SI9300108A

SI9300108A - Immunological method for the determination of hemoglobin derivatives

Info

Publication number: SI9300108A
Application number: SI9300108A
Authority: SI
Inventors: Johann Karl; Lorenz Kerscher; Erich Schneider
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1992-03-05
Filing date: 1993-03-05
Publication date: 1993-09-30
Also published as: AU652092B2; DE4206932A1; ZA931533B; IL104902A0; HU9300596D0; JPH0611510A; HUT70463A; KR930020162A; EP0559164A3; HRP930253A2; ES2148190T3; US5541117A; FI930975A0; SK14993A3; NO930770L; JP2637677B2; DK0559164T3; NZ247054A; EP0559164A2; DE59310046D1

Description

Imunološka metoda za določanje derivata hemoglobina

Izum se nanaša na metodo za določanje vsebnosti določenega derivata hemoglobina v vzorcu krvi. Podrobno se izum nanaša na metodo za določanje vsebnosti derivatov hemoglobina, kot glikiranega hemoglobina, ki zahtevajo ločeno določanje vsebnosti celokupnega hemoglobina in določanje derivata hemoglobina, da bi določili delež derivatiziranega hemoglobina v krvi.

V odvisnosti od nivoja sladkorja v krvi se majhen del glukoze, ki so jo privzeli eritrociti, spoji v neencimski reakciji z N-terminalnim ostankom valina /3-verige hemoglobina. Reakcija do stabilnega glikiranega derivata hemoglobina HbA_lc(ketoaminska oblika) poteka v dveh stopnjah. Prvič se glukoza preko hitre reverzibilne adicije na hemoglobin veže ob tvorbi labilnega glikiranega derivata hemoglobina (Schiffove baze). Z ireverzibilno počasno premestitveno reakcijo (Amadorijeva premestitev) se tvori stabilna oblika. Delež HbA_lc v celokupnem hemoglobinu znaša pri ljudeh z zdravo presnovo 3 do 6 %. Pri bolnikih z diabetesom lahko delež HbA_lc proporcionalno višini koncentracije glukoze v krvi med predhodnimi 4 do 12 tedni naraste do vrednosti 12 %, v posameznih primerih celo do 20 %. Določitev relativnega deleža HbA_lc v celokupni vsebnosti hemoglobina se ponuja zlasti kot integralni parameter za kontrolo poteka uravnavanja sladkorja v krvi.

Za določanje glikiranega hemoglobina so opisali vrsto metod. Konvencionalne metode temelje na tehnikah, kot elektroforezi, izoelektričnem fokusiranju in kolorimetričnem določanju kot tudi na ionsko izmenjevani in afinitetni kromatografiji. Potem ko so opisali pripravo specifičnih poliklonskih protiteles (US patent 4,247,533) in monoklonskih protiteles (EP-A-0 316 306, EP-A-0 201 187), so razvili vrsto imunoloških metod za dokaz HbA_lc.

EP-A-0 185 870 opisuje imunološko metodo za določanje proteinov, med drugim HbA_lc. Uporabili so monoklonska protitelesa, ki prepoznajo specifično linearne peptidepitope. Za sproščanje epitopov predpisujejo denaturiranje, med drugim s kaotropnimi reagenti. Pri temperaturah pod 37°C zahteva ta stopnja denaturiranja eno do več ur, pri temperaturah nad 50°C pa eno minuto. V istočasno določanje vsebnosti celokupnega hemoglobina v vzorcu se ne spuščajo.

V EP-A-0 201 187 je opisana metoda za določanje HbA_lc, pri kateri uporabijo monoklonska protitelesa proti HbA_lc, ki so jih dobili z imuniziranjem z nativnim humanim HbA_lc. Dokaz izvedejo pri temperaturah od 4 do 37°C, pri čemer lahko traja vsaka stopnja inkubacije do 72 ur. Določanje vsebnosti celokupnega hemoglobina in vsebnosti HbA^ v istem vzorcu ni opisano.

V EP-0 315 864 je opisana metoda za določanje relativne vsebnosti HbA_lc v vzorcu krvi. Hemoglobin denaturirajo s tiocianatom in z dodatnim oksidacijskim sredstvom, prednostno fericianidom, prevedejo v met-hemoglobin V tako obdelanem vzorcu krvi lahko določijo vsebnost celokupnega hemoglobina kot tudi vsebnost HbA_lc.

Uporaba litijevih soli, prednostno litijevega tiocianata, za lizo eritrocitov in denaturiranje derivata hemoglobina je opisana v EP-A-0 407 860. Vsebnost HbA_lclahko določijo imunološko. Za dokaz celokupnega hemoglobina je treba dodatno dodati oksidacijsko sredstvo, prednostno fericianid, ki prevede hemoglobin v methemoglobin.

