CN102893147A - 血红蛋白类的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种利用液相色谱法在短时间内能够高精度分离血红蛋白类的血红蛋白类的分析方法。本发明是使用了液相色谱法的血红蛋白类的分析方法，是预先用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理的血红蛋白类的分析方法。

Description

血红蛋白类的分析方法
技术领域
本发明涉及一种利用液相色谱法分离血红蛋白类的血红蛋白类的分析方法。
背景技术
目前，利用高效液相色谱法(HPLC)的血红蛋白类的分析被广泛进行，其在糖尿病诊断中用于糖化血红蛋白之一种的血红蛋白A1c的定量或异常血红蛋白的分析等。例如，已知如下液相色谱法：通过阳离子交换法，利用各血红蛋白成分不同的带电状态，分离将血液检体溶血稀释来制备的测定试样中的血红蛋白类。随着近年的糖尿病患者的增加，血红蛋白A1c的测定病例数也倾向于增加，在用HPLC的测定中，也要求高精度测定和测定时间的缩短。
在生物体内，在血红蛋白类中存在结合有氧的氧合血红蛋白、结合二氧化碳的脱氧血红蛋白、血红素中所包含的铁被氧化成三价铁离子的高铁血红蛋白。在使用阳离子交换色谱法的HPLC中，根据分离柱上的保留力的不同，而产生氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、高铁血红蛋白的溶出时间的差异，检测到的溶出峰宽化或者显示双峰性，因此分离精度有时变差。此外已知，在高铁血红蛋白与叠氮化物或氰化物共存的情况下，叠氮化物或氰化物与高铁血红蛋白的三价铁离子结合，形成叠氮高铁血红蛋白或氰化高铁血红蛋白(以下，将它们也称为稳定型高铁血红蛋白)而进行稳定化，但该稳定型高铁血红蛋白也在分离柱上的保留力与氧合血红蛋白或脱氧血红蛋白稍微不同，因此由于稳定型高铁血红蛋白的存在，检测到的溶出峰有时宽化或者显示双峰性。
使用了HPLC的血红蛋白类的分析除了糖尿病诊断之外还用于主要引起贫血的异常血红蛋白症或地中海贫血之类的诊断。其中，血红蛋白S为最多见的异常血红蛋白，其是引起严重贫血症状的镰状红细胞症的原因物质，因此，分离、检测的必要性高。此外，对作为糖尿病的指标的血红蛋白A1c进行测定时，理想的是，将以血红蛋白S为首的异常血红蛋白以尖锐的溶出峰形式分离。如果血红蛋白类的溶出峰宽化或形成双峰，则异常血红蛋白与正常血红蛋白之间的分离变得困难，并且有可能对测定值产生不良影响。另外，与新鲜血相比，变质血有更易于产生宽或双峰性的溶出峰的倾向。该原因是，通过变质产生的高铁血红蛋白增加。因此，在通过再检查等对保存检体进行分析的情况下，有可能对测定值产生不良影响。
作为用于防止血红蛋白类的变质或改性的方法，已知添加公知的抗菌剂的方法和添加糖类的方法，除此之外，例如还公开了下述方法：在专利文献1中，公开了使白蛋白与血红蛋白类共存的方法；在专利文献2中，公开了使血红蛋白类与酪蛋白、硼酸等共存的方法；在专利文献3中，公开了使血红蛋白类与亚氨基羧酸及其盐共存的方法。
然而，即使使用专利文献1～3中所公开的方法，在血液检体中混杂氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、高铁血红蛋白等各种血红蛋白类的情况下，用HPLC测定时，溶出峰有时宽化或者显示双峰性。
此外，在通常的HPLC装置中，虽然组装有用于去除洗脱(溶離)液中的气体的脱气机，但是脱气机在启动后一定时间气体去除能力不稳定，有时血红蛋白的洗脱时间变动、或者对分离造成不良影响。特别是，在HPLC装置刚刚启动后或洗脱液温度不稳定的情况下，血红蛋白类的溶出时间变动、或者容易导致定量性变差。由于这在要求迅速性的以血红蛋白A1c为指标的糖尿病检查中，与第一次报告为止的时间较长有关，因此需要从刚刚启动HPLC装置后就能够稳定地测定的技术。
另外，在各种血红蛋白类的检测、定量中，通常使用基于分光光度计的吸光度，但由于氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、高铁血红蛋白、叠氮高铁血红蛋白、氰化高铁血红蛋白各自的吸收光谱不同，因此如果它们混杂在一起，则有时不能测定正确的血红蛋白量。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2003-194825号公报
专利文献2：日本特开平11-166932号公报
专利文献3：日本特开2009-97956号公报
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供一种利用液相色谱法在短时间内能够高精度地分离血红蛋白类的血红蛋白类的分析方法。
解决课题的手段
本发明是使用了液相色谱法的血红蛋白类的分析方法，是预先用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理的血红蛋白类的分析方法。
下面，对本发明进行详述。
