JP2637677B2 - ヘモグロビン誘導体の測定のための免疫学的方法 - Google Patents
ヘモグロビン誘導体の測定のための免疫学的方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血液試料中の特別なヘ
モグロビン誘導体の含量の測定法に関する。特に、本発
明は、血液中の誘導体化ヘモグロビンの部分を測定する
ために、全ヘモグロビン含量の別々の測定およびヘモグ
ロビン誘導体の測定を必要とするグリコヘモグロビンの
如きヘモグロビン誘導体の含量の測定法に関する。
モグロビン誘導体の含量の測定法に関する。特に、本発
明は、血液中の誘導体化ヘモグロビンの部分を測定する
ために、全ヘモグロビン含量の別々の測定およびヘモグ
ロビン誘導体の測定を必要とするグリコヘモグロビンの
如きヘモグロビン誘導体の含量の測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】血糖の
量に応じて、赤血球により摂取される少量のグルコース
は非酵素的反応でグロビンのβ鎖のＮ末端バリン残基に
結合する。安定なグリコヘモグロビン誘導体HbA1C （ケ
トアミン形態）を生成する反応は二工程で進行する。最
初に、グルコースが不安定なグリコヘモグロビン誘導体
（シッフ塩基）の生成を伴う迅速な可逆的付着によりヘ
モグロビンに結合される。その安定な形態は不可逆の遅
い転位反応（アモダリ転位）により生成される。全ヘモ
グロビンに対するHbA1C の比率は、健康な代謝のヒトで
は３〜６％である。糖尿病の患者では、HbA1C の比率
は、その前の４〜12週の間の血液グルコース濃度のレベ
ルに比例して12％の値まで増加することがあり、時とし
て20％までも増加することがある。特に、全ヘモグロビ
ン含量に対するHbA1C の相対比率の測定は、血糖調節の
過程を監視するのに不可欠のパラメーターを与える。
量に応じて、赤血球により摂取される少量のグルコース
は非酵素的反応でグロビンのβ鎖のＮ末端バリン残基に
結合する。安定なグリコヘモグロビン誘導体HbA1C （ケ
トアミン形態）を生成する反応は二工程で進行する。最
初に、グルコースが不安定なグリコヘモグロビン誘導体
（シッフ塩基）の生成を伴う迅速な可逆的付着によりヘ
モグロビンに結合される。その安定な形態は不可逆の遅
い転位反応（アモダリ転位）により生成される。全ヘモ
グロビンに対するHbA1C の比率は、健康な代謝のヒトで
は３〜６％である。糖尿病の患者では、HbA1C の比率
は、その前の４〜12週の間の血液グルコース濃度のレベ
ルに比例して12％の値まで増加することがあり、時とし
て20％までも増加することがある。特に、全ヘモグロビ
ン含量に対するHbA1C の相対比率の測定は、血糖調節の
過程を監視するのに不可欠のパラメーターを与える。
【０００３】グリコヘモグロビンの一連の測定法が記載
されていた。通常の方法は、電気泳動、等電点電気泳動
および比色測定、並びにイオン交換クロマトグラフィー
およびアフィニティークロマトグラフィーの如き技術に
基いている。特異的ポリクローナル抗体（米国特許第4,
247,533 号明細書）およびモノクローナル抗体（欧州特
許公開第0316306 号、同第0201187 号明細書）の生産が
記載された後、HbA1Cを検出するための一連の免疫学的
方法が開発された。
されていた。通常の方法は、電気泳動、等電点電気泳動
および比色測定、並びにイオン交換クロマトグラフィー
およびアフィニティークロマトグラフィーの如き技術に
基いている。特異的ポリクローナル抗体（米国特許第4,
247,533 号明細書）およびモノクローナル抗体（欧州特
許公開第0316306 号、同第0201187 号明細書）の生産が
記載された後、HbA1Cを検出するための一連の免疫学的
方法が開発された。
【０００４】欧州特許公開第0185870 号明細書は、HbA
1C を含むタンパク質の測定のための免疫学的方法を記
載している。特定の線状ペプチドエピトープを認識する
モノクローナル抗体が使用される。変性が、とりわけカ
オトロピック試薬により、エピトープの放出に関して明
記される。この変性工程は37℃以下の温度で１〜数時間
を要し、50℃以上の温度ではそれは１分を要する。試料
の全ヘモグロビン含量の同時測定は示されていない。
1C を含むタンパク質の測定のための免疫学的方法を記
載している。特定の線状ペプチドエピトープを認識する
モノクローナル抗体が使用される。変性が、とりわけカ
オトロピック試薬により、エピトープの放出に関して明
記される。この変性工程は37℃以下の温度で１〜数時間
を要し、50℃以上の温度ではそれは１分を要する。試料
の全ヘモグロビン含量の同時測定は示されていない。
【０００５】欧州特許公開第0201187 号明細書には、Hb
A1C のモノクローナル抗体（これらは天然のヒトHbA1C
による免疫化により得られた）が使用されるHbA1C の測
定法が記載されている。その試験は４〜37℃の温度で行
われ、それによりそれぞれのインキュベーション工程は
72時間までを要することがある。同じ試料中の全ヘモグ
ロビン含量およびHbA1C 含量の測定は記載されていな
い。
A1C のモノクローナル抗体（これらは天然のヒトHbA1C
による免疫化により得られた）が使用されるHbA1C の測
定法が記載されている。その試験は４〜37℃の温度で行
われ、それによりそれぞれのインキュベーション工程は
72時間までを要することがある。同じ試料中の全ヘモグ
ロビン含量およびHbA1C 含量の測定は記載されていな
い。
【０００６】血液試料中のHbA1C の相対含量の測定法が
欧州特許公開第0315864 号明細書に記載されている。ヘ
モグロビンはチオシアネートにより変性され、そして付
加的な酸化剤、好ましくはフェリシアニドによりメトヘ
モグロビンに変換される。全ヘモグロビン含量だけでな
くHbA1C 含量が、このようにして処理された血液試料中
で測定し得る。
欧州特許公開第0315864 号明細書に記載されている。ヘ
モグロビンはチオシアネートにより変性され、そして付
加的な酸化剤、好ましくはフェリシアニドによりメトヘ
モグロビンに変換される。全ヘモグロビン含量だけでな
くHbA1C 含量が、このようにして処理された血液試料中
で測定し得る。
【０００７】赤血球を溶解し、そしてヘモグロビン誘導
体を変性するためのリチウム塩、好ましくはチオシアン
酸リチウムの使用が、欧州特許公開第0407860 号明細書
に記載されている。HbA1C 含量が免疫学的に測定し得
る。全ヘモグロビンを測定するために、酸化剤、好まし
くはフェリシアニドが更に添加される必要があり、これ
はヘモグロビンをメトヘモグロビンに変換する。
体を変性するためのリチウム塩、好ましくはチオシアン
酸リチウムの使用が、欧州特許公開第0407860 号明細書
に記載されている。HbA1C 含量が免疫学的に測定し得
る。全ヘモグロビンを測定するために、酸化剤、好まし
くはフェリシアニドが更に添加される必要があり、これ
はヘモグロビンをメトヘモグロビンに変換する。
【０００８】最後の二つの方法の欠点は、ヘモグロビン
をシアノ−メトヘモグロビンに変換するために、シアニ
ドが使用される必要があることである。全ヘモグロビン
を測定するためのラウリル硫酸ナトリウム(SLS) による
シアニドの置換が、Clin.Biochem.15(1982)83-88に記載
されている。しかしながら、この文献には、SLS がヘモ
グロビン誘導体、特にHbA1C の免疫学的測定の試料前処
理に適すことが示されていない。
をシアノ−メトヘモグロビンに変換するために、シアニ
ドが使用される必要があることである。全ヘモグロビン
