CN111989568A - 血红蛋白分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种分离和检测含有异常血红蛋白和地中海贫血标记物的各种血红蛋白的方法。本发明涉及一种血红蛋白分析方法，该方法包括通过阳离子交换色谱来分离试样中的血红蛋白，在该血红蛋白的分离中，使用pH为8.1以上、渗透压为40mOsm/kg以下的洗脱液。

Description

血红蛋白分析方法
技术领域
本发明涉及血红蛋白的分析方法。
背景技术
血红蛋白(Hb)是由与氧结合的血红素(色素部分)和携带血红素的球蛋白构成的色素蛋白，与氧向全身细胞的运输有关。正常人球蛋白的多肽有α、β、γ、δ链这样的4种亚基，它们构成由2根α链和2根非α链构成的四聚体。正常人Hb存在HbA(α2β2)、HbA2(α2δ2)和HbF(α2γ2)这3种，但其大部分为HbA。HbA主要包含HbA0和糖化的HbA1c，HbA1c作为糖尿病等的标记物使用。
球蛋白亚基的立体结构的异常引起异常Hb症，另一方面，球蛋白亚基的形成不全引起地中海贫血，均导致贫血，进而在重症例时，引起溶血、发育不全、骨骼变形等。异常Hb症一般通过检测HbS、HbC、HbE、HbD等异常Hb来诊断。地中海贫血大致分为因α链的形成不全所致的α地中海贫血和因β链的形成不全所致的β地中海贫血，一般以HbA2、HbF等的高值为指标来诊断。
有使用高效液相色谱(HPLC)来检测血红蛋白异常的方法。在专利文献1中记载了通过使用将以不同比率含有磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)的多种洗脱液依次送液的梯度洗脱的HPLC，能够分离作为异常Hb的HbS、HbC、HbE和HbD或地中海贫血标记物HbA2和HbF。在专利文献2中记载了通过使用含有离子对试剂且pH在7.1～7.3的范围的洗脱液的离子交换液相色谱来分离HbA0、HbS和HbC。在专利文献3中记载了通过阳离子交换高效液相色谱并使用pH6.88～7.50的洗脱液来分析血红蛋白S，或者使用pH6.60～6.80的洗脱液来分析血红蛋白A2的方法。
现有技术献
专利文献
专利文献1：日本特开2016－27326号公报
专利文献2：日本特开2010－237110号公报
专利文献3：国际公开公报第2011/096420号
发明内容
本发明涉及从血液试样中分离和检测含有异常血红蛋白和地中海贫血标记物的各种血红蛋白的方法。
因此，本发明提供以下方案。
〔1〕一种血红蛋白分析方法，包括通过阳离子交换色谱来分离试样中的血红蛋白，
在该血红蛋白的分离中，使用pH为8.1以上、渗透压为40mOsm/kg以下的洗脱液。
〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，所述洗脱液含有不含金属离子的缓冲剂。
〔3〕根据〔2〕所述的方法，其中，所述缓冲剂为Bicine、Tricine或TES。
〔4〕根据〔2〕或〔3〕所述的方法，其中，所述洗脱液中的所述缓冲剂的浓度为2～17mmol/L。
〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，所述洗脱液含有血红蛋白变性剂。
〔6〕根据〔1〕～〔5〕中任一项所述的方法，其中，通过使用所述洗脱液的梯度洗脱来分离血红蛋白。
〔7〕根据〔6〕所述的方法，其中，在所述梯度中所述洗脱液的比例从0％增加至100％。
〔8〕根据〔1〕～〔7〕中任一项所述的方法，其中，将选自HbS、HbC、HbE、HbD和HbO－Arab中的至少1种异常血红蛋白分离。
〔9〕根据〔1〕～〔8〕中任一项所述的方法，其中，将选自HbA2、HbF、HbH、HbBart’和HbConstant Spring中的至少1种地中海贫血标记物分离。
