CN105223299A - 测定方法、测定装置及洗脱液 - Google Patents

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Abstract

本发明提供对选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白进行测定的测定方法、测定装置及洗脱液。对选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白进行测定的测定方法中，在高效液相色谱中，使用以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.5质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1为0.4以上且10以下的洗脱液(洗脱液L)。

Description

测定方法、测定装置及洗脱液
技术领域
本发明涉及测定各种血红蛋白类的测定方法、测定装置及测定各种血红蛋白类时使用的洗脱液。
背景技术
血红蛋白类、其中作为血红蛋白与葡萄糖结合而得到的糖化蛋白的糖化血红蛋白(HbA1c)反映过去1～2个月间的平均血糖水平，因此，广泛用于包括糖尿病、代谢综合征在内的生活习惯病的检查和血糖管理等。因此，要求容易且高精度地测定HbA1c等血红蛋白类的方法。
作为HbA1c的测定方法，可以列举高效液相色谱(HPLC)法、免疫法、酶法、电泳法等。其中，作为HbA1c的标准测定法，在临床检查领域中多采用HPLC法。
作为使用HPLC法来对血红蛋白类进行分离、测定的方法，可以列举各种方法。例如，在专利文献1中公开了一种血红蛋白类的分析方法，向具备羧基或羧烷基作为离子交换基团的分离用柱供给磷酸系缓冲液作为洗脱液来对试样中的血红蛋白类进行分析，该方法中，将含有S-(羧烷基)-L-半胱氨酸且含有磷酸系缓冲物质的液体供给至上述分离用柱。专利文献1的技术中，据说能够对HbA1c、HbF、HbA0这样的血红蛋白类进行分离。
另外，专利文献2中公开了使用含有多糖类的缓冲液作为缓冲液的血红蛋白类的测定方法。专利文献2的技术中，据说能够对HbA1c、HbF、HbA2和异常血红蛋白(HbS、HbC)进行测定、分离。此外，专利文献2中，以高效液相色谱为原理且以上述异常血红蛋白的测定为目的的测定装置具有两个向柱输送洗脱液的送液泵，一个送液泵上连接一种洗脱液罐，使用改变两种洗脱液的混合比而向柱输送洗脱液的梯度方式。
专利文献1：日本特开平5-281222号公报
专利文献2：日本特开2009-236768号公报
发明内容
发明所要解决的问题
专利文献1的技术中，无法实现HbA1c、HbF、HbA0以外的血红蛋白类的分离，专利文献2的技术中，HbA1c、HbF、HbA2以外的血红蛋白类的分离局限于HbS和HbC。因此，在上述现有技术以外，要求以高精度测定各种血红蛋白类的测定方法、测定装置及以高精度测定各种血红蛋白类时使用的洗脱液。
本发明的目的在于提供能够对选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白进行测定的测定方法、测定装置及洗脱液。
用于解决问题的方法
用于实现上述目的的具体方法如下所述。
＜1＞本发明的一个方式为一种测定方法，其中，在高效液相色谱中，使用以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.50质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1が0.4以上且10以下的洗脱液(洗脱液L)，由此对选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白进行测定。
＜2＞本发明的一个方式为一种测定方法，其中，在高效液相色谱中，使用以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率低于0.07质量％、成分2的含有率超过1.4质量％且在2.0质量％以下、成分2/成分1超过20的洗脱液(洗脱液O)，由此对选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白进行测定。
＜3＞本发明的一个方式为一种测定方法，其中，在高效液相色谱中，使用以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.40质量％以上且低于1.04质量％、成分2的含有率超过0.26质量％且在0.88质量％以下、成分2/成分1超过0.25且在2.2以下的洗脱液(洗脱液M)，由此对选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白进行测定。
＜4＞本发明的一个方式为一种对选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白进行测定的测定方法，其中，在高效液相色谱中，组合输送选自由以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.50质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1为0.4以上且10以下的洗脱液(洗脱液L)、以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率低于0.07质量％、成分2的含有率超过1.4质量％且在2.0质量％以下、成分2/成分1超过20的洗脱液(洗脱液O)、和以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.4质量％以上且低于1.04质量％、成分2的含有率超过0.26质量％且在0.88质量％以下、成分2/成分1超过0.25且在2.2以下的洗脱液(洗脱液M)组成的组中的至少两种洗脱液。
＜5＞本发明的一个方式为上述＜4＞所述的测定方法，其中，基于下述(I)～(III)中的任意一个输送洗脱液：
(I)输送选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的至少一种洗脱液，或者将选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的至少两种洗脱液不混合而依次进行输送；
(II)输送将选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的两种以上的洗脱液混合而形成的至少一种混合液；
(III)依次输送选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的至少一种洗脱液以及将选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的两种以上的洗脱液混合而形成的至少一种混合液。
＜6＞本发明的一个方式为上述＜4＞或上述＜5＞所述的测定方法，其中，至少输送将上述洗脱液O和上述洗脱液M中的至少一种洗脱液与上述洗脱液L混合而形成的至少一种混合液。
＜7＞本发明的一个方式为上述＜4＞～上述＜6＞中任一项所述的测定方法，其中，输送将上述洗脱液L、上述洗脱液L和上述洗脱液O混合而形成的混合液、以及将上述洗脱液M和上述洗脱液L混合而形成的混合液。
＜8＞本发明的一个方式为上述＜7＞所述的测定方法，其中，所测定的血红蛋白类为HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种。
＜9＞本发明的一个方式为上述＜1＞、上述＜4＞～上述＜8＞中任一项所述的测定方法，其中，使用上述洗脱液L，上述洗脱液L的渗透压为35mOsm以上且200mOsm以下。
＜10＞本发明的一个方式为上述＜2＞、上述＜4＞～上述＜8＞中任一项所述的测定方法，其中，使用上述洗脱液O，上述洗脱液O的渗透压为170mOsm以上且290mOsm以下。
＜11＞本发明的一个方式为上述＜3＞～上述＜8＞中任一项所述的测定方法，其中，使用上述洗脱液M，上述洗脱液M的渗透压为160mOsm以上且210mOsm以下。
＜12＞本发明的一个方式为上述＜5＞～上述＜8＞中任一项所述的测定方法，其中，使用将上述洗脱液L和上述洗脱液O混合而形成的混合液，上述混合液的混合比为洗脱液L:洗脱液O＝1:2～1:4。
＜13＞本发明的一个方式为上述＜5＞～上述＜8＞中任一项所述的测定方法，其中，使用将上述洗脱液M和上述洗脱液L混合而形成的混合液，上述混合液的混合比为洗脱液M:洗脱液L＝1:2～1:4。
＜14＞本发明的一个方式为上述＜1＞～上述＜13＞中任一项所述的测定方法，其中，进一步使用pH为5.30以上且5.40以下、渗透压为204mOsm以上且210mOsm以下的洗脱液(洗脱液A)。
＜15＞本发明的一个方式为上述＜1＞～上述＜14＞中任一项所述的测定方法，其中，进一步使用pH为7.85以上且8.25以下、渗透压为350mOsm以上且600mOsm以下的洗脱液(洗脱液B)。
＜16＞本发明的一个方式为上述＜1＞～上述＜13＞中任一项所述的测定方法，其中，进一步使用将pH为7.85以上且8.25以下、渗透压为350mOsm以上且600mOsm以下的洗脱液(洗脱液B)和pH为5.30以上且5.40以下、渗透压为204mOsm以上且210mOsm以下的洗脱液(洗脱液A)以混合比为洗脱液B:洗脱液A＝1:2～1:4的方式混合而形成的混合液。
＜17＞本发明的一个方式为上述＜16＞所述的测定方法，其中，所测定的血红蛋白类为HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种。
＜18＞本发明的一个方式为一种测定装置，用于对血红蛋白类进行测定，其具备：
送液泵，在高效液相色谱中，将选自由以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.50质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1为0.4以上且10以下的洗脱液(洗脱液L)、以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率低于0.07质量％、成分2的含有率超过1.4质量％且在2.0质量％以下、成分2/成分1超过20的洗脱液(洗脱液O)、和以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.40质量％以上且低于1.04质量％、成分2的含有率超过0.26质量％且在0.88质量％以下、成分2/成分1超过0.25且在2.2以下的洗脱液(洗脱液M)组成的组中的洗脱液单独输送或组合输送；以及