を測定するためのラウリル硫酸ナトリウム(SLS) による
シアニドの置換が、Clin.Biochem.15(1982)83-88に記載
されている。しかしながら、この文献には、SLS がヘモ
グロビン誘導体、特にHbA1C の免疫学的測定の試料前処
理に適すことが示されていない。
【０００９】また、血液試料中の全ヘモグロビンの測定
用のシアニドを含まない試薬が欧州特許公開第0184787
号明細書に記載されている。その試薬は、少なくとも1
1.3、好ましくは13.7以上のpHを有するイオン性表面活
性剤である。ヘモグロビン誘導体の免疫学的測定が示さ
れていない。非常に高いpH値はグリコヘモグロビンの免
疫学的測定に不利である。何となれば、糖部分が強アル
カリ性媒体中でヘモグロビンから開裂されることがある
からである。使用される抗体が酵素で標識される場合、
酵素反応は抑制されることがある。何となれば、殆どの
場合に使用される酵素のpH最適値は６〜８のpHであるか
らである。また、免疫反応は高いpH値により抑制される
ことがある。
用のシアニドを含まない試薬が欧州特許公開第0184787
号明細書に記載されている。その試薬は、少なくとも1
1.3、好ましくは13.7以上のpHを有するイオン性表面活
性剤である。ヘモグロビン誘導体の免疫学的測定が示さ
れていない。非常に高いpH値はグリコヘモグロビンの免
疫学的測定に不利である。何となれば、糖部分が強アル
カリ性媒体中でヘモグロビンから開裂されることがある
からである。使用される抗体が酵素で標識される場合、
酵素反応は抑制されることがある。何となれば、殆どの
場合に使用される酵素のpH最適値は６〜８のpHであるか
らである。また、免疫反応は高いpH値により抑制される
ことがある。
【００１０】それ故、溶血が低温、例えば、室温で行う
ことができ、試料調製に長いインキュベーション時間を
必要とせず、しかもシアニドの如き環境上有害な試薬の
使用を避けるような血液中のヘモグロビン誘導体の測定
のための免疫学的検出法に対する要望が依然としてあっ
た。加えて、更なる溶血調製をしないで、血液の全ヘモ
グロビン含量に対するヘモグロビン誘導体の比率を測定
できるために、同じ溶血物中の全ヘモグロビンを同時に
測定することが可能であるべきである。本発明の目的は
血液中のヘモグロビン誘導体の測定のためのこのような
免疫学的検出法を提供することであった。
ことができ、試料調製に長いインキュベーション時間を
必要とせず、しかもシアニドの如き環境上有害な試薬の
使用を避けるような血液中のヘモグロビン誘導体の測定
のための免疫学的検出法に対する要望が依然としてあっ
た。加えて、更なる溶血調製をしないで、血液の全ヘモ
グロビン含量に対するヘモグロビン誘導体の比率を測定
できるために、同じ溶血物中の全ヘモグロビンを同時に
測定することが可能であるべきである。本発明の目的は
血液中のヘモグロビン誘導体の測定のためのこのような
免疫学的検出法を提供することであった。
【００１１】
【課題を解決するための手段】その目的は、請求の範囲
で更に詳しく特定される本発明により達成される。この
目的は、血液試料を、５〜9.5 のpHを有するイオン性洗
剤を含む溶血試薬で処理し、そしてヘモグロビン誘導体
を溶血された血液試料中で免疫学的に測定することを特
徴とする血液試料中のヘモグロビンの含量の測定のため
の免疫学的検出法により本質的に達成される。
で更に詳しく特定される本発明により達成される。この
目的は、血液試料を、５〜9.5 のpHを有するイオン性洗
剤を含む溶血試薬で処理し、そしてヘモグロビン誘導体
を溶血された血液試料中で免疫学的に測定することを特
徴とする血液試料中のヘモグロビンの含量の測定のため
の免疫学的検出法により本質的に達成される。
【００１２】また、本発明は、血液試料を、５〜9.5 の
pHを有するイオン性洗剤を含む溶血試薬で処理し、全ヘ
モグロビン含量を溶血試料中で測光測定し、そしてヘモ
グロビン誘導体を溶血試料中で免疫学的に測定すること
を特徴とする血液試料中のヘモグロビン誘導体および全
ヘモグロビンの含量の測定法に関する。更に、本発明
は、５〜9.5 のpHを有するイオン性洗剤を含む溶血試
薬、ヘモグロビン誘導体の免疫学的測定のため、そして
所望により全ヘモグロビン含量の測定のための血液試料
の試料調製に使用するためのその使用、並びにその溶血
試薬を含む試験キットに関する。
pHを有するイオン性洗剤を含む溶血試薬で処理し、全ヘ
モグロビン含量を溶血試料中で測光測定し、そしてヘモ
グロビン誘導体を溶血試料中で免疫学的に測定すること
を特徴とする血液試料中のヘモグロビン誘導体および全
ヘモグロビンの含量の測定法に関する。更に、本発明
は、５〜9.5 のpHを有するイオン性洗剤を含む溶血試
薬、ヘモグロビン誘導体の免疫学的測定のため、そして
所望により全ヘモグロビン含量の測定のための血液試料
の試料調製に使用するためのその使用、並びにその溶血
試薬を含む試験キットに関する。
【００１３】溶血試薬の作用は、血液試料中に存在する
赤血球の溶解および特定のヘモグロビン発色団へのヘモ
グロビンの変換をもたらす。生成されるヘモグロビン発
色団は、その特徴的な吸光度により全ヘモグロビン含量
を測定し、そして特定のエピトープの免疫反応によりヘ
モグロビン誘導体を測定するのに使用し得る。原則とし
て、全ての通常の方法、例えば、サンドイッチ試験、IE
MA試験、沈殿試験または凝集試験、並びにFPIA技術およ
びCEDIA 技術に基く試験が、検出の免疫学的方法として
使用し得る。湿式試験および乾式試験が可能である。
赤血球の溶解および特定のヘモグロビン発色団へのヘモ
グロビンの変換をもたらす。生成されるヘモグロビン発
色団は、その特徴的な吸光度により全ヘモグロビン含量
を測定し、そして特定のエピトープの免疫反応によりヘ
モグロビン誘導体を測定するのに使用し得る。原則とし
て、全ての通常の方法、例えば、サンドイッチ試験、IE
MA試験、沈殿試験または凝集試験、並びにFPIA技術およ
びCEDIA 技術に基く試験が、検出の免疫学的方法として
使用し得る。湿式試験および乾式試験が可能である。
【００１４】溶血試薬中に使用し得るイオン性洗剤は、
アニオン性洗剤、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム(S
DS) 、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム(DONS)、カ
チオン性洗剤、好ましくはテトラデシルトリメチルアン
モニウムブロミド(TTAB)もしくはセチルトリメチルアン
モニウムブロミド(CTAB)または両性イオン性洗剤、好ま
しくはツイッタージェント(Zwittergent)3-14 である。
溶血試薬は、赤血球を溶解し、ヘモグロビンを特定のヘ
モグロビン発色団に変換し、そしてヘモグロビン誘導体
のエピトープを放出するのに充分な量で血液試料に添加
される。溶血試薬は1:10〜1:400 の比で血液試料に添加
され、その結果、得られる混合物中のイオン性洗剤の濃
度は0.01〜５重量％、好ましくは0.5 〜1.5 重量％であ
る。溶血試薬のpH値は弱酸性〜弱アルカリ性の範囲であ
る。そのpHは5.0 〜9.5 であることが好ましく、7.4 で
あることが特に好ましい。全ての通常の緩衝剤が溶血試
薬中でpH値を設定するのに使用し得る。HEPES 、MES 、
TRISまたはリン酸緩衝剤が使用されることが好ましい。
アニオン性洗剤、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム(S
DS) 、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム(DONS)、カ