〔10〕根据〔1〕～〔9〕中任一项所述的方法，其中，所述色谱为高效液相色谱。
〔11〕一种基于阳离子交换色谱的血红蛋白分离用洗脱液，pH为8.1以上，渗透压为40mOsm/kg以下。
〔12〕根据〔11〕所述的洗脱液，其中，含有不含金属离子的缓冲剂。
〔13〕根据〔12〕所述的洗脱液，其中，所述缓冲剂为Bicine、Tricine或TES。
〔14〕根据〔12〕或〔13〕所述的洗脱液，其中，所述洗脱液中的所述缓冲剂的浓度为2～17mmol/L。
〔15〕根据〔11〕～〔14〕中任一项所述的洗脱液，其中，所述洗脱液含有血红蛋白变性剂。
〔16〕一种pH为8.1以上、渗透压为40mOsm/kg以下的液体组合物的作为基于阳离子交换色谱的血红蛋白分离用洗脱液的应用。
〔17〕一种pH为8.1以上、渗透压为40mOsm/kg以下的液体组合物的用于制造基于阳离子交换色谱的血红蛋白分离用洗脱液的应用。
〔18〕根据〔16〕或〔17〕所述的应用，其中，所述液体组合物含有不含金属离子的缓冲剂。
〔19〕根据〔18〕所述的应用，其中，所述缓冲剂为Bicine、Tricine或TES。
〔20〕根据〔18〕或〔19〕所述的应用，其中，所述液体组合物中的所述缓冲剂的浓度为2～17mmol/L。
〔21〕根据〔16〕～〔20〕中任一项所述的应用，其中，所述液体组合物含有血红蛋白变性剂。
根据本发明，除作为主要的血红蛋白的HbA0以外，还能够从血液试样中迅速且高灵敏度地分离HbA1c、异常Hb、地中海贫血标记物等。本发明对异常Hb症或地中海贫血的简便、迅速且高灵敏度的诊断有用。
附图说明
图1是采用使用了含有TES洗脱液的阳离子交换色谱的实施例1中的HbA0、HbA2、HbS和HbC的分析结果。
图2是采用使用了含有Tricine洗脱液的阳离子交换色谱的实施例2中的HbA0、HbA2、HbS和HbC的分析结果。
图3是采用使用了含有Bicine洗脱液的阳离子交换色谱的实施例3中的HbA0、HbA2、HbS和HbC的分析结果。
图4是比较例5中的HbA0、HbA2和HbS的分析结果。
图5是比较例6中的HbA0、HbA2和HbS的分析结果。
图6是比较例7中的HbA0、HbA2和HbS的分析结果。
图7是比较例8中的HbA0、HbA2和HbS的分析结果。
具体实施方式
本说明书中所引用的全部专利文献、非专利文献和其它刊物在本说明书中作为参考援引其整体。
本发明的血红蛋白分析方法包括通过离子交换色谱来分离试样中的血红蛋白。作为该本发明的方法中使用的试样，可以使用通常的血红蛋白分析中使用的含有血红蛋白的血液试样。例如，可以使用将从人采取的血液进行溶血或稀释而得的血液试样。
本发明的方法中进行的色谱优选为液相色谱，更优选为高效液相色谱(HPLC)。本发明中的离子交换色谱可以使用与公知的液相色谱系统、即具备洗脱液送液用的泵、取样器、检测器等的系统连接的离子交换柱进行。
优选本发明的方法中进行的离子交换色谱为使用阳离子交换柱的阳离子交换色谱。本发明的方法中使用的阳离子交换柱只要为填充有具有阳离子交换基团的固定相的柱即可。作为该阳离子交换基团，可举出羧基、磷酸基、磺酸基等，其中，优选磺酸基。
作为该阳离子交换柱的固定相，可举出填充剂粒子、多孔体等，优选填充剂粒子。作为该填充剂粒子，可举出无机系粒子、有机系粒子等。作为该无机系粒子，可举出由二氧化硅、氧化锆等构成的粒子。作为该有机系粒子，可举出纤维素、聚氨基酸、壳聚糖等天然高分子粒子、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯等合成高分子粒子。作为具有该阳离子交换基团的固定相的优选的例子，可举出日本特开2011－047858号公报中公开的、包含将非交联性的亲水性丙烯酸系单体与聚缩水甘油醚类的混合物聚合而得到的交联聚合物粒子以及在该交联聚合物粒子的表面聚合且具有阳离子交换基团的丙烯酸系单体的层的填充剂。