分离用柱，与上述送液泵连接而被输送上述洗脱液。
＜19＞本发明的一个方式为上述＜18＞所述的测定装置，其中，上述送液泵基于下述(I)～(III)中的任意一个输送洗脱液：
(I)输送选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的至少一种洗脱液，或者将选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的至少两种洗脱液不混合而依次进行输送；
(II)输送将选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的两种以上的洗脱液混合而形成的至少一种混合液；
(III)依次输送选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的至少一种洗脱液以及将选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的两种以上的洗脱液混合而形成的至少一种混合液。
＜20＞本发明的一个方式为上述＜18＞或上述＜19＞所述的测定装置，其中，进一步输送作为上述洗脱液的pH为5.30以上且5.40以下、渗透压为204mOsm以上且210mOsm以下的洗脱液(洗脱液A)、和pH为7.85以上且8.25以下、渗透压为350mOsm以上且600mOsm以下的洗脱液(洗脱液B)中的至少一种，或者，进一步输送将上述洗脱液A和上述洗脱液B混合而形成的混合液。
＜21＞本发明的一个方式为上述＜18＞～上述＜20＞中任一项所述的测定装置，其中，上述送液泵为一个。
＜22＞本发明的一个方式为一种在高效液相色谱中用于测定选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的、以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.50质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1为0.4以上且10以下的洗脱液(洗脱液L)。
＜23＞本发明的一个方式为一种在高效液相色谱中用于测定选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的、以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率低于0.07质量％、成分2的含有率超过1.4质量％且在2.0质量％以下、成分2/成分1超过20的洗脱液(洗脱液O)。
＜24＞本发明的一个方式为一种在高效液相色谱中用于测定选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的、以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.40质量％以上且低于1.04质量％、成分2的含有率超过0.26质量％且在0.88质量％以下、成分2/成分1超过0.25且在2.2以下的洗脱液(洗脱液M)。
＜25＞本发明的一个方式为上述＜22＞～上述＜24＞中任一项所述的洗脱液，其中，所测定的血红蛋白类为HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种。
＜26＞本发明的一个方式为上述＜22＞所述的洗脱液，其中，上述洗脱液L的渗透压为35mOsm以上且200mOsm以下。
＜27＞本发明的一个方式为上述＜23＞所述的洗脱液，其中，上述洗脱液O的渗透压为170mOsm以上且290mOsm以下。
＜28＞本发明的一个方式为上述＜24＞所述的洗脱液，其中，上述洗脱液M的渗透压为160mOsm以上且210mOsm以下。
＜29＞本发明的一个方式为上述＜22＞～上述＜28＞中任一项所述的洗脱液，其中，所测定的血红蛋白类为HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种。
＜30＞本发明的一个方式为一种洗脱液的组合，包含选自由在高效液相色谱中用于测定选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的、以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.50质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1为0.4以上且10以下的洗脱液(洗脱液L)、以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率低于0.07质量％、成分2的含有率超过1.4质量％且在2.0质量％以下、成分2/成分1超过20的洗脱液(洗脱液O)、和以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.40质量％以上且低于1.04质量％、成分2的含有率超过0.26质量％且在0.88质量％以下、成分2/成分1超过0.25且在2.2以下的洗脱液(洗脱液M)组成的组中的至少两种洗脱液。
＜31＞本发明的一个方式为上述＜30＞所述的洗脱液的组合，其中，选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的至少两种洗脱液为非混合状态。
＜32＞本发明的一个方式为上述＜30＞所述的洗脱液的组合，其由以下的满足(a)的洗脱液和满足(b)的混合液构成，上述满足(a)的洗脱液和上述满足(b)的混合液符合非混合状态和混合状态中的至少任意一种状态：
(a)选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的至少一种洗脱液；
(b)将选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的两种以上的洗脱液混合而形成的至少一种混合液。
＜33＞本发明的一个方式为上述＜30＞所述的洗脱液的组合，其包含上述洗脱液L、将上述洗脱液L和上述洗脱液O混合而形成的混合液以及将上述洗脱液M和上述洗脱液L混合而形成的混合液。
＜34＞本发明的一个方式为上述＜30＞～上述＜33＞中任一项所述的洗脱液的组合，其中，所测定的血红蛋白类为HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种。
＜35＞本发明的一个方式为上述＜30＞～上述＜34＞中任一项所述的洗脱液的组合，其中，包含上述洗脱液L，上述洗脱液L的渗透压为35mOsm以上且200mOsm以下。
＜36＞本发明的一个方式为上述＜30＞～上述＜35＞中任一项所述的洗脱液的组合，其中，包含上述洗脱液O，上述洗脱液O的渗透压为170mOsm以上且290mOsm以下。
＜37＞本发明的一个方式为上述＜30＞～上述＜36＞中任一项所述的洗脱液的组合，其中，包含上述洗脱液M，上述洗脱液M的渗透压为160mOsm以上且210mOsm以下。
＜38＞本发明的一个方式为上述＜30＞～上述＜37＞中任一项所述的洗脱液的组合，其中，包含将上述洗脱液L和上述洗脱液O混合而形成的混合液，上述混合液的混合比为洗脱液L:洗脱液O＝1:2～1:4。
＜39＞本发明的一个方式为上述＜30＞～上述＜38＞中任一项所述的洗脱液的组合，其中，包含将上述洗脱液M和上述洗脱液L混合而形成的混合液，上述混合液的混合比为洗脱液M:洗脱液L＝1:2～1:4。
＜40＞本发明的一个方式为上述＜30＞～上述＜39＞中任一项所述的洗脱液的组合，其中，所测定的血红蛋白类为HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种。
＜41＞本发明的一个方式为上述＜30＞所述的组合中将选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的两种以上的洗脱液混合而形成的至少一种混合液。
＜42＞本发明的一个方式为上述＜41＞所述的混合液，其为将上述洗脱液O和上述洗脱液M中的至少一种洗脱液与上述洗脱液L混合而形成的至少一种。
＜43＞本发明的一个方式为上述＜41＞或上述＜42＞所述的混合液，其中，所测定的血红蛋白类为HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种。
＜44＞本发明的一个方式为上述＜41＞～上述＜43＞中任一项所述的混合液，其中，包含上述洗脱液L，上述洗脱液L的渗透压为35mOsm以上且200mOsm以下。
＜45＞本发明的一个方式为上述＜41＞～上述＜44＞中任一项所述的混合液，其中，包含上述洗脱液O，上述洗脱液O的渗透压为170mOsm以上且290mOsm以下。
＜46＞本发明的一个方式为上述＜41＞～上述＜45＞中任一项所述的混合液，其中，包含上述洗脱液M，上述洗脱液M的渗透压为160mOsm以上且210mOsm以下。
＜47＞本发明的一个方式为上述＜41＞～上述＜46＞中任一项所述的混合液，其将上述洗脱液L和上述洗脱液O混合而形成，混合比为洗脱液L:洗脱液O＝1:2～1:4。
＜48＞本发明的一个方式为上述＜41＞～上述＜47＞中任一项所述的混合液，其将上述洗脱液M和上述洗脱液L混合而形成，混合比为洗脱液M:洗脱液L＝1:2～1:4。
＜49＞本发明的一个方式为上述＜41＞～上述＜48＞中任一项所述的混合液，其中，所测定的血红蛋白类为HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种。
＜50＞本发明的一个方式为上述＜1＞～上述＜17＞中任一项所述的测定方法，其中，将上述洗脱液输送到分离用柱。
＜51＞本发明的一个方式为上述＜50＞所述的测定方法，其中，将上述洗脱液输送到上述分离用柱时的流速为0.001ml/分钟以上。
＜52＞本发明的一个方式为上述＜50＞或上述＜51＞所述的测定方法其中，将上述洗脱液输送到上述分离用柱时的流速为5.0ml/分钟以下。
＜53＞本发明的一个方式为上述＜5＞～＜8＞、＜12＞、＜13＞、＜16＞及び＜17＞中任一项所述的测定方法，其中，将上述混合液输送到分离用柱。
＜54＞本发明的一个方式为上述＜53＞所述的测定方法，其中，将上述混合液输送到上述分离用柱时的流速为0.001ml/分钟以上。
＜55＞本发明的一个方式为上述＜53＞或上述＜54＞所述的测定方法，其中，将上述混合液输送到上述分离用柱时的流速为5.0ml/分钟以下。
＜56＞本发明的一个方式为上述＜18＞～上述＜21＞中任一项所述的测定装置，其中，将上述洗脱液输送到上述分离用柱时的流速为0.001ml/分钟以上。
＜57＞本发明的一个方式为上述＜18＞～上述＜21＞和上述＜56＞中任一项所述的测定装置，其中，将上述洗脱液输送到上述分离用柱时的流速为5.0ml/分钟以下。