Pomankljivost obeh zadnje navedenih metod je v tem, da je treba za prevedbo hemoglobina v ciano-met-hemoglobin uporabiti cianid. Nadomestitev cianida z natrijevim lavrilsulfatom (SLS) za določitev celokupnega hemoglobina je opisana v Ciin. Biochem. 15 (1982) 83 - 88. Vendar pa tu ni nobenega namiga, da je SLS primeren za predhodno obdelavo vzorca pri imunološki določitvi derivata hemoglobina, posebno HbA_lc.

Tudi v EP-A-0 184 787 je opisan reagent za določanje celokupnega hemoglobina v vzorcu krvi, ki je brez cianida. Reagent je ionsko površinsko aktivno sredstvo s pH najmanj 11,3, prednostno več kot 13,7. Imunološkega določanja derivata hemoglobina ne obravnavajo. Zelo visoka vrednost pH bi bila pri imunološki določitvi glikiranega derivata hemoglobina v škodo, ker lahko pride v močno alkalnem do odcepitve sladkornih deležev hemoglobina. V primeru encimskega markiranja uporabljenih protiteles bi prišlo lahko do inhibicije encimske reakcije, ker leži optimalni pH encimov, ki jih najpogosteje uporabljajo, pri pH od 6 do 8. Visoka vrednost pH lahko inhibira tudi imunološko reakcijo.

Zato je še vedno obstojala potreba po imunološki dokazovalni metodi za določanje derivata hemoglobina v krvi, pri čemer bi lahko hemolizo izvedli pri nizkih temperaturah - kot npr. pri sobni temperaturi -, za pripravo vzorca ne bi bil potreben dolg inkubacijski čas in bi se izognili uporabi okolju škodljivih reagentov, kot cianida. Razen tega naj bi bilo možno istočasno določanje celokupnega hemoglobina v istem hemolizatu, da bi mogli določiti delež derivata hemoglobina v vsebnosti celokupnega hemoglobina v krvi brez dodatnega začetka hemolize. Naloga pričujočega izuma je bila dati na razpolago tako imunološko dokazovalno metodo za določanje derivata hemoglobina v krvi.

Nalogo rešimo z izumom, ki je podrobneje označen v patentnih zahtevkih. V bistvu rešimo to nalogo z imunološko dokazovalno metodo za določanje vsebnosti derivata hemoglobina v vzorcu krvi, ki je označena s tem, da obdelamo vzorec s hemoliznim reagentom, ki vsebuje ionski detergent s pH od 5 do 9,5, in v vzorcu hemolizirane krvi imunološko določimo derivat hemoglobina.

Nadaljnji predmet izuma je metoda za določanje vsebnosti derivata hemoglobina in celokupnega hemoglobina v vzorcu krvi, ki obstaja v tem, da vzorec krvi obdelamo s hemoliznim reagentom, ki vsebuje ionski detergent s pH od 5,0 do 9,5, v hemoliziranem vzorcu fotometrično določimo vsebnost celokupnega hemoglobina in v hemoliziranem vzorcu imunološko določimo derivat hemoglobina.

Nadaljnji predmet izuma je hemolizni reagent, ki vsebuje ionski detergent s pH od 5 do 9,5, njegova uporaba za pripravo vzorca krvi za imunološko določanje derivata hemoglobina in po želji za določanje vsebnosti celokupnega hemoglobina kot tudi testni komplet, ki vsebuje hemolizni reagent.

Pod učinkom hemoliznega reagenta se eritrociti, ki jih vsebuje vzorec krvi, lizirajo in hemoglobin prevede v specifičen hemoglobinski kromofor. Nastali hemoglobinski kromofor lahko uporabimo preko njegove karakteristične absorpcije za določitev vsebnosti celokupnega hemoglobina in preko imunološke reakcije specifičnega epitopa za določitev derivata hemoglobina. Kot imunološko dokazovalno metodo lahko načelno uporabimo vse običajne metode, kot npr. sandwich-teste, DEMAteste, precipitacijske ali aglutinacijske teste kot tudi teste po principu FPIA in CEDIA. Možni so tako mokri kot tudi suhi testi.

V hemoliznem reagentu lahko uporabimo kot ionske detergente anionske detergente, prednostno natrijev dodecilsulfat (SDS), natrijev dioktilsulfosukcinat (DONS), kationske detergente, prednostno tetradeciltrimetilamonijev bromid (TTAB) ali cetiltrimetilamonijev bromid (CTAB) ali amfionske detergente, prednostno Zwittergent 3-14. Hemolizni reagent dodamo vzorcu krvi v množini, ki zadoča, da lizira eritrocite, prevede hemoglobin v specifični hemoglobinski kromofor in sprosti epitope derivata hemoglobina. Homolizni reagent dodamo vzorcu krvi v razmerju 1:10 do 1:400, tako da znaša koncentracija ionskega detergenta v nastali mešanici 0,01 do 5 mas.%, prednostno 0,5 do 1,5 mas.%. Vrednost pH hemoliznega reagenta leži v rahlo kislem do šibko alkalnem območju. Prednostno leži pH med J,0 do 9,5, posebno prednostno pri 7,4. Za naravnavo vrednosti pH v hemoliznem reagentu lahko uporabimo vse običajne puferje. Prednostno uporabimo HEPES, MES, TRIS ah fosfatni pufer.