在本发明的血红蛋白分析方法中，与以往的基于离子交换色谱的血红蛋白分析同样地，使试样中的血红蛋白吸附于离子交换柱后，使洗脱液在该柱中流动而使血红蛋白从该柱中洗脱，由此将试样中的血红蛋白分离。因此，本发明的血红蛋白分析方法中使用的洗脱液是用于通过离子交换色谱将血红蛋白分离的洗脱液。更优选该洗脱液是在阳离子交换色谱中用于将血红蛋白从阳离子交换柱中洗脱的洗脱液。
在本发明的血红蛋白分析方法中，与以往的血红蛋白分析方法相比，使用高pH且低渗透压的洗脱液。本发明中使用的该洗脱液优选pH为8.1以上。更详细而言，该洗脱液的pH优选为8.1以上，更优选为8.2以上，进一步优选为8.3以上，另一方面，优选为10.0以下，更优选为9.0以下，进一步优选为8.6以下。如果该洗脱液的pH小于8.1，则有时从柱中洗脱血红蛋白、特别是HbC变得不充分，另一方面，如果超过pH10，则有时特别是HbS与HbC的分离变得不充分。作为本发明中使用的该洗脱液的pH范围，可举出pH8.1～10.0、pH8.1～9.0、pH8.1～8.6、pH8.2～10.0、pH8.2～9.0、pH8.2～8.6、pH8.3～10.0、pH8.3～9.0和pH8.3～8.6。另一方面，以往的血红蛋白分析方法中使用的洗脱液的pH通常为pH5.0～8.0左右。
本发明中使用的该洗脱液的渗透压优选为40mOsm/kg以下。更详细而言，该洗脱液的渗透压优选为40mOsm/kg以下，更优选为37mOsm/kg以下，进一步优选为36mOsm/kg以下，另一方面，优选为15mOsm/kg以上，更优选为19mOsm/kg以上，进一步优选为26mOsm/kg以上。如果该洗脱液的渗透压小于15mOsm/kg，则有时血红蛋白、特别是HbA0和HbA2的洗脱变得不充分，另一方面，如果超过40mOsm/kg，则血红蛋白种类之间、特别是HbA0与HbA2的分离变差。作为本发明中使用的该洗脱液的渗透压的范围，可举出15～40mOsm/kg、15～37mOsm/kg、15～36mOsm/kg、19～40mOsm/kg、19～37mOsm/kg、19～36mOsm/kg、26～40mOsm/kg、26～37mOsm/kg和26～36mOsm/kg。另一方面，在以往的基于色谱的血红蛋白分离中，从调整渗透压的观点考虑，并未设计洗脱液的组成，并且以往使用的洗脱液的pH通常为125～570mOsm/kg左右。本说明书中的渗透压的值是指通过凝固点下降法测定的渗透压的值。渗透压可以使用市售的渗透压计、例如Osmometer 3250(Advanced Instruments制)等进行测定。另外，在本说明书中，渗透压的单位mOsm/kg是指mOsm/kgH2O，这有时也表述为mOsm/L或mOsm。
为了制备具有上述的pH和渗透压的范围的洗脱液，在本发明中，使该洗脱液含有不含金属离子的缓冲剂。磷酸缓冲液等以往的洗脱液中一般使用的缓冲液含有金属离子，因此，难以同时实现高pH性和低渗透压性。作为该不含金属离子的缓冲剂的例子，可举出古德缓冲剂，其中，优选Bicine(N,N－双(2－羟基乙基)甘氨酸)、Tricine(N－[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸)或TES(N－三(羟基甲基)甲基－2－氨基乙磺酸)，更优选TES。
