CN101776648B - 测定葡萄糖醛酸内酯及其所含葡萄糖醛酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高效液相色谱法测定葡萄糖醛酸内酯含量，以及测定葡萄糖醛酸内酯中葡萄糖醛酸含量的方法。所用流动相由烷基磺酸盐溶液、乙腈和水组成。本方法开创性地采用烷基磺酸盐作为阴离子对试剂与葡萄糖醛酸的羧基形成离子对以达到分离的目的。本方法能检测到葡醛内酯中低达0.01％的葡萄糖醛酸，且5分钟之内即可完成一次检测，避免了葡醛内酯在水溶液中的水解。经方法学验证，本测定方法可得到良好的线性，精密度及准确度。
Description
技术领域：
本发明涉及一种药品含量的测定方法，具体涉及高效液相色谱法测定葡萄糖醛酸内酯含量，以及测定葡萄糖醛酸内酯中葡萄糖醛酸含量的方法。
背景技术：
葡萄糖醛酸内酯，简称葡醛内酯。英文名：Glucurolactone、Glucurone、Guronsan。化学名称为：D-(+)-呋喃葡萄糖醛酸-γ-内酯。
葡醛内酯水溶液不稳定，室温时水溶液中有40％的内酯和60％的葡萄糖醛酸达到互变平衡，提高温度以及在酸性介质存在下加速达到这个平衡。因此往往需要测定葡萄糖醛酸内酯中葡萄糖醛酸含量。
目前高效液相色谱法用于测定葡醛内酯中的葡萄糖醛酸主要是采用氢型阳离子交换柱，以低浓度的硫酸为流动相的方法进行测定。由于色谱柱具有较强的酸性，葡醛内酯在色谱柱内不断水解生成葡萄糖醛酸，导致两峰之间出现一个平台，1％以下的葡萄糖醛酸均被此平台掩盖，观察不到色谱峰，所以现有的方法不适用于葡醛内酯中葡萄糖醛酸的测定。
测定葡萄糖醛酸内酯中葡萄糖醛酸有两个难点：一是当葡醛内酯中葡萄糖醛酸含量很低时，现有技术的方法较难测到这些微量的葡萄糖醛酸；二是葡醛内酯在水中易于水解，因此需要有快速测定的方法。
所以，建立一种灵敏而快速的方法检测葡醛内酯中的葡萄糖醛酸的方法，很有必要。
发明内容：
本发明的目的是提供一种测定葡萄糖醛酸内酯含量或测定葡萄糖醛酸内酯中葡萄糖醛酸含量的方法，该方法应灵敏而快速。
本发明采用高效液相色谱法进行测定，经发明人试验，选用烷基磺酸盐溶液、乙腈和水组成的流动相，达到了本发明的目的。
所述流动相的体积比是：烷基磺酸盐溶液∶乙腈∶水＝5～8∶0～3∶1～5。
所述烷基磺酸盐中的烷基可以选用多种不同碳数的，优选的烷基磺酸盐为辛烷磺酸钠或庚烷磺酸钠。
所述烷基磺酸盐溶液优选是水溶液，浓度是0.01％～1.0％(W/V)。
上述流动相pH为2.5～3.5。
本方法开创性地采用烷基磺酸盐作为阴离子对试剂与葡萄糖醛酸的羧基形成离子对以达到分离的目的。而不是一般理论认为的应该用烷基铵盐阳离子对试剂。
本方法进行测定时，其它测定条件可根据本领域普通技术人员通常熟悉的高效液相色谱条件进行，如本发明的方法进行测定可使用以下条件：
色谱柱可选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
柱温为20～40℃；
所述的烷基磺酸盐溶液可用磷酸、盐酸或硝酸等稀酸调节pH为2.5～3.5。
经实验证实，本方法具有以下优点：
1、灵敏度高。能检测到葡醛内酯中低达0.01％的葡萄糖醛酸。
2、快速。5分钟之内即可完成一次检测。很大程度地避免了葡醛内酯在水溶液中的水解。
3、测定结果准确。经方法学验证，本测定方法可得到良好的线性，精密度及准确度。
附图说明：
图1是流动相空白高效液相色谱图；
图2是葡萄糖对照品高效液相色谱图；
图3是葡萄糖醛酸钠对照品高效液相色谱图；
图4是葡醛内酯对照品高效液相色谱图；
图5是酸降解实验高效液相色谱图；
图6是碱降解实验高效液相色谱图；
图7是氧化降解实验高效液相色谱图。
具体实施方式：
下面的实施例进一步举例说明本发明的方法，但是本发明的保护范围并不限于此实施例。
除特别说明，实施例中所用的实验条件如下：
高效液相色谱仪：日本岛津公司SHIMADZU LC-10AT；
检测波长：200nm；
流动相：0.1％辛烷磺酸钠(用稀磷酸调pH3.0±0.1)；
流速：0.8ml/min；
柱温：40℃；进样量：20μl；
色谱柱：Synergi 4um Hydro-RP 250×4.6mm 菲罗门公司
辛烷磺酸钠：分析纯，成都科龙化学试剂有限公司
葡萄糖醛酸钠对照品：纯度99.0％，西格玛有限公司
葡醛内酯对照品：纯度99.8％，重庆华邦制药股份有限公司
实施例1葡醛内酯中葡萄糖醛酸测定
1、溶液的配制
流动相的配制：称取辛烷磺酸钠1.0g，溶解于1000ml水中，摇匀，用稀磷酸调节其pH在2.9～3.1之间。
对照溶液——取葡萄糖醛酸钠对照品约45mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；取1ml至50ml容量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀。配制后立即使用。
样品溶液——取葡醛内酯样品约370mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。配制后立即使用。