Hemolizni reagent lahko vsebuje nadaljnje reagente, ki rabijo npr. pri odpravi motenj imunološke reakcije, oksidacije hemoglobina, odstranitvi motnosti, stabiliziranju ali konserviranju. Nekateri detergenti, med drugimi SDS, lahko motijo imunološke reakcije. V redkih primerih se pojavijo po dodatku hemoliznega reagenta zamotnitve in izkosmičenja, ki imajo različne vzroke. Pri nizkih temperaturah je npr. SDS težko topen. Presenetljivo se je pokazalo, da se lahko tem motnjam izognemo z dodatkom neionskega detergenta, prednostno polioksietilenetra, kot je Brij 35 in 58 ali Triton Χ100 kot tudi polioksietilenestra, kot je Myrj_52 in 59 ali Tween 20. Normalno dodamo neionski detergent hemoliznemu reagentu v taki množini, da znaša po dodatku k vzorcu v nastali mešanici koncentracija 0,01 do 5 mas.%, prednostno 0,1 do 0,5 mas.%.

Hemolizni reagent lahko vsebuje še vedno običajno oksidacijsko sredstvo fericianid, npr. heksacianoferat (III). Vendar lahko pride skupaj s kationskimi detergenti do obarjanj. Dodatno je pri uporabi fericianida potrebna zaščita pred svetlobo. Presenetljivo se je pokazalo, da se lahko pri dodatku konservimih sredstev, katerih mehanizem delovanja temelji na učinku na tiolne skupine, kot sta npr.

I metilizotiazolon ali Bronidox® K, povsem odpovemo dodatku fericianida. Skupaj s kationskimi detergenti vodijo ta konservima sredstva do rjavo zeleno obarvanega hemoglobinskega kromofora, katerega absorpcijski maksimum leži pri 570 nm. Posebna prednost je v tem, da dosežemo prvič z dodatkom konservimega sredstva tako prevedbo hemoglobina v specifičen hemoglobinski kromofor kot tudi dobro konserviranje hemoliznega reagenta in drugič, da je končna točka hemolize dobro vidna na spremembi barve iz rdeče v rjavo-zeleno. Konservima sredstva uporabimo v hemoliznem reagentu v koncentraciji od 0,005 do 0,2 mas.%, prednostno 0,01 do 0,02 mas.%.

Hemoliza, prevedba hemoglobina v specifični hemoglobinski kromofor kot tudi priprava vzorca za dokaz derivatov hemoglobina s hemoliznim reagentom so pri nizkih temperaturah, prednostno pri 4 do 37 °C in zlasti prednostno pri sobni temperaturi (20 °C) zaključene po 1 do 10 minutah. V večini primerov zadošča za popolno pripravo vzorca 2-minutna inkubacija.

Tako pripravljeni vzorec krvi nato razredčimo z reakcijskim puferjem v razmeiju 1:10 do 1:100. Kot pufer lahko uporabimo vse običajne puferje, ki ne motijo imunološke reakcije. Prednostno uporabimo pufer MES ali HEPES V koncentracijah od 10 do 200 mmolov/1. Vrednost pH reakcijskega pufeija znaša 5,0 do 8,0. V primeru da obsega imunološki dokaz encimsko reakcijo, bo imel reakcijski pufer prednostno vrednost pH, ki ustreza optimalnemu pH encimske reakcije. Reakcijski pufer lahko nadalje že vsebuje reagente, potrebne za dokaz derivata hemoglobina, predvsem partneije za specifično vezavo, prednostno visoko specifična poliklonska ali monoklonska protitelesa.

Tudi tu se je presenetljivo pokazalo, da je dodatek nadaljnjega detergenta, prednostno neionskih detergentov, kot sta Brij ali Myij, ugoden za to, da nudi optimalne pogoje tako za pripravo vzorca za dokaz derivata hemoglobina, kot glikiranega hemoglobina, kot tudi za imunološko reakcijo, in za preprečitev motenj. Detergent dodamo reakcijskemu puferju v taki množini, da znaša koncentracija v nastali mešanici 0,01 do 5 mas.%, prednostno 0.5 mas,%.

V primeru da je treba v istem vzorcu poleg določitve derivata hemoglobina ugotoviti tudi vsebnost celokupnega hemoglobina, merimo prednostno po dodatku reakcijskega pufeija za določitev vsebnosti celokupnega hemoglobina absorpcijo pri valovnih dolžinah od 400 do 650 nm, prednostno 500 do 650 in posebno prednostno pri 546 ali 570 nm. V primeru mokrega testa določimo ekstinkcijo pri tej valovni dolžini v kiveti fotometrično, v primeru suhega testa lahko določimo absorpcijo reflekcijsko fotometrično po nanosu dobljene mešanice na testni nosilec.

