ES2961300T3 - Método para analizar hemoglobinas - Google Patents

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Abstract

Se divulga un método de análisis de hemoglobinas capaz de separar hemoglobinas con alta precisión en poco tiempo mediante cromatografía líquida. Más específicamente se describe un método para analizar hemoglobinas usando cromatografía líquida, en el que una muestra se trata previamente con un agente oxidante y un aglutinante para hierro hemo trivalente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para analizar hemoglobinas
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para analizar hemoglobinas mediante la separación de las hemoglobinas por cromatografía líquida.
Antecedentes de la invención
El análisis de hemoglobinas por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica ampliamente utilizada. En concreto, esta técnica se utiliza, por ejemplo, para cuantificar una glucohemoglobina conocida como hemoglobina A1c o para analizar hemoglobinas anormales para el diagnóstico de diabetes. Por ejemplo, se conoce un método que utiliza cromatografía líquida y que separa los componentes de la hemoglobina en una muestra de sangre hemolizada diluida mediante un método de intercambio catiónico basado en la diferencia de carga positiva entre los componentes de la hemoglobina. Un aumento reciente de pacientes con diabetes también ha aumentado el número de casos que requieren medición de hemoglobina A1c. Esta tendencia ha creado una demanda de mediciones mediante HPLC más precisas y que requieren menos tiempo.
Las hemoglobinas están presentes en el cuerpo en forma de oxihemoglobina que contenía oxígeno unido, desoxihemoglobina que contenía dióxido de carbono unido y metahemoglobina en la que el hierro del grupo hemo se oxida al estado de ión trivalente. En el caso de la HPLC de intercambio catiónico, la oxihemoglobina, la desoxihemoglobina y la metahemoglobina pueden diferir entre sí en la retención en una columna de separación y, por lo tanto, también pueden diferir entre sí en el tiempo de elución. En consecuencia, el análisis puede proporcionar una precisión de separación deficiente (por ejemplo, detección de picos de elución amplios o picos de elución en una distribución bimodal). Además, se sabe que en presencia de una azida o cianuro, la metahemoglobina se convierte en azida-metahemoglobina o cianometahemoglobina estables (en lo sucesivo, también denominada metahemoglobina estable) como resultado de la unión de la azida o cianuro al ion hierro trivalente en la metahemoglobina. Dado que la retención en una columna de separación también es ligeramente diferente entre las formas estables de metahemoglobina, oxihemoglobina y desoxihemoglobina, la presencia de metahemoglobina estable puede provocar que se detecte un pico de elución amplio o un pico de elución en una distribución bimodal.
El análisis por HPLC de hemoglobinas se utiliza principalmente para el diagnóstico de hemoglobinopatía y talasemia que pueden causar anemia, además de diabetes. Especialmente, el número de casos que requieren separación y detección de hemoglobina S es grande porque la hemoglobina S es la hemoglobina anormal más común y causa anemia falciforme que resulta en anemia grave. Por otra parte, en el caso de la medición del marcador de diabetes hemoglobina A1c, se prefiere separar las hemoglobinas anormales, incluida la hemoglobina S, en picos de elución agudos. Si las hemoglobinas se eluyen en picos de elución amplios o picos de elución en una distribución bimodal, la separación de las hemoglobinas anormales de las hemoglobinas normales es difícil y esta dificultad puede causar un impacto negativo en las mediciones obtenidas.
Además, las muestras de sangre deterioradas tienden a dar picos de elución amplios o picos de elución en una distribución bimodal en comparación con las muestras de sangre fresca. Esto se debe a que la cantidad de metahemoglobina aumenta debido al deterioro. Por lo tanto, en el caso del análisis de una muestra conservada (por ejemplo, un nuevo examen), existe la posibilidad de que se produzca un impacto negativo en las mediciones obtenidas.
Se conoce la adición de agentes antimicrobianos o sacáridos conocidos como técnica para evitar que las hemoglobinas se deterioren y se desnaturalicen. Otras formas de lograrlo son, por ejemplo, la coexistencia de hemoglobinas con albúmina (bibliografía de patente 1); coexistencia de hemoglobinas con caseína, ácido bórico o similares (bibliografía de patente 2); y coexistencia de hemoglobinas con ácido iminocarboxílico o una sal del mismo (bibliografía de patente 3).
Sin embargo, no importa qué técnica se utilice entre las técnicas de las bibliografías de patente 1 a 3, la medición por HPLC de una muestra de sangre que contenía hemoglobinas en diversas formas, incluidas oxihemoglobina, desoxihemoglobina y metahemoglobina, posiblemente dé como resultado picos de elución amplios o picos de elución en un distribución bimodal.
Los instrumentos de HPLC comunes están equipados con un desgasificador para eliminar el gas de los eluyentes. Un desgasificador de este tipo puede provocar fluctuaciones en los tiempos de elución de las hemoglobinas y tener un impacto negativo en la separación de las hemoglobinas porque su rendimiento de eliminación de gases no es estable durante un tiempo inmediatamente después de la puesta en marcha. Especialmente, inmediatamente después de la puesta en marcha o cuando la temperatura de un eluyente es inestable, es probable que los instrumentos de HPLC provoquen fluctuaciones en los tiempos de elución de las hemoglobinas y un deterioro de la precisión de la cuantificación. Esto prolonga el tiempo previo a un primer informe de análisis para el diagnóstico de diabetes utilizando la hemoglobina A1c como marcador, aunque dicho análisis requiere un resultado rápido. Por lo tanto, existe la necesidad de una técnica que proporcione una medición estable incluso inmediatamente después de la puesta en marcha de un instrumento de HPLC.
Generalmente, la absorbancia obtenida mediante un espectrofotómetro es una medida para detectar y cuantificar hemoglobinas. La coexistencia de oxihemoglobina, desoxihemoglobina, metahemoglobina, azida-metahemoglobina y ciano-metahemoglobina puede inhibir la cuantificación precisa de las hemoglobinas debido a sus diferentes espectros de absorción.
