CN111443150B - 复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法 - Google Patents

复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法，它包括以下步骤：乙酰半胱氨酸对照品和乙酰酪氨酸对照品溶液配制、供试品溶液配制、确定色谱条件、对对照品溶液进行高效液相色谱检测并记录峰面积、对供试品溶液进行高效液相色谱检测并记录峰面积，再采用外标法计算供试品中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸的含量。本发明采用耐水反相色谱柱，以硫酸水溶液与乙腈相结合作为流动相，梯度洗脱，达到同时对复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸的含量进行测定的目的。该方法操作简单、色谱柱平衡快、专属性好、准确性佳、重现性好。

Description

复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测 方法
技术领域
本发明涉及一种检测乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的方法，具体涉及到一种利用HPLC检测复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的方法。
背景技术
乙酰半胱氨酸、乙酰酪氨酸是复方氨基酸注射液中两个含有乙酰基的主成分，由于该基团易水解，无法使用现有的衍生法检测其含量。乙酰半胱氨酸极性强，紫外吸收弱，在普通C18色谱柱，和其他大部分组分一样，保留很弱，难分离。而乙酰酪氨酸由于结构中含有苯环，和C18作用力较强，与乙酰半胱氨酸相反，需要使用较强流动相才能洗脱。普通离子对色谱法保留时间不重现、色谱柱寿命短，亲水模式色谱法HILIC色谱柱较难平衡且分析时间较长，阳离子交换色谱柱对此两种成分专属性差。因此，如何使用同一个体系快速准确的检测出复方氨基酸注射液中二者的含量成为一个难点。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种操作简单、色谱柱平衡快、专属性好、准确性佳且重现性好的复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法。
按照本发明提供的技术方案，所述复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法包括以下步骤：
步骤一、使用0.01～0.1mol/L盐酸作为溶剂配制浓度均为0.010mg/ml～0.080mg/ml的乙酰半胱氨酸对照品和乙酰酪氨酸对照品溶液；
步骤二、复方氨基酸注射液加溶剂0.01～0.1mol/L盐酸进行稀释后作为供试品溶液；
步骤三、确定色谱条件：
色谱柱：采用耐水反相色谱柱；
流动相：流动相A为pH值为3.0-3.5的硫酸水溶液；流动相B：流动相A与乙腈按体积比为70:30的比例混合；
线性梯度洗脱条件为：0～7分钟：100％流动相A、0％流动相B；7～7.1分钟：由100％流动相A、0％流动相B匀速变为70％流动相A、30％流动相B；7.1～20分钟：70％流动相A、30％流动相B；20～20.1分钟：由70％流动相A、30％流动相B匀速变为100％流动相A、0％流动相B；20.1分钟以后：100％流动相A、0％流动相B；
或者，线性梯度洗脱条件为：0～7分钟：100％流动相A、0％流动相B；7～7.1分钟：由100％流动相A、0％流动相B匀速变为60％流动相A、40％流动相B；7.1～17分钟：60％流动相A、40％流动相B；17～17.1分钟：由60％流动相A、40％流动相B匀速变为100％流动相A、0％流动相B；17.1分钟以后：100％流动相A、0％流动相B；
或者，线性梯度洗脱条件为：0～6.5分钟：100％流动相A、0％流动相B；6.5～8.5分钟：由100％流动相A、0％流动相B匀速变为70％流动相A、30％流动相B；8.5～20分钟：70％流动相A、30％流动相B；20～21分钟：由70％流动相A、30％流动相B匀速变为0％流动相A、100％流动相B；21～23分钟：0％流动相A、100％流动相B；23～24分钟：由0％流动相A、100％流动相B匀速变为100％流动相A、0％流动相B；24分钟以后：100％流动相A、0％流动相B；
流速：0.9-1.1mL/min；
柱温：23-30℃；
检测波长：200-210nm；
进样器温度：5℃；
步骤四、对所述对照品溶液进行高效液相色谱检测，记录峰面积；
步骤五、对所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，记录峰面积，再采用外标法计算供试品中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸的含量。
作为优选，步骤一和步骤二中所用溶剂为0.1mol/L盐酸。
作为优选，步骤三中，流速为1.0mL/min。
作为优选，步骤三中，柱温为25℃。
作为优选，步骤三中，检测波长为210nm。