Tak testni nosilec za določanje vsebnosti celokupnega hemoglobina lahko konstruiramo zelo enostavno, ker ni treba, da bi vseboval kemikalije. Za enostavne zahteve zadošča vpojna koprena, ki je nameščena na transparentni nosilni foliji. Za boljše rokovanje s testnim trakom in njegovo boljšo uporabo lahko vsebuje še nadaljnje nosilčne sloje, npr. transportno kopreno ah dozirno kopreno.

Vsebnost celokupnega hemoglobina in vsebnost derivata hemoglobina lahko določimo tudi v različnih delih vzorca po dodatku hemoliznega reagenta. V tem primeru določimo v delu mešanice iz vzorca in hemoliznega reagenta, če je potrebno po ustreznem razredčenju, fotometrično vsebnost celokupnega hemoglobina. Drugemu delu mešanice dodamo reakcijski pufer in nato imunološko določimo derivat hemoglobina.

Za določanje derivata hemoglobina, kot HbA_lc, so načelno primerne vse običajne imunološke metode. Kot že opisano, lahko pripravimo poliklonska in monoklonska protitelesa proti derivatom hemoglobina, prednostno HbA_lc, ki specifično vežejo karakteristične epitope derivata hemoglobina. (US 4,247,533, EP-A-0 316 306 in EP-A-0 201187).

Pri varianti imunološkega dokaza, načinu markiranja kot tudi metodi detekcije merilnih signalov gre za znane metode iz stanja tehnike. Primerni so npr. sandwich testi z encimskim markiranjem (ELISA), testi z IEMA, RIA, precipitacijski in aglutinacijski testi kot tudi homogeni imunski testi, kot tehnologija CEDIA®, ΕΜΓΤ ali FPIA.

V mokrem testu se vrši imunološko določanje derivata hemoglobina prednostno po načelu TINIA, ker tu ni potrebna nikakršna stopnja ločenja. Vzorcu dodamo za analit specifično protitelo in polihapten kot aglutinacijsko sredstvo. Polihapten obstojf iz nosilčnega materiala, npr. albumina, dekstrana ali IgG, na katerega je pripojenih več epitopov, na katere se lahko vežejo specifična protitelesa. Ker se lahko precipitacija protiteles vrši samo preko polihaptena, dobimo pri pojemajoči vsebnosti analita v vzorcu naraščajočo motnost, ki jo lahko dokažemo nefelometrično ali turbidimetrično.

Prednostno je za derivat hemoglobina specifično protitelo že vsebovano v reakcijskem puferju. Po dodatku reakcijskega puferja lahko v nastali mešanici najprej fotometrično določimo vsebnost celokupnega hemoglobina. Precipitacijsko reakcijo sprožimo z dodatkom raztopine, ki vsebuje polihapten. Po kratkem inkubacijskem času, pri čemer večinoma zadošča 5 minut, lahko nastalo motnost izmerimo pri primerni valovni dolžini, prednostno pri valovnih dolžinah od 340 do 600 nm, zlasti prednostno pri 340 nm, in iz tega določimo koncentracijo derivata hemoglobina. Ker se vrši merjenje celokupnega hemoglobina pri valovnih dolžinah od 500 do 650 nm, prednostno pri 546 ali 570 nm, se ti dve meritvi ne motita in ju lahko izvedemo drugo za drugo v eni kiveti v isti reakcijski raztopini.

Pri pripravi raztopine polihaptena, to pomeni tekoče galenske oblike polihaptena ali glikoziliranega proteina oz. peptida, se je pokazalo, da le-ta pri fosfatnem puferju, ki se uporablja običajno, pri pH od 7,0 do 7,5 ni stabilen in lahko vodi pri daljšem skladiščenju do razkroja glikoproteina. Take nestabilnosti glikoziliranih proteinov v fosfatnem puferju so npr. znane iz Ahmed et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 4889 4894. Z uporabo puferja MES v koncentraciji od 5 do 200 mmolov/I, prednostno 20 do 50 mmolov/l in vrednostjo pH od 5,0 do 8,0, prednostno med 6,0 do 6,5, in istočasnim dodatkom EDTA ali ekvivalentnega tvorca kompleksov v prednostni koncentraciji od 1 do 50 mmolov/l, posebno prednostno 0,1 do 20 mmolov/l, smo dosegli stabiliziranje glikoziliranih peptidov, proteinov in polihaptena. Dodatek albumina govejega seruma (RSA) v prednostni koncentraciji od 0,1 do 2 %, posebno prednostno 1 %, je imel nadaljnji pozitiven učinek na stabilnost raztopine polihaptena. To raztopino polihaptena lahko skladiščimo več kot 12 mesecev pri 4°C, ne da bi bile opazne omembe vredne nestabilnosti polihaptena oz. glikoziliranih proteinov ali peptidov. Pri stresni obremenitvi 3 tedne pri 35°C nastopijo samo upadi za 15 do 20 % prvotnega ekstinkcijskega signala.