本发明人发现，通过预先用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理，使检体中的血红蛋白类全部变为稳定型高铁血红蛋白，统一各血红蛋白在柱固定相中的保留力，在短时间内能够高精度地分离血红蛋白类，从而完成了本发明。
在本发明的血红蛋白类的分析方法中，预先用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理。
通过用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理，可以提高血红蛋白类的分离能力，并且可以缩短血红蛋白类的溶出时间。进而，即使在HPLC装置的脱气机在刚刚启动后气体去除能力不稳定的情况下，血红蛋白类的溶出时间也不会发生变动，并且检测到的溶出峰不会宽化或显示双峰性，而高精度地分离血红蛋白类。
需要说明的是，在本发明中，“预先用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理”是指，以分离柱分离血红蛋白类之前，用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理，并不限于在液相色谱法中的测定开始前进行处理。具体地说，例如，在检体前处理液和/或洗脱液中，以表1所记载的组合中的任一组合，配合氧化剂和三价血红素铁的结合剂，由此可以在分离血红蛋白类之前，用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理。表1中，“○”是指配合，“-”是指不配合。
[表1]
Figure BDA00002159428500041
在本发明的血红蛋白类的分析方法中，氧化剂使血红蛋白类的血红素铁由二价变为三价，形成高铁血红蛋白。
作为氧化剂，只要具有使血红蛋白类的血红素铁由二价变为三价的效果就没有特别限定，例如可以举出亚硝酸盐、铁氰化钾、亚甲基蓝、过氧化氢、抗坏血酸、硫化氢等。其中，优选亚硝酸盐，更优选亚硝酸钠、亜硝酸钾。通过使用这些氧化剂，不会因氧化力过强而血红蛋白类进行分解，并且，不会与高铁血红蛋白结合而大大改变溶出图案、或者不会因检测血红蛋白类的波长和氧化剂的吸收光谱的干扰而在HPLC测定中产生基线的波动，血红蛋白类的定量性变得更优异。
在本发明的血红蛋白类的分析方法中，三价血红素铁的结合剂使高铁血红蛋白成为稳定型高铁血红蛋白。
作为三价血红素铁的结合剂，例如可以举出叠氮化物、氰化物等。通过使用叠氮化物或氰化物作为三价血红素铁的结合剂，不会大大改变高铁血红蛋白的结构，也不会大大改变血红蛋白类的溶出行为。因此，血红蛋白类的定量性变得更优异。
作为叠氮化物，例如可以举出叠氮化钠、叠氮磷酸二苯酯、4-十二烷基苯磺酰叠氮、4-乙酰氨基苯磺酰叠氮、叠氮化钾、叠氮化锂、叠氮化铁、叠氮化氢、叠氮化铅、叠氮化汞、叠氮化铜、叠氮化银等。
作为氰化物，例如可以举出氰化钾、氰化氢、氰化钠、氰化银、氰化汞、氰化铜、氰化铅、氰化铁、氰化锂、氰化铵等。
这些三价血红素铁的结合剂当中，优选叠氮化钠。
作为检体前处理液，例如可以使用含有有机酸或其盐类、氨基酸类、无机酸或其盐类、Good’s缓冲剂等缓冲剂的公知的缓冲液。
作为有机酸，例如可以举出柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸等。
作为氨基酸类，例如可以举出甘氨酸、牛磺酸、精氨酸等。
作为无机酸，例如可以举出盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、硼酸、醋酸等。
此外，在缓冲液中，可根据需要适当添加表面活性剂、各种聚合物、亲水性的低分子化合物等。
检体前处理液的缓冲剂浓度没有特别限定，但优选的下限为5mmol/L，优选的上限为500mmol/L。如果缓冲剂浓度不到5mmol/L，则有时不能充分得到缓冲作用。如果缓冲剂浓度超过500mmol/L，则引起缓冲剂的析出，而有时成为堵塞HPLC装置的流路的原因。缓冲剂浓度的更优选的下限为10mmol/L，更优选的上限为200mmol/L。
在检体前处理液含有氧化剂的情况下，检体前处理液中的氧化剂的浓度没有特别限定，但优选的下限为0.05mmol/L，优选的上限为50mmol/L。如果检体前处理液中的氧化剂的浓度不到0.05mmol/L，则血红蛋白类的高铁血红蛋白化不能充分进行，氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白混杂在测定试样中，从而检测到的溶出峰有时宽化或者显示双峰性。如果检体前处理液中的氧化剂的浓度超过50mmol/L，则高铁血红蛋白被分解，而有时检测不到溶出峰、或者在不同的溶出时间检测到溶出峰。检体前处理液中的氧化剂的浓度的更优选的下限为0.5mmol/L，更优选的上限为25mmol/L。