Listado de citaciones
Bibliografía de patentes
Bibliografía de patente 1: JP-A 2003-194825
Bibliografía de patente 2: JP-A 11-166932
Bibliografía de patente 3: JP-A 2009-97956
De acuerdo con el documento JP-S56-44851 A, las muestras que contenían azido-metaglucohemoglobina y azidometahemoglobina obtenidas metoxilando con azida de sodio, glucohemoglobina y hemoglobina contenidas en una solución hemolítica de eritrocitos, se suministran a una columna que contenía resina de intercambio catiónico con ácido débil como relleno o un dispositivo de cromatografía líquida y se hace que la azido-metahemoglobina se vierta con una solución tampón que contenía azida de sodio.
Para la determinación de hemoglobina A<1>c estable, el documento EP 1103812 A1 muestra un método para determinar hemoglobinas mediante cromatografía líquida de intercambio catiónico, en el que se utiliza un eluyente que contenía un ion caotrópico y además un ácido inorgánico, un ácido orgánico y/o cualquier sal del mismo que tiene una capacidad tampón en el intervalo de pH de 4,0 a 6,8.
De acuerdo con el documento EP 0077515 A2, un proceso para la determinación de hemoglobina glucosilada en una muestra de sangre comprende liberar hemoglobina glucosilada y no glucosilada de los eritrocitos mediante tratamiento químico o físico; convertir la hemoglobina en metahemoglobina y, posteriormente, diferenciar la porción de hemoglobina glucosilada y no glucosilada utilizando su reacción con la haptoglobina.
De acuerdo con el documento EP 0315 864 A1, una muestra de sangre se trata con la combinación de una sal de tiocianato y un oxidante para desnaturalizar la hemoglobina en la muestra y convertir la hemoglobina en metahemoglobina, que se mide espectrofotométricamente para obtener la cantidad de hemoglobina total presente y el derivado de hemoglobina desnaturalizado se puede distinguir y medir mediante inmunoensayo.
La patente de los Estados Unidos No. 4.260.516 muestra un estándar para determinar la hemoglobina glucosilada que comprende una mezcla de hemoglobina o metahemoglobina y aproximadamente del 1% al 25% del derivado de N-[5-nitrotropon-2-il]hemoglobina o metahemoglobina en la que el sitio de unión alostérico está bloqueado.
Resumen de la invención
Problema técnico
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para analizar hemoglobinas que pueda separar hemoglobinas con precisión en poco tiempo mediante cromatografía líquida.
Solución al problema
La presente invención es un método para analizar hemoglobinas mediante cromatografía líquida, que comprende pretratar una muestra con un oxidante y un aglutinante para hierro hemo trivalente.
La siguiente descripción se ofrece para describir la presente invención en detalle.
Los presentes inventores descubrieron que el tratamiento previo de una muestra con un oxidante y un aglutinante para hierro hemo trivalente convierte todas las hemoglobinas de la muestra en sus formas estables de metahemoglobina y, por lo tanto, elimina las variaciones en la retención a una fase fija en una columna entre las formas de cada hemoglobina. Por lo tanto, se descubrió que el pretratamiento permitía separar con precisión las hemoglobinas en poco tiempo y se completó la presente invención.
El método para analizar hemoglobinas de la presente invención se define en la reivindicación 1.
El pretratamiento con un oxidante y un aglutinante para hierro hemo trivalente en una muestra mejora la resolución de las hemoglobinas y reduce los tiempos de elución de las hemoglobinas. Además, incluso en el caso de utilizar un instrumento de HPLC equipado con un desgasificador cuya capacidad de eliminación de gas no es estable inmediatamente después de la puesta en marcha, las hemoglobinas se pueden separar con precisión sin mostrar fluctuaciones en sus tiempos de elución ni presentar picos de elución amplios y picos de elución en un distribución bimodal.
En la presente invención, el "pretratamiento con un oxidante y un aglutinante para el hierro hemo trivalente en una muestra" significa un tratamiento que se realiza en la muestra usando un oxidante y un aglutinante para el hierro hemo trivalente antes de la separación de las hemoglobinas a través de una columna de separación, y no se limita a tratamientos a realizar antes de la medición por cromatografía líquida. Específicamente, se puede tratar una muestra con un oxidante y un aglutinante para hierro hemo trivalente antes de la separación de hemoglobinas, por ejemplo, mezclando cualquiera de las combinaciones mostradas en la Tabla 1, es decir, el oxidante y/o el aglutinante para hierro hemo trivalente en una solución de pretratamiento de la muestra y/o el o los eluyentes. En la Tabla 1, "O" indica que se usó el agente correspondiente y "-" indica que no se usó el agente correspondiente.
En el método para analizar hemoglobinas de la presente invención, el oxidante convierte el hierro hemo en las hemoglobinas de la forma divalente a la forma trivalente, transformando así las hemoglobinas en sus formas de metahemoglobina.
El oxidante no está particularmente limitado, siempre que sea capaz de convertir el hierro hemo en hemoglobinas de la forma divalente a la forma trivalente. Ejemplos de los mismos incluyen nitritos, ferricianuro de potasio, azul de metileno, peróxido de hidrógeno, ácido ascórbico y sulfuro de hidrógeno. En particular, son preferibles los nitritos, y son más preferibles el nitrito de sodio y el nitrito de potasio. Estos oxidantes no descomponen la hemoglobina debido a su capacidad de oxidación no tan fuerte. Además, estos oxidantes evitan grandes cambios en el patrón de elución que se producen cuando un oxidante se une a la metahemoglobina y también evitan las fluctuaciones de la línea base durante la medición por HPLC que son causadas por la interferencia entre la longitud de onda para la detección de hemoglobina y el espectro de absorción de un oxidante. Por lo tanto, se garantiza una cuantificación más precisa de las hemoglobinas.
En el método para analizar hemoglobinas de la presente invención, el aglutinante del hierro hemo trivalente convierte la metahemoglobina en metahemoglobina estable.