Kot j suhi testj se vrši imunološka določitev derivata hemoglobina prednostno po načelu testa IEMA. Po dodatku reakcijskega puferja k vzorcu hemolizirane krvi dodamo specifično encimsko markirano protitelo. V prednostni izvedbeni obliki je v reakcijskem puferju protitelo že vsebovano. Po kratki inkubaciji nanesemo mešanico na testni nosilec. Prosta encimsko markirana protitelesa prestrežemo na epitopni matrici, t.j. coni testnega nosilca, na katero je pripojenih več epitopov, na katere se lahko vežejo specifična protitelesa. V nadaljnji coni, dokazovalni coni, določimo kompleks iz derivata hemoglobina in markiranega protitelesa s presnovo primernega encimskega substrata reflekcijsko fotometrično. Substrat je lahko vsebovan v dokazovalni coni ali pa pride vanjo s tem, da spravimo dokazovalno cono v stik z nadaljnjo cono, ki vsebuje substrat.

Smotrno pridejo reagenti, potrebni za metodo v smislu izuma, na tržišče v obliki testnega kompleta, ki vsebuje v najmanj dveh med seboj ločenih embalažah poleg hemoliznega reagenta druge reagente v raztopljeni ali liofilizirani obliki ali nanešene na testni nosilec.

Pričujoči izum pojasnjujemo z naslednjimi primeri.

Primer 1:

Istočasna določitev celokupnega hemoglobina in HbA_R v mokrem testu

Poskuse smo izvedli na aparaturi Hitachi 717 firme Boehringer Mannheim GmbH. Vsebnost celokupnega hemoglobina smo izmerili fotometrično pri valovni dolžini 546 nm. Imunološki dokaz HbA_lc se je vršil po načelu testa TINIA s turbidimetriČnim merjenjem pri 340 nm. Vse določitve in inkubacije smo izvedli pri temperaturi 37 °C.

Uporabili smo tele raztopine:

Hemolizni reagent:

20	mM	NaPO₄-puferja pH 7,0
1,0	%	SDS
0,1	%	natrijevega azida
0,02	%	kalijevega heksacianoferata (III)
0,5	%	Brija 35

Reaciiski pufer:

20	mM	MES-pufeija pH 6,0
150	mM	natrijevega klorida
3,0	%	PEG-a 6000
0,5	%	Brija 35
0,1	%	albumina govejega s<

0,1 % natrijevega azida mM EDTA mg/ml PAK <HbA_lc> S-IgG (DE) (poliklonsko ovčje protitelo proti HbA_lc) ali

100 Mg/ml MAK <HbA_lc> M-IgG (DE) (monoklonsko mišje protitelo proti HbAJ

Raztopina polihaptena:

mM MES-pufeija pH 6,0

150 mM natrijevega klorida

6,0 % PEG-a 6000

0,5 % Brij-a 35

0,1 % albumina govejega seruma μ-g/ml polihapten HbA_lc-/3-l-4(cis, MHS)-RSA 18:1

K vzorcu krvi smo dodali hemolizni reagent v razmerju 1:100 in pri 25 °C inkubirali 2 minuti. K 5 μ\ hemoliziranega vzorca smo dodali 250 μ\ reakcijskega puferja. Po 4 minutah smo izmerili absorpcijo celokupnega hemoglobina pri 546 nm (El). Eno minuto kasneje smo izmerili absorpcijo pri 340 mn (E2) in nato dopipetirali 50 μΐ raztopine polihaptena in inkubirali 5 minut. Nato smo izmerili motnost pri 340 nm (E3).

Za določitev vrednosti HbA_lc v g/dl nanašamo diferenco ekstinkcij Δ E = E3-kE2 proti koncentraciji HbA_lc in določimo grafično.

volumen + volumen ..... , vzorec reakcijski pufer k = volumenski korekcijski faktor -celokupni volumen

Koncentracijo celokupnega hemoglobina izračunamo iz konstantnega faktorja K z množenjem z El (K = molami ekstinkcijski koeficient hemoglobinskega kromofora x faktor razredčenja). Kot kalibrator je rabila EDTA-polna kri z znano vsebnostjo hemoglobina in HbA^. EDTA-polno kri smo za izdelavo umeritvene krivulje različno močno razredčili s hemoliznim reagentom.

Umeritvene krivulje so grafično prikazane na sliki 1 in 2. Na sliki 1 smo nanesli koncentracijo celokupnega hemoglobina proti El. Dobimo linearen odnos. Pri izračunavanju lahko torej množimo s konstantnim faktorjem K. V sliki 2 smo nanašali razliko ekstinkcij E = E3-kE2 proti vsebnosti HbA_lc.