本发明采用耐水反相色谱柱，以硫酸水溶液与乙腈相结合作为流动相，梯度洗脱，达到同时对复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸的含量进行测定的目的。该方法操作简单、色谱柱平衡快、专属性好、准确性佳、重现性好，可用于氨基酸注射液或者乙酰半胱氨酸、乙酰酪氨酸原料药中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的定性或定量分析。
附图说明
图1是本发明实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图。
图2是本发明实施例2中供试品溶液的高效液相色谱图。
图3是本发明实施例3中供试品溶液的高效液相色谱图。
图4是本发明实施例4中供试品溶液的高效液相色谱图。
图中：NAC—乙酰半胱氨酸，NAT—乙酰酪氨酸。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法包括以下步骤：
步骤一、NAC和NAT贮备液制备：精密称定NAC对照品25mg，至25ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至最大刻度；精密称定NAT对照品26.9mg，至25ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至最大刻度；
NAC和NAT对照品溶液制备：
分别精密移取1ml NAC和1ml NAT对照品贮备液至同一25ml容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至最大刻度；
步骤二、精密移取复方氨基酸注射液1mL于20mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至最大刻度，稀释倍数为20；
步骤三、确定色谱条件：
色谱柱：采用250mm×4.6mm、5μm的Agilent SB-Aq色谱柱；
流动相：流动相A为pH值为3.5的硫酸水溶液；流动相B：流动相A与乙腈按体积比为70:30的比例混合；
线性梯度洗脱条件为：0～7分钟：100％流动相A、0％流动相B；7～7.1分钟：由100％流动相A、0％流动相B匀速变为70％流动相A、30％流动相B；7.1～20分钟：70％流动相A、30％流动相B；20～20.1分钟：由70％流动相A、30％流动相B匀速变为100％流动相A、0％流动相B；20.1分钟以后：100％流动相A、0％流动相B；
流速：1.0mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：210nm；
进样器温度：5℃；
步骤四、对所述对照品溶液进行高效液相色谱检测，记录峰面积；
步骤五、对所述供试品溶液进行高效液相色谱检测并输出色谱图，记录峰面积，如图1所示，再采用外标法计算供试品中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸的含量。
供试品与对照品的色谱分离参数见表1，
表1
Figure BDA0002510442170000041
色谱参数显示，NAC和NAT与相邻峰有很好的分离效果。
外标法计算供试品中NAC和NAT的含量。含量计算公式：供试品溶液中NAC(NAT)的峰面积/对照品溶液中NAC(NAT)的峰面积*对照品溶液中NAC(NAT)的浓度*供试品稀释倍数。
实施例2
一种复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法包括以下步骤：
步骤一、NAC和NAT贮备液制备：精密称定NAC对照品25mg，至25ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至最大刻度；精密称定NAT对照品26.9mg，至25ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至最大刻度；
NAC和NAT对照品溶液制备：
分别精密移取1ml NAC和1ml NAT对照品贮备液至同一25ml容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至最大刻度；
步骤二、精密移取复方氨基酸注射液1mL于20mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至最大刻度；
步骤三、确定色谱条件：
色谱柱：采用250mm×4.6mm、5μm的Agilent SB-Aq色谱柱；
流动相：流动相A为pH值为3.0的硫酸水溶液；流动相B：流动相A与乙腈按体积比为70:30的比例混合；
线性梯度洗脱条件为：0～7分钟：100％流动相A、0％流动相B；7～7.1分钟：由100％流动相A、0％流动相B匀速变为70％流动相A、30％流动相B；7.1～20分钟：70％流动相A、30％流动相B；20～20.1分钟：由70％流动相A、30％流动相B匀速变为100％流动相A、0％流动相B；20.1分钟以后：100％流动相A、0％流动相B；
流速：1.0mL/min；
柱温：28℃；
检测波长：210nm；
进样器温度：5℃；
步骤四、对所述对照品溶液进行高效液相色谱检测，记录峰面积；
步骤五、对所述供试品溶液进行高效液相色谱检测并输出色谱图，记录峰面积，如图2所示，再采用外标法计算供试品中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸的含量。