Los ejemplos del aglutinante para hierro hemo trivalente incluyen azidas y cianuros. Cuando el aglutinante del hierro hemo trivalente es una azida o cianuro, no altera tanto la estructura de la metahemoglobina y, por lo tanto, no cambia tanto el patrón de elución de las hemoglobinas. De este modo se garantiza una cuantificación más precisa de las hemoglobinas.
Los ejemplos de azidas incluyen azida de sodio, azida de difenilfosforilo, azida de 4-dodecilbencenosulfonilo, azida de 4-acetilamidobencenosulfonilo, azida de potasio, azida de litio, azida de hierro, azida de hidrógeno, azida de plomo, azida de mercurio, azida de cobre y azida de plata.
Los ejemplos de cianuros incluyen cianuro de potasio, cianuro de hidrógeno, cianuro de sodio, cianuro de plata, cianuro de mercurio, cianuro de cobre, cianuro de plomo, cianuro de hierro, cianuro de litio y cianuro de amonio.
Entre estos aglutinantes para el hierro hemo trivalente, es preferible la azida de sodio.
Los ejemplos de solución de pretratamiento de la muestra incluyen ácidos orgánicos y sus sales, aminoácidos, ácidos inorgánicos y sus sales, y tampones conocidos que contenían un agente tamponador tal como un tampón de Good.
Los ejemplos de ácidos orgánicos incluyen ácido cítrico, ácido succínico, ácido tartárico y ácido málico.
Los ejemplos de aminoácidos incluyen glicina, taurina y arginina.
Los ejemplos de ácidos inorgánicos incluyen ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido bórico y ácido acético.
Los tampones anteriores pueden contener opcionalmente cualquiera de tensioactivos, diversos polímeros, compuestos hidrófilos de bajo peso molecular y similares.
La concentración del agente de tamponamiento en la solución de pretratamiento de la muestra no está particularmente limitada. El límite inferior preferible del mismo es 5 mmol/L y el límite superior preferible del mismo es 500 mmol/L. Si la concentración del agente de tamponamiento es inferior a 5 mmol/L, es posible que la acción del tampón no sea suficiente. Si la concentración del agente de tamponamiento es superior a 500 mmol/L, el agente de tamponamiento puede precipitar y obstruir un tramo del instrumento de HPLC. El límite inferior más preferible de la concentración del agente de tamponamiento es 10 mmol/L y el límite superior más preferible de la misma es 200 mmol/L.
Para la concentración de oxidante en la solución de pretratamiento de la muestra, el límite inferior de la misma es 0,05 mmol/L y el límite superior de la misma es 50 mmol/L. Si la concentración de oxidante en la solución de pretratamiento de la muestra es inferior a 0,05 mmol/L, es posible que no se transforme una cantidad suficiente de hemoglobinas en las formas meta. En este caso, es posible que todavía haya oxihemoglobina y desoxihemoglobina en la muestra, lo que puede provocar que se detecte un pico de elución amplio o un pico de elución con una distribución bimodal. Si la concentración de oxidante en la solución de pretratamiento de la muestra es superior a 50 mmol/L, la metahemoglobina puede descomponerse. En este caso, es posible que no se detecte un pico de elución del mismo, o se puede detectar un pico de elución en un tiempo de elución diferente. El límite inferior preferible de la concentración de oxidante en la solución de pretratamiento de la muestra es 0,5 mmol/L y el límite superior preferible de la misma es 25 mmol/L.
Para la concentración del aglutinante para hierro hemo trivalente en la solución de pretratamiento de la muestra, el límite inferior de la misma es 0,05 mmol/L y el límite superior de la misma es 50 mmol/L. Si la concentración del aglutinante para el hierro hemo trivalente en la solución de pretratamiento de la muestra es inferior a 0,05 mmol/L, es posible que una cantidad suficiente del aglutinante no se una al hierro hemo trivalente en la metahemoglobina, lo que puede causar un pico de elución amplio o una pico de elución en una distribución bimodal para ser detectado. Si la concentración del aglutinante del hierro hemo trivalente en la solución de pretratamiento de la muestra es superior a 50 mmol/L, la metahemoglobina puede descomponerse. En este caso, es posible que no se detecte un pico de elución del mismo, o se puede detectar un pico de elución en un tiempo de elución diferente. El límite inferior preferible de la concentración del aglutinante para hierro hemo trivalente en la solución de pretratamiento de la muestra es 0,5 mmol/L y el límite superior preferible del mismo es 25 mmol/L.
Para el pH de la solución de pretratamiento de la muestra, su límite inferior es 4,0 y su límite superior es 10,0. Si el pH de la solución de pretratamiento de la muestra es inferior a 4,0 o superior a 10,0, la estabilidad de las hemoglobinas se deteriora. En este caso, no se puede detectar ningún pico de elución o se puede detectar un pico de elución en un tiempo de elución diferente. El límite inferior preferible del pH de la solución de pretratamiento de la muestra es 6,0 y el límite superior preferible del mismo es 8,5.
Los ejemplos de eluyentes incluyen ácidos orgánicos y sus sales, aminoácidos, ácidos inorgánicos y sus sales, y tampones conocidos que contenían un agente de tamponamiento tal como un tampón de Good.
Los ejemplos de ácidos orgánicos incluyen ácido cítrico, ácido succínico, ácido tartárico y ácido málico.
Los ejemplos de aminoácidos incluyen glicina, taurina y arginina.
Los ejemplos de ácidos inorgánicos incluyen ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido bórico y ácido acético.
El tampón puede contener opcionalmente cualquiera de tensioactivos, diversos polímeros, compuestos hidrófilos de bajo peso molecular y similares.