Pri nadaljnjih poskusih smo hemoliziranemu vzorcu krvi najprej dopipetirali raztopino polihaptena in po petminutni inkubaciji sprožili precipitacijsko reakcijo z dodatkom reakcijskega pufetja, ki je vseboval specifično protitelo. To zaporedje pipetiranja je vodilo v primerjavi z zgoraj navedenim zaporedjem pipetiranja, pri katerem smo najprej dodali protitelo in potem polihapten, do razločno manjše občutljivosti pri določitvi HbA_Jc (slika 3).

Primer 2

Testni trak za določitev celokupnega hemoglobina in HbA_lc

K 30 μ\ polne krvi smo dodali 300 μϊ hemoliznega reagenta in inkubirali 10 minut pri 20 °C. Hemolizni reagent je obstajal iz 0,18 %-ne raztopine SDS, ki smo jo zapufrali na pH 7.

Za določitev celokupnega hemoglobina smo nanesli 32 μϊ hemoliziranega vzorca krvi na testni trak. Zgradba testnega traku je grafično prikazana na sl. 4. Obstoji samo iz neobdelane dozirne koprene (1) iz steklenih vlaken, neobdelane transportne koprene iz steklenih vlaken (2), neobdelane poliestrske tkanine (3) in transparentne polikarbonatne folije (4). Testni trak ne vsebuje nobeneh dodatnih kemikalij. S to izvedbo poskusa se da zelo precizno izmeriti vsebnost celokupnega hemoglobina v vzorcu krvi pri valovni dolžini 576 nm.

Dobili smo variacijske koeficiente pod 2,5 % (Tabela 1).

Tabela 1:

Določitev celokupnega hemoglobina

VK smo vsakokrat izračunali iz 10 posameznih določitev.

Koncentracija HbA_lc[g/dl]

VK [%]

14,1

17,5

13.7

14.7

1,0

2,5

1,9

1,8

Za določitev koncentracije HbA^ dodamo k 32 μ\ hemoliziranega vzorca 1200 μ,Ι reakcijskega pufeija in inkubiramo 10 minut. Reakcijski pufer sestoji iz 100 mM Hepesa, pH 7,4, 100 mM NaCl in 0,1 % Brija s konjugatom monoklonskega protitelesa-encima (konjugat MAK-encim). 32 μΐ mešanice smo nanesli na testni trak, ki je grafično prikazan na sliki 5. Prosti konjugat protitelesa prestrežemo na epitopski matrici (11). V coni, kije priključena nanjo, določimo kompleks protitelo proti HbA_lc-encim s presnovo substrata potem, ko smo spravili substratno kopreno (13), ki vsebuje substrat, v stik s transportno kopreno (12), refleksijsko fotometrično (Tabela 2).

Tabela 2:

Določitev koncentracije HbA_lc s testnim trakom

VK smo vsakokrat izračunali iz 10 posameznih določitev.

Koncentracija HbA_lc VK [g/dl] [%]

0,8

1,1

1,4

6,8

5,4

6,0

Primer 3

Vpliv različnih ionskih detergentov na določanje HbA_u

Poskuse smo izvedli tako, kot je opisano v primeru 1. Hemolizni reagent je imel to-le sestavo:

20	mM	NaPO₄-pufeija pH 7,2
0,1	%	natrijevega azida
0,02	%	kalijevega heksacianoferata (III)
0,5	%	Brija 35

V tabeli 3 navedeni ionski detergenti so bili vsakokrat vsebovani v tam navedeni koncentraciji.

V primeru ΤΓΑΒ in CTAB se v hemoliznem reagentu ni nahajal kalijev heksacianoferat (III), ker se ta z detergenti obori.

Sestava reakcijskega pufeija in raztopine polihaptena ustreza primeru 1.

Kot krvni vzorec smo uporabili standard z vsebnostjo HbA_lc 3,2 g/dl. Vsi testirani ionski detergenti so povzročili lizo celic in sproščanje epitopa. Kot najprimernejši se je pokazal anionski detergent SDS kot tudi kationska detergenta TTAB in CTAB.

Tabela 3:

Določanje HbA_R

Vpliv različnih ionskih detergentov v hemoliznem reagentu.

Absorpcijo smo merili pri 340 nm.

Detergent	Koncentracija v hemoliznem reagentu	El [OgAUHbAjJ	E2 [3,2 g/dl HbAJ	ADE = E1-E2
SDS	0,5%	337 mE	73 mE	264 mE
SDS	1,0%	338 mE	80 mE	258 mE
Zwitter-
gent 3-14	0,5%	341 mE	172 mE	169 mE
Zwitter-
gent 3-14	1,0%	343 mE	139 mE	204 mE

TTAB	1,0%	377 mE	149 mE	228 mE
CTAB	1,0%	374 mE	137 mE	237 mE
Kontrola brez ionskega detergenta		340 mE	275 mE	65 mE

Primer 4

Odvisnost dinamičnega merilnega področja določanja HbA_lc od koncentracije Briia 35

Poskuse smo izvedli tako kot v primeru 3. V hemoliznem reagentu smo konstantno uporabili 1 % SDS. Koncentracijo Brija 35 v reakcijskem pufeiju smo variirali znotraj območja, navedenega v tabeli 4. Kot vzorec je rabil v primeru 3 navedeni standard HbA^.