チオン性洗剤、好ましくはテトラデシルトリメチルアン
モニウムブロミド(TTAB)もしくはセチルトリメチルアン
モニウムブロミド(CTAB)または両性イオン性洗剤、好ま
しくはツイッタージェント(Zwittergent)3-14 である。
溶血試薬は、赤血球を溶解し、ヘモグロビンを特定のヘ
モグロビン発色団に変換し、そしてヘモグロビン誘導体
のエピトープを放出するのに充分な量で血液試料に添加
される。溶血試薬は1:10〜1:400 の比で血液試料に添加
され、その結果、得られる混合物中のイオン性洗剤の濃
度は0.01〜５重量％、好ましくは0.5 〜1.5 重量％であ
る。溶血試薬のpH値は弱酸性〜弱アルカリ性の範囲であ
る。そのpHは5.0 〜9.5 であることが好ましく、7.4 で
あることが特に好ましい。全ての通常の緩衝剤が溶血試
薬中でpH値を設定するのに使用し得る。HEPES 、MES 、
TRISまたはリン酸緩衝剤が使用されることが好ましい。
【００１５】溶血試薬は、例えば、免疫反応の妨害を排
除し、ヘモグロビンを酸化し、濁りを除去し、安定化
し、または保存するのに利用できる更に別の試薬を含ん
でもよい。SDS を含む幾つかの洗剤は免疫反応を妨害す
ることがある。稀な場合には、濁りおよび凝集が、異な
る原因を有する溶血試薬の添加後に生じる。例えば、SD
S は低温で可溶性が不十分である。驚くことに、これら
の妨害はノニオン性洗剤の添加により避けられることが
わかった。好ましい洗剤はBrij35および58またはトリト
ン(Triton)X100の如きポリオキシエチレンエーテル並び
にMyrj52および59またはトィーン(Tween)20 の如きポリ
オキシエチレンエステルである。ノニオン性洗剤は、試
料の添加後に、得られる混合物中のその濃度が0.01〜５
重量％、好ましくは0.1 〜0.5 重量％であるような量で
溶血試薬に通常添加される。
除し、ヘモグロビンを酸化し、濁りを除去し、安定化
し、または保存するのに利用できる更に別の試薬を含ん
でもよい。SDS を含む幾つかの洗剤は免疫反応を妨害す
ることがある。稀な場合には、濁りおよび凝集が、異な
る原因を有する溶血試薬の添加後に生じる。例えば、SD
S は低温で可溶性が不十分である。驚くことに、これら
の妨害はノニオン性洗剤の添加により避けられることが
わかった。好ましい洗剤はBrij35および58またはトリト
ン(Triton)X100の如きポリオキシエチレンエーテル並び
にMyrj52および59またはトィーン(Tween)20 の如きポリ
オキシエチレンエステルである。ノニオン性洗剤は、試
料の添加後に、得られる混合物中のその濃度が0.01〜５
重量％、好ましくは0.1 〜0.5 重量％であるような量で
溶血試薬に通常添加される。
【００１６】その他の普通使用される酸化剤フェリシア
ニド、例えば、ヘキサシアノフェレート(III) が溶血試
薬に含まれてもよい。しかしながら、カチオン性洗剤と
一緒にすると、沈殿が生じることがある。更に、フェリ
シアニドが使用される場合、光からの保護が必要であ
る。驚くことに、作用の機構がチオール基の酸化的攻撃
に基いている防腐剤、例えば、メチルイソチアゾロンま
たはブロニドックス(Bronidox 、商標)Kが添加される場
合、フェリシアニドの添加を完全に省くことができるこ
とがわかった。カチオン性洗剤と一緒のこれらの防腐剤
は、最大吸光度が570nm にある褐色−緑に着色したヘモ
グロビン発色団を生じる。特別な利点は、第一に、これ
らの防腐剤の添加が特定のヘモグロビン発色団へのヘモ
グロビンの変換だけでなく溶血試薬の良好な保存をもた
らし、第二に、溶血の終点が赤から褐色−緑への色の変
化により容易に認識できることである。防腐剤は0.005
〜0.2 重量％、好ましくは0.01〜0.02重量％の濃度で溶
血試薬中で使用される。
ニド、例えば、ヘキサシアノフェレート(III) が溶血試
薬に含まれてもよい。しかしながら、カチオン性洗剤と
一緒にすると、沈殿が生じることがある。更に、フェリ
シアニドが使用される場合、光からの保護が必要であ
る。驚くことに、作用の機構がチオール基の酸化的攻撃
に基いている防腐剤、例えば、メチルイソチアゾロンま
たはブロニドックス(Bronidox 、商標)Kが添加される場
合、フェリシアニドの添加を完全に省くことができるこ
とがわかった。カチオン性洗剤と一緒のこれらの防腐剤
は、最大吸光度が570nm にある褐色−緑に着色したヘモ
グロビン発色団を生じる。特別な利点は、第一に、これ
らの防腐剤の添加が特定のヘモグロビン発色団へのヘモ
グロビンの変換だけでなく溶血試薬の良好な保存をもた
らし、第二に、溶血の終点が赤から褐色−緑への色の変
化により容易に認識できることである。防腐剤は0.005
〜0.2 重量％、好ましくは0.01〜0.02重量％の濃度で溶
血試薬中で使用される。
【００１７】溶血、特定のヘモグロビン発色団へのヘモ
グロビンの変換、並びに溶血試薬によりヘモグロビン誘
導体につき試験するための試料調製は、低温、好ましく
は４〜37℃、特に好ましくは室温(20 ℃) で１〜10分後
に完結される。殆どの場合、２分間のインキュベーショ
ンが完全な試料調製に充分である。このようにして調製
された血液試料は、続いて1:10〜1:100 の比で反応緩衝
液で希釈される。免疫反応を妨害しない全ての現行の緩
衝液が緩衝液として使用し得る。10〜200 ミリモル/lの
濃度のMES またはHEPES 緩衝液が使用されることが好ま
しい。反応緩衝液のpH値は5.0 〜8.0 である。免疫学的
試験が酵素反応を含む場合、反応緩衝液は酵素反応の最
適pHに一致するpH値を有することが好ましい。その他
に、反応緩衝液はヘモグロビン誘導体試験に必要な試
薬、特に特異的結合パートナー、好ましくは高度に特異
的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を既
に含んでいてもよい。
グロビンの変換、並びに溶血試薬によりヘモグロビン誘
導体につき試験するための試料調製は、低温、好ましく
は４〜37℃、特に好ましくは室温(20 ℃) で１〜10分後
に完結される。殆どの場合、２分間のインキュベーショ
ンが完全な試料調製に充分である。このようにして調製
された血液試料は、続いて1:10〜1:100 の比で反応緩衝
液で希釈される。免疫反応を妨害しない全ての現行の緩
衝液が緩衝液として使用し得る。10〜200 ミリモル/lの
濃度のMES またはHEPES 緩衝液が使用されることが好ま
しい。反応緩衝液のpH値は5.0 〜8.0 である。免疫学的
試験が酵素反応を含む場合、反応緩衝液は酵素反応の最
適pHに一致するpH値を有することが好ましい。その他
に、反応緩衝液はヘモグロビン誘導体試験に必要な試
薬、特に特異的結合パートナー、好ましくは高度に特異
的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を既
に含んでいてもよい。
【００１８】驚くことに、この場合、更に別の洗剤、好
ましくはBrijまたはMyrjの如きノニオン性洗剤の添加
が、グリコヘモグロビンの如きヘモグロビン誘導体を検
出するための試料調製並びに免疫反応に最適の条件を与
えるのに有利であり、そして妨害を避けることがまたわ
かった。洗剤は、得られる混合物中で0.01〜５重量％、
好ましくは0.5 重量％の濃度を生じる量で反応緩衝液に
添加される。
ましくはBrijまたはMyrjの如きノニオン性洗剤の添加
が、グリコヘモグロビンの如きヘモグロビン誘導体を検
出するための試料調製並びに免疫反応に最適の条件を与
えるのに有利であり、そして妨害を避けることがまたわ
かった。洗剤は、得られる混合物中で0.01〜５重量％、