La concentración del agente de tamponamiento en los eluyentes no está particularmente limitada, pero su límite inferior preferible es 5 mmol/L y su límite superior preferible es 500 mmol/L. Si la concentración del agente de tamponamiento es inferior a 5 mmol/L, es posible que la acción del tampón no sea suficiente. Si la concentración del agente de tamponamiento es superior a 500 mmol/L, el agente de tamponamiento puede precipitar y obstruir un tramo del instrumento de HPLC; o reducir la eficiencia de reemplazo del eluyente, lo que resulta en un tiempo más largo para el equilibrio. El límite inferior más preferible de la concentración del agente de tamponamiento es 10 mmol/L, y el límite superior preferible es 200 mmol/L.
Cuando el o los eluyentes contienen el oxidante, la concentración de oxidante tiene un límite inferior de 0,05 mmol/L y un límite superior de 50 mmol/L. Si la concentración de oxidante en los eluyentes es inferior a 0,05 mmol/L, es posible que no se transforme una cantidad suficiente de hemoglobinas en las formas meta. En este caso, es posible que todavía haya oxihemoglobina y desoxihemoglobina en la muestra, lo que puede provocar que se detecte un pico de elución amplio o un pico de elución con una distribución bimodal. El uso de un eluyente que tenga una concentración de oxidante superior a 50 mmol/L puede provocar una elución en tiempos demasiado cortos, dando como resultado una resolución deficiente. Cabe señalar que los tiempos de elución se pueden controlar ajustando las concentraciones de los componentes tales como el agente de tamponamiento en los eluyentes dentro de rangos en los que la metahemoglobina no se descompone. El límite inferior más preferible de la concentración de oxidante en los eluyentes es 0,5 mmol/L, y el límite superior más preferible de la misma es 25 mmol/L.
Cuando el o los eluyentes contienen el aglutinante para hierro hemo trivalente, la concentración del aglutinante para hierro hemo trivalente en los eluyentes tiene un límite inferior de 0,05 mmol/L y un límite superior de 50 mmol/L. Si la concentración del aglutinante del hierro hemo trivalente en los eluyentes es inferior a 0,05 mol/L, es posible que no se transforme una cantidad suficiente de hemoglobinas en las formas meta. En este caso, es posible que todavía haya oxihemoglobina y desoxihemoglobina en la muestra, lo que puede provocar que se detecte un pico de elución amplio o un pico de elución con una distribución bimodal. El uso de un eluyente que tiene una concentración del aglutinante para hierro hemo trivalente superior a 50 mmol/L puede provocar la elución en tiempos demasiado cortos, lo que da como resultado una resolución deficiente. Cabe señalar que los tiempos de elución se pueden controlar ajustando las concentraciones de componentes tales como el agente de tamponamiento en los eluyentes dentro de rangos en los que la metahemoglobina no se descompone. El límite inferior más preferible de la concentración del aglutinante para hierro hemo trivalente en los eluyentes es 0,5 mmol/L, y el límite superior más preferible del mismo es 25 mmol/L.
En el método para analizar hemoglobinas de la presente invención, en el caso de que el oxidante y el aglutinante para el hierro hemo trivalente se mezclen sólo en el o los eluyentes, el oxidante y el aglutinante para el hierro hemo trivalente se deben mezclar en al menos el primer eluyente que se suministrará para la medición de HPLC. Es preferible mezclar el oxidante y el aglutinante para hierro hemo trivalente con otro eluyente o eluyentes además del primer eluyente que se suministrará para la medición por HPLC, y es más preferible mezclarlos con todos los eluyentes usados para la medición.
Los eluyentes pueden contener un ajustador del pH tal como un ácido o una base conocidos. Ejemplos de ácido incluyen ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y ácido sulfúrico. Ejemplos de base incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de bario e hidróxido de calcio.
Los eluyentes pueden contener un disolvente orgánico soluble en agua tal como metanol, etanol, acetonitrilo o acetona. El disolvente orgánico se añade preferiblemente a una concentración tal que no precipiten una sal u otros componentes en el eluyente, y el límite superior preferible de la concentración es 80% (v/v).
El pH de los eluyentes tiene un límite inferior de 4,0 y un límite superior de 10,0. El uso de un eluyente que tiene un pH inferior a 4,0 puede provocar que se detecte un pico principal amplio, un pico de elución amplio o un pico de elución en una distribución bimodal. En el caso de un eluyente que tiene un pH superior a 10,0, las hemoglobinas pueden presentar una baja retención en una fase fija en una columna y, por lo tanto, pueden eluirse en tiempos extremadamente cortos. Además, dicho eluyente puede provocar que se detecte un pico de cola ancho, un pico de elución amplio o un pico de elución en una distribución bimodal. Controlando el pH a 4,0 o más y 10,0 o menos, es posible evitar el deterioro de la estabilidad de las hemoglobinas en una muestra bajo análisis y también evitar la falla en la detección de picos de elución de hemoglobinas o la detección de un pico de elución en un tiempo de elución diferente. El límite inferior más preferible del pH de los eluyentes es 6,0, y el límite superior más preferible del mismo es 8,5.
La cromatografía líquida utilizada en el método para analizar hemoglobinas de la presente invención es preferiblemente cromatografía líquida de intercambio iónico.
La cromatografía líquida de intercambio iónico se puede realizar de una manera conocida, por ejemplo, transportando un eluyente mediante una bomba a una columna de separación, introduciendo una muestra en el eluyente después de que el eluyente pase a través de un desgasificador en el camino hacia la columna de separación, separar hemoglobinas en la columna de separación y detectar los componentes separados en el eluyente liberado de la columna con un detector.
La columna de separación es una columna que contenía una fase fija. Ejemplos de fase fija incluyen partículas de relleno y materiales porosos. En particular, se prefieren las partículas de relleno.
Los ejemplos de partículas de relleno incluyen partículas inorgánicas y partículas orgánicas.
Los ejemplos de partículas inorgánicas incluyen partículas hechas de sílice, óxido de circonio o similares.
Los ejemplos de partículas orgánicas incluyen partículas poliméricas naturales de celulosa, un poliaminoácido, quitosano o similares, y partículas poliméricas sintéticas de poliestireno, un éster de ácido poliacrílico o similares.