在检体前处理液含有三价血红素铁的结合剂的情况下，检体前处理液中的三价血红素铁的结合剂的浓度没有特别限定，但优选的下限为0.05mmol/L，优选的上限为50mmol/L。如果检体前处理液中的三价血红素铁的结合剂的浓度不到0.05mmol/L，则结合剂向高铁血红蛋白的三价血红素的结合不能充分进行，而有时检测到的溶出峰宽化或者显示双峰性。如果检体前处理液中的三价血红素铁的结合剂的浓度超过50mmol/L，则高铁血红蛋白被分解，而有时检测不到溶出峰、或者在不同的溶出时间检测到溶出峰。检体前处理液中的三价血红素铁的结合剂的浓度的更优选的下限为0.5mmol/L，更优选的上限为25mmol/L。
检体前处理液的pH没有特别限定，但优选的下限为4.0，优选的上限为10.0。如果检体前处理液的pH不到4.0或者超过10.0，则血红蛋白类的稳定性降低，有时检测不到溶出峰、或者在不同的溶出时间检测到溶出峰。检体前处理液的pH的更优选的下限为6.0，更优选的上限为8.5。
作为洗脱液，例如可以使用含有有机酸或其盐类、氨基酸类、无机酸或其盐类、Good’s缓冲剂等缓冲剂的公知的缓冲液。
作为有机酸，例如可以举出柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸等。
作为氨基酸类，例如可以举出甘氨酸、牛磺酸、精氨酸等。
作为无机酸，例如可以举出盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、硼酸、醋酸等。
此外，在缓冲液中可根据需要适当添加表面活性剂、各种聚合物、亲水性的低分子化合物等。
洗脱液中的缓冲剂浓度没有特别限定，但优选的下限为5mmol/L，优选的上限为500mmol/L。如果缓冲剂浓度不到5mmol/L，则有时不能充分得到缓冲作用。如果缓冲剂浓度超过500mmol/L，则有时引起缓冲剂的析出而成为堵塞HPLC装置的流路的原因，或者洗脱液的转换效率降低，成为平衡化花费时间的原因。缓冲剂浓度的更优选的下限为10mmol/L，更优选的上限为200mmol/L。
在洗脱液含有氧化剂的情况下，洗脱液中的氧化剂的浓度没有特别限定，但优选的下限为0.05mmol/L，优选的上限为50mmol/L。如果洗脱液中的氧化剂的浓度不到0.05mmol/L，则血红蛋白类的高铁血红蛋白化不能充分进行，氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白混杂在测定试样中，从而检测到的溶出峰有时宽化或者显示双峰性。如果洗脱液中的氧化剂的浓度超过50mmol/L，则溶出时间变得过快，分离能力有时变差。另外，溶出时间可以在高铁血红蛋白不分解的范围内通过调整洗脱液中的缓冲剂浓度等来调节。洗脱液中的氧化剂的浓度的更优选的下限为0.5mmol/L，更优选的上限为25mmol/L。
在洗脱液含有三价血红素铁的结合剂的情况下，洗脱液中的三价血红素铁的结合剂的浓度没有特别限定，但优选的下限为0.05mmol/L，优选的上限为50mmol/L。如果洗脱液中的三价血红素铁的结合剂的浓度不到0.05mmol/L，则血红蛋白类的高铁血红蛋白化不能充分进行，由于混杂氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白，因此有时溶出峰宽化或者显示双峰性。如果洗脱液中的三价血红素铁的结合剂的浓度超过50mmol/L，则溶出时间变得过快，分离能力有时变差。另外，溶出时间可以在高铁血红蛋白不分解的范围内通过调整洗脱液中的缓冲剂浓度等来调节。洗脱液中的三价血红素铁的结合剂的浓度的更优选的下限为0.5mmol/L，更优选的上限为25mmol/L。
本发明的血红蛋白类的分析方法中，仅在洗脱液中配合氧化剂和三价血红素铁的结合剂的情况下，至少在利用HPLC测定的最初送液的洗脱液中配合氧化剂和三价血红素铁的结合剂。此外，优选的是，将氧化剂和三价血红素铁的结合剂还配合在除了利用HPLC测定的最初送液的洗脱液以外的洗脱液中，更优选将其配合在测定中所用的全部洗脱液中。
洗脱液中可以含有公知的酸、碱作为pH调节剂。作为酸，例如可以举出盐酸、磷酸、硝酸、硫酸等，作为碱，例如可以举出氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化钡、氢氧化钙等。
洗脱液中可以含有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等水溶性有机溶剂。有机溶剂的浓度优选以盐等不析出的程度使用，优选的上限为80％(v/v)。
洗脱液的pH没有特别限定，但优选的下限为4.0，优选的上限为10.0。如果洗脱液的pH不到4.0，则有时检测到的溶出峰的前延(リ一ディング)变大、或者溶出峰变宽或显示双峰性。如果洗脱液的pH超过10.0，则柱固定相和血红蛋白类的保留变弱而血红蛋白类的溶出时间变得极快，而且有时检测到的溶出峰的脱尾(テ一リング)变大、或者溶出峰变宽或显示双峰性。此外，通过将pH设为4.0以上10.0以下，测定试样中的血红蛋白类的稳定性不会下降，不会发生检测不到血红蛋白类的溶出峰、或者在不同的溶出时间检测到溶出峰的情况。洗脱液的pH的更优选的下限为6.0，更优选的上限为8.5。