好ましくは0.5 重量％の濃度を生じる量で反応緩衝液に
添加される。
【００１９】ヘモグロビン誘導体の測定の他に、同じ試
料中の全ヘモグロビン含量を測定することが意図されて
おり、そして好ましくは反応緩衝液の添加後に全ヘモグ
ロビン含量を測定するために、吸光度は400 〜650nm 、
好ましくは500 〜650nm 、特に好ましくは546 または57
0nm の波長で測定される。湿式試験の場合、この波長に
於ける吸光度はキュベット中で測光測定され、乾式試験
の場合には、吸光度は得られる混合物を試験キャリヤー
に適用した後に反射率測光法により測定し得る。
料中の全ヘモグロビン含量を測定することが意図されて
おり、そして好ましくは反応緩衝液の添加後に全ヘモグ
ロビン含量を測定するために、吸光度は400 〜650nm 、
好ましくは500 〜650nm 、特に好ましくは546 または57
0nm の波長で測定される。湿式試験の場合、この波長に
於ける吸光度はキュベット中で測光測定され、乾式試験
の場合には、吸光度は得られる混合物を試験キャリヤー
に適用した後に反射率測光法により測定し得る。
【００２０】全ヘモグロビン含量の測定用のこのような
試験キャリヤーは非常に簡単につくることができる。何
となれば、それはいかなる薬品をも含むべきではないか
らである。透明なキャリヤー箔に取り付けられている吸
収パッドが簡単な要件に適する。試験ストリップの改良
された取扱および評価の目的で、更に別のキャリヤー
層、例えば、輸送パッドまたは投薬パッドが含まれても
よい。
試験キャリヤーは非常に簡単につくることができる。何
となれば、それはいかなる薬品をも含むべきではないか
らである。透明なキャリヤー箔に取り付けられている吸
収パッドが簡単な要件に適する。試験ストリップの改良
された取扱および評価の目的で、更に別のキャリヤー
層、例えば、輸送パッドまたは投薬パッドが含まれても
よい。
【００２１】また、全ヘモグロビン含量およびヘモグロ
ビン誘導体含量は、溶血試薬の添加後に試料の異なる部
分中で測定し得る。この場合、全ヘモグロビン含量は、
必要により適当な希釈後に、試料と溶血試薬の混合物の
一部中で測光測定される。反応緩衝液が、その混合物の
第二部分に添加され、続いてヘモグロビン誘導体が免疫
学的に測定される。
ビン誘導体含量は、溶血試薬の添加後に試料の異なる部
分中で測定し得る。この場合、全ヘモグロビン含量は、
必要により適当な希釈後に、試料と溶血試薬の混合物の
一部中で測光測定される。反応緩衝液が、その混合物の
第二部分に添加され、続いてヘモグロビン誘導体が免疫
学的に測定される。
【００２２】原則として、全ての現行の免疫学的方法が
HbA1C の如きヘモグロビン誘導体の測定に適する。上記
のように、ヘモグロビン誘導体の特徴的なエピトープを
特異的に結合するヘモグロビン誘導体、好ましくはHbA
1C のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を
生産することが可能である（米国特許第4,247,533 号、
欧州特許出願第0316306 号および同第0201187 号明細
書) 。
HbA1C の如きヘモグロビン誘導体の測定に適する。上記
のように、ヘモグロビン誘導体の特徴的なエピトープを
特異的に結合するヘモグロビン誘導体、好ましくはHbA
1C のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を
生産することが可能である（米国特許第4,247,533 号、
欧州特許出願第0316306 号および同第0201187 号明細
書) 。
【００２３】免疫学的試験の別法、標識の種類、並びに
測定シグナルを検出する方法は当該技術分野の既知の方
法である。例えば、酵素標識によるサンドイッチ試験(E
LISA) 、IEMA試験操作、RIA 、沈殿試験および凝集試験
および均一イムノアッセイ、例えば、CEDIA(商標) 、EM
ITまたはFPIA技術が好適である。湿式試験では、ヘモグ
ロビン誘導体の免疫学的測定はTINIA 技術に従って行わ
れることが好ましい。何となれば、分離工程がこの場合
には必要ではないからである。分析物−特異的抗体およ
び凝集剤としてのポリハプテンが試料に添加される。ポ
リハプテンはキャリヤー物質、例えば、アルブミン、デ
キストランまたはIgG からなり、これには特異的抗体が
結合し得る幾つかのエピトープがカップリングされてい
る。抗体の沈殿はポリハプテンのみにより起こり得るの
で、比濁分析または濁度測定で測定し得る濁度の増加は
試料中の分析物の含量を減少することにより得られる。
測定シグナルを検出する方法は当該技術分野の既知の方
法である。例えば、酵素標識によるサンドイッチ試験(E
LISA) 、IEMA試験操作、RIA 、沈殿試験および凝集試験
および均一イムノアッセイ、例えば、CEDIA(商標) 、EM
ITまたはFPIA技術が好適である。湿式試験では、ヘモグ
ロビン誘導体の免疫学的測定はTINIA 技術に従って行わ
れることが好ましい。何となれば、分離工程がこの場合
には必要ではないからである。分析物−特異的抗体およ
び凝集剤としてのポリハプテンが試料に添加される。ポ
リハプテンはキャリヤー物質、例えば、アルブミン、デ
キストランまたはIgG からなり、これには特異的抗体が
結合し得る幾つかのエピトープがカップリングされてい
る。抗体の沈殿はポリハプテンのみにより起こり得るの
で、比濁分析または濁度測定で測定し得る濁度の増加は
試料中の分析物の含量を減少することにより得られる。
【００２４】ヘモグロビン誘導体−特異的抗体は反応緩
衝液中に既に存在していることが好ましい。反応緩衝液
の添加後に、得られる混合物中の全ヘモグロビン含量は
最初に測光測定し得る。沈殿反応が、ポリハプテンを含
む溶液の添加により開始される。短いインキュベーショ
ン期間（それには、５分が通常適当である）後に、得ら
れる濁度が適当な波長、好ましくは340 〜600nm 、特に
好ましくは340nm の波長で測定され、そしてヘモグロビ
ン誘導体濃度がこれから決定される。全ヘモグロビンの
測定は500 〜650nm 、好ましくは546 または570nm の波
長で行われるので、二つの測定は互いに妨害せず、それ
故、同じ反応溶液中で一つのキュベット中で連続的に行
い得る。
衝液中に既に存在していることが好ましい。反応緩衝液
の添加後に、得られる混合物中の全ヘモグロビン含量は
最初に測光測定し得る。沈殿反応が、ポリハプテンを含
む溶液の添加により開始される。短いインキュベーショ
ン期間（それには、５分が通常適当である）後に、得ら
れる濁度が適当な波長、好ましくは340 〜600nm 、特に
好ましくは340nm の波長で測定され、そしてヘモグロビ
ン誘導体濃度がこれから決定される。全ヘモグロビンの
測定は500 〜650nm 、好ましくは546 または570nm の波
長で行われるので、二つの測定は互いに妨害せず、それ
故、同じ反応溶液中で一つのキュベット中で連続的に行
い得る。
【００２５】ポリハプテン溶液、即ち、ポリハプテンま
たはグリコシル化されたタンパク質もしくはペプチドの
液体ガレン形態を調製する場合、これはリン酸緩衝液
（それは通常7.0 〜7.5 のpHで使用される）中で安定で
はなく、そして長時間の貯蔵中に糖タンパク質の分解を
もたらすことがあることがわかった。リン酸緩衝液中の
グリコシル化タンパク質のこのような不安定性は、例え
ば、Ahmed ら、J.Biol.Chem.261(1986),4889-4894 によ
り知られている。グリコシル化されたペプチド、タンパ
ク質およびポリハプテンの安定化は、５〜200 ミリモル
/l、好ましくは20〜50ミリモル/lの濃度および5.0 〜8.