La fase fija es preferiblemente una fase fija que tiene un grupo de intercambio catiónico.
Los ejemplos del grupo de intercambio catiónico incluyen grupos carboxilo, fosfato y ácido sulfónico.
Las condiciones de análisis en el método para analizar hemoglobinas de la presente invención se pueden determinar apropiadamente basándose en las muestras a analizar, el tipo de columna y similares. Específicamente, el límite inferior preferible del caudal de los eluyentes es 0,05 ml/min, y el límite superior preferible del mismo es 5 ml/min. El límite inferior más preferible es 0,2 ml/min y el límite superior más preferible es 3 ml/min. La longitud de onda de detección para hemoglobinas es preferiblemente, pero no se limita únicamente a, 415 nm.
Las muestras a analizar son aquellas preparadas hemolizando una muestra de sangre con una solución que contenía una sustancia que tiene actividad hemolítica tal como un tensioactivo, y diluyendo la muestra de sangre hemolizada. La cantidad de muestra a introducir depende de la proporción de dilución de la muestra de sangre, pero es preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 100 pL.
Efectos ventajosos de la invención
El método para analizar hemoglobinas de la presente invención permite análisis a corto plazo con excelente resolución y facilita la separación de hemoglobinas que han sido difíciles de separar mediante técnicas convencionales.
Por lo tanto, la presente invención permite separar y analizar con precisión las hemoglobinas en poco tiempo mediante cromatografía líquida.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un gráfico que muestra la relación entre el número de mediciones y el tiempo de elución de la hemoglobina S en el Ejemplo 1 y el Ejemplo Comparativo 1;
La Fig. 2 es un gráfico que muestra el gradiente del primer eluyente y del segundo eluyente en el Ejemplo 2;
Las Figs. 3(a) y 3(b) son cromatogramas obtenidos respectivamente midiendo una muestra que contenía nivel de control de glucohemoglobina II y una muestra que contenía sangre que contenía hemoglobina S en el Ejemplo 2; Las Figs. 4(a) y 4(b) son cromatogramas obtenidos respectivamente midiendo una muestra que contenía nivel de control de glucohemoglobina II y una muestra que contenía sangre que contenía hemoglobina S en el Ejemplo 3; Las Figs. 5(a) y 5(b) son cromatogramas obtenidos respectivamente midiendo una muestra que contenía nivel de control de glucohemoglobina II y una muestra que contenía sangre que contenía hemoglobina S en el Ejemplo 4; Las Figs. 6(a) y 6(b) son cromatogramas obtenidos respectivamente midiendo una muestra que contenía nivel de control de glucohemoglobina II y una muestra que contenía sangre que contenía hemoglobina S en el Ejemplo 5; Las Figs. 7(a) y 7(b) son cromatogramas obtenidos respectivamente midiendo una muestra que contenía nivel de control de glucohemoglobina II y una muestra que contenía sangre que contenía hemoglobina S en el Ejemplo 6; Las Figs. 8(a) y 8(b) son cromatogramas obtenidos respectivamente midiendo una muestra que contenía nivel de control de glucohemoglobina II y una muestra que contenía sangre que contenía hemoglobina S en el Ejemplo 7; Las Figs. 9(a) y 9(b) son cromatogramas obtenidos respectivamente midiendo una muestra que contenía nivel de control de glucohemoglobina II y una muestra que contenía sangre que contenía hemoglobina S en el Ejemplo 8; Las Figs. 10(a) y 10(b) son cromatogramas obtenidos respectivamente midiendo una muestra que contenía nivel de control de glucohemoglobina II y una muestra que contenía sangre que contenía hemoglobina S en el Ejemplo Comparativo 2;
Las Figs. 11 (a) y 11(b) son cromatogramas obtenidos respectivamente midiendo una muestra que contenía nivel de control de glucohemoglobina II y una muestra que contenía sangre que contenía hemoglobina S en el Ejemplo Comparativo 3;
Las Figs. 12(a) y 12(b) son cromatogramas obtenidos respectivamente midiendo una muestra que contenía nivel de control de glucohemoglobina II y una muestra que contenía sangre que contenía hemoglobina S en el Ejemplo Comparativo 4;
Las Figs. 13(a) y 13(b) son cromatogramas obtenidos respectivamente midiendo una muestra que contenía nivel de control de glucohemoglobina II y una muestra que contenía sangre que contenía hemoglobina S en el Ejemplo 9; y Las Figs. 14(a) y 14(b) son cromatogramas obtenidos respectivamente midiendo una muestra que contenía nivel de control de glucohemoglobina II y una muestra que contenía sangre que contenía hemoglobina S en el Ejemplo 10.
Descripción de realizaciones
La siguiente descripción discutirá la presente invención con más detalle mediante ejemplos, pero el alcance de la presente invención no se limita sólo a estos ejemplos.
(Ejemplo 1)
Se preparó una muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con una solución de pretratamiento de la muestra (tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
La columna de separación utilizada era una columna que contenía partículas de relleno de resina de intercambio catiónico que tenían grupos de ácido sulfónico en las superficies.
El instrumento de HPLC usado estaba provisto de un muestreador automático SIL-20AC (Shimadzu Corp.), una bomba de suministro LC-20AD (Shimadzu Corp.), un desgasificador DGU-20A5 (Shimadzu Corp.), un horno de columna CTO-20AC. (Shimadzu Corp.) y un detector SPD-M20A (Shimadzu Corp.). El instrumento se operó bajo las siguientes condiciones:
caudal de eluyente: 1,7 mL/min;
longitud de onda de detección: 415 nm; y
cantidad de muestra introducida: 10 pL.