Merilno območje se je od 47 mE kontrole že z dodatkom 0,1 % Brija 35 razširilo na 233 mE. Prednostna koncentracija Brija 35 je znašala 0,1 do 1,0 %.

Tabela 4:

Vpliv različnih koncentracij Brija v reakcijskem puferju na določanje HbA_lc

Absorpcijo smo merili pri 340 nm

Koncentracija El E2

Brija 35 v reakcijskem pufeiju	[0g/dlHbA_lc]	[3,2 g/dl HbAJ	ΔΕ = E1-E2
-	240 mE	193 mE	47 mE
0,1%	266 mE	33 mE	233 mE
0,25%	274 mE	40 mE	234 mE
0,5%	302 mE	57 mE	245 mE

1,0% 351 mE 99 mE

2,0% 385 mE 242 mE

252 mE 143 mE

Primer 5

Vpliv različnih detergentov v reakcijskem puferju na določanje HbA_R

Poskuse smo izvedli analogno primeru 4. V reakcijskem puferju smo uporabili detergente, navedene v tabeli 5. Dinamično merilno področje smo najbolj razširili z dodatkom Brija 35, 56 in 58 kot tudi Myija 52 in 59. Vendar pa so tudi drugi neionski detergenti, kot Triton, kot tudi amfionski detergenti, kot Zwittergent 3-14, pokazali v primerjavi s kontrolo razločno izrazit pozitiven učinek.

Tabela 5:

Vpliv detergentov v reakcijskem puferju

Detergent	koncentracija v reakcijskem puferju	El [Og/dlHbAJ	E2 [3,2 g/dl HbAjJ	ΔΕ = E1-E2
Kontrola	-	240 mE	193 mE	47 mE
Brij 35	0,5%	302 mE	57 mE	245 mE
Brij 56	0,5%	302 mE	57 mE	245 mE
Brij 58	0,5%	303 mE	51 mE	252 mE
Triton x 114	0,2%	523 mE	275 mE	248 mE
Triton x 100	0,5%	298 mE	202 mE	96 mE
Tween80	0,25	277 mE	143 mE	134 mE
Tween60	0,25	266 mE	75 mE	191 mE
Tween40	0,25	276 mE	86 mE	189 mE
Tween20	0,1	266 mE	131 mE	135 mE
Zwitter- gent 3-14	0,1	308 mE	155 mE	153 mE
Myrj 52	0,5%	308 mE	40 mE	268 mE
Myrj 59	0,5%	317 mE	31 mE	286 mE

Primer 6:

Istočasno določanje celokupnega hemoglobina in HbA_R s specifičnim riavo-zelenim hemoglobinskim kromoforom

Poskuse smo izvedli na aparaturi Hitachi 717 firme Boehringer Mannheim GmbH. Vsebnost celokupnega hemoglobina smo izmerili fotometrično pri valovni dolžini 570 nm. Imunološki dokaz HbA_lc se je vršil po principu TINIA-testa s turbidimetriČnim merjenjem pri 340 nm. Vse določitve in inkubacije smo izvedli pri temperaturi 37 °C.

Uporabili smo te-le raztopine:

Hemolizni reagent:

20	mM	NaPO₄ puferja pH 7,4
1,0	%	tetradeciltrimetilamonijevega bromida (TTAB)
0,01	%	metilizotiazolona
0,02	%	Bronidoxa® K
0,5	%	Brija 35
10	mM	EDTA

Reakcijski pufer:

20	mM	MES puferja pH 6,0
150	mM	natrijevega klorida
3,0	%	PEGa 6000
0,5	%	Brija 35
0,01	%	metilizotiazolona
0,02	%	Bronidoxa® K
1,2	mg/ml PAK <HbA_lc> S-IgG (DE) (poliklonsko ovčje protitelo proti HbA_lc)
Raztopina polihaptena:

mM MES puferja pH 6,0

150 mM natrijevega klorida

6,0 % PEGa 6000

0,5 % Brija 35 μ-g/ml polihaptena

K vzorcu krvi smo dodali hemolizni reagent v razmerju 1:100 in pri 25 °C inkubirali 2 minut. K 10 μΐ hemoliziranega vzorca smo dodali 250 μΐ reakcijskega puferja. Po 4 minutah smo izmerili absorpcijo celokupnega hemoglobina pri 570 nm (El). Eno minuto kasneje smo izmerili absorpcijo pri 340 nm (E2) in nato dopipetirali 50 μΐ raztopine polihaptena in inkubirali 5 minut. Nato smo izmerili motnost pri 340 nm (E3).