0 、好ましくは6.0 〜6.5 のpHのMES 緩衝液を使用する
ことにより、そして１〜50ミリモル/l、特に好ましくは
0.1 〜20ミリモル/lの好ましい濃度のEDTAまたは均等の
錯生成剤の同時添加により得られた。0.1 〜２％、特に
好ましくは１％の好ましい濃度のウシ血清アルブミン(B
SA)の添加は、ポリハプテン溶液の安定性に関して更に
顕著な効果を有していた。このポリハプテン溶液は、ポ
リハプテンまたはグリコシル化されたタンパク質もしく
はペプチドのかなりの不安定性を観察しないで４℃で12
ケ月以上貯蔵し得る。35℃で３週間ストレスをかける場
合、もとの吸光度シグナルのわずかに15〜20％のシグナ
ルの減少が生じる。
たはグリコシル化されたタンパク質もしくはペプチドの
液体ガレン形態を調製する場合、これはリン酸緩衝液
（それは通常7.0 〜7.5 のpHで使用される）中で安定で
はなく、そして長時間の貯蔵中に糖タンパク質の分解を
もたらすことがあることがわかった。リン酸緩衝液中の
グリコシル化タンパク質のこのような不安定性は、例え
ば、Ahmed ら、J.Biol.Chem.261(1986),4889-4894 によ
り知られている。グリコシル化されたペプチド、タンパ
ク質およびポリハプテンの安定化は、５〜200 ミリモル
/l、好ましくは20〜50ミリモル/lの濃度および5.0 〜8.
0 、好ましくは6.0 〜6.5 のpHのMES 緩衝液を使用する
ことにより、そして１〜50ミリモル/l、特に好ましくは
0.1 〜20ミリモル/lの好ましい濃度のEDTAまたは均等の
錯生成剤の同時添加により得られた。0.1 〜２％、特に
好ましくは１％の好ましい濃度のウシ血清アルブミン(B
SA)の添加は、ポリハプテン溶液の安定性に関して更に
顕著な効果を有していた。このポリハプテン溶液は、ポ
リハプテンまたはグリコシル化されたタンパク質もしく
はペプチドのかなりの不安定性を観察しないで４℃で12
ケ月以上貯蔵し得る。35℃で３週間ストレスをかける場
合、もとの吸光度シグナルのわずかに15〜20％のシグナ
ルの減少が生じる。
【００２６】乾式試験としてのヘモグロビン誘導体の免
疫学的測定はIEMA試験技術に従って行われることが好ま
しい。溶血された血液試料への反応緩衝液の添加後に、
特異的酵素標識抗体が添加される。好ましい実施態様で
は、その抗体は反応緩衝液中に既に存在している。短い
インキュベーション後に、その混合物は試験キャリヤー
に適用される。遊離の酵素標識抗体はエピトープマトリ
ックス、即ち幾つかのエピトープ（これには特異的抗体
が結合し得る）がカップリングされている試験キャリヤ
ー領域で捕捉される。別の領域、試験領域では、ヘモグ
ロビン誘導体および標識抗体の複合体が適当な酵素基質
の変換により反射率測光により測定される。基質は試験
領域中に存在することができ、または試験領域を基質を
含む別の領域と接触させることにより利用できる。
疫学的測定はIEMA試験技術に従って行われることが好ま
しい。溶血された血液試料への反応緩衝液の添加後に、
特異的酵素標識抗体が添加される。好ましい実施態様で
は、その抗体は反応緩衝液中に既に存在している。短い
インキュベーション後に、その混合物は試験キャリヤー
に適用される。遊離の酵素標識抗体はエピトープマトリ
ックス、即ち幾つかのエピトープ（これには特異的抗体
が結合し得る）がカップリングされている試験キャリヤ
ー領域で捕捉される。別の領域、試験領域では、ヘモグ
ロビン誘導体および標識抗体の複合体が適当な酵素基質
の変換により反射率測光により測定される。基質は試験
領域中に存在することができ、または試験領域を基質を
含む別の領域と接触させることにより利用できる。
【００２７】溶血試薬の他に、溶解もしくは凍結乾燥形
態のその他の試薬、または少なくとも二つの別個のパー
ケージ中で試験キャリヤーに適用されるその他の試薬を
含む試験キットの形態で本発明の方法に必要である試薬
を販売することが適当である。本発明を下記の実施例に
より説明する。
態のその他の試薬、または少なくとも二つの別個のパー
ケージ中で試験キャリヤーに適用されるその他の試薬を
含む試験キットの形態で本発明の方法に必要である試薬
を販売することが適当である。本発明を下記の実施例に
より説明する。
【００２８】
【実施例】実施例１ 湿式試験に於ける全ヘモグロビンおよびHbA1c の同時測
定 実験をベーリンガー・マンハイム(Boeringer Mannheim)
GmbHのヒタチ(Hitachi)717で行った。全ヘモグロビン含
量を546nm の波長で測光測定した。HbA1c の免疫学的検
出をTINIA 試験技術に従って340nm で濁度測定により行
った。全ての測定およびインキュベーションを37℃の温
度で行った。
定 実験をベーリンガー・マンハイム(Boeringer Mannheim)
GmbHのヒタチ(Hitachi)717で行った。全ヘモグロビン含
量を546nm の波長で測光測定した。HbA1c の免疫学的検
出をTINIA 試験技術に従って340nm で濁度測定により行
った。全ての測定およびインキュベーションを37℃の温
度で行った。
【００２９】下記の溶液を使用した。溶血試薬： 20ミリモルのNaPO4 緩衝液、pH7.0 1.0 ％のSDS 0.1 ％のアジ化ナトリウム 0.02％のカリウムヘキサシアノフェレート(III) 0.5 ％のBrij35反応緩衝液： 20ミリモルのMES 緩衝液、pH6.0 150 ミリモルの塩化ナトリウム 3.0 ％のPEG6000 0.5 ％のBrij35 0.1 ％のウシ血清アルブミン 0.1 ％のアジ化ナトリウム 10ミリモルのEDTA ６mg/ mlのPAB<HbA1c ＞S-IgG(DE)(HbA1cのポリクロー
ナルヒツジAB) または 100 μg/mlのMAB<HbA1c ＞M-IgG(DE)(HbA1cのモノクロ
ーナルマウスAB)ポリハプテン溶液： 20ミリモルのMES 緩衝液、pH6.0 150 ミリモルの塩化ナトリウム 6.0 ％のPEG6000 0.5 ％のBrij35 0.1 ％のウシ血清アルブミン 25μg/mlのポリハプテンHbA1c - β-1-4(cys,MHS)-BSA1
8:1 溶血試薬を100:1 の比で血液試料に添加し、25℃で２分
間インキュベートした。反応緩衝液250 μl を溶血試料
５μl に添加した。４分後、全ヘモグロビンの吸光度を
546nm(A1) で測定した。340nm の吸光度(A2)を１分後に
測定し、続いてポリハプテン溶液50μl をピペットで添
加し、５分間インキュベートした。その後、濁度を340n
m(A3) で測定した。
ナルヒツジAB) または 100 μg/mlのMAB<HbA1c ＞M-IgG(DE)(HbA1cのモノクロ
ーナルマウスAB)ポリハプテン溶液： 20ミリモルのMES 緩衝液、pH6.0 150 ミリモルの塩化ナトリウム 6.0 ％のPEG6000 0.5 ％のBrij35 0.1 ％のウシ血清アルブミン 25μg/mlのポリハプテンHbA1c - β-1-4(cys,MHS)-BSA1
8:1 溶血試薬を100:1 の比で血液試料に添加し、25℃で２分
間インキュベートした。反応緩衝液250 μl を溶血試料
５μl に添加した。４分後、全ヘモグロビンの吸光度を
546nm(A1) で測定した。340nm の吸光度(A2)を１分後に
測定し、続いてポリハプテン溶液50μl をピペットで添
加し、５分間インキュベートした。その後、濁度を340n
m(A3) で測定した。
【００３０】HbA1c 値(g/dl)を測定するために、吸光度
の差ΔA ＝A3−Ｋ・A2をHbA1c 濃度に対してプロット
し、グラフで測定した。 全ヘモグロビンの濃度を、一定の係数ＫからA1を掛ける
ことにより計算する（Ｋ＝ヘモグロビン発色団のモル吸
光率ｘ希釈係数）。既知のヘモグロビンおよびHbA1c 含
量を有するEDTA全血が較正物質として利用できた。較正
曲線を確立するために、EDTA全血を種々の量の溶血試薬
で希釈した。
の差ΔA ＝A3−Ｋ・A2をHbA1c 濃度に対してプロット
し、グラフで測定した。 全ヘモグロビンの濃度を、一定の係数ＫからA1を掛ける
ことにより計算する（Ｋ＝ヘモグロビン発色団のモル吸
光率ｘ希釈係数）。既知のヘモグロビンおよびHbA1c 含
量を有するEDTA全血が較正物質として利用できた。較正
曲線を確立するために、EDTA全血を種々の量の溶血試薬
で希釈した。
【００３１】較正曲線を図１および図２に図示する。図