Cada porción de la muestra se eluyó y midió usando los siguientes eluyentes durante los respectivos períodos de tiempo:
hasta 0,5 minutos después de la puesta en marcha: eluyente 1 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 60 mmol/L de perclorato de sodio, 1 mmol/L de nitro de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio);
de 0,5 minutos a 1,0 minuto después de la puesta en marcha: eluyente 2 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 10 mmol/L de perclorato de sodio, 1 mmol/L de nitro de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio);
de 1,0 minuto a 1,1 minutos después de la puesta en marcha: eluyente 3 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8 % en peso de Triton X-100, 300 mmol/L de perclorato de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio); y de 1,1 minutos a 1,5 minutos después de la puesta en marcha: eluyente 1.
La medición se repitió continuamente 15 veces inmediatamente después de la puesta en marcha del instrumento de HPLC.
(Ejemplo Comparativo 1)
Se utilizó la misma muestra que la del Ejemplo 1.
Cada porción de la muestra se midió de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que se usó el eluyente 4 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 60 mmol/L de perclorato de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio) en lugar del eluyente 1 y se usó el eluyente 5 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 10 mmol/L de perclorato de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio) en lugar del eluyente 2.
La Fig. 1 es un gráfico que muestra la relación entre el número de mediciones y el tiempo de elución de la hemoglobina S en el Ejemplo 1 y el Ejemplo Comparativo 1. Como se observa en la Fig. 1, el tiempo de elución de la hemoglobina S se hizo más largo a medida que aumentaba el número de mediciones en el Ejemplo Comparativo 1. Por otro lado, el tiempo de elución de la hemoglobina S fue constante independientemente del número de mediciones en el Ejemplo 1.
(Ejemplo 2)
Se preparó una muestra disolviendo el nivel de control de glucohemoglobina II (Sysmex Corp.) en agua para inyección (200 pL) y diluyendo adicionalmente la solución 100 veces con una solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato ( pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
Se preparó otra muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con la solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100). Se usó la misma columna de separación que la del Ejemplo 1.
Se operó el mismo instrumento de HPLC que el del Ejemplo 1 en las siguientes condiciones:
caudal: 1,7 ml/min;
longitud de onda de detección: 415 nm; y
cantidad de muestra introducida: 10 pL.
Cada muestra se eluyó y se midió mediante un gradiente lineal de dos eluyentes:
primer eluyente: eluyente 6 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 30 mmol/L de perclorato de sodio, 1 mmol/L de nitro de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio); y
segundo eluyente: eluyente 7 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8 % en peso de Tritón X-100, 300 mmol/L de perclorato de sodio, 1 mmol/L de nitro de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio).
La Fig. 2 es un gráfico que muestra el gradiente del primer eluyente y el segundo eluyente en el Ejemplo 2. La Fig. 2 muestra la proporción (% en peso) del segundo eluyente con respecto a la cantidad total del primer eluyente y el segundo eluyente. Las Figs. 3 son los cromatogramas resultantes.
(Ejemplo 3)
Se preparó una muestra disolviendo el nivel de control de glucohemoglobina II (Sysmex Corp.) en agua para inyección (200 pL) y diluyendo adicionalmente la solución 100 veces con una solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100, 1 mmol/L de nitrito de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio).
Se preparó otra muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con la solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1 % en peso de Triton X-100, 1 mmol/L de nitro de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio).
Las muestras se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el eluyente 3 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8 % en peso de Triton X-100, 300 mmol/L de perclorato de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio) usado en el Ejemplo 1 se utilizó como el segundo eluyente. Las Figs. 4 son los cromatogramas resultantes.
(Ejemplo 4)
Se preparó una muestra disolviendo el nivel de control de glucohemoglobina II (Sysmex Corp.) en agua para inyección (200 pL) y diluyendo adicionalmente la solución 100 veces con una solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
Se preparó otra muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con la solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
Las muestras se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el eluyente 8 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 30 mmol/L de perclorato de sodio, nitrito de sodio de 10 mmol/L y 1 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el primer eluyente, y el eluyente 9 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8% en peso de Triton X-100, 300 mmol/L de perclorato de sodio, nitrito de sodio de 10 mmol/L y 1 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el segundo eluyente. Las Figs. 5 son los cromatogramas resultantes.
(Ejemplo 5)
Se preparó una muestra disolviendo el nivel de control de glucohemoglobina II (Sysmex Corp.) en agua para inyección (200 pL) y diluyendo adicionalmente la solución 100 veces con una solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
Se preparó otra muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con la solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
Las muestras se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el eluyente 10 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 30 mmol/L de perclorato de sodio, 1 mmol/L de nitro de sodio y 10 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el primer eluyente, y el eluyente 11 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8% en peso de Triton X-100, 300 mmol/L de perclorato de sodio, 1 mmol/L de nitro de sodio y 10 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el segundo eluyente. Las Figs. 6 son los cromatogramas resultantes.
(Ejemplo 6)
Se preparó una muestra disolviendo el nivel de control de glucohemoglobina II (Sysmex Corp) en agua para inyección (200 pL) y diluyendo adicionalmente la solución 100 veces con una solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
Se preparó otra muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con la solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
Las muestras se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el eluyente 12 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 30 mmol/L de perclorato de sodio, nitrito de sodio de 10 mmol/L y 10 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el primer eluyente, y el eluyente 13 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8% en peso de Triton X-100, 300 mmol/L de perclorato de sodio, 10 mmol/L de nitrito de sodio y 10 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el segundo eluyente. Las Figs. 7 son los cromatogramas resultantes.
(Ejemplo 7)
Se preparó una muestra disolviendo el nivel de control de glucohemoglobina II (Sysmex Corp.) en agua para inyección (200 pL) y diluyendo adicionalmente la solución 100 veces con una solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100, 1 mmol/L de ferricianuro de potasio y 1 mmol/L de azida de sodio).
Se preparó otra muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con la solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1 % en peso de Triton X-100, 1 mmol/L de ferricianuro de potasio y 1 mmol/L de azida de sodio).