本发明中使用的该洗脱液中的上述缓冲剂的浓度只要是在考虑后述的添加剂等的影响的基础上能够将最终的洗脱液的pH和渗透压调整为上述范围的浓度即可。该洗脱液中的该缓冲剂的浓度优选为2mmol/L以上，更优选为2.5mmol/L以上，进一步优选为5mmol/L以上，另一方面，优选为17mmol/L以下，更优选为15mmol/L以下，进一步优选为12.5mmol/L以下。作为本发明中使用的该洗脱液中的该缓冲剂的浓度的范围，可举出2～17mmol/L、2～15mmol/L、2～12.5mmol/L、2.5～17mmol/L、2.5～15mmol/L、2.5～12.5mmol/L、5～17mmol/L、5～15mmol/L和5～12.5mmol/L。
优选本发明中使用的该洗脱液为含有Bicine、Tricine或TES作为缓冲剂的溶液状的液体组合物。该洗脱液中的该缓冲剂的浓度为2～17mmol/L，该洗脱液的渗透压为15～40mOsm/kg且pH优选为8.1～10.0，更优选为pH8.2～9.0，进一步优选为pH8.2～8.6，更加优选为pH8.3～8.6。
更优选本发明中使用的该洗脱液含有Bicine、Tricine或TES作为缓冲剂，该洗脱液中的该缓冲剂的浓度为2.5～15mmol/L，该洗脱液的渗透压为15～37mOsm/kg且pH优选为8.1～10.0，更优选为pH8.2～9.0，进一步优选为pH8.2～8.6、更加优选为pH8.3～8.6。
进一步优选本发明中使用的该洗脱液含有Bicine、Tricine或TES作为缓冲剂，该洗脱液中的该缓冲剂的浓度为5～15mmol/L，该洗脱液的渗透压为19～37mOsm/kg且pH优选为8.1～10.0，更优选为pH8.2～9.0，进一步优选为pH8.2～8.6，更加优选为pH8.3～8.6。
进一步更优选本发明中使用的该洗脱液含有Bicine、Tricine或TES作为缓冲剂，该洗脱液中的该缓冲剂的浓度为5～15mmol/L，该洗脱液的渗透压为26～36mOsm/kg且pH优选为pH8.2～9.0，进一步优选为pH8.2～8.6，更加优选为pH8.3～8.6。
更加优选本发明中使用的该洗脱液含有Bicine、Tricine或TES作为缓冲剂，该洗脱液中的该缓冲剂的浓度为5～12.5mmol/L，该洗脱液的渗透压为26～36mOsm/kg且pH为pH8.3～8.6。
本发明中使用的该洗脱液除上述的缓冲剂以外，还可以含有溶剂和血红蛋白变性剂、与三价血红素铁的结合剂、pH调节剂、表面活性剂等添加剂。
优选本发明中使用的该洗脱液含有血红蛋白变性剂。血红蛋白变性剂只要是能够使血红蛋白的血红素铁从二价变为三价而生成高铁血红蛋白的氧化剂即可。作为这样的氧化剂的例子，可举出亚硝酸盐、铁氰化钾、亚甲蓝、过氧化氢、抗坏血酸、硫化氢等。其中，优选亚硝酸盐，更优选亚硝酸钠或亚硝酸钾。该洗脱液中的该血红蛋白变性剂的浓度优选为0.05～15mmol/L，更优选为1.0～10mmol/L。
另外，优选本发明中使用的该洗脱液含有与三价血红素铁的结合剂。该与三价血红素铁的结合剂使通过该血红蛋白变性剂而生成的高铁血红蛋白稳定化而使其洗脱行为稳定化。作为该与三价血红素铁的结合剂的例子，可举出叠氮化物、氰化物等。作为叠氮化物的例子，可举出叠氮化钠、二苯基磷酰叠氮化物、4－十二烷基苯磺酰叠氮化物、4－乙酰氨基苯磺酰叠氮化物、叠氮化钾、叠氮化锂、叠氮化铁、叠氮化氢、叠氮化铅、叠氮化汞、叠氮化铜、叠氮化银等。作为氰化物的例子，可举出氰化钾、氰化氢、氰化钠、氰化银、氰化汞、氰化铜、氰化铅、氰化铁、氰化锂、氰化铵等。优选该与三价血红素铁的结合剂为叠氮化物，更优选为叠氮化钠。该洗脱液中的该与三价血红素铁的结合剂的浓度优选为0.05～15mmol/L，更优选为0.5～10mmol/L。
作为该pH调节剂，可举出公知的酸和碱，作为酸的例子，可举出盐酸、磷酸、硝酸、硫酸等，作为碱的例子，可举出氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化钡、氢氧化钾等。