供试品与对照品的色谱分离参数见表2，
表2
Figure BDA0002510442170000051
色谱参数显示，NAC和NAT与相邻峰有很好的分离效果。
外标法计算供试品中NAC和NAT的含量。含量计算公式：供试品溶液中NAC(NAT)的峰面积/对照品溶液中NAC(NAT)的峰面积*对照品溶液中NAC(NAT)的浓度*供试品稀释倍数。
实施例3
一种复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法包括以下步骤：
步骤一、NAC和NAT贮备液制备：精密称定NAC对照品25mg，至25ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至最大刻度；精密称定NAT对照品26.9mg，至25ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至最大刻度；
NAC和NAT对照品溶液制备：
分别精密移取1ml NAC和1ml NAT对照品贮备液至同一25ml容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至最大刻度；
步骤二、精密移取复方氨基酸注射液1mL于20mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至最大刻度；
步骤三、确定色谱条件：
色谱柱：采用250mm×4.6mm、5μm的Agilent SB-Aq色谱柱；
流动相：流动相A为pH值为3.0的硫酸水溶液；流动相B：流动相A与乙腈按体积比为70:30的比例混合；
线性梯度洗脱条件为：0～7分钟：100％流动相A、0％流动相B；7～7.1分钟：由100％流动相A、0％流动相B匀速变为60％流动相A、40％流动相B；7.1～17分钟：60％流动相A、40％流动相B；17～17.1分钟：由60％流动相A、40％流动相B匀速变为100％流动相A、0％流动相B；17.1分钟以后：100％流动相A、0％流动相B；
流速：1.0mL/min；
柱温：23℃；
检测波长：210nm；
进样器温度：5℃；
步骤四、对所述对照品溶液进行高效液相色谱检测，记录峰面积；
步骤五、对所述供试品溶液进行高效液相色谱检测并输出色谱图，记录峰面积，如图3所示，再采用外标法计算供试品中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸的含量。
供试品与对照品的色谱分离参数见表3，
表3
Figure BDA0002510442170000061
色谱参数显示，NAC和NAT与相邻峰有很好的分离效果。
外标法计算供试品中NAC和NAT的含量。含量计算公式：供试品溶液中NAC(NAT)的峰面积/对照品溶液中NAC(NAT)的峰面积*对照品溶液中NAC(NAT)的浓度*供试品稀释倍数。
实施例4
一种复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法包括以下步骤：
步骤一、NAC和NAT贮备液制备：精密称定NAC对照品25mg，至25ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至最大刻度；精密称定NAT对照品26.9mg，至25ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释至最大刻度；
NAC和NAT对照品溶液制备：
分别精密移取1ml NAC和1ml NAT对照品贮备液至同一25ml容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至最大刻度；
步骤二、精密移取复方氨基酸注射液1mL于20mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至最大刻度；
步骤三、确定色谱条件：
色谱柱：采用250mm×4.6mm、5μm的Agilent SB-Aq色谱柱；
流动相：流动相A为pH值为3.3的硫酸水溶液；流动相B：流动相A与乙腈按体积比为70:30的比例混合；
线性梯度洗脱条件为：0～6.5分钟：100％流动相A、0％流动相B；6.5～8.5分钟：由100％流动相A、0％流动相B匀速变为70％流动相A、30％流动相B；8.5～20分钟：70％流动相A、30％流动相B；20～21分钟：由70％流动相A、30％流动相B匀速变为0％流动相A、100％流动相B；21～23分钟：0％流动相A、100％流动相B；23～24分钟：由0％流动相A、100％流动相B匀速变为100％流动相A、0％流动相B；24分钟以后：100％流动相A、0％流动相B；
流速：1.0mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：210nm；
进样器温度：5℃；
步骤四、对所述对照品溶液进行高效液相色谱检测，记录峰面积；
步骤五、对所述供试品溶液进行高效液相色谱检测并输出色谱图，记录峰面积，如图4所示，再采用外标法计算供试品中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸的含量。
