光度約0.35（比較
例の処理試薬１）及び吸光度約0.32（本発明の処理試薬
２）から、それぞれその半分の吸光度になるまでに要す
るＨｂＡ_1C量の近似的な代替評価として、それぞれの吸
光度が約1/4減じるまでに要するＨｂＡ_1C量、すなわち
未添加時の吸光度の約3/4（比較例の処理試薬１におい
て約0.26；本発明の処理試薬において約0.24）になるま
でに要するＨｂＡ_1C量を感度の尺度とした。図３におい
て点線で示すＨｂＡ_1C量から理解できるように、本発明
の処理試薬では、少なくとも約12倍から約20倍に達する
大幅な感度上昇が認められた。またＨｂＡ_1C濃度変動に
対し、より大きな吸光度変化を観測することができ、本
発明の処理試薬により、よりＳ／Ｎ比の高い、すなわち
より高感度なＨｂＡ_1C定量が可能であることが示され
た。

【００３８】

【発明の効果】以上のように本発明では、ヘモグロビン
Ａ_1Cなどのヘモグロビン誘導体含有試料を２−ブタノー
ル含有処理試薬で処理したので、検出感度ばかりでなく
Ｓ／Ｎ比も高い高感度な免疫学的測定が可能になる。ま
たアッセイに酵素を使用する場合でも、この処理試薬は
酵素活性を低下させることがない。このため均一系を含
めたエンザイムイムノアッセイに適用することができ、
簡便な操作で高感度にかつ迅速にヘモグロビンＡ_1Cなど
のヘモグロビン誘導体の定量分析ができる。

【００３９】なお本発明の好ましい実施態様をまとめる
と以下の通りである。 (1) ヘモグロビン誘導体含有試料を２−ブタノールを
含有する処理試薬で処理した後、ヘモグロビン誘導体量
を免疫学的に測定することを特徴とするヘモグロビン誘
導体の免疫学的測定方法。 (2) ヘモグロビン誘導体量の免疫学的測定は、酵素免
疫学的測定方法で行われることを特徴とする(1)の測定
方法。 (3) 前記処理試薬で処理した試料に酵素標識抗体を添
加し抗原抗体反応をさせ、この抗原抗体反応後の試料液
を標識酵素アッセイ用の乾式分析要素に点着して酵素活
性を測定することを特徴とする(2)の測定方法。 (4) 前記処理試薬で処理した試料を、乾式分析要素に
点着し、要素内で標識酵素との抗原抗体反応、及び標識
酵素の酵素反応を行わせるとを特徴とする(2)の測定方
法。 (5) 前記ヘモグロビン誘導体含有試料は全血試料であ
って、この全血試料を、前記処理試薬で処理する前に溶
血処理させる(1)に記載の測定方法。 (6) 前記ヘモグロビン誘導体含有試料は全血試料であ
って、前記処理試薬は溶血剤も含有しており、前記全血
試料を実質的に溶血させると同時に前記ヘモグロビン誘
導体を２−ブタノール処理する(1)に記載の測定方法。 (7) 前記処理試薬は、処理時の終濃度が約1.0〜約5.0
重量％となる２−ブタノールを含む(1)に記載の測定方
法。 (8) 前記ヘモグロビン誘導体がグリコヘモグロビン
（glycated hemoglobin)である(1)に記載の測定方法。 (9) 前記グリコヘモグロビンがグルコヘモグロビン
（ＨｂＡ_1C: glycosylatedhemoglobin）である(8)に記
載の測定方法。 (10) 前記溶血剤がノニオン系界面活性剤である(6)に
記載の測定方法。 (11) ２−ブタノールを含有することを特徴とするヘモ
グロビン誘導体処理用の処理試薬。 (12) さらに溶血剤を含有することを特徴とする(11)に
記載の処理試薬。 (13) 前記２−ブタノールの含有量は、試料を添加し処
理時の終濃度が約1.0〜約5.0重量％となる範囲であるこ
とを(11)に記載の処理試薬。 (14) 前記ヘモグロビン誘導体がグリコヘモグロビンで
ある(11)に記載の処理試薬。 (15) 前記グリコヘモグロビンがヘモグロビンＡ_1Cであ
る(14)に記載の処理試薬。 (16) 前記溶血剤がノニオン系界面活性剤である(15)に
記載の処理試薬。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の２−ブタノール処理による、均一系エ
ンザイムイムノアッセイに対する効果を示す図である。
−■−は、２−ブタノールを含まない処理試薬１（比較
例）、−△−は２−ブタノールを含む試薬２（本発明の
処理試薬）の結果を示す。

【図２】本発明による種々の濃度の２−ブタノール処理
による均一系エンザイムイムノアッセイに対する効果を
示す図である。

【図３】本発明の実施例４の測定方法における検量線を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヘモグロビン誘導体含有試料を２−ブタ
ノールで処理した後、ヘモグロビン誘導体量を免疫学的
に測定することを特徴とするヘモグロビン誘導体の免疫
学的測定方法。
【請求項２】ヘモグロビン誘導体量の免疫学的測定の
前処理に用いる処理試薬であって、２−ブタノールを含
有することを特徴とするヘモグロビン誘導体処理用の処
理試薬。
【請求項３】さらに溶血剤を含有することを特徴とす
る請求項２の処理試薬。