作为该溶剂，可举出甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等水溶性有机溶剂。该溶剂的浓度优选为盐等不会析出的程度，例如优选80％(v/v)以下，更优选的范围为0.1％(w/w)以上且50％(w/w)以下。
优选在本发明的血红蛋白分析方法中通过使用上述洗脱液的梯度洗脱来分离血红蛋白。优选在本发明的方法中将上述洗脱液设为洗脱液B(以下，称为B液，或简称为B)，将另一洗脱液设为洗脱液A(以下，称为A液，或简称为A)，以B液的比例阶段性地变高的方式在A液与B液之间施加梯度。
洗脱液A只要是包含含有公知的盐化合物的缓冲剂的洗脱液即可。作为该洗脱液A中可含有的缓冲剂的例子，可举出含有有机酸或无机酸的缓冲液。作为有机酸的例子，可举出柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸等和它们的盐，作为无机酸的例子，可举出盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、硼酸、乙酸、高氯酸等和它们的盐。该洗脱液A中使用的缓冲液可以组合含有这些有机酸和无机酸中的任1种或2种以上。其中，优选含有磷酸盐、琥珀酸盐或高氯酸盐的缓冲液。作为磷酸盐的例子，可举出钠盐和钾盐等，优选磷酸二氢钠、磷酸一氢钠。作为琥珀酸盐的例子，可举出钠盐和钾盐等，优选琥珀酸二氢钠、琥珀酸一氢钠。作为高氯酸盐的例子，可举出高氯酸钠。这些磷酸盐、琥珀酸盐和高氯酸盐可以单独使用，也可以并用2种以上。
洗脱液A除上述的缓冲剂以外，还可以含有与上述的洗脱液B中可含有的溶剂和添加剂同样的溶剂和添加剂(例如上述的血红蛋白变性剂、与三价血红素铁的结合剂、pH调节剂、表面活性剂等)。
洗脱液A的pH优选为5.0以上，更优选为5.2以上，优选为6.0以下，更优选为5.8以下。洗脱液A的pH范围优选为5.0～6.0，更优选为5.2～5.8。另外，洗脱液A的渗透压优选为130mOsm/kg以上，更优选为150mOsm/kg以上，优选为210mOsm/kg以下，更优选为190mOsm/kg以下。洗脱液A的渗透压的范围优选为130～210mOsm/kg，更优选为150～190mOsm/kg。在优选的实施方式中，洗脱液A为pH5.0～6.0且渗透压为130～210mOsm/kg，更优选为150～190mOsm/kg。在更优选的实施方式中，洗脱液A为pH5.2～5.8且渗透压为130～210mOsm/kg，更优选为150～190mOsm/kg。
优选在本发明的方法的梯度洗脱中，首先，用A液100％(B液0％)进行通液，接着施加梯度而使B液的比例增加，将B液的比例提高至100％。梯度的大小只要根据柱的性能等而适当调整即可，没有特别限定。梯度的一个例子为A：B＝100：0→使B的比例增加至50～98容量％(优选70～95容量％)→阶段性地进一步增加B的比例→A：B＝0：100。梯度的另一个例子为A：B＝100：0→以洗脱液整体的pH为6.5～8.0、渗透压为20～100mOsm/kg的方式使B的比例增加→阶段性地进一步增加B的比例→A：B＝0：100。根据需要，其后可以再次设置A：B＝100：0的通液时间。
在一个实施方式中，本发明的血红蛋白分析方法被利用于异常血红蛋白的检测。作为通过本发明的方法检测到的异常血红蛋白，可举出选自HbS、HbC、HbE、HbD和HbO－Arab中的至少1种，优选为选自HbC和HbS中的至少1种。在本发明的方法中，能够将上述举出的各种异常血红蛋白均通过一次分析而全部分离检测。
在另一个实施方式中，本发明的血红蛋白分析方法被利用于地中海贫血标记物的检测。作为通过本发明的方法检测到的地中海贫血标记物，可举出选自HbA2、HbF、HbH、HbBart’和HbConstant Spring中的至少1种，优选为HbA2。在本发明的方法中，能够将上述举出的各种地中海贫血标记物均通过一次分析而全部分离检测。