作为本发明的血红蛋白类的分析方法中的液相色谱法，优选使用离子交换液相色谱法。
作为离子交换液相色谱法，可以使用公知的方法。例如可以举出如下方法：使用泵将洗脱液送液至分离柱时，使洗脱液在通过脱气机后注入测定试样而送至分离柱，用分离柱分离血红蛋白类，利用检测器，对溶出的溶出液中的分离成分进行检测。
分离柱为柱内填充有固定相的柱。作为固定相，可以举出填充剂粒子、多孔质体等。其中，优选填充剂粒子。
作为填充剂粒子，可以举出无机系粒子、有机系粒子等。
作为无机系粒子，可以举出由二氧化硅、氧化锆等构成的粒子。
作为有机系粒子，可以举出纤维素、聚氨基酸、壳聚糖等天然高分子粒子；或聚苯乙烯、聚丙烯酸酯等合成高分子粒子。
作为固定相，优选使用具有阳离子交换基团的固定相。
作为阳离子交换基团，可以举出羧基、磷酸基、磺酸基等。
本发明的血红蛋白类的分析方法中的测定条件可根据所使用的测定试样、柱等的种类来适当选择，但洗脱液的流速的优选的下限为0.05mL/分钟，优选的上限为5mL/分钟，更优选的下限为0.2mL/分钟，更优选的上限为3mL/分钟。血红蛋白类的检测波长优选为415nm，但并不特别仅限于此。
测定试样通常使用将由下述溶液溶血后的血液检体进行稀释后的试样，所述溶液包含具有表面活性剂等溶血活性的物质。测定试样的注入量根据血液检体的稀释倍率而不同，但优选0.1～100μL左右。
发明效果
本发明的血红蛋白类的分析方法在显示优异的分离能力的同时，可以在短时间内进行分析，并且对以往分离困难的血红蛋白类也容易进行分离。
即，根据本发明，可以利用液相色谱法在短时间内高精度分离、分析血红蛋白类。
附图说明
图1为示出实施例1和比较例1中的测定次数与血红蛋白S的溶出时间之间的关系的图。
图2为示出实施例2中的第1洗脱液和第2洗脱液的梯度条件的图。
图3为在实施例2中，对(a)含有糖化血红蛋白Control level2的测定试样、以及(b)含有包含血红蛋白S的血液的测定试样进行测定而得到的色谱。
图4为在实施例3中，对(a)含有糖化血红蛋白Control level2的测定试样、以及(b)含有包含血红蛋白S的血液的测定试样进行测定而得到的色谱。
图5为在实施例4中，对(a)含有糖化血红蛋白Control level2的测定试样、以及(b)含有包含血红蛋白S的血液的测定试样进行测定而得到的色谱。
图6为在实施例5中，对(a)含有糖化血红蛋白Control level2的测定试样、以及(b)含有包含血红蛋白S的血液的测定试样进行测定而得到的色谱。
图7为在实施例6中，对(a)含有糖化血红蛋白Control level2的测定试样、以及(b)含有包含血红蛋白S的血液的测定试样进行测定而得到的色谱。
图8为在实施例7中，对(a)含有糖化血红蛋白Control level2的测定试样、以及(b)含有包含血红蛋白S的血液的测定试样进行测定而得到的色谱。
图9为在实施例8中，对(a)含有糖化血红蛋白Control level2的测定试样、以及(b)含有包含血红蛋白S的血液的测定试样进行测定而得到的色谱。
图10为在比较例2中，对(a)含有糖化血红蛋白Control level2的测定试样、以及(b)含有包含血红蛋白S的血液的测定试样进行测定而得到的色谱。
图11为在比较例3中，对(a)含有糖化血红蛋白Control level2的测定试样、以及(b)含有包含血红蛋白S的血液的测定试样进行测定而得到的色谱。
图12为在比较例4中，对(a)含有糖化血红蛋白Control level2的测定试样、以及(b)含有包含血红蛋白S的血液的测定试样进行测定而得到的色谱。
图13为在实施例9中，对(a)含有糖化血红蛋白Control level2的测定试样、以及(b)含有包含血红蛋白S的血液的测定试样进行测定而得到的色谱。
图14为在实施例10中，对(a)含有糖化血红蛋白Control level2的测定试样、以及(b)含有包含血红蛋白S的血液的测定试样进行测定而得到的色谱。
具体实施方式
下面，举出实施例更详细说明本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。
(实施例1)
用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的磷酸缓冲液(pH7.0))将含有血红蛋白S的血液检体稀释至100倍，并将其用作测定试样。
作为分离柱，使用了如下柱：将在粒子表面上导入了磺酸基的阳离子交换树脂填充剂填充到柱本体。
在HPLC装置中，作为自动进样器使用SIL-20AC(岛津制作所社制)、作为送液泵使用LC-20AD(岛津制作所社制)、作为脱气机使用DGU-20A5(岛津制作所社制)、作为柱温箱使用CTO-20AC(岛津制作所社制)、作为检测器使用SPD-M20A(岛津制作所社制)，将洗脱液的流速设为1.7mL/分钟，将检测波长设为415nm，并将测定试样注入量设为10μL。