^{νθΙυΠ,6η}™ + ^VOlUn’^enrakdpk,p»fer k = volumenski korekcijski faktor =celokupni volumen

Koncentracijo celokupnega hemoglobina izračunamo iz konstantnega faktorja K z množenjem z El (K = molarni ekstinkcijski koeficient hemoglobinskega kromofoija x faktor razredčenja). Karakteristični absorpcijski spektrum je podan na sl. 6. Kot kalibrator je rabila EDTA-polna kri z znano vsebnostjo hemoglobina in HbA_lc. EDTA-polno kri smo za izdelavo umeritvene krivulje različno močno razredčili s hemoliznim reagentom.

Umeritvene krivulje so grafično prikazane na sliki 7 in 8. Na sliki 7 smo nanesli koncentracijo celokupnega hemoglobina proti El. Dobimo linearen odnos. Pri izračunavanju lahko torej množimo s konstantnim faktorjem K V sliki 8 smo nanašali razliko ekstinkcij Δ E = E3-k E2 proti vsebnosti HbA_lc.

Claims

PATENTNI ZAHTEVKI

1. Metoda za določanje vsebnosti derivata hemoglobina v vzorcu krvi, označena s tem, da (a) vzorec krvi obdelamo s hemoliznim reagentom, ki vsebuje ionski detergent s pH od 5 do 9,5, in (b) v hemoliziranem vzorcu krvi določimo derivat hemoglobina imunološko.
2. Metoda po zahtevku 1, označena s tem, da obdelujemo vzorec krvi s hemoliznim reagentom pri temperaturah od 4 do 37 °C do 10 minut.
3. Metoda po enem od zahtevkov 1 in 2, označena s tem, da vsebuje hemolizni reagent dodatno neionski detergent.
4. Metoda po enem od zahtevkov 1 do 3, označena s tem, da dodamo hemoliziranemu vzorcu reakcijski pufer, ki vsebuje neionski ali amfionski detergent, in v nastali mešanici določimo derivat hemoglobina imunološko.
5. Metoda po enem od zahtevkov 1 do 4, označena s tem, da je derivat hemoglobina HbA_lc.
6. Metoda za določanje vsebnosti derivata hemoglobina in celokupnega hemoglobina v vzorcu krvi, označena s tem, da (a) obdelamo vzorec krvi s hemoliznim reagentom, ki vsebuje ionski detergent s pH od 5,0 do 9,5, (b) v hemoliziranem vzorcu določimo vsebnost celokupnega hemoglobina in (c) v hemoliziranem vzorcu imunološko določimo derivat hemoglobina.
7. Metoda po zahtevku 6, označena s tem, da določimo vsebnost celokupnega hemoglobina z meljenjem karakteristične absorpcije specifičnega hemoglobinskega kromofora.
8. Metoda po enem od zahtevkov 6 in 7, označena s tem, da vsebuje hemolizni reagent dodatno neionski detergent.
9. Metoda po enem od zahtevkov 6-8, označena s tem, da dodamo hemoliziranemu vzorcu reakcijski pufer, ki vsebuje neionski ali amfionski detergent, in v nastali mešanici določimo celokupni hemoglobin in derivat hemoglobina.
10. Hemolizni reagent, označen s tem, da vsebuje ionski detergent s pH od 5 do 9,5.
11. Hemolizni reagent po zahtevku 10, označen s tem, da vsebuje neionski detergent.
12. Hemolizni reagent po enem od zahtevkov 10 ali 11, označen s tem, da vsebuje primerno oksidacijsko sredstvo ali konservirno sredstvo, katerega mehanizem delovanja temelji na oksidativnem napadu na tiolne skupine.
13. Uporaba hemoliznega reagenta po enem od zahtevkov 10 do 12 pri imunološkem določanju derivata hemoglobina ali istočasnem določanju derivata hemoglobina in vsebnosti celokupnega hemoglobina v vzorcu.
14. Testni komplet za imunološki dokaz derivata hemoglobina, označen s tem, da sestoji iz najmanj dveh med seboj ločenih zavojev, od katerih vsebuje eden hemolizni reagent po enem od zahtevkov 10 do 12 in drugi nadaljnjo mešanico reagentov, ki vsebuje za imunološki dokaz derivata hemoglobina potrebne reagente.
15. Testni komplet po zahtevku 14, označen s tem, da so za imunološki dokaz potrebni reagenti naneseni na testni nosilec.
16. Stabiliziranje raztopine glikoziliranega proteina, peptida ali polihaptena, označeno s tem, da uporabimo kot pufer MES-pufer, pH 5,0 do 8,0, in da vsebuje raztopina EDTA.
17. Stabiliziranje raztopine po zahtevku 16, označeno s tem, da dodamo RSA. λ _r