进而，在本发明的血红蛋白分析方法中，能够检测上述举出的异常血红蛋白和地中海贫血标记物这两者。进而，能够在检测该异常血红蛋白和/或地中海贫血标记物的同时检测HbA0或糖化血红蛋白HbA1c。因此，通过本发明的血红蛋白分析方法，能够一次分析试样中的异常血红蛋白和地中海贫血标记物的有无，进而也能够一次分析试样中的异常血红蛋白、地中海贫血标记物和HbA1c的有无。因此，本发明的方法能够通过一次分析来检测多种血红蛋白，因此，能够进行异常Hb症、地中海贫血的简便且迅速的诊断。
实施例
以下，通过实施例对本发明详细地进行说明，但本发明并不限定于以下的实施例。
(参考例1：血红蛋白分离用柱的制备)
在将作为非交联性的亲水性丙烯酸系单体的四乙二醇单甲基丙烯酸酯(日油株式会社制)200g和作为聚缩水甘油醚类的聚乙二醇二缩水甘油醚(日油株式会社制)200g而得的单体混合物中溶解作为聚合引发剂的过氧化苯甲酰(Nacalai Tesque公司制)1.0g。使得到的混合物分散于4重量％的聚乙烯醇(日本合成化学工业株式会社制、“Gohsenol GH－20”)水溶液5L，一边搅拌一边在氮气氛下加热到80℃，进行1小时聚合反应。将温度冷却到30℃后，将作为具有阳离子交换基团的丙烯酸系单体的2－甲基丙烯酰胺－2－甲基丙磺酸(东亚合成株式会社制)100g添加于反应体系，再次加热到80℃进行1小时聚合反应。将得到的交联聚合物粒子用离子交换水和丙酮进行清洗，由此得到导入有磺酸基的交联聚合物粒子。将得到的血红蛋白分离用柱填充剂充填于内径4mm、长度20mm的不锈钢制柱，制备血红蛋白分离用阳离子交换柱。
(参考例2：检体的制备)
检体A：将从健康人采取的血液检体用含有0.1％Triton X－100的磷酸缓冲液(pH7.00)适当稀释而制备检体。
检体B：将Lyphocheck(注册商标)Hemoglobin A2 Control Level 2(Bio－Rad公司制，含有HbA0、HbA2和HbS)用含有0.1％Triton X－100的磷酸缓冲液(pH7.00)适当稀释而制备检体。
检体C：将AFSC Hemocontrol(Helena研究所株式会社制，含有HbA0、HbS和HbC)用含有0.1％Triton X－100的磷酸缓冲液(pH7.00)适当稀释而制备检体。
检体D：将Hemoglobin A2(Sigma Aldrich公司制，含有HbA2)用含有0.1％TritonX－100的磷酸缓冲液(pH7.00)释放稀释而制备检体。
(试验1)
对参考例2中制备的检体A～C进行血红蛋白分析。将分析条件示于以下。
HPLC装置：Prominence20A系列(岛津制作所株式会社制)
检测器：SPD－M20A(岛津制作所株式会社制)
送液泵：LC－20AD(岛津制作所株式会社制)
脱气单元：DGU－20A5R(岛津制作所株式会社制)
柱温箱：CTO－20AC(岛津制作所株式会社制)
自动取样器：SIL－20AC(岛津制作所株式会社制)
柱：参考例1中制作的血红蛋白分离用阳离子交换柱
流速：1.1mL/min
检测波长：415nm
试样注入量：10μL
洗脱液
洗脱液A：含有40mmol/L琥珀酸钠、45mmol/L高氯酸钠、1mmol/L叠氮化钠的缓冲液(pH5.3、渗透压170mOsm/kg)
洗脱液B：洗脱液B1～B6(表1)
梯度：如表2所示
pH计：F-52(堀场制作所制)
渗透压计：Osmometer 3250(Advanced Instruments制)
[表1]
Figure BDA0002725912520000111
Figure BDA0002725912520000112
*用1N氢氧化钠水溶液调整
[表2]
梯度
Figure BDA0002725912520000121