Las muestras se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el eluyente 14 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 30 mmol/L de perclorato de sodio, 1 mmol/L de ferricianuro de potasio y 1 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el primer eluyente, y el eluyente 15 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8% en peso de Triton X-100, 300 mmol/L de perclorato de sodio, 1 mmol/L de ferricianuro de potasio y 1 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el segundo eluyente. Las Figs. 8 son los cromatogramas resultantes. (Ejemplo 8)
Se preparó una muestra disolviendo el nivel de control de glucohemoglobina II (Sysmex Corp.) en agua para inyección (200 pL) y diluyendo adicionalmente la solución 100 veces con una solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100 y 1 mmol/L de azida de sodio). Se preparó otra muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con la solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1 % en peso de Triton X-100 y 1 mmol/L de azida de sodio).
Las muestras se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el eluyente 16 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 30 mmol/L de perclorato de sodio, 1 mmol/L de ferricianuro de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el primer eluyente, y el eluyente 3 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8 % en peso de Triton X-100, 300 mmol/L de perclorato de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio) utilizado en el Ejemplo 1 se utilizó como el segundo eluyente. Las Figs. 9 son los cromatogramas resultantes.
(Ejemplo Comparativo 2)
Se preparó una muestra disolviendo el nivel de control de glucohemoglobina II (Sysmex Corp.) en agua para inyección (200 pL) y diluyendo adicionalmente la solución 100 veces con una solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100 y 1 mmol/L de azida de sodio). Se preparó otra muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con la solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100 y 1 mmol/L de azida de sodio).
Las muestras se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el eluyente 17 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 30 mmol/L de perclorato de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el primer eluyente, y el eluyente 3 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8% en peso de Triton X-100, 300 mmol/L de perclorato de sodio y 1 mmol/L de azida de sodio) usado en el Ejemplo 1 se utilizó como el segundo eluyente. Las Figs. 10 son los cromatogramas resultantes.
(Ejemplo Comparativo 3)
Se preparó una muestra disolviendo el nivel de control de glucohemoglobina II (Sysmex Corp.) en agua para inyección (200 pL) y diluyendo adicionalmente la solución 100 veces con una solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100 y 1 mmol/L de nitrito de sodio). Se preparó otra muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con la solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100 y I mmol/L de nitrito de sodio).
Las muestras se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el eluyente 18 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 30 mmol/L de perclorato de sodio y 1 mmol/L de nitro de sodio) se utilizó como el primer eluyente, y el eluyente 19 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8% en peso de Triton X-100, 300 mmol/L de perclorato de sodio y 1 mmol/L de nitro de sodio) se utilizó como el segundo eluyente. Las Figs. I I son los cromatogramas resultantes.
(Ejemplo Comparativo 4)
Se preparó una muestra disolviendo el nivel de control de glucohemoglobina II (Sysmex Corp.) en agua para inyección (200 pL) y diluyendo adicionalmente la solución 100 veces con una solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
Se preparó otra muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con la solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
Las muestras se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el eluyente 20 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 30 mmol/L de perclorato de sodio y 1 mmol/L de ferricianuro de potasio) se utilizó como el primer eluyente, y el eluyente 21 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8% en peso de Triton X-100 y 300 mmol/L de perclorato de sodio) se utilizó como el segundo eluyente. Las Figs. 12 son los cromatogramas resultantes.
(Ejemplo 9)
Se preparó una muestra disolviendo el nivel de control de glucohemoglobina II (Sysmex Corp.) en agua para inyección (200 pL) y diluyendo adicionalmente la solución 100 veces con una solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
Se preparó otra muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con la solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
Las muestras se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el eluyente 22 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 30 mmol/L de perclorato de sodio, 25 mmol/L de nitrito de sodio y 25 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el primer eluyente, y el eluyente 23 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8 % en peso de Triton X-100, 300 mmol/L de perclorato de sodio, 25 mmol/L de nitrito de sodio y 25 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el segundo eluyente. Las Figs. 13 son los cromatogramas resultantes.
(Ejemplo 10)
Se preparó una muestra disolviendo el nivel de control de glucohemoglobina II (Sysmex Corp.) en agua para inyección (200 pL) y diluyendo adicionalmente la solución 100 veces con una solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1% en peso de Triton X-100).
Se preparó otra muestra diluyendo 100 veces una muestra de sangre que contenía hemoglobina S con la solución de pretratamiento de la muestra (10 mmol/L de tampón de fosfato (pH 7,0) que contenía 0,1 % en peso de Triton X-100).
Las muestras se midieron de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que el eluyente 24 (20 mmol/L de tampón de fosfato (pH 5,4) que contenía 30 mmol/L de perclorato de sodio, 50 mmol/L de nitrito de sodio y 50 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el primer eluyente, y el eluyente 25 (40 mmol/L de tampón de fosfato (pH 8,0) que contenía 0,8% en peso de Triton X-100, 300 mmol/L de perclorato de sodio, 50 mmol/L de nitrito de sodio y 50 mmol/L de azida de sodio) se utilizó como el segundo eluyente. Las Figs. 14 son los cromatogramas resultantes.
Las composiciones de las soluciones de pretratamiento de muestras y los eluyentes usados para la medición en los Ejemplos 2 a 10 y los Ejemplos Comparativos 2 a 4 se muestran en las Tablas 2 y 3. La Tabla 4 muestra cómo se separaron los picos de hemoglobinas en los cromatogramas obtenidos así como los patrones de picos de los cromatogramas.
En las Figs. 3 a 14, el pico (A) corresponde a la hemoglobina A0, el pico (B) corresponde a la hemoglobina A2 y el pico (C) corresponde a la hemoglobina S.
Como se observa en las Figs. 3 a 7 (Ejemplos 2 a 6), el pico (A) y el pico (C) se resolvieron respectivamente en picos únicos agudos. La precisión de la cuantificación del cromatograma de la Fig. 8 (Ejemplo 7) fue ligeramente mala debido a una pequeña deriva, pero todavía estaba en un nivel satisfactorio para la identificación de los picos. Por otro lado, el pico (A) y el pico (C) en la Fig. 9 (Ejemplo 8) se dividieron ligeramente en distribuciones trimodales o bimodales, pero no fueron problemáticos.