作为洗脱液，在0.5分钟之前，用洗脱液1(含有60mmol/L高氯酸钠、1mmol/L亚硝酸钠、1mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))来溶出，在超过0.5分钟到1.0分钟，用洗脱液2(含有10mmol/L高氯酸钠、1mmol/L亚硝酸钠、1mmol/L叠氮化钠的20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))来溶出，在超过1.0分钟到1.1分钟，用洗脱液3(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠、1mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))来溶出，在超过1.1分钟到1.5分钟，用洗脱液1来溶出，而对测定试样进行测定。
另外，刚刚启动HPLC装置后开始连续进行测定15次。
(比较例1)
测定试样使用了与实施例1同样的物质。
将洗脱液1变更为洗脱液4(含有60mmol/L高氯酸钠、1mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))，并将洗脱液2变更为洗脱液5(含有10mmol/L高氯酸钠、1mmol/L叠氮化钠的20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))，除此以外，与实施例1同样地对测定试样进行测定。
将实施例1和比较例1中的测定次数与血红蛋白S的溶出时间之间的关系示于图1。由图1可知，在比较例1中，随着测定次数的增加，血红蛋白S的溶出时间延迟。另一方面，在实施例1中，血红蛋白S的溶出时间几乎恒定，而与测定次数无关。
(实施例2)
将糖化血红蛋白Control level2(Sysmex社制)用200μL的注射用水溶解后，用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
此外，将含有血红蛋白S的血液检体用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
分离柱使用了与实施例1同样的分离柱。
使用与实施例1同样的HPLC装置，将流速设为1.7mL/分钟，将检测波长设为415nm，并将测定试样注入量设为10μL。
洗脱液使用洗脱液6(含有30mmol/L高氯酸钠、1mmol/L亚硝酸钠、1mmol/L叠氮化钠的20mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))作为第1洗脱液、以及使用洗脱液7(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠、1mmol/L亚硝酸钠、1mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))作为第2洗脱液，用2液线性梯度溶出对测定试样进行测定。将第1洗脱液和第2洗脱液的梯度条件示于图2。图2示出相对于第1洗脱液和第2洗脱液的合计量的第2洗脱液的比例(重量％)。此外，将所得到的色谱示于图3。
(实施例3)
将糖化血红蛋白Control level2(Sysmex社制)用200μL的注射用水溶解后，用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100、1mmol/L亚硝酸钠、1mmol/L叠氮化钠的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
此外，将含有血红蛋白S的血液检体用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100、1mmol/L亚硝酸钠、1mmol/L叠氮化钠的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
将第2洗脱液变更为实施例1中所用的洗脱液3(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠、1mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))，除此以外，与实施例2同样地对测定试样进行测定。将所得到的色谱示于图4。
(实施例4)
将糖化血红蛋白Control level2(Sysmex社制)用200μL的注射用水溶解后，用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
此外，将含有血红蛋白S的血液检体用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