＜58＞本发明的一个方式为上述＜19＞或上述＜20＞所述的测定装置，其中，将上述混合液输送到上述分离用柱时的流速为0.001ml/分钟以上。
＜59＞本发明的一个方式为上述＜19＞、上述＜20＞及び上述＜58＞中任一项所述的测定装置，其中，将上述混合液输送到上述分离用柱时的流速为5.0ml/分钟以下。
＜60＞本发明的一个方式为上述＜18＞～上述＜21＞和上述＜56＞～上述＜59＞中任一项所述的测定装置，其中，上述分离用柱为阳离子交换柱。
＜61＞本发明的一个方式为上述＜60＞所述的测定装置，其中，上述阳离子交换柱的阳离子交换基团为磺基、羧基和磷酸基中的至少任意一种。
＜62＞本发明的一个方式为上述＜60＞所述的测定装置，其中，上述阳离子交换柱的阳离子交换基团为磺基。
＜63＞本发明的一个方式为上述＜18＞～上述＜21＞和上述＜56＞～上述＜62＞中任一项所述的测定装置，其中，上述分离用柱的柱填充剂为聚合物凝胶或无机系凝胶。
＜64＞本发明的一个方式为上述＜63＞所述的测定装置，其中，上述柱填充剂为聚合物凝胶，上述聚合物凝胶为甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物。
＜65＞本发明的一个方式为上述＜18＞～上述＜21＞和上述＜56＞～上述＜64＞中任一项所述的测定装置，其中，上述分离用柱的长度为1mm以上。
＜66＞本发明的一个方式为上述＜18＞～上述＜21＞和上述＜56＞～上述＜65＞中任一项所述的测定装置，其中，上述分离用柱的长度为300mm以下。
＜67＞本发明的一个方式为上述＜18＞～上述＜21＞和上述＜56＞～上述＜66＞中任一项所述的测定装置，其中，上述分离用柱的内径为0.1mm以上。
＜68＞本发明的一个方式为上述＜18＞～上述＜21＞和上述＜56＞～上述＜67＞中任一项所述的测定装置，其中，上述分离用柱的内径为50mm以下。
＜69＞本发明的一个方式为上述＜18＞～上述＜21＞和上述＜56＞～上述＜68＞中任一项所述的测定装置，其中，上述分离用柱中的柱填充剂的平均粒径为0.1μm以上。
＜70＞本发明的一个方式为上述＜18＞～上述＜21＞和上述＜56＞～上述＜69＞中任一项所述的测定装置，其中，上述分离用柱中的柱填充剂的平均粒径为50μm以下。
发明效果
根据本发明的一个方式，可以提供能够对选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白进行测定的测定方法、测定装置及洗脱液。
附图说明
图1表示测定本实施方式的血红蛋白类的测定装置。
图2表示实施例1中使用健康人样本作为测定试样时的测定结果。
图3表示实施例1中使用含有HbBart’s、HbF、HbA0、HbE、HbD、HbS、HbC和HbCS的样本作为测定试样时的测定结果。
图4表示实施例1中使用含有HbBart’s和HbH的样本时的测定结果。
图5表示实施例2中使用含有HbBart’s、HbF、HbA1c、HbA0、HbE、HbD、HbS、HbC和HbCS的样本作为测定试样时的测定结果。
图6表示实施例3中使用含有HbE的样本和健康人样本作为测定试样时的测定结果。
图7表示实施例4中使用含有HbE的样本和健康人样本作为测定试样且使用比较洗脱液L代替洗脱液L时的测定结果。
图8表示实施例5中使用含有HbBart’s的样本作为测定试样时的测定结果。
图9表示实施例6中使用含有HbBart’s的样本作为测定试样且使用比较洗脱液O代替洗脱液O时的测定结果。
图10表示实施例7中使用含有HbS、HbC的样本和含有HbCS的样本作为测定试样时的测定结果。
图11表示实施例8中使用含有HbS、HbC的样本和含有HbCS的样本作为测定试样且使用比较洗脱液M代替洗脱液M时的测定结果。
图12表示洗脱液L的渗透压与pH的关系。
图13表示洗脱液L的渗透压与成分2/成分1的关系。
图14表示洗脱液M的渗透压与pH的关系。
图15表示洗脱液M的渗透压与成分2/成分1的关系。
图16表示洗脱液O的渗透压与pH的关系。
图17表示洗脱液O的渗透压与成分2/成分1的关系。
图18表示洗脱液B的渗透压与pH的关系。
标号说明
1洗脱液
2切换阀
3送液泵
4压力计
5进样阀
6自动进样器
7分离用柱
8检测器
9废液容器
10测定装置
具体实施方式
以下，对本发明的一个方式的测定方法的实施方式进行详细说明。
本发明的一个方式的测定方法的一个方式中，在高效液相色谱(HPLC)中，将洗脱液单独使用或者将多种洗脱液混合使用，由此，能够对糖化血红蛋白(HbA1c)、血红蛋白A0(HbA0)、突变血红蛋白(突变Hb)和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白的至少一种血红蛋白进行测定。需要说明的是，作为高效液相色谱法，可以列举例如阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、分配色谱法、反相分配色谱法、亲和色谱法、凝胶过滤色谱法等。
HbA1c是血红蛋白与葡萄糖结合而得到的糖化蛋白的一种，被视为糖尿病诊断的指标。另外，HbA0占血液试样中的血红蛋白的大部分，在健康人中占全部血红蛋白的约90％。此外，作为健康人中含有的血红蛋白，存在HbF、HbA2等。
作为突变Hb，可以列举HbE、HbS、HbD、HbC等。根据洗脱液或将多种洗脱液混合而形成的混合液的pH、渗透压、各成分的浓度等，能够测定的突变Hb有所不同。
另外，本发明的一个方式的测定方法的一个方式中，在高效液相色谱中，将洗脱液单独使用或者将多种洗脱液混合使用，由此，能够进行作为地中海贫血的标志物的血红蛋白的测定。作为地中海贫血的标志物的血红蛋白可以列举HbBart’s、HbH、HbConstantSpring(以下也称为“HbCS”)。
需要说明的是，以下将HbA1c、HbA0、HbF、HbA2、突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白总称为“血红蛋白类”。
本发明的一个方式的测定方法中，如上所述的各种血红蛋白类作为测定的对象。而且，能够进行上述的专利文献1和专利文献2的技术中不作为分离、测定对象的血红蛋白类的分离、测定。
作为本发明的一个方式中使用的试样，是指由试样原料制备的试样。作为试样原料，是含有血红蛋白类的生物体试样。作为生物体试样，包括血液、包含红细胞成分的血液来源物、唾液、髓液等。作为血液，可以列举从生物体采集的血液，优选动物的血液，更优选哺乳类的血液，进一步优选人的血液。作为包含红细胞成分的血液来源物，可以列举由血液分离或制备且包含红细胞成分的物质，可以列举例如除去血浆后的血球级分、血球浓缩物、血液或血球的冷冻干燥物、对全血进行溶血处理而得到的溶血试样、离心分离血液、自然沉淀血液等。
本发明的一个方式中使用的试样可以是对试样原料进行稀释而得到的试样。另外，作为试样中的试样原料的浓度(含量)，从抑制血红蛋白的变性的观点出发，优选为1质量％以上且30质量％以下。
(洗脱液L)
本发明的一个方式的测定方法中使用的洗脱液L是以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.50质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1为0.4以上且10以下的洗脱液。
通过将洗脱液L单独使用或者与其他洗脱液组合来用于血红蛋白类的测定，能够对突变血红蛋白、作为地中海贫血的标志物的血红蛋白等进行测定。另外，例如，能够对正常血红蛋白、突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少两种血红蛋白同时进行测定，能够一次性测定例如HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC、HbConstantSpring等血红蛋白类中的至少一种，特别是能够一次性测定HbBart’s、HbH、HbF、HbA0、HbE、HbA2、HbD、HbS等血红蛋白类中的至少一种。单独使用洗脱液L，特别是能够一次性测定HbA0、HbE、HbA2、HbD等血红蛋白类。需要说明的是，比测定对象的Hb先溶出的Hb可以根据需要利用其他洗脱液使其溶出。
需要说明的是，本发明的一个方式的血红蛋白类的测定方法中，将试样注入到分离用柱中后，将洗脱液供给至分离用柱，由此，根据供给的洗脱液对试样中含有的血红蛋白进行分离、测定。
另外，在输送洗脱液L来对例如HbA0、HbE、HbD进行分离的情况下，例如使这些血红蛋白类从分离用柱溶出的时间不重叠，由此，能够根据测定时间对各血红蛋白类高精度地进行分离。此外，在输送洗脱液L来对例如HbA0、HbA2、HbD进行分离的情况下，也例如使这些血红蛋白类从分离用柱溶出的时间不重叠，由此，能够根据测定时间对各血红蛋白类高精度地进行分离。
作为洗脱液L的成分1和成分2的比率，只要满足上述的数值范围则没有限定，关于成分1的含有率，优选为0.15质量％以上且0.40质量％以下，更优选为0.20质量％以上且0.29质量％以下，进一步优选为0.20质量％以上且0.27质量％以下，关于成分2的含有率，优选为0.35质量％以上且1.05质量％以下，更优选为0.60质量％以上且0.70质量％以下。成分2/成分1优选为1.4以上且7.0以下，更优选为2.2以上且3.5以下。
洗脱液L的渗透压优选为35mOsm以上且200mOsm以下，更优选为80mOsm以上且185mOsm以下，进一步优选为125mOsm以上且140mOsm以下。洗脱液L、以下所示的各洗脱液的渗透压可以通过改变磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)的浓度来进行调节。
洗脱液L的pH优选为5.5以上且7.4以下，更优选为5.8以上且6.7以下，进一步优选为6.2以上且6.4以下。
洗脱液L优选通过在上述的成分1和成分2以外加入其他添加物来制备。作为其他添加物，可以添加例如缓冲剂、无机盐类、pH调节剂、水溶性有机溶剂、防腐剂、血红蛋白稳定剂、离液离子等。另外，洗脱液L可以利用蒸馏水等进行稀释。
作为添加到洗脱液L中的缓冲剂，可以列举例如磷酸、硼酸、碳酸等无机物、以及羧酸、二元羧酸、羧酸衍生物、羟基羧酸、苯胺或苯胺衍生物、氨基酸、胺类、咪唑类、醇类等有机物。另外，还可以是乙二胺四乙酸、焦磷酸、吡啶、卡可基酸、甘油磷酸、2,4,6-三甲基吡啶、N-乙基吗啉、吗啉、4-氨基吡啶、氨、麻黄碱、羟基脯氨酸、哌啶、三(羟基甲基)氨基甲烷、双甘氨肽等有机物。洗脱液L中的缓冲剂的含量只要是具有缓冲作用的范围即可，优选为1mM以上且1000mM以下，更优选为10mM以上且500mM以下。另外，上述缓冲剂可以使用一种也可以组合使用多种，例如，可以将有机物和无机物组合使用。