１では、全ヘモグロビン濃度をA1に対してプロットし
た。それは線形の関係を生じる。こうして、計算に際し
て一定の係数を掛けることが可能である。図２では、吸
光度の差ΔA ＝A3−Ｋ・A2をHbA1c 含量に対してプロッ
トする。別の実験では、ポリハプテン溶液を最初にピペ
ットで溶血された血液試料に添加し、５分のインキュベ
ーション後に沈殿反応を特異的抗体を含む反応緩衝液の
添加により開始した。このピペット操作の順序は上記の
ピペット操作の順序（この場合、最初に抗体を添加し、
その後にポリハプテンを添加した）と較べてHbA1 c 測定
のかなり低い感度をもたらした（図３）。
１では、全ヘモグロビン濃度をA1に対してプロットし
た。それは線形の関係を生じる。こうして、計算に際し
て一定の係数を掛けることが可能である。図２では、吸
光度の差ΔA ＝A3−Ｋ・A2をHbA1c 含量に対してプロッ
トする。別の実験では、ポリハプテン溶液を最初にピペ
ットで溶血された血液試料に添加し、５分のインキュベ
ーション後に沈殿反応を特異的抗体を含む反応緩衝液の
添加により開始した。このピペット操作の順序は上記の
ピペット操作の順序（この場合、最初に抗体を添加し、
その後にポリハプテンを添加した）と較べてHbA1 c 測定
のかなり低い感度をもたらした（図３）。
【００３２】実施例２ 全ヘモグロビンおよびHbA1c の測定用の試験ストリップ 溶血試薬300 μl を全血30μl に添加し、20℃で10分間
インキュベートした。溶血試薬は0.18％のSDS 溶液（こ
れはpH７で緩衝されている）からなっていた。全ヘモグ
ロビンを測定するために、溶血された血液試料32μl を
試験ストリップに適用した。試験ストリップの構造を図
４に図示する。それは、単に、未処理のガラス繊維投薬
パッド(1) 、未処理のガラス繊維輸送パッド(2) 、未処
理のポリエステル布(3) および透明なポリカーボネート
箔(4) からなる。試験ストリップは付加的な薬品を含ん
でいない。この実験操作を使用して、血液試料の全ヘモ
グロビン含量を576nm の波長で非常に正確に測定するこ
とができる。
インキュベートした。溶血試薬は0.18％のSDS 溶液（こ
れはpH７で緩衝されている）からなっていた。全ヘモグ
ロビンを測定するために、溶血された血液試料32μl を
試験ストリップに適用した。試験ストリップの構造を図
４に図示する。それは、単に、未処理のガラス繊維投薬
パッド(1) 、未処理のガラス繊維輸送パッド(2) 、未処
理のポリエステル布(3) および透明なポリカーボネート
箔(4) からなる。試験ストリップは付加的な薬品を含ん
でいない。この実験操作を使用して、血液試料の全ヘモ
グロビン含量を576nm の波長で非常に正確に測定するこ
とができる。
【００３３】2.5 ％以下の変化係数を得た（表１）。 表１ 全ヘモグロビンの測定 CVを10の単一測定からそれぞれの場合に計算した。 HbA1c 濃度を測定するために、反応緩衝液1200μl を溶
血試料32μl に添加し、10分間インキュベートする。反
応緩衝液はMAB-酵素複合体と一緒に100 ミリモルのHepe
s 、pH7.4 、100 ミリモルのNaClおよび0.1 ％のBrij35
からなる。その混合物32μl を試験ストリップ（これは
図５に図示されている）に適用する。遊離の抗体−酵素
複合体をエピトープマトリックス(11)で捕捉する。隣接
領域、輸送パッド(12)中で、HbA1c 抗体−酵素複合体
を、基質を含む基質パッド(13)を輸送パッド(12)と接触
させた後に基質の反応により反射率測光により測定する
（表２）。 表２ 試験ストリップによるHbA1c 濃度の測定 CVを10の単一測定からそれぞれの場合に測定した。
血試料32μl に添加し、10分間インキュベートする。反
応緩衝液はMAB-酵素複合体と一緒に100 ミリモルのHepe
s 、pH7.4 、100 ミリモルのNaClおよび0.1 ％のBrij35
からなる。その混合物32μl を試験ストリップ（これは
図５に図示されている）に適用する。遊離の抗体−酵素
複合体をエピトープマトリックス(11)で捕捉する。隣接
領域、輸送パッド(12)中で、HbA1c 抗体−酵素複合体
を、基質を含む基質パッド(13)を輸送パッド(12)と接触
させた後に基質の反応により反射率測光により測定する
（表２）。 表２ 試験ストリップによるHbA1c 濃度の測定 CVを10の単一測定からそれぞれの場合に測定した。
【００３４】 実施例３ HbA1c の測定に関する種々のイオン性洗剤の影響 実験を実施例１に記載したように行った。溶血試薬は下
記の組成を有していた。 20ミリモルのNaPO4 緩衝液、pH7.2 0.1 ％のアジ化ナトリウム 0.02％のカリウムヘキサシアノフェレート(III) 0.5 ％のBrij35 表３にリストしたイオン性洗剤が、そこに記載されたそ
れぞれの濃度で存在していた。
記の組成を有していた。 20ミリモルのNaPO4 緩衝液、pH7.2 0.1 ％のアジ化ナトリウム 0.02％のカリウムヘキサシアノフェレート(III) 0.5 ％のBrij35 表３にリストしたイオン性洗剤が、そこに記載されたそ
れぞれの濃度で存在していた。
【００３５】TTABおよびCTABの場合、カリウムヘキサシ
アノフェレート(III) は溶血試薬中に含まれていなかっ
た。何となれば、これはこれらの洗剤と共に沈殿するか
らである。反応緩衝液およびポリハプテン溶液の組成は
実施例１に一致する。3.2g/dl のHbA1c 含量を有する標
準物質を血液試料として使用した。試験した全てのイオ
ン性洗剤は、細胞の溶解およびエピトープ放出を生じ
た。アニオン性洗剤SDS 並びにカチオン性洗剤TTABおよ
びCTABが最適のものであることがわかった。 表３HbA1c 測定 溶血試薬中の種々のイオン性洗剤の影響 吸光度を340nm で測定した。 洗剤 溶血試薬 A1 A2 ΔA=A1−A2 中の濃度 ［0g/dl HbA1c ］ ［3.2g/dl HbA1c ］ SDS 0.5 ％ 337mA 73mA 264mA SDS 1.0 ％ 338mA 80mA 258mA ツイッター ジェント3-14 0.5 ％ 341mA 172mA 169mA ツイッター ジェント3-14 1.0 ％ 343mA 139mA 204mA TTAB 1.0 ％ 377mA 149mA 228mA CTAB 1.0 ％ 374mA 137mA 237mA イオン性洗剤 を含まない対照 -- 340mA 275mA 65mA 実施例４ Brij35濃度に対するHbA1c 測定の動的測定範囲の依存性 実験を実施例３のようにして行った。１％のSDS を常に
溶血試薬中に使用した。反応緩衝液中のBrij35の濃度
を、表４に記載した範囲内で変化させた。実施例３に記
載したHbA1c 標準物質が試料として利用できた。
アノフェレート(III) は溶血試薬中に含まれていなかっ
た。何となれば、これはこれらの洗剤と共に沈殿するか
らである。反応緩衝液およびポリハプテン溶液の組成は
実施例１に一致する。3.2g/dl のHbA1c 含量を有する標
準物質を血液試料として使用した。試験した全てのイオ
ン性洗剤は、細胞の溶解およびエピトープ放出を生じ
た。アニオン性洗剤SDS 並びにカチオン性洗剤TTABおよ
びCTABが最適のものであることがわかった。 表３HbA1c 測定 溶血試薬中の種々のイオン性洗剤の影響 吸光度を340nm で測定した。 洗剤 溶血試薬 A1 A2 ΔA=A1−A2 中の濃度 ［0g/dl HbA1c ］ ［3.2g/dl HbA1c ］ SDS 0.5 ％ 337mA 73mA 264mA SDS 1.0 ％ 338mA 80mA 258mA ツイッター ジェント3-14 0.5 ％ 341mA 172mA 169mA ツイッター ジェント3-14 1.0 ％ 343mA 139mA 204mA TTAB 1.0 ％ 377mA 149mA 228mA CTAB 1.0 ％ 374mA 137mA 237mA イオン性洗剤 を含まない対照 -- 340mA 275mA 65mA 実施例４ Brij35濃度に対するHbA1c 測定の動的測定範囲の依存性 実験を実施例３のようにして行った。１％のSDS を常に
溶血試薬中に使用した。反応緩衝液中のBrij35の濃度
を、表４に記載した範囲内で変化させた。実施例３に記
載したHbA1c 標準物質が試料として利用できた。
【００３６】測定範囲は0.1 ％のBrij35の添加により対