将实施例1～6中的检体A～C的分析结果示于表3。另外，将实施例1、2和3中得到的检体A～C的色谱图分别示于图1、图2和图3。在实施例1～6中，HbA0、HbA2、HbS和HbC分别作为单独的峰被检测出。根据本结果，显示出通过使用含有缓冲剂TES、Tricien或Bicine的洗脱液，能够检测HbA0、HbA2、HbS和HbC。
[表3]
Figure BDA0002725912520000122
+检测出峰，-无法检测出峰
(试验2)
对参考例2中制备的检体A～C进行血红蛋白分析。洗脱液B和梯度条件以外的条件与试验1同样。作为洗脱液B，使用表4～6中记载的洗脱液。梯度条件是以HbA0在2.1分钟内洗脱的方式适当决定洗脱液A和洗脱液B的混合比例。另外，为了确认HbC洗脱，适当延长洗脱液B浓度100％的时间。
将分析结果示于表4～6。如表6所示，在使用pH8.0的洗脱液B的比较例1～3中，未检测出HbC。另外，在使用渗透压超过40mOsm/kg的洗脱液B的比较例3～4中，HbA2与HbA0的峰肩重叠，两种峰未被充分分离。另一方面，如表4～5所示，在使用pH高于8.0且渗透压为40mOsm/kg以下的实施例7～18中，分别检测出HbA0、HbA2、HbS和HbC。但是，在实施例10、11中，发现HbA2的洗脱稍快、HbA0与HbA2的峰接近的趋势(未示出数据)。根据这些结果，显示出pH8.1以上且渗透压40mOsm/kg以下的洗脱液B适于各种血红蛋白的分析。
[表4]
Figure BDA0002725912520000131
*用1N氢氧化钠水溶液调整
+检测出峰，-无法检测出峰
[表5]
Figure BDA0002725912520000141
*用1N氢氧化钠水溶液调整
+检测出峰，-无法检测出峰
[表6]
Figure BDA0002725912520000142
*用1N氢氧化钠水溶液调整
+检测出峰，-无法检测出峰
(试验3)
对参考例2中制备的检体B和检体D进行血红蛋白分析。梯度和洗脱液B以外的分析条件与试验1相同。洗脱液B使用具有表7中记载的pH和渗透压的含有磷酸钠和高氯酸钠的缓冲液的洗脱液。应予说明，表7中记载的洗脱液的组成基于以往的血红蛋白分析中一般使用的含有磷酸缓冲液的洗脱液的组成。梯度条件如表8所示。
将分析结果示于表7。另外，将比较例5～8的色谱图示于图4～7。检体B中含有5～7质量％左右的HbA2，但在比较例5～8中，HbA0的峰与HbA2的峰重叠，两种峰未被充分分离。根据该结果，显示出采用pH8.0以下、渗透压为130mOsm/kg以上这样的以往使用的洗脱液无法充分地检测HbA0和HbA2。
[表7]
Figure BDA0002725912520000151
*用1N氢氧化钠水溶液调整
+检测出峰，-无法检测出峰
[表8]
梯度
Figure BDA0002725912520000161
(试验4)
使用表9中记载的含有磷酸缓冲液的洗脱液B对参考例2中制备的检体A～C进行血红蛋白分析。洗脱液B以外的条件与试验2同样。作为洗脱液B，使用表9中记载的含有磷酸缓冲液的洗脱液。
将分析结果示于表9。在比较例9、10中，HbA0与HbA2的峰的分离不充分，进而未检测出HbS和HbC中的任一者或两者。在比较例11～14中，虽然检测出HbS和HbC，但HbA0与HbA2的峰的分离不充分。比较例9～14的洗脱液B与上述的实施例的洗脱液相比，渗透压高，另外，pH也更高或更低，因此，无法实现pH8.0以上、渗透压40mOsm/kg以下的条件。认为这导致比较例9～14中的不充分的血红蛋白检测。
[表9]
Figure BDA0002725912520000171
*用1N氢氧化钠水溶液调整
+检测出峰，-无法检测出峰
(试验5)