作为添加到洗脱液L中的无机盐类，可以列举氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、磷酸钠等。通过将无机盐类添加到洗脱液L中，能够对血红蛋白类的峰溶出进行优化。这些无机盐类的浓度没有特别限定，优选为1mM以上且1500mM以下。
作为添加到洗脱液L中的pH调节剂，可以列举公知的酸、碱。作为酸，可以列举例如盐酸、磷酸、硝酸、硫酸等，作为碱，可以列举氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化钡、氢氧化钙等。这些酸、碱的浓度没有特别限定，优选为0.001mM以上且500mM以下。
作为添加到洗脱液L中的水溶性有机溶剂，可以列举甲醇、乙醇、2-苯氧基乙醇、乙腈、丙酮等。这些水溶性有机溶剂的浓度优选以不析出盐等的程度使用，优选的上限为80％(v/v)。
作为添加到洗脱液L中的防腐剂，可以列举叠氮化钠、麝香草酚、丙酸钠等。这些防腐剂的浓度没有特别限定，优选为0.1mM以上且100mM以下。
另外，作为添加到洗脱液L中的血红蛋白稳定剂，可以列举公知的稳定剂、例如乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂、谷胱甘肽、叠氮化钠等还原剂或抗氧化剂等。这些血红蛋白稳定剂的浓度没有特别限定，优选为0.1mM以上且100mM以下。
另外，可以在洗脱液L中添加离液离子。离液离子是指在化合物溶解于水溶液时通过解离产生、破坏水的结构、抑制在疏水性物质与水接触时引起的水的熵减少的离子。
作为添加到洗脱液L中的离液离子，有阴离子和阳离子的离液离子。作为阴离子的离液离子，可以列举三溴乙酸根离子、三氯乙酸根离子、硫氰酸根离子、碘离子、高氯酸根离子、二氯乙酸根离子、硝酸根离子、溴离子、氯离子、乙酸根离子等，作为阳离子的离液离子，可以列举钡离子、钙离子、锂离子、铯离子、钾离子、镁离子、胍离子等。洗脱液L中的离液离子的含量优选为0.1mM以上且3000mM以下，更优选为1mM以上且1000mM以下，进一步优选为10mM以上且500mM以下。通过使含量为0.1mM以上，在血红蛋白类的测定中，分离效果提高，通过使含量为3000mM以下，能够有效地提高血红蛋白类的分离效果。
(洗脱液O)
本发明的一个方式的测定方法中使用的洗脱液O是以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率低于0.07质量％、成分2的含有率超过1.4质量％且在2.0质量％以下、成分2/成分1超过20的洗脱液。
将洗脱液O单独使用或者与其他洗脱液组合来用于血红蛋白类的测定，由此，能够对例如HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC、HbConstantSpring等血红蛋白类中的至少一种进行测定，特别是能够对HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c等血红蛋白类进行测定。另外，单独使用洗脱液O，能够对HbBart’s等作为地中海贫血的标志物的血红蛋白进行测定。需要说明的是，比测定对象的Hb先溶出的Hb可以根据需要利用其他洗脱液使其溶出。
作为洗脱液O的成分1和成分2的比率，只要满足上述的数值范围则没有限定，关于成分1的含有率，优选为0.05质量％以下，更优选为0.04质量％以下，进一步优选为0.03质量％以下。另外，作为成分1的含有率的下限，没有特别限定，优选为0.001质量％以上，更优选为0.002质量％以上，进一步优选为0.01质量％以上。此外，关于成分2的含有率，优选为1.42质量％以上且1.70质量％以下，更优选为1.44质量％以上且1.60质量％以下。成分2/成分1优选为25以上，更优选为40以上，进一步优选为48以上。另外，作为成分2/成分1的上限，优选为1000以下，更优选为300以下。
洗脱液O的渗透压优选为170mOsm以上且290mOsm以下，更优选为190mOsm以上且220mOsm以下，进一步优选为200mOsm以上且210mOsm以下。
洗脱液O的pH优选为5.4以下，更优选为4.8以上且5.4以下，进一步优选为5.0以上且5.3以下。
优选在成分1和成分2的磷酸系缓冲液以外还加入其他添加物来制备满足上述数值范围的洗脱液O。作为其他添加物，与制备上述的洗脱液L的情况相同。
(洗脱液M)
本发明的一个方式的血红蛋白类的测定方法中使用的洗脱液M是以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.40质量％以上且低于1.04质量％、成分2的含有率超过0.26质量％且在0.88质量％以下、成分2/成分1超过0.25且在2.2以下的洗脱液。
将洗脱液M单独使用或者与其他洗脱液组合来用于血红蛋白类的测定，由此，能够对HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbE、HbA2、HbD、HbS、HbC、HbCS等正常血红蛋白、突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白的至少一种血红蛋白进行测定。特别是，单独使用洗脱液M，能够对HbC等突变血红蛋白和HbCS等作为地中海贫血的标志物的血红蛋白进行测定。需要说明的是，比测定对象的Hb先溶出的Hb可以根据需要利用其他洗脱液使其溶出。另外，更详细而言，对于能够测定的HbC、HbCS等血红蛋白类，例如使从分离用柱溶出的时间不重叠，由此，能够根据测定时间对各血红蛋白类高精度地进行分离。
作为洗脱液M的成分1和成分2的比率，只要满足上述的数值范围则没有限定，关于成分1的含有率，优选为0.5质量％以上且0.90质量％以下，更优选为0.6质量％以上且0.80质量％以下，关于成分2的含有率，优选为0.45质量％以上且0.75质量％以下，更优选为0.55质量％以上且0.65质量％以下。成分2/成分1优选为0.5以上且1.7以下，更优选为0.7以上且1.4以下。
洗脱液M的渗透压优选为160mOsm以上且210mOsm以下，更优选为170mOsm以上且200mOsm以下，进一步优选为175mOsm以上且190mOsm以下。
洗脱液M的pH优选为7.3以下，更优选为6.4以上且7.0以下，进一步优选为6.5以上且6.9以下。
优选在成分1和成分2的磷酸系缓冲液以外还加入其他添加物来制备满足上述数值范围的洗脱液M。作为其他添加物，与制备上述的洗脱液L的情况相同。
(洗脱液A)
本发明的一个方式的测定方法中，可以进一步使用pH为5.30以上且5.40以下、渗透压为204mOsm以上且210mOsm以下的洗脱液(洗脱液A)。洗脱液A可以通过改变成分1和成分2的浓度而调节pH和渗透压来得到。
将洗脱液A单独使用或者与其他洗脱液组合来用于血红蛋白类的测定，由此，能够一次性测定HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种，特别是能够一次性测定HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbCS。特别是，单独使用洗脱液A，能够一次性测定HbF和HbA1c。洗脱液A可以与上述的洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M中的任意一种混合而制成混合液来使用，另外，也可以与洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M组合而依次输送到分离用柱。通过洗脱液A与洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M组合来进行送液，能够进行HbA1c与突变Hb的一次性分离、或者HbA1c与作为地中海贫血的标志物的血红蛋白的一次性分离。其中，通过将洗脱液L与洗脱液A组合来进行送液，能够对HbA1c和突变Hb一次性进行测定，是有用的。需要说明的是，比测定对象的Hb先溶出的Hb可以根据需要利用其他洗脱液使其溶出。
(洗脱液B)
本发明的一个方式的测定方法中，可以进一步使用pH为7.85以上且8.25以下、渗透压为350mOsm以上且600mOsm以下的洗脱液(洗脱液B)。洗脱液B可以通过改变成分1和成分2的浓度等而调节pH和渗透压来得到。另外，作为洗脱液B的渗透压，优选为370mOsm以上且570mOsm以下，更优选为400mOsm以上且480mOsm以下。
通过将洗脱液B与洗脱液A混合而形成的混合液用于血红蛋白类的测定，能够一次性测定HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种，特别是能够一次性测定HbS、HbC和HbCS。另外，洗脱液B可以与上述的洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M中的任意一种混合而制成混合液来使用。此外，可以将洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M、它们的混合液依次输送到分离用柱后，将洗脱液B输送到分离用柱，用于冲洗分离用柱内的试样。需要说明的是，比测定对象的Hb先溶出的Hb可以根据需要利用其他洗脱液使其溶出。
可以单独地依次输送上述的洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M、洗脱液A和洗脱液B的洗脱液，或者，可以依次输送将上述的洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M、洗脱液A和洗脱液B任意混合而形成的混合液，还可以将洗脱液和混合液组合而依次进行送液。通过将洗脱液和混合液组合来进行送液，能够一次性测定各种血红蛋白类。
其中，在一次性测定各种血红蛋白类的情况下，优选在高效液相色谱中，组合输送选自由以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.50质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1为0.4以上且10以下的洗脱液(洗脱液L)、以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率低于0.07质量％、成分2的含有率超过1.4质量％且在2.0质量％以下、成分2/成分1超过20的洗脱液(洗脱液O)、和以磷酸一氢二碱金属盐(成分1)和磷酸二氢一碱金属盐(成分2)作为成分、成分1的含有率为0.40质量％以上且低于1.04质量％、成分2的含有率超过0.26质量％且在0.88质量％以下、成分2/成分1超过0.25且在2.2以下的洗脱液(洗脱液M)组成的组中的至少两种洗脱液。需要说明的是，比测定对象的Hb先溶出的Hb可以根据需要利用其他洗脱液使其溶出。