Como se observa en las Figs. 3 a 9 (Ejemplos 2 a 8), el pico (B) se resolvió bien a partir del pico (A). Por el contrario, en las Figs. 10 (Ejemplo Comparativo 2), el pico (B) de la muestra que contenía el nivel de control de glucohemoglobina II no se resolvió en absoluto del pico (A), y el pico (B) de la muestra que contenía hemoglobina S se observó como un pequeño hombro más adelante del pico (A). Se supone que el análisis de otras hemoglobinas produce los mismos patrones. Por lo tanto, es probable que la presente invención separe con precisión un pico próximo al de una especie de hemoglobina que está presente en una concentración elevada.
En las Figs. 11 y 12 (Ejemplos Comparativos 3 y 4), se detectaron picos que se suponía que eran productos descompuestos de las hemoglobinas además de picos de las hemoglobinas transformadas en formas meta mediante nitrito de sodio o ferricianuro de potasio.
En las Figs. 13 y 14 (Ejemplos 9 y 10), los componentes se resolvieron respectivamente en picos únicos debido a la coexistencia de nitrito de sodio y azida de sodio pero eluyeron en tiempos de elución demasiado cortos debido a cantidades excesivas de nitrito de sodio y azida de sodio. Sin embargo, dado que se obtuvieron picos únicos, la precisión de la cuantificación se puede garantizar ajustando otros factores, como la concentración del agente de tamponamiento.
Aplicabilidad industrial
La presente invención proporciona un método para analizar hemoglobinas que puede separar con precisión hemoglobinas en poco tiempo mediante cromatografía líquida.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un método para analizar hemoglobinas mediante cromatografía líquida, que comprende pretratar a un pH de 4,0 a 10,0 una muestra de sangre hemolizada con 0,05 mmol/L a 50 mmol/L de un oxidante capaz de transformar hemoglobinas a sus formas meta y 0,05 mmol/L a 50 mmol/L de un aglutinante que se une al hierro trivalente en la metahemoglobina y convierte la metahemoglobina en metahemoglobina estable, y determinar las metahemoglobinas estables en un perfil de elución a partir de la cromatografía líquida a una longitud de onda de detección con la muestra que ha sido sometida a el pretratamiento.
2. El método para analizar hemoglobinas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el oxidante es una sal de nitrito.
3. El método para analizar hemoglobinas de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el oxidante es nitrito de sodio.
4. El método para analizar hemoglobinas de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el aglutinante del hierro hemo trivalente es una azida.
5. El método para analizar hemoglobinas de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el aglutinante del hierro hemo trivalente es azida de sodio.
6. El método para analizar hemoglobinas de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3, 4 o 5, en donde la cromatografía líquida es cromatografía líquida de intercambio catiónico.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103913454B (zh) * 2014-04-04 2017-01-25 重庆医科大学 一种快速检测高铁血红蛋白血含量比色卡的制备方法
JP2016027326A (ja) * 2014-06-26 2016-02-18 アークレイ株式会社 測定方法、測定装置および溶離液
KR102443804B1 (ko) * 2018-01-11 2022-09-19 도요보 가부시키가이샤 측정 시료 희석액, 키트 및 측정 방법
WO2019203302A1 (ja) * 2018-04-18 2019-10-24 積水メディカル株式会社 ヘモグロビン分析方法
CN113009024B (zh) * 2018-12-29 2023-05-09 江山德瑞医疗科技有限公司 一种测定糖化血红蛋白中洗脱条件方法
CN110779914B (zh) * 2019-11-05 2022-05-20 湖南科技大学 基于血红蛋白与四碳或五碳二元酸复合物试剂盒制备方法
JPWO2021182599A1 (es) * 2020-03-13 2021-09-16

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5844985B2 (ja) * 1976-04-13 1983-10-06 中外製薬株式会社 ヘモグロビン測定用試薬
US4108603A (en) * 1977-05-18 1978-08-22 Purdue Research Foundation Method for rapid analysis of hemoglobin variants by high speed liquid chromatography
JPS55162060A (en) * 1979-06-04 1980-12-17 Mitsubishi Chem Ind Ltd Measuring method for glycosyl hemoglobin
JPS5644851A (en) * 1979-09-21 1981-04-24 Mitsubishi Chem Ind Ltd Measurement of glycocylhemoglobin
US4260516A (en) * 1979-12-07 1981-04-07 Abbott Laboratories Glycosylated hemoglobin standards
DE3141146A1 (de) * 1981-10-16 1983-04-28 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und reagens zur bestimmung von glykosiliertem haemoglobin
US4970171A (en) 1987-11-09 1990-11-13 Miles Inc. Denaturant reagents for convenient determination of hemoglobin derivatives in blood
DE4206932A1 (de) * 1992-03-05 1993-09-09 Boehringer Mannheim Gmbh Immunologische methode zur bestimmung eines haemoglobinderivates
US5223219A (en) * 1992-04-10 1993-06-29 Biotrack, Inc. Analytical cartridge and system for detecting analytes in liquid samples
JP4033534B2 (ja) 1997-12-03 2008-01-16 アルフレッサファーマ株式会社 ヒトヘモグロビンの安定化方法
CA2339360C (en) * 1998-08-07 2008-07-29 Sekisui Chemical Co., Ltd. Method for determination of hemoglobins
US6184228B1 (en) * 1999-05-25 2001-02-06 Anadys Pharmaceuticals, Inc. Anti-sickling agents: selection methods and effective compounds
AU2001282550A1 (en) * 2000-09-07 2002-03-22 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Method of quantifying total hemoglobin and glycohemoglobin
JP2003014714A (ja) * 2001-06-29 2003-01-15 Sekisui Chem Co Ltd ヘモグロビン類の測定方法
JP3898947B2 (ja) 2001-12-27 2007-03-28 栄研化学株式会社 ヘムタンパク質の安定化方法およびこれに用いる保存溶液
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