对参考例2中制备的检体A～C进行血红蛋白分析。洗脱液B和梯度条件以外的条件与试验1同样。作为洗脱液B，使用表10中记载的洗脱液。梯度条件如表11所示。将分析结果示于表10。实施例19和20这两者中，HbA0和HbA2的峰被良好地分离，且HbS和HbC的峰也被良好地分离，能够检测出HbA0、HbA2、HbS和HbC。
[表10]
Figure BDA0002725912520000181
*用1N氢氧化钠水溶液调整
+检测出峰，-无法检测出峰
[表11]
梯度
Figure BDA0002725912520000182

Claims (21)

1.一种血红蛋白分析方法，包括通过阳离子交换色谱来分离试样中的血红蛋白，
在该血红蛋白的分离中，使用pH为8.1以上、渗透压为40mOsm/kg以下的洗脱液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述洗脱液含有不含金属离子的缓冲剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述缓冲剂为Bicine、Tricine或TES。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述洗脱液中的所述缓冲剂的浓度为2～17mmol/L。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述洗脱液含有血红蛋白变性剂。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，通过使用所述洗脱液的梯度洗脱来分离血红蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，在所述梯度中所述洗脱液的比例从0％增加至100％。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，将选自HbS、HbC、HbE、HbD和HbO－Arab中的至少1种异常血红蛋白分离。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，将选自HbA2、HbF、HbH、HbBart’和HbConstant Spring中的至少1种地中海贫血标记物分离。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述色谱为高效液相色谱。
11.一种基于阳离子交换色谱的血红蛋白分离用洗脱液，pH为8.1以上，渗透压为40mOsm/kg以下。
12.根据权利要求11所述的洗脱液，其中，含有不含金属离子的缓冲剂。
13.根据权利要求12所述的洗脱液，其中，所述缓冲剂为Bicine、Tricine或TES。
14.根据权利要求12或13所述的洗脱液，其中，所述洗脱液中的所述缓冲剂的浓度为2～17mmol/L。
15.根据权利要求11～14中任一项所述的洗脱液，其中，所述洗脱液含有血红蛋白变性剂。
16.一种pH为8.1以上、渗透压为40mOsm/kg以下的液体组合物的作为基于阳离子交换色谱的血红蛋白分离用洗脱液的应用。
17.一种pH为8.1以上、渗透压为40mOsm/kg以下的液体组合物的用于制造基于阳离子交换色谱的血红蛋白分离用洗脱液的应用。
18.根据权利要求16或17所述的应用，其中，所述液体组合物含有不含金属离子的缓冲剂。
19.根据权利要求18所述的应用，其中，所述缓冲剂为Bicine、Tricine或TES。
20.根据权利要求18或19所述的应用，其中，所述液体组合物中的所述缓冲剂的浓度为2～17mmol/L。
21.根据权利要求16～20中任一项所述的应用，其中，所述液体组合物含有血红蛋白变性剂。
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