此外，作为对血红蛋白类进行测定的方法，更优选基于下述(I)～(III)中的任意一个输送洗脱液：(I)输送选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的至少一种洗脱液，或者将至少两种洗脱液不混合而依次进行输送；(II)输送将选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的两种以上的洗脱液混合而形成的至少一种混合液；(III)依次输送选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的至少一种洗脱液以及将选自由上述洗脱液L、上述洗脱液O和上述洗脱液M组成的组中的两种以上的洗脱液混合而形成的至少一种混合液。由此，能够一次性测定各种血红蛋白类。需要说明的是，关于上述(III)，输送洗脱液和混合液的顺序没有特别限定，可以以任意的顺序进行送液。因此，例如，可以先输送洗脱液，也可以先输送混合液，还可以随机地输送洗脱液和混合液。需要说明的是，比测定对象的Hb先溶出的Hb可以根据需要利用其他洗脱液使其溶出。
在输送多种的洗脱液和混合液的情况下，可以采用线性梯度方式和不连续梯度方式中的任意一种方式。
作为将各洗脱液或各混合液输送到分离用柱时的流速，例如，优选为0.001ml/分钟以上，更优选为0.01ml/分钟以上，进一步优选为0.05ml/分钟以上，进一步优选为0.1ml/分钟以上，进一步优选为0.2ml/分钟以上，进一步优选为0.3ml/分钟以上，进一步优选为1.0ml/分钟以上，进一步优选为1.5ml/分钟以上。另外，作为将各洗脱液或各混合液输送到分离用柱时的流速，例如，优选为5.0ml/分钟以下，更优选为4.0ml/分钟以下，进一步优选为3.0ml/分钟以下，特别优选为2.5ml/分钟以下。
作为将各洗脱液或各混合液输送到分离用柱的时间，没有特别限定，可以根据作为测定对象的血红蛋白类的种类来确定。关于洗脱液L，优选为21秒以上且105秒以下，更优选为30秒以上且70秒以下。由此，能够适合测定HbA0、HbE、HbA2、HbD等血红蛋白类，能够根据测定时间对各血红蛋白类高精度地进行分离。
作为输送洗脱液O的时间，优选为14秒以上且71秒以下，更优选为20秒以上且47秒以下。由此，能够适合测定HbBart’s。另外，作为输送洗脱液M的时间，优选为18秒以上且95秒以下，更优选为27秒以上且63秒以下。由此，能够适合测定HbC、HbCS等血红蛋白。
作为本发明的一个方式的测定血红蛋白类的方法，优选至少输送洗脱液L。通过单独输送洗脱液L或者将洗脱液L与其他洗脱液组合输送来用于血红蛋白类的测定，能够一次性测定例如HbBart’s、HbH、HbF、HbA0、HbE、HbA2、HbD、HbS等血红蛋白类的至少一种。单独使用洗脱液L，特别能够一次性测定HbA0、HbE、HbA2、HbD等血红蛋白类，例如，对于正常血红蛋白和突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的测定有用。此外，更优选将作为其他洗脱液的洗脱液O或洗脱液M与洗脱液L一起组合来输送。通过输送洗脱液L和洗脱液O，能够对例如HbH、HbF、HbA1c等血红蛋白类进行测定。另外，例如，通过输送洗脱液L和洗脱液M，能够对HbS进行测定。需要说明的是，比测定对象先溶出的Hb可以根据需要利用其他洗脱液使其溶出。
另外，作为本发明的一个方式的测定血红蛋白类的方法，优选输送将洗脱液O和洗脱液M中的至少一种洗脱液与洗脱液L混合而形成的混合液。
其中，将洗脱液L与洗脱液O混合而形成的混合液在一次性地测定HbA1c和HbF、作为地中海贫血标志物的HbH等时有用，将洗脱液L与洗脱液M混合而形成的混合液在测定HbS等突变Hb时有用。
此外，作为本发明的一个方式的测定血红蛋白类的方法，更优选组合输送将洗脱液L、洗脱液L和洗脱液O混合而形成的混合液、以及将洗脱液M和洗脱液L混合而形成的混合液。由此，能够一次性测定HbA1c、HbF、HbA0和HbA2、作为地中海贫血标志物的HbH以及大部分突变Hb。作为能够测定的突变Hb，可以列举HbE、HbS、HbD等。
本发明的一个方式中，能够一次性测定HbA1c和突变Hb，因此，能够用一台测定装置实现糖尿病诊断与突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的鉴定。因此，与分开进行HbA1c的测定与突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的测定的情况相比，能够削减成本。另外，在对包含突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的试样进行测定的情况下，可以得到精度高的HbA1c的测定结果。此外，能够在HbA1c的测定时确认突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的有无，能够将其结果用于医疗领域、临床检查领域中的治疗、试验、研究等。
关于将洗脱液L和洗脱液O混合而形成的混合液，洗脱液L与洗脱液O的混合比根据作为测定对象的血红蛋白进行适当调节即可。例如，在以HbF、HbA1c等血红蛋白类作为测定对象的情况下，混合比优选为洗脱液L:洗脱液O＝1:2～1:4，更优选为1:2.5～1:3.5。
作为输送将洗脱液L和洗脱液O混合而形成的混合液的时间，优选为11秒以上且64秒以下，更优选为16秒以上且39秒以下。由此，能够适合测定HbH、HbA1c和HbF。更详细而言，对于能够测定的HbH、HbA1c、HbF等血红蛋白类，例如使从分离用柱溶出的时间不重叠，由此，能够根据测定时间对各血红蛋白类高精度地进行分离。
另外，关于将洗脱液M和洗脱液L混合而形成的混合液，洗脱液M与洗脱液L的混合比根据作为测定对象的血红蛋白进行适当调节即可。例如，在以HbS等血红蛋白类作为测定对象的情况下，混合比优选为洗脱液M:洗脱液L＝1:2～1:4，更优选为1:2.5～1:3.5。
此外，作为输送将洗脱液M和洗脱液L混合而形成的混合液的时间，优选为9秒以上且47秒以下，更优选为13秒以上且32秒以下。由此，能够适合测定HbS等血红蛋白。
此外，本发明的一个方式的测定血红蛋白类的方法中，优选输送选自由洗脱液M、洗脱液O、以及将洗脱液B和洗脱液A混合而形成的混合液组成的组中的至少一种液体。由此，能够对HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种进行测定，特别是能够对HbBart’s、HbS、HbC和HbCS中的至少一种进行测定。
其中，更优选依次输送洗脱液M和洗脱液O来测定血红蛋白类或者依次输送将洗脱液B和洗脱液A混合而形成的混合液以及洗脱液O来测定血红蛋白类。通过依次输送洗脱液M和洗脱液O，能够对HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种进行测定，特别是能够一次性测定HbBart’s、HbC和HbCS的全部，通过依次输送将洗脱液B和洗脱液A混合而形成的混合液以及洗脱液O，能够对HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种进行，特别是能够一次性测定HbBart’s、HbS、HbC和HbCS的全部。
另外，关于将洗脱液B和洗脱液A混合而形成的混合液，洗脱液B与洗脱液A的混合比根据作为测定对象的血红蛋白进行适当调节即可。例如，在以HbS、HbC和HbCS等血红蛋白类作为测定对象的情况下，混合比优选为洗脱液B：洗脱液A＝1:2～1:4，更优选为1:2.5～1:3.5。
此外，作为输送将洗脱液B和洗脱液A混合而形成的混合液的时间，优选为17秒以上且86秒以下，更优选为24秒以上且57秒以下。由此，能够适合测定HbS、HbC、HbCS等血红蛋白。
在输送多种洗脱液、输送多种混合液或者组合输送洗脱液和混合液的情况下，输送洗脱液、混合液的顺序(送液程序)没有特别限定，可以以任意的顺序输送洗脱液、混合液。作为送液程序，可以列举例如以下的送液程序1～送液程序5。
(送液程序1)
在输送洗脱液L、洗脱液O和洗脱液M作为洗脱液的情况下，如上所述，送液顺序没有特别限定，优选以洗脱液O、洗脱液L、洗脱液M的顺序进行送液。由此，能够对HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbE、HbA2、HbD、HbS、HbC、HbCS等血红蛋白类中的至少一种进行测定，特别是能够一次性测定HbBart’s、HbA0、HbE、HbA2、HbD、HbC、HbCS等血红蛋白类。另外，对于能够测定的血红蛋白类，能够根据测定时间对各血红蛋白类高精度地进行分离。
另外，例如，在输送洗脱液L来对HbA0、HbE、HbD进行分离的情况下或对HbA0、HbA2、HbD进行分离的情况下，例如使这些血红蛋白类从分离用柱溶出的时间不重叠，由此，能够根据测定时间对各血红蛋白类高精度地进行分离。此外，例如，在输送洗脱液M来对HbC、HbCS进行分离的情况下，例如使这些血红蛋白类从分离用柱溶出的时间不重叠，由此，能够根据测定时间对各血红蛋白类高精度地进行分离。
(送液程序2)
在以(1)洗脱液O、(2)洗脱液L的顺序进行送液的情况下，可以在(1)、(2)之间输送将洗脱液L和洗脱液O混合而形成的混合液。通过输送将洗脱液L和洗脱液O混合而形成的混合液，能够一次性测定HbH、HbA1c和HbF。因此，能够测定HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD中的至少一种，例如使能够测定的血红蛋白类从分离用柱溶出的时间不重叠，由此，能够对各血红蛋白类高精度地进行分离。
(送液程序3)
接着，在以(1)洗脱液L、(2)洗脱液M的顺序进行送液的情况下，可以在(1)、(2)之间输送将洗脱液M和洗脱液L混合而形成的混合液。通过输送将洗脱液M和洗脱液L混合而形成的混合液，能够测定HbS等突变Hb。因此，能够测定HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种，例如使能够测定的血红蛋白类从分离用柱溶出的时间不重叠，由此，能够对各血红蛋白类高精度地进行分离。
(送液程序4)
进而，优选以洗脱液O、将洗脱液L和洗脱液O混合而形成的混合液、洗脱液L、将洗脱液M和洗脱液L混合而形成的混合液、洗脱液M的顺序进行送液。由此，能够一次性测定HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbE、HbA2、HbD、HbS、HbC、HbCS等血红蛋白类。对于能够测定的血红蛋白类，能够对各血红蛋白类高精度地进行分离。