照の47mAから233mA まで既に増加した。Brij35の好まし
い濃度は0.1 〜1.0 ％であった。 表４ HbA1c 測定に関する反応緩衝液中の種々のBrij濃度の影響 吸光度を340nm で測定した。 反応緩衝液中の A1 A2 ΔA=A1−A2Brij35の濃度 ［0g/dl HbA1c ］ ［3.2g/dl HbA1c ］ - 240mA 193mA 47mA 0.1％ 266mA 33mA 233mA 0.25 ％ 274mA 40mA 234mA 0.5％ 302mA 57mA 245mA 1.0％ 351mA 99mA 252mA 2.0％ 385mA 242mA 143mA 実施例５ HbA1c 測定に関する反応緩衝液中の種々の洗剤の影響 実験を実施例４と同様にして行った。表５に記載した洗
剤を反応緩衝液中に使用した。動的測定範囲をBrij35、
56および58並びにMyrj52および59の添加により最大に拡
大した。しかしながら、トリトンの如きその他のノニオ
ン性洗剤およびツイッタージェント3-14の如き両性イオ
ン性洗剤がまた対照と較べて実質的に顕著な効果を示し
た。 表５ 反応緩衝液中の洗剤の影響 洗剤 反応緩衝液 A1 A2 ΔA=A1−A2 中の濃度 ［0g/dl HbA1c ］ ［3.2g/dl HbA1c ］ 対照 − 240mA 193mA 47mA Brij35 0.5 ％ 302mA 57mA 245mA Brij56 0.5 ％ 302mA 57mA 245mA Brij58 0.5 ％ 303mA 51mA 252mA トリトンX114 0.2 ％ 523mA 275mA 248mA トリトンX100 0.5 ％ 298mA 202mA 96mA トィーン80 0.25％ 277mA 143mA 134mA トィーン60 0.25％ 266mA 75mA 191mA トィーン40 0.25％ 276mA 86mA 189mA トィーン20 0.1 ％ 266mA 131mA 135mA ツィッター ジェント3-14 0.1 ％ 308mA 155mA 153mA Myrj52 0.5 ％ 308mA 40mA 268mA Myrj59 0.5 ％ 317mA 31mA 286mA 実施例６ 特定の褐色−緑のヘモグロビン発色団による全ヘモグロ
ビンおよびHbA1c の同時測定 実験をベーリンガー・マンハイムGmbHのヒタチ717 で行
った。全ヘモグロビン含量を570nm の波長で測光測定し
た。HbA1c の免疫学的測定をTINIA 試験技術に従って34
0nm に於ける濁度測定により行った。全ての測定および
インキュベーションを37℃の温度で行った。
照の47mAから233mA まで既に増加した。Brij35の好まし
い濃度は0.1 〜1.0 ％であった。 表４ HbA1c 測定に関する反応緩衝液中の種々のBrij濃度の影響 吸光度を340nm で測定した。 反応緩衝液中の A1 A2 ΔA=A1−A2Brij35の濃度 ［0g/dl HbA1c ］ ［3.2g/dl HbA1c ］ - 240mA 193mA 47mA 0.1％ 266mA 33mA 233mA 0.25 ％ 274mA 40mA 234mA 0.5％ 302mA 57mA 245mA 1.0％ 351mA 99mA 252mA 2.0％ 385mA 242mA 143mA 実施例５ HbA1c 測定に関する反応緩衝液中の種々の洗剤の影響 実験を実施例４と同様にして行った。表５に記載した洗
剤を反応緩衝液中に使用した。動的測定範囲をBrij35、
56および58並びにMyrj52および59の添加により最大に拡
大した。しかしながら、トリトンの如きその他のノニオ
ン性洗剤およびツイッタージェント3-14の如き両性イオ
ン性洗剤がまた対照と較べて実質的に顕著な効果を示し
た。 表５ 反応緩衝液中の洗剤の影響 洗剤 反応緩衝液 A1 A2 ΔA=A1−A2 中の濃度 ［0g/dl HbA1c ］ ［3.2g/dl HbA1c ］ 対照 − 240mA 193mA 47mA Brij35 0.5 ％ 302mA 57mA 245mA Brij56 0.5 ％ 302mA 57mA 245mA Brij58 0.5 ％ 303mA 51mA 252mA トリトンX114 0.2 ％ 523mA 275mA 248mA トリトンX100 0.5 ％ 298mA 202mA 96mA トィーン80 0.25％ 277mA 143mA 134mA トィーン60 0.25％ 266mA 75mA 191mA トィーン40 0.25％ 276mA 86mA 189mA トィーン20 0.1 ％ 266mA 131mA 135mA ツィッター ジェント3-14 0.1 ％ 308mA 155mA 153mA Myrj52 0.5 ％ 308mA 40mA 268mA Myrj59 0.5 ％ 317mA 31mA 286mA 実施例６ 特定の褐色−緑のヘモグロビン発色団による全ヘモグロ
ビンおよびHbA1c の同時測定 実験をベーリンガー・マンハイムGmbHのヒタチ717 で行
った。全ヘモグロビン含量を570nm の波長で測光測定し
た。HbA1c の免疫学的測定をTINIA 試験技術に従って34
0nm に於ける濁度測定により行った。全ての測定および
インキュベーションを37℃の温度で行った。
【００３７】下記の溶液を使用した。溶血試薬： 20ミリモルのNaPO4 緩衝液、pH7.4 1.0 ％のテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド
(TTAB) 0.01％のメチルイソチアゾロン 0.02％のブロニドックス（商標）K 0.5 ％のBrij35 10ミリモルのEDTA反応緩衝液： 20ミリモルのMES 緩衝液、pH6.0 150 ミリモルの塩化ナトリウム 3.0 ％のPEG6000 0.5 ％のBrij35 0.01％のメチルイソチアゾロン 0.02％のブロニドックス（商標）K 1.2mg/mlのPAK<HbA1c ＞S-IgG(DE)( HbA1c のポリクロ
ーナルヒツジAB)ポリハプテン溶液： 20ミリモルのMES 緩衝液、pH6.0 150 ミリモルの塩化ナトリウム 6.0 ％のPEG6000 0.5 ％のBrij35 20μg/mlのポリハプテン 溶血試薬を100:1 の比で血液試料に添加し、25℃で２分
間インキュベートした。反応緩衝液250 μl を溶血試料
10μl に添加した。４分後に全ヘモグロビンの吸光度を
570nm で測定した(A1)。１分間後に吸光度を340nm で測
定し(A2)、続いてポリハプテン溶液50μl をピペットで
添加し、５分間インキュベートした。その後、濁度を34
0nm で測定した(A3)。
(TTAB) 0.01％のメチルイソチアゾロン 0.02％のブロニドックス（商標）K 0.5 ％のBrij35 10ミリモルのEDTA反応緩衝液： 20ミリモルのMES 緩衝液、pH6.0 150 ミリモルの塩化ナトリウム 3.0 ％のPEG6000 0.5 ％のBrij35 0.01％のメチルイソチアゾロン 0.02％のブロニドックス（商標）K 1.2mg/mlのPAK<HbA1c ＞S-IgG(DE)( HbA1c のポリクロ
ーナルヒツジAB)ポリハプテン溶液： 20ミリモルのMES 緩衝液、pH6.0 150 ミリモルの塩化ナトリウム 6.0 ％のPEG6000 0.5 ％のBrij35 20μg/mlのポリハプテン 溶血試薬を100:1 の比で血液試料に添加し、25℃で２分
間インキュベートした。反応緩衝液250 μl を溶血試料
10μl に添加した。４分後に全ヘモグロビンの吸光度を
570nm で測定した(A1)。１分間後に吸光度を340nm で測
定し(A2)、続いてポリハプテン溶液50μl をピペットで
添加し、５分間インキュベートした。その後、濁度を34
0nm で測定した(A3)。
【００３８】HbA1c 値(g/dl)を測定するために、吸光度
の差ΔA ＝A3−Ｋ・A2をHbA1c 濃度に対してプロット
し、グラフにより測定した。 全ヘモグロビンの濃度を、一定の係数ＫからA1を掛ける
ことにより計算する（Ｋ＝ヘモグロビン発色団のモル吸
光率ｘ希釈係数）。特徴的な吸収スペクトルを図６に示
す。既知のヘモグロビン含量およびHbA1c 含量を有する
EDTA−全血が較正物質として利用できた。較正曲線を確
立するために、EDTA−全血を種々の量の溶血試薬で希釈
した。
の差ΔA ＝A3−Ｋ・A2をHbA1c 濃度に対してプロット