将第1洗脱液变更为洗脱液8(含有30mmol/L高氯酸钠、10mmol/L亚硝酸钠、1mmol/L叠氮化钠的20mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))，并将第2洗脱液变更为洗脱液9(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠、10mmol/L亚硝酸钠、1mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))，除此以外，与实施例2同样地对测定试样进行测定。将所得到的色谱示于图5。
(实施例5)
将糖化血红蛋白Control level2(Sysmex社制)用200μL的注射用水溶解后，用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
此外，将含有血红蛋白S的血液检体用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
将第1洗脱液变更为洗脱液10(含有30mmol/L高氯酸钠、1mmol/L亚硝酸钠、10mmol/L叠氮化钠的20mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))，并将第2洗脱液变更为洗脱液11(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠、1mmol/L亚硝酸钠、10mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))，除此以外，与实施例2同样地对测定试样进行测定。将所得到的色谱示于图6。
(实施例6)
将糖化血红蛋白Control level2(Sysmex社制)用200μL的注射用水溶解后，用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
此外，将含有血红蛋白S的血液检体用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
将第1洗脱液变更为洗脱液12(含有30mmol/L高氯酸钠、10mmol/L亚硝酸钠、10mmol/L叠氮化钠的20mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))，并将第2洗脱液变更为洗脱液13(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠、10mmol/L亚硝酸钠、10mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))，除此以外，与实施例2同样地对测定试样进行测定。将所得到的色谱示于图7。
(实施例7)
将糖化血红蛋白Control level2(Sysmex社制)用200μL的注射用水溶解后，用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100、1mmol/L铁氰化钾、1mmol/L叠氮化钠的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
此外，将含有血红蛋白S的血液检体用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100、1mmol/L铁氰化钾、1mmol/L叠氮化钠的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
将第1洗脱液变更为洗脱液14(含有30mmol/L高氯酸钠、1mmol/L铁氰化钾、1mmol/L叠氮化钠的20mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))，并将第2洗脱液变更为洗脱液15(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠、1mmol/L铁氰化钾、1mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))，除此以外，与实施例2同样地对测定试样进行测定。将所得到的色谱示于图8。
(实施例8)
将糖化血红蛋白Control level2(Sysmex社制)用200μL的注射用水溶解后，用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100、1mmol/L叠氮化钠的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
此外，将含有血红蛋白S的血液检体用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100、1mmol/L叠氮化钠的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