另外，例如，在输送将洗脱液L和洗脱液O混合而形成的混合液来对HbH、HbA1c、HbF进行分离的情况下，例如使这些血红蛋白类从分离用柱溶出的时间不重叠，由此，能够根据测定时间对各血红蛋白类高精度地进行分离。
(送液程序5)
此外，优选以(1)洗脱液O、(2)洗脱液A、(3)洗脱液L的顺序进行送液。由此，能够一次性测定HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbE、HbA2、HbD等。例如，例如使能够测定的血红蛋白类从分离用柱溶出的时间不重叠，由此，能够对各血红蛋白类高精度地进行分离。
在使用洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M、洗脱液A或洗脱液B的情况下，上述送液程序1～5以外的送液程序也包括在本发明的范围内。
以下，使用图1对本发明的一个方式的测定装置的构成和测定装置的工作流程进行说明。图1表示本发明的一个方式的一实施方式的测定装置。测定装置10是用于对测定试样中含有的血红蛋白类进行测定的装置，具备洗脱液罐1、切换阀2、送液泵3、压力计4、进样阀5、自动进样器6、分离用柱7、检测器8和废液容器9。
需要说明的是，上述的血红蛋白类的测定方法可以使用以下说明的测定装置来实施。
洗脱液罐1是用于储存上述各洗脱液的罐。洗脱液罐1设置有多个，分别储存上述的各洗脱液。储存在洗脱液罐1中的洗脱液经由流路供给至切换阀2和送液泵3。
通过切换切换阀2，能够改变所输送的洗脱液。例如，基于所设定的送液程序，驱动切换阀2而切换切换阀2，进行基于程序的洗脱液的送液。
利用送液泵3，能够将恒定流量的洗脱液输送至进样阀5，利用压力计4，能够在压力不变的情况下输送恒定流量的洗脱液。另外，在利用送液泵3进行送液时，通过连续地切换切换阀2，能够在流路内进行各洗脱液的混合。
利用自动进样器6，测定试样从进样阀5通过而被注入到分离用柱7。此外，洗脱液也从进样阀5通过而被输送到分离用柱7。而且，利用所输送的洗脱液，在分离用柱7的内部进行血红蛋白类的分离，与所输送的洗脱液的种类相对应的血红蛋白类溶出，并从分离用柱7流出。
流出的血红蛋白类利用紫外可见吸光光度计等检测器8进行检测。根据检测器8的检测结果，绘制出谱图，显示于显示装置(未图示)。利用检测器8进行检测后，包含血红蛋白类的液体作为废液被注入到废液容器9中。
作为测定血红蛋白类的测定装置，没有特别限定，可以使用市售的高效液相色谱系统。
作为分离用柱，可以列举例如阳离子交换柱。阳离子交换柱例如优选包含磺基、羧基和磷酸基中的至少一种作为阳离子交换基团，更优选包含磺基作为阳离子交换基团。
关于分离用柱，使用填充有作为柱基材的柱填充剂的分离用柱即可。作为柱填充剂，可以列举例如甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、丙烯酸-丙烯酸酯共聚物等聚合物凝胶、或者二氧化硅凝胶等无机系凝胶等，其中，优选甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物。
作为分离用柱的长度，例如，优选为1mm以上，更优选为5mm以上，进一步优选为10mm以上。另外，作为分离用柱的长度，例如，优选为300mm以下，更优选为200mm以下，进一步优选为150mm以下，进一步优选为100mm以下，进一步优选为75mm以下，进一步优选为50mm以下，进一步优选为40mm以下，进一步优选为35mm以下，进一步优选为30mm以下。
作为分离用柱的内径(φ)，例如，优选为0.1mm以上，更优选为0.2mm以上，进一步优选为0.3mm以上，进一步优选为0.5mm以上，进一步优选为1mm以上，进一步优选为2mm以上，进一步优选为3mm以上。另外，作为分离用柱的内径，例如，优选为50mm以下，更优选为30mm以下，进一步优选为20mm以下，进一步优选为10mm以下，进一步优选为5mm以下。
分离用柱中的柱填充剂的平均粒径例如优选为0.1μm以上，更优选为0.5μm以上，进一步优选为1μm以上，特别优选为3μm以上。另外，分离用柱的柱填充剂的平均粒径例如优选为50μm以下，更优选为20μm以下，进一步优选为10μm以下。
分离用柱中的柱填充剂的平均粒径的变异系数值(CV值)没有特别限定，优选为40％以下，更优选为30％以下，进一步优选为15％以下。需要说明的是，CV值是指通过下述公式求出的数值。
CV值(％)＝(粒径的标准偏差/平均粒径)×100
另外，测定血红蛋白类的测定装置优选具有一个送液泵。采用利用一个送液泵将混合有各洗脱液或各洗脱液的混合液依次输送到分离用柱的构成时，能够实现测定装置的尺寸缩减和成本降低。需要说明的是，测定血红蛋白类的测定装置可以具有两个以上的送液泵，一个送液泵上连接一种洗脱液罐，使用改变两种洗脱液的混合比而向分离用柱输送洗脱液的梯度方式。
实施例
接着，通过本发明的一个方式的测定方法，基于以下的实施例对测定各血红蛋白类而得到的结果进行说明，但本发明不限于实施例。另外，在以下的说明中，只要没有特别说明，则“％”均表示“质量％”。
[测定条件]
在以下的各实施例和各比较例中，基于以下的测定条件进行血红蛋白类的测定。
·液体色谱系统：糖化血红蛋白分析装置(爱科来株式会社制造)
·分离用柱：φ4.6×20mm凝胶(柱填充剂)：甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物
·流速：2.1ml/分钟
·洗脱条件：利用单个泵的低压不连续梯度
[实施例1]
实施例1的血红蛋白类的测定方法中，将洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M和洗脱液B单独使用或者以下述送液程序所示的混合比混合使用。本实施例中使用的测定试样和洗脱液B如下所示，洗脱液L、洗脱液O和洗脱液M如以下的表1所示。
·测定试样：(1)健康人样本、(2)含有HbBart’s、HbF、HbA0、HbE、HbD、HbS、HbC和HbCS的样本(将多种血液混合而制备的血液样本)、(3)含有HbBart’s和HbH的样本
·洗脱液B：pH：8.05、渗透压：547mOsm
[表1]
使用上述(1)～(3)的样本作为测定试样，以以下(I)～(VII)的顺序将各洗脱液和各混合液输送到分离用柱，测定血红蛋白类。
·使用上述(1)的样本作为测定试样时的送液程序：(I)输送1秒洗脱液O、(II)输送64秒以洗脱液L:洗脱液O＝1:3的混合比混合的混合液、(III)输送49秒洗脱液L、(IV)输送22秒以洗脱液M:洗脱液L＝1:3的混合比混合的混合、(V)输送15秒洗脱液M、(VI)输送4秒洗脱液B、(VII)输送15秒洗脱液O
·使用上述(2)的样本作为测定试样时的送液程序：(I)输送1秒洗脱液O、(II)输送32秒以洗脱液L:洗脱液O＝1:3的混合比混合的混合液、(III)输送49秒洗脱液L、(IV)输送22秒以洗脱液M:洗脱液L＝1:3的混合比混合的混合液、(V)输送55秒洗脱液M、(VI)输送4秒洗脱液B、(VII)输送15秒洗脱液O
·使用上述(3)的样本作为测定试样时的送液程序：(I)输送1秒洗脱液O、(II)输送32秒以洗脱液L:洗脱液O＝1:3的混合比混合的混合液、(III)输送49秒洗脱液L、(IV)输送22秒以洗脱液M:洗脱液L＝1:3的混合比混合的混合液、(V)输送15秒洗脱液M、(VI)输送4秒洗脱液B、(VII)输送15秒洗脱液O
将实施例1的测定结果示于图2～图4中。图2是使用(1)健康人样本作为测定试样时的测定结果，图3是使用(2)含有HbBart’s、HbF、HbA0、HbE、HbD、HbS、HbC和HbCS的样本(将多种血液混合而制备的血液样本)作为测定试样时的测定结果，图4是使用(3)含有HbBart’s和HbH的样本作为测定试样时的测定结果。图2～图4中，纵轴均表示吸光度，横轴均表示测定时间(秒)(以下，在图5～图11中也同样)。由图2～图4可知，在输送任意一种洗脱液或混合液的情况下，均能够测定任意血红蛋白类。
如图2所示，在上述(II)中测定HbF后，测定HbA1c，在上述(III)中测定HbA0后，测定HbA2。因此表明，利用上述送液程序，能够将HbA1c与其他Hb一次性分离。
接着，如图3所示，在上述(I)中测定HbBart’s，在上述(II)中测定HbF，在上述(III)中以HbA0、HbE、HbD的顺序测定血红蛋白类，在上述(IV)中测定HbS，在上述(V)中测定HbC后测定HbCS。因此表明，利用上述送液程序，能够将突变Hb与作为地中海贫血的标志物的HbBart’s和HbCS一次性分离。
另外，如图4所示，在上述(I)中测定HbBart’s，在上述(II)中测定HbH。
[实施例2]
实施例2的血红蛋白类的测定方法中，将洗脱液L、洗脱液O、洗脱液A和洗脱液B单独使用或者以下述送液程序所示的混合比混合使用。本实施例中使用的测定试样和洗脱液A、洗脱液B如下所示，洗脱液L和洗脱液O如以下的表2所示。
·测定试样：含有HbBart’s、HbF、HbA1c、HbA0、HbE、HbD、HbS、HbC和HbCS的样本(将多种血液混合而制备的血液样本)
·洗脱液A：pH：5.35、渗透压：207mOsm
·洗脱液B：pH：8.05、渗透压：469mOsm
[表2]
使用上述样本作为测定试样，以以下(I)～(VI)的顺序将各洗脱液和各混合液输送到分离用柱，测定血红蛋白类。
·送液程序：以以下(I)～(VI)的顺序将各洗脱液输送到分离用柱，测定血红蛋白类。(I)输送1秒洗脱液O、(II)输送20秒洗脱液A、(III)输送50秒洗脱液L、(IV)输送40秒以洗脱液B:洗脱液A＝1:3的混合比混合的混合液、(V)输送8秒洗脱液B、(VI)输送15秒洗脱液O
将实施例2的测定结果示于图5中。图5是使用含有HbBart’s、HbF、HbA1c、HbA0、HbE、HbD、HbS、HbC和HbCS的样本作为测定试样时的测定结果。如图5所示，利用上述送液程序，能够将HbA1c、突变Hb、HbBart’s等一次性分离。
[实施例3、4]
实施例3的血红蛋白类的测定方法中，将洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M和洗脱液B单独使用或者以下述送液程序所示的混合比混合使用。实施例4的血红蛋白类的测定方法中，使用比较洗脱液L来代替洗脱液L，将下述送液程序中的洗脱液L变更为比较洗脱液L。这些实施例中使用的测定试样和洗脱液B如下所示，洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M和比较洗脱液L如以下的表3所示。
·测定试样：(1)含有HbE的样本、(2)健康人样本
·洗脱液B：pH：8.05、渗透压：547mOsm
[表3]
分别使用上述样本为测定试样，以以下(I)～(VII)的顺序将各洗脱液和各混合液输送到分离用柱，测定血红蛋白类。