供试品与对照品的色谱分离参数见表4，
表4
Figure BDA0002510442170000071
色谱参数显示，NAC和NAT与相邻峰有很好的分离效果。
外标法计算供试品中NAC和NAT的含量。含量计算公式：供试品溶液中NAC(NAT)的峰面积/对照品溶液中NAC(NAT)的峰面积*对照品溶液中NAC(NAT)的浓度*供试品稀释倍数。
方法的线性
按实施例4的色谱条件对NAC、NAT线性关系进行测定，分别配制不同浓度的NAC、NAT的工作标准溶液五份，分别进样分析，以峰面积与其对应浓度进行线性回归。结果表明，NAC工作标准溶液浓度在0.01003mg/ml～0.08024mg/ml之间时，以工作标准溶液浓度C对平均峰面积A进行线性回归，线性回归方程为y＝3272.5703x-0.8403，r＝0.9999；NAT工作标准溶液浓度在0.01080mg/ml～0.08637mg/ml之间时，以工作标准溶液浓度C对平均峰面积A进行线性回归，线性回归方程为y＝9773.8108x+1.5963，r＝0.9999。
方法的准确度和精密度
按实施例4的色谱条件对本发明方法的准确度和精密度进行试验，分别向乙酰半胱氨酸乙酰酪氨酸空白样品中添加乙酰半胱氨酸、乙酰酪氨酸，设计3种不同浓度，每种浓度分别制备3份供试品溶液进行测定，用9份样品的测定结果评价，乙酰半胱氨酸准确度和精密度结果见表5，乙酰酪氨酸准确度和精密度结果见表6。
表5
Figure BDA0002510442170000081
表6
Figure BDA0002510442170000082
Figure BDA0002510442170000091
对于乙酰半胱氨酸，在相当于供试品中乙酰半胱氨酸浓度在0.5730g/L～1.0438g/L范围内时，该法的回收率均在98.70％～99.50％之间，平均回收率为99.0％，RSD％(n＝9)＝0.3％；对于乙酰酪氨酸，在相当于供试品中乙酰酪氨酸浓度在0.6362g/L～1.1070g/L范围内时，该法的回收率均在99.93％～100.95％之间，平均回收率为100.6％，RSD％(n＝9)＝0.4％。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法，其特征是该检测方法包括以下步骤：
步骤一、使用0.01~0.1mol/L盐酸作为溶剂配制浓度均为0.010mg/ml~0.080mg/ml的乙酰半胱氨酸对照品和乙酰酪氨酸对照品溶液；
步骤二、复方氨基酸注射液加溶剂0.01~0.1mol/L盐酸进行稀释后作为供试品溶液；
步骤三、确定色谱条件：
色谱柱：Agilent SB-Aq色谱柱；
流动相：流动相A为pH 值为3.0-3.5的硫酸水溶液；流动相B：流动相A与乙腈按体积比为70:30的比例混合；
线性梯度洗脱条件为：0~7分钟：100%流动相A、0%流动相B；7~7.1分钟：由100%流动相A、0%流动相B 匀速变为70%流动相A、30%流动相B；7.1~20分钟：70%流动相A、30%流动相B；20~20.1分钟：由70%流动相A、30%流动相B 匀速变为100%流动相A、0%流动相B；20.1分钟以后：100%流动相A、0%流动相B；
或者，线性梯度洗脱条件为：0~7分钟：100%流动相A、0%流动相B；7~7.1分钟：由100%流动相A、0%流动相B 匀速变为60%流动相A、40%流动相B；7.1~17分钟：60%流动相A、40%流动相B；17~17.1分钟：由60%流动相A、40%流动相B 匀速变为100%流动相A、0%流动相B；17.1分钟以后：100%流动相A、0%流动相B；
或者，线性梯度洗脱条件为：0~6.5分钟：100%流动相A、0%流动相B；6.5~8.5分钟：由100%流动相A、0%流动相B 匀速变为70%流动相A、30%流动相B；8.5~20分钟：70%流动相A、30%流动相B；20~21分钟：由70%流动相A、30%流动相B 匀速变为0%流动相A、100%流动相B；21~23分钟：0%流动相A、100%流动相B；23~24分钟：由0%流动相A、100%流动相B 匀速变为100%流动相A、0%流动相B；24分钟以后：100%流动相A、0%流动相B；
流速：0.9-1.1mL/min；
柱温：23-28℃；
检测波长：210nm；
进样器温度：5℃；
步骤四、对所述对照品溶液进行高效液相色谱检测，记录峰面积；
步骤五、对所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，记录峰面积，再采用外标法计算供试品中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸的含量。
2.根据权利要求1所述的复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法，其特征是：步骤一和步骤二中所用溶剂为0.1mol/L盐酸。
3.根据权利要求1所述的复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法，其特征是：步骤三中，流速为1.0mL/min。
4.根据权利要求1所述的复方氨基酸注射液中乙酰半胱氨酸和乙酰酪氨酸含量的检测方法，其特征是：步骤三中，柱温为25℃。
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