将第1洗脱液变更为洗脱液16(含有30mmol/L高氯酸钠、1mmol/L铁氰化钠、1mmol/L叠氮化钠的20mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))，并将第2洗脱液变更为实施例1中所用的洗脱液3(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠、1mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))，除此以外，与实施例2同样地对测定试样进行测定。将所得到的色谱示于图9。
(比较例2)
将糖化血红蛋白Control level2(Sysmex社制)用200μL的注射用水溶解后，用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100、1mmol/L叠氮化钠的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
此外，将含有血红蛋白S的血液检体用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100、1mmol/L叠氮化钠的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
将第1洗脱液变更为洗脱液17(含有30mmol/L高氯酸钠、1mmol/L叠氮化钠的20mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))，并将第2洗脱液变更为实施例1中所用的洗脱液3(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠、1mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))，除此以外，与实施例2同样地对测定试样进行测定。将所得到的色谱示于图10。
(比较例3)
将糖化血红蛋白Control level2(Sysmex社制)用200μL的注射用水溶解后，用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100、1mmol/L亚硝酸钠的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
此外，将含有血红蛋白S的血液检体用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100、1mmol/L亚硝酸钠的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
将第1洗脱液变更为洗脱液18(含有30mmol/L高氯酸钠、1mmol/L亚硝酸钠的20mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))，并将第2洗脱液变更为洗脱液19(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠、1mmol/L亚硝酸钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))，除此以外，与实施例2同样地对测定试样进行测定。将所得到的色谱示于图11。
(比较例4)
将糖化血红蛋白Control level2(Sysmex社制)用200μL的注射用水溶解后，用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
此外，将含有血红蛋白S的血液检体用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
将第1洗脱液变更为洗脱液20(含有30mmol/L高氯酸钠、1mmol/L铁氰化钾的20mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))，并将第2洗脱液变更为洗脱液21(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))，除此以外，与实施例2同样地对测定试样进行测定。将所得到的色谱示于图12。
(实施例9)
将糖化血红蛋白Control level2(Sysmex社制)用200μL的注射用水溶解后，用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
此外，将含有血红蛋白S的血液检体用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
将第1洗脱液变更为洗脱液22(含有30mmol/L高氯酸钠、25mmol/L亚硝酸钠、25mmol/L叠氮化钠的20mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))，并将第2洗脱液变更为洗脱液23(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠、25mmol/L亚硝酸钠、25mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))，除此以外，与实施例2同样地对测定试样进行测定。将所得到的色谱示于图13。