·送液程序：以以下(I)～(VII)的顺序将各洗脱液输送到分离用柱，测定血红蛋白类。(I)输送1秒洗脱液O、(II)输送64秒以洗脱液L:洗脱液O＝1:3的混合比混合的洗脱液、(III)输送49秒洗脱液L、(IV)输送22秒以洗脱液M:洗脱液L＝1:3的混合比混合的混合液、(V)输送15秒洗脱液M、(VI)输送4秒洗脱液B、(VII)输送15秒洗脱液O
将实施例3的测定结果示于图6中。图6是使用含有HbE的样本和健康人样本作为测定试样时的测定结果。如图6所示，利用上述送液程序，能够将HbA1c与突变Hb一次性分离。
将实施例4的测定结果示于图7中。图7是使用含有HbE的样本和健康人样本作为测定试样且使用比较洗脱液L代替洗脱液L时的测定结果。如图7所示，在上述送液程序中，HbA1c和HbF的溶出位置(峰1)重叠，另外，HbA0和HbE的溶出位置(峰2)重叠。
由图6、7的结果可知，在使用比较洗脱液L的情况下，HbA1c和HbF的溶出位置以及HbA0和HbE的溶出位置重叠，但在使用洗脱液L的情况下，这些血红蛋白类的溶出位置不重叠。因此，通过使用洗脱液L，能够根据测定时间对更多的血红蛋白类高精度地进行分离。
[实施例5、6]
实施例5的血红蛋白类的测定方法中，将洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M和洗脱液B单独使用或者以下述送液程序所示的混合比混合使用。实施例6的血红蛋白类的测定方法中，使用比较洗脱液O来代替洗脱液O，将下述送液程序中的洗脱液O变更为比较洗脱液O。这些实施例中使用的测定试样和洗脱液B如下所示，洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M和比较洗脱液O如以下的表4所示。
·测定试样：含有HbBart’s的样本
·洗脱液B：pH：8.05、渗透压：547mOsm
[表4]
使用上述样本为测定试样，以以下(I)～(VII)的顺序将各洗脱液和各混合液输送到分离用柱，测定血红蛋白类。
·送液程序：以以下(I)～(VII)的顺序将各洗脱液输送到分离用柱，测定血红蛋白类。(I)输送1秒洗脱液O、(II)输送32秒以洗脱液L:洗脱液O＝1:3的混合比混合的洗脱液、(III)输送49秒洗脱液L、(IV)输送22秒以洗脱液M:洗脱液L＝1:3的混合比混合的混合液、(V)输送15秒洗脱液M、(VI)输送4秒洗脱液B、(VII)输送15秒洗脱液O
将实施例5的测定结果示于图8中。图8是使用含有HbBart’s的样本作为测定试样时的测定结果。如图8所示，利用上述送液程序，能够将HbBart’s和HbF一次性分离。
将实施例6的测定结果示于图9中。图9是使用含有HbBart’s的样本作为测定试样且使用比较洗脱液O代替洗脱液O时的测定结果。如图9所示，在上述送液程序中，HbBart’s和HbF的溶出位置重叠。
由图8、9的结果可知，在使用比较洗脱液O的情况下，HbBart’s和HbF的溶出位置重叠，但在使用洗脱液O的情况下，HbBart’s和HbF的溶出位置不重叠。因此，通过使用洗脱液O，能够根据测定时间对更多的血红蛋白类高精度地进行分离。
[实施例7、8]
实施例7的血红蛋白类的测定方法中，将洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M和洗脱液B单独使用或者以下述送液程序所示的混合比混合使用。实施例8的血红蛋白类的测定方法中，使用比较洗脱液M来代替洗脱液M，将下述送液程序中的洗脱液M变更为比较洗脱液M。这些实施例中使用的测定试样和洗脱液B如下所示，洗脱液L、洗脱液O、洗脱液M和比较洗脱液M如以下的表5所示。
·测定试样：(1)含有HbS、HbC的样本、(2)含有HbCS的样本
·洗脱液B：pH：8.05、渗透压：547mOsm
[表5]
使用上述样本为测定试样，以以下(I)～(VII)的顺序将各洗脱液和各混合液输送到分离用柱，测定血红蛋白类。
·送液程序：以以下(I)～(VII)的顺序将各洗脱液输送到分离用柱，测定血红蛋白类。(I)输送1秒洗脱液O、(II)输送32秒以洗脱液L:洗脱液O＝1:3的混合比混合的洗脱液、(III)输送49秒洗脱液L、(IV)输送22秒以洗脱液M:洗脱液L＝1:3的混合比混合的混合液、(V)输送55秒洗脱液M、(VI)输送4秒洗脱液B、(VII)输送15秒洗脱液O
将实施例7的测定结果示于图10中。图10是使用(1)含有HbS、HbC的样本和(2)含有HbCS的样本作为测定试样时的测定结果。如图10所示，利用上述送液程序，能够一次性测定HbS和HbC，并且能够在与HbS和HbC不同的溶出位置测定HbCS。
将实施例8的测定结果示于图11中。图11是使用(1)含有HbS、HbC的样本和(2)含有HbCS的样本作为测定试样且使用比较洗脱液M代替洗脱液M时的测定结果。如图11所示，在上述送液程序中，HbC和HbCS的溶出位置重叠，但能够一次性测定HbS和HbC。
接着，示出通过改变成分1和成分2的含有率而求出各洗脱液的成分2/成分1、渗透压和pH的优选的范围的实验的结果。
[实验1]
首先，将成分1和成分2以各种含有率混合，求出洗脱液L的成分2/成分1、优选的渗透压和优选的pH的范围。其结果如表6、图12和图13所示。图12表示洗脱液L的渗透压与pH的关系，图13表示洗脱液L的渗透压与成分2/成分1的关系。需要说明的是，表6的L液是组成与实施例1中制备的洗脱液L相同的洗脱液。
[表6]
研究1 研究2 研究3 研究4 研究5 研究6 L液 研究7 研究8 研究9 研究10 研究11 研究12
渗透压 40 60 136 90 136 135 133 130 134 140 134 134 180
pH 7.33 6.95 6.58 6.55 6.45 6.38 6.35 6.30 6.28 6.25 6.22 6.13 5.92
成分1(质量％) 0.097 0.161 0.360 0.173 0.300 0.270 0.248 0.216 0.225 0.218 0.200 0.180 0.165
成分2(质量％) 0.041 0.138 0.540 0.369 0.600 0.630 0.651 0.648 0.675 0.727 0.700 0.720 1.102
成分2/成分1 0.43 0.85 1.50 2.14 2.00 2.33 2.63 3.01 3.00 3.34 3.50 4.00 6.68
判定 × × △ △ △ ○ ○ ○ ○ △ △ △ △
表6、图12和图13的判定的基准如下所述。
○…能够将HbA0、HbE、HbD适当分离
△…能够将HbA0、HbE、HbD分离，但峰过于接近或者其分离需要大量时间
×…能够将HbA0、HbE、HbD中的两种分离
图12中，由点划线表示的最大的框示出了洗脱液L的渗透压和pH的优选的范围，由虚线表示的框示出了洗脱液L的渗透压和pH的更优选的范围，由点线表示的最小的框示出了洗脱液L的渗透压和pH的进一步优选的范围。
图13中，由点划线表示的最大的框示出了洗脱液L的成分2/成分1的范围和渗透压的优选的范围，由虚线表示的框示出了洗脱液L的成分2/成分1的优选的范围和渗透压的更优选的范围，由点线表示的最小的框示出了洗脱液L的成分2/成分1的更优选的范围和渗透压的进一步优选的范围。
[实验2]
接着，将成分1和成分2以各种含有率混合，求出洗脱液M的成分2/成分1、优选的渗透压和优选的pH的范围。其结果如表7、图14和图15所示。图14表示洗脱液M的渗透压与pH的关系，图15表示洗脱液M的渗透压与成分2/成分1的关系。需要说明的是，表7的M液是组成与实施例1中制备的洗脱液M相同的洗脱液。
[表7]
研究1 研究2 研究3 研究4 研究5 M液 研究6 研究7 研究8 研究9 研究10
渗透压 188 187 185 186 185 185 185 185 185 185 184
pH 7.33 7.02 6.85 6.85 6.76 6.76 6.66 6.63 6.60 6.53 6.43
成分1(质量％) 1.040 0.865 0.731 0.740 0.675 0.691 0.524 0.586 0.581 0.516 0.431
成分2(质量％) 0.256 0.431 0.576 0.556 0.633 0.605 0.784 0.710 0.727 0.780 0.865
成分2/成分1 0.25 0.50 0.79 0.75 0.94 0.88 1.25 1.21 1.50 1.51 2.01
判定 × △ △ ○ ○ ○ ○ ○ ○ △ △
表7、图14和图15的判定的基准如下所述。
○…能够将HbC、HbCS适当分离
△…能够将HbC、HbCS分离，但峰过于接近或者其分离需要大量时间
×…不能将HbC、HbCS分离
图14中，由点划线表示的最大的框示出了洗脱液M的渗透压和pH的优选的范围，由虚线表示的框示出了洗脱液M的渗透压和pH的更优选的范围，由点线表示的最小的框示出了洗脱液M的渗透压和pH的进一步优选的范围。
图15中，由点划线表示的最大的框示出了洗脱液M的成分2/成分1的范围和渗透压的优选的范围，由虚线表示的框示出了洗脱液M的成分2/成分1的优选的范围和渗透压的更优选的范围，由点线表示的最小的框示出了洗脱液M的成分2/成分1的更优选的范围和渗透压的进一步优选的范围。
[实验3]
接着，将成分1和成分2以各种含有率混合，求出洗脱液O的成分2/成分1、优选的渗透压和优选的pH的范围。其结果如表8、图16和图17所示。图16表示洗脱液O的渗透压与pH的关系，图17表示洗脱液O的渗透压与成分2/成分1的关系。需要说明的是，表8的O液是组成与实施例1中制备的洗脱液O相同的洗脱液。
[表8]
表8、图16和图17的判定的基准如下所述。
○…能够将HbBart’s、HbF适当分离
△…能够将HbBart’s、HbF分离，但峰过于接近或者其分离需要大量时间
×…不能将HbBart’s、HbF分离
图16中，由点划线表示的最大的框示出了洗脱液O的渗透压和pH的优选的范围，由虚线表示的框示出了洗脱液O的渗透压和pH的更优选的范围，由点线表示的最小的框示出了洗脱液O的渗透压和pH的进一步优选的范围。
图17中，由点划线表示的最大的框示出了洗脱液O的成分2/成分1的范围和渗透压的优选的范围，由虚线表示的框示出了洗脱液O的成分2/成分1的优选的范围和渗透压的更优选的范围，由点线表示的最小的框示出了洗脱液O的成分2/成分1的更优选的范围和渗透压的进一步优选的范围。
[实验4]
接着，求出洗脱液B的渗透压和pH的范围。其结果如表9、图18所示。图18表示洗脱液B的渗透压与pH的关系。需要说明的是，表9的B液是组成与实施例1中使用的洗脱液B相同的洗脱液。
[表9]
研究1 研究2 研究3 研究4 B液 研究5 研究6 研究7 研究8 研究9
渗透压 550 550 500 498 471 470 444 440 394 390