し、グラフにより測定した。 全ヘモグロビンの濃度を、一定の係数ＫからA1を掛ける
ことにより計算する（Ｋ＝ヘモグロビン発色団のモル吸
光率ｘ希釈係数）。特徴的な吸収スペクトルを図６に示
す。既知のヘモグロビン含量およびHbA1c 含量を有する
EDTA−全血が較正物質として利用できた。較正曲線を確
立するために、EDTA−全血を種々の量の溶血試薬で希釈
した。
【００３９】較正曲線を図７および図８に示す。図７で
は、全ヘモグロビン濃度をA1に対してプロットした。そ
れは線形の関係を生じる。こうして、計算に際して一定
の係数Ｋを掛けることができる。図８では、吸光度の差
ΔA ＝A3−Ｋ・A2をHbA1c 含量に対してプロットした。
は、全ヘモグロビン濃度をA1に対してプロットした。そ
れは線形の関係を生じる。こうして、計算に際して一定
の係数Ｋを掛けることができる。図８では、吸光度の差
ΔA ＝A3−Ｋ・A2をHbA1c 含量に対してプロットした。
【図１】全ヘモグロビン含量を測定するための較正曲線
を示す。
を示す。
【図２】HbA1c 含量を測定するための較正曲線を示す。
【図３】HbA1c 測定の免疫学的測定の結果を示すグラフ
図である。
図である。
【図４】試験ストリップの構造の線図である。
【図５】試験ストリップの線図である。
【図６】褐色−緑のヘモグロビン発色団の吸光スペクト
ルである。
ルである。
【図７】全ヘモグロビン含量を測定するための較正曲線
を示す。
を示す。
【図８】HbA1c 含量を測定するための較正曲線を示す。
１−未処理のガラス繊維投薬パッド ２−未処理のガラス繊維輸送パッド ３−未処理のポリエステル布 ４−透明なポリカーボネート箔 １１−エピトープマトリックス １２−輸送パッド １３−基質パッド
フロントページの続き (72)発明者 エリッヒ シュナイダー ドイツ連邦共和国 Ｄ−6800 マンハイ ム 31 エム．クエルシュラク ６ (56)参考文献 特開 昭61−172064（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−67457（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−137566（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−252557（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−61465（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−191057（ＪＰ，Ａ)
Claims (13)
- 【請求項１】（ａ）血液試料を、５〜９．５のｐＨを有
するイオン性洗剤を含む溶血試薬で４〜３７℃の温度で
１０分間まで処理し、そして （ｂ）グリコヘモグロビンを溶血させた血液試料中で免
疫学的に測定することを特徴とする血液試料中のグリコ
ヘモグロビン含量の測定方法。 - 【請求項２】（ａ）血液試料を、５〜９．５のｐＨを有
するイオン性洗剤およびノニオン性洗剤を含む溶血試薬
で処理しそして （ｂ）グリコヘモグロビンを溶血させた血液試料中で免
疫学的に測定することを特徴とする、血液試料中のグリ
コヘモグロビン含量の測定方法。 - 【請求項３】 ノニオン性または両性イオン性の洗剤を
含む反応緩衝液を溶血させた試料に添加し、そしてグリ
コヘモグロビンを得られる混合物中で免疫学的に測定す
る請求項１または２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４】 グリコヘモグロビンがＨｂＡｌｃである
請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 グリコヘモグロビンの含量に加え、全ヘ
モグロビン含量を溶血させた試料中で測定する請求項１
〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 全ヘモグロビン含量を、特定のヘモグロ
ビン発色団の特徴的な吸光度を測定することにより測定
する請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 ノニオン性または両性イオン性の洗剤を
含む反応緩衝液を溶血させた試料に添加し、そして全ヘ
モグロビンおよびグリコヘモグロビンを得られる混合物
中で測定する、請求項５または６のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項８】 ５〜９．５のｐＨを有するイオン性洗剤
とノニオン性洗剤および作用の機構がチオール基の酸化
的攻撃に基づいている適当な酸化剤または防腐剤を含む
グリコヘモグロビンの免疫学的測定のための溶血試薬。 - 【請求項９】 請求項８に記載の溶血試薬を使用するこ
とを特徴とするグリコヘモグロビンの免疫学的測定のた
め、または試料中のグリコヘモグロビンおよび全ヘモグ
ロビン含量の同時測定のための方法。 - 【請求項１０】 少なくとも二つの別個のパッケージか
らなり、その一つが請求項８に記載の溶血試薬を含み、
そして他のパッケージがグリコヘモグロビンの免疫学的
検出に必要な試薬を含む更に別の試薬混合物を含むこと
を特徴とするグリコヘモグロビンの免疫学的検出用の試
験キット。 - 【請求項１１】 免疫学的試験に必要な試薬が試験キャ
リヤーに適用されている請求項１０に記載の試験キッ
ト。 - 【請求項１２】 グリコヘモグロビンの免疫学的検出に
必要な試薬がＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０〜８．０）を緩
衝液として使用し、ＥＤＴＡを含む、グリコシル化され
たタンパク質、ペプチドまたはポリハプテンの溶液を含
むことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の試験キ
ット。 - 【請求項１３】 グリコシル化されたタンパク質、ペプ
チドまたはポリハプテンの溶液がＢＳＡを含有すること
を特徴とする請求項１２に記載の試験キット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4206932A DE4206932A1 (de) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | Immunologische methode zur bestimmung eines haemoglobinderivates |
| DE4206932:7 | 1992-03-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0611510A JPH0611510A (ja) | 1994-01-21 |
| JP2637677B2 true JP2637677B2 (ja) | 1997-08-06 |
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|---|---|---|---|
| JP5045130A Expired - Fee Related JP2637677B2 (ja) | 1992-03-05 | 1993-03-05 | ヘモグロビン誘導体の測定のための免疫学的方法 |
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| JP (1) | JP2637677B2 (ja) |
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| CZ (1) | CZ29193A3 (ja) |
| DE (2) | DE4206932A1 (ja) |
| DK (1) | DK0559164T3 (ja) |
| ES (1) | ES2148190T3 (ja) |
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| HU (1) | HUT70463A (ja) |
| IL (1) | IL104902A0 (ja) |
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| PL (1) | PL297915A1 (ja) |
| PT (1) | PT559164E (ja) |
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