(实施例10)
将糖化血红蛋白Control level2(Sysmex社制)用200μL的注射用水溶解后，用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
此外，将含有血红蛋白S的血液检体用检体前处理液(含有0.1重量％tritonX-100的10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0))稀释至100倍，并将其用作测定试样。
将第1洗脱液变更为洗脱液24(含有30mmol/L高氯酸钠、50mmol/L亚硝酸钠、50mmol/L叠氮化钠的20mmol/L磷酸缓冲液(pH5.4))，并将第2洗脱液变更为洗脱液25(含有0.8重量％tritonX-100、300mmol/L高氯酸钠、50mmol/L亚硝酸钠、50mmol/L叠氮化钠的40mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0))，除此以外，与实施例2同样地对测定试样进行测定。将所得到的色谱示于图14。
将实施例2～10、以及比较例2～4的测定中所用的检体前处理液和洗脱液的组成示于表2、3。并且，将所得到的色谱的血红蛋白类的分离情况和峰图案示于表4。
在图3～14中，峰(A)表示血红蛋白A0，峰(B)表示血红蛋白A2，峰(C)表示血红蛋白S。
在图3～7(实施例2～6)中确认到，峰(A)、峰(C)以尖锐的单峰形式分离。图8(实施例7)中，在色谱中确认到少许漂移，因此定量性略下降，但为可鉴定峰的水平。另一方面，虽然图9(实施例8)的峰(A)、峰(C)作为略微显示三峰性或双峰性的峰被检测，但该程度是没有问题的。
此外，在图3～9(实施例2～8)中确认到，峰(B)从峰(A)分离，但在图10(比较例2)中，在含有糖化血红蛋白Control 2的测定试样中，峰(B)完全未能从峰(A)分离，在含有血红蛋白S的测定试样中，只能在峰(A)的后面以肩峰形式略微确认到峰(B)。可以认为，对其他的血红蛋白种类也产生同样的现象，通过采用本发明，容易使与含量多的血红蛋白种类相邻的峰高精度地分离。
在图11、12(比较例3、4)中，以峰的形式检测到被亚硝酸钠或铁氰化钾高铁血红蛋白化的血红蛋白，还检测到被认为是血红蛋白类的分解物的峰。
在图13、14(实施例9、10)中，因为亚硝酸钠和叠氮化钠共存，而形成了单峰，但是由于添加量过多，因此溶出时间过快。然而，由于形成了单峰，因此通过调节缓冲剂浓度等其他的条件，能够确保定量性。
[表2]
Figure BDA00002159428500181
[表3]
Figure BDA00002159428500191
[表4]
Figure BDA00002159428500201
工业应用性
根据本发明，可以提供一种利用液相色谱法在短时间内能够高精度分离血红蛋白类的血红蛋白类的分析方法。

Claims (8)

1.一种血红蛋白类的分析方法，其是使用了液相色谱法的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，预先用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理。
2.根据权利要求1所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，氧化剂为使血红蛋白成为高铁血红蛋白的物质。
3.根据权利要求2所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，氧化剂为亚硝酸盐。
4.根据权利要求3所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，氧化剂为亚硝酸钠。
5.根据权利要求1所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，三价血红素铁的结合剂为与高铁血红蛋白中的三价铁结合的物质。
6.根据权利要求5所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，三价血红素铁的结合剂为叠氮化物。
7.根据权利要求6所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，三价血红素铁的结合剂为叠氮化钠。
8.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，作为液相色谱法，使用阳离子交换液相色谱法。
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