pH 8.06 8.06 8.06 8.06 8.06 8.06 8.08 8.08 8.09 8.09
判定 △ △ △ △ ○ ○ ○ ○ △ ○
表9、图18的判定的的基准如下所述。
○…在与洗脱液A混合进行送液时，能够将HbS、HbC、HbCS适当分离
△…在与洗脱液A混合进行送液时，能够将HbS、HbC、HbCS中的至少两种分离
图18中，示出了洗脱液B的渗透压和pH的范围。
需要说明的是，关于上述实施例的效果，利用与上述实施例中使用的柱不同种类的柱也可以得到同样的效果。
上述液相色谱系统中，“能够测定”是指能够溶出并且通过与其他Hb分离而能够进行测定，根据实施例，能够使用上述洗脱液来对预定的血红蛋白进行测定。

Claims (13)

1.一种测定方法，通过以下的(A)～(D)中的任意一个对选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白进行测定：
(A)在高效液相色谱中，使用以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.50质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1为0.4以上且10以下的洗脱液即洗脱液L；
(B)在高效液相色谱中，使用以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率低于0.07质量％、成分2的含有率超过1.4质量％且在2.0质量％以下、成分2/成分1超过20的洗脱液即洗脱液O；
(C)在高效液相色谱中，使用以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率为0.40质量％以上且低于1.04质量％、成分2的含有率超过0.26质量％且在0.88质量％以下、成分2/成分1超过0.25且在2.2以下的洗脱液即洗脱液M；
(D)在高效液相色谱中，组合输送选自由下述洗脱液组成的组中的至少两种洗脱液：
以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.50质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1为0.4以上且10以下的洗脱液即洗脱液L、
以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率低于0.07质量％、成分2的含有率超过1.4质量％且在2.0质量％以下、成分2/成分1超过20的洗脱液即洗脱液O、和
以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率为0.40质量％以上且低于1.04质量％、成分2的含有率超过0.26质量％且在0.88质量％以下、成分2/成分1超过0.25且在2.2以下的洗脱液即洗脱液M。
2.如权利要求1所述的测定方法，其中，所述(D)中，基于下述(I)～(III)中的任意一个输送洗脱液：
(I)输送选自由所述洗脱液L、所述洗脱液O和所述洗脱液M组成的组中的至少一种洗脱液，或者将选自由所述洗脱液L、所述洗脱液O和所述洗脱液M组成的组中的至少两种洗脱液不混合而依次进行输送；
(II)输送将选自由所述洗脱液L、所述洗脱液O和所述洗脱液M组成的组中的两种以上的洗脱液混合而形成的至少一种混合液；
(III)依次输送选自由所述洗脱液L、所述洗脱液O和所述洗脱液M组成的组中的至少一种洗脱液以及将选自由所述洗脱液L、所述洗脱液O和所述洗脱液M组成的组中的两种以上的洗脱液混合而形成的至少一种混合液。
3.如权利要求1或2所述的测定方法，其中，所述(D)中，基于下述(a)或(b)输送混合液：
(a)输送将所述洗脱液O和所述洗脱液M中的至少一种洗脱液与所述洗脱液L混合而形成的至少一种混合液；
(b)输送将所述洗脱液L、所述洗脱液L和所述洗脱液O混合而形成的混合液、以及将所述洗脱液M和所述洗脱液L混合而形成的混合液。
4.如权利要求3所述的测定方法，其中，通过所述(b)测定的血红蛋白类为HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种。
5.如权利要求1～4中任一项所述的测定方法，其满足以下的(1)～(5)中的至少一个：
(1)使用所述洗脱液L，所述洗脱液L的渗透压为35mOsm以上且200mOsm以下；
(2)使用所述洗脱液O，所述洗脱液O的渗透压为170mOsm以上且290mOsm以下；
(3)使用所述洗脱液M，所述洗脱液M的渗透压为160mOsm以上且210mOsm以下；
(4)使用将所述洗脱液L和所述洗脱液O混合而形成的混合液，所述洗脱液的混合比为洗脱液L:洗脱液O＝1:2～1:4；
(5)使用将所述洗脱液M和所述洗脱液L混合而形成的混合液，所述洗脱液的混合比为洗脱液M:洗脱液L＝1:2～1:4。
6.如权利要求1～5中任一项所述的测定方法，其满足以下的(6)～(8)中的至少一个：
(6)进一步使用pH为5.30以上且5.40以下、渗透压为204mOsm以上且210mOsm以下的洗脱液即洗脱液A；
(7)进一步使用pH为7.85以上且8.25以下、渗透压为350mOsm以上且600mOsm以下的洗脱液即洗脱液B；
(8)进一步使用将pH为7.85以上且8.25以下、渗透压为350mOsm以上且600mOsm以下的洗脱液即洗脱液B和pH为5.30以上且5.40以下、渗透压为204mOsm以上且210mOsm以下的洗脱液即洗脱液A以混合比为洗脱液B:洗脱液A＝1:2～1:4的方式混合而形成的混合液。
7.如权利要求6所述的测定方法，其中，通过所述(8)测定的血红蛋白类为HbBart’s、HbH、HbF、HbA1c、HbA0、HbA2、HbE、HbD、HbS、HbC和HbConstantSpring中的至少一种。
8.一种测定装置，用于对血红蛋白类进行测定，其具备：
送液泵，在高效液相色谱中，将选自由下述洗脱液组成的组中的洗脱液单独输送或组合输送：
以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.50质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1为0.4以上且10以下的洗脱液即洗脱液L、
以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率低于0.07质量％、成分2的含有率超过1.4质量％且在2.0质量％以下、成分2/成分1超过20的洗脱液即洗脱液O、和
以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率为0.40质量％以上且低于1.04质量％、成分2的含有率超过0.26质量％且在0.88质量％以下、成分2/成分1超过0.25且在2.2以下的洗脱液即洗脱液M；以及
分离用柱，与所述送液泵连接而被输送所述洗脱液。
9.如权利要求8所述的测定装置，其中，所述送液泵基于下述(I)～(III)中的任意一个输送洗脱液：
(I)输送选自由所述洗脱液L、所述洗脱液O和所述洗脱液M组成的组中的至少一种洗脱液，或者将选自由所述洗脱液L、所述洗脱液O和所述洗脱液M组成的组中的至少两种洗脱液不混合而依次进行输送；
(II)输送将选自由所述洗脱液L、所述洗脱液O和所述洗脱液M组成的组中的两种以上的洗脱液混合而形成的至少一种混合液；
(III)依次输送选自由所述洗脱液L、所述洗脱液O和所述洗脱液M组成的组中的至少一种洗脱液以及将选自由所述洗脱液L、所述洗脱液O和所述洗脱液M组成的组中的两种以上的洗脱液混合而形成的至少一种混合液。
10.如权利要求8或9所述的测定装置，其中，进一步输送作为所述洗脱液的pH为5.30以上且5.40以下、渗透压为204mOsm以上且210mOsm以下的洗脱液即洗脱液A和pH为7.85以上且8.25以下、渗透压为350mOsm以上且600mOsm以下的洗脱液即洗脱液B中的至少一种，或者，进一步输送将所述洗脱液A和所述洗脱液B混合而形成的混合液。
11.如权利要求8～10中任一项所述的测定装置，其中，所述送液泵为一个。
12.以下的(1)～(3)中的任意一种洗脱液：
(1)在高效液相色谱中用于测定选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的、以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.50质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1为0.4以上且10以下的洗脱液即洗脱液L；
(2)在高效液相色谱中用于测定选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的、以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率低于0.07质量％、成分2的含有率超过1.4质量％且在2.0质量％以下、成分2/成分1超过20的洗脱液即洗脱液O。
(3)在高效液相色谱中用于测定选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的、以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率为0.40质量％以上且低于1.04质量％、成分2的含有率超过0.26质量％且在0.88质量％以下、成分2/成分1超过0.25且在2.2以下的洗脱液即洗脱液M。
13.一种洗脱液的组合，包含选自由在高效液相色谱中用于测定选自突变血红蛋白和作为地中海贫血的标志物的血红蛋白中的至少一种血红蛋白的下述洗脱液组成的组中的至少两种洗脱液：
以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率为0.08质量％以上且0.50质量％以下、成分2的含有率为0.04质量％以上且1.2质量％以下、成分2/成分1为0.4以上且10以下的洗脱液即洗脱液L、
以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率低于0.07质量％、成分2的含有率超过1.4质量％且在2.0质量％以下、成分2/成分1超过20的洗脱液即洗脱液O、和
以磷酸一氢二碱金属盐即成分1和磷酸二氢一碱金属盐即成分2作为成分、成分1的含有率为0.40质量％以上且低于1.04质量％、成分2的含有率超过0.26质量％且在0.88质量％以下、成分2/成分1超过0.25且在2.2以下的洗脱液即洗脱液M。
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