系统适应性溶液——取葡萄糖醛酸钠对照品约45mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；取2ml至50ml容量瓶中，另取葡醛内酯对照品约370mg，精密称定后置该容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。配制后立即使用。
2、测定方法
分别将对照溶液和样品溶液各取20μl注入高效液相色谱仪，记录图谱时间为葡醛内酯峰保留时间的3.5倍，按下式计算样品中葡醛内酯的各相关物质含量：
式中：mS——葡萄糖醛酸对照品质量，g
AS——对照品溶液中葡萄糖醛酸峰响应值的平均值
PS——葡萄糖醛酸对照品含量
mX——葡萄糖醛酸供试品质量，g
AX——供试品溶液中的葡萄糖醛酸峰响应值
0.829是葡萄糖醛酸与一水葡萄糖醛酸钠之间的换算率(即每1g一水葡萄糖醛酸钠相当于0.829g葡萄糖醛酸)。
3、系统适应性
操作步骤：取系统适应性溶液20μl进样，计算葡醛内酯峰与葡萄糖醛酸峰的分离度，对称因子及理论塔板数。
表1系统适应性实验数据
| 进样次数 | 保留时间(min) | 葡萄糖醛酸峰面积(mAU) | 分离度 | 理论塔板数 | 对称因子 |
| 1 | 3.036 | 16405 | 3.28 | 2604 | 1.21 |
| 2 | 3.039 | 18660 | 3.28 | 2624 | 1.24 |
| 3 | 3.041 | 20968 | 3.27 | 2644 | 1.22 |
| 4 | 3.042 | 22181 | 3.28 | 2658 | 1.21 |
| 5 | 3.042 | 23317 | 3.28 | 2675 | 1.21 |
结论：葡醛内酯峰与葡萄糖醛酸峰的分离度大于2.0，不干扰测定。对称因子小于1.5，理论板数大于2000，峰面积不断增大，表明本品溶液不稳定，葡醛内酯不断转变为葡萄糖醛酸。测定时应临用新配。
4、方法专属性
操作步骤：
葡萄糖溶液——取葡萄糖约45mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；取1ml至50ml容量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀。配制后立即使用。
葡萄糖醛酸溶液——取葡萄糖醛酸钠对照品约45mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；取1ml至50ml容量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀。配制后立即使用。
葡醛内酯溶液——取葡醛内酯样品约370mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。配制后立即使用。
碱降解溶液——取葡醛内酯样品约370mg，加0.1M氢氧化钠溶液放置1分钟，用盐酸中和后，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。配制后立即使用。
酸降解溶液——取葡醛内酯样品约370mg，加0.1M盐酸溶液放置1小时，用氢氧化钠中和后，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。配制后立即使用。
氧化降解溶液——取葡醛内酯样品约370mg，加1％双氧水溶液放置25分钟，用盐酸中和后，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。配制后立即使用。
取流动相和上述各样品溶液分别进样，结果表明该流动相对样品测试无干扰，并可确认所有降解物质对葡醛内酯和葡糖醛酸的测试无干扰。测试结果见表2、表3。
表2专属性测试结果
| 进样样品 | 保留时间(minutes) | 高效液相色谱图 |
| 空白进样 | 溶剂峰不干扰测定 | 图1 |
| 葡萄糖 | 未检出 | 图2 |
| 葡萄糖醛酸钠标准品 | 3.112 | 图3 |
| 葡醛内酯标准品 | 3.776 | 图4 |
表3方法专属性测试结果-降解
结论：主要原料及各中间体在本系统中不干扰葡萄糖醛酸的测定，最近杂质峰与葡萄糖醛酸的分离度大于1.5，专属性强。
5、检测限测试
操作步骤：配制一定浓度的葡萄糖醛酸对照品溶液，进样，连续3次。计算主峰峰高与噪声的比值(信噪比)，信噪比(S/N)为3∶1的样品进样浓度即为检测限浓度。测试结果见表4
表4葡萄糖醛酸检测限数据
| 次数 | 浓度(g/ml) | 保留时间(min) | 主峰峰高 | 噪音 | S/N |
| 1 | 7.8×10-8 | 3.061 | 16 | 5.08 | 3.1 |
| 2 | 7.8×10-8 | 3.046 | 17 | 5.49 | 3.1 |
| 3 | 7.8×10-8 | 3.044 | 17 | 6.25 | 2.7 |
结论：葡萄糖醛酸检测限为7.8×10-8g/ml，样品中葡萄糖醛酸LOD为10.4μg/g。
6、定量限测试
操作步骤：配制一定浓度的葡萄糖醛酸对照品溶液，进样，连续3次。计算主峰峰高与噪声的比值(信噪比)，信噪比(S/N)为10∶1的样品进样浓度即为定量限浓度。
表5葡萄糖醛酸定量限数据
| 次数 | 浓度(g/ml) | 保留时间(min) | 主峰峰高 | 噪音 | S/N |
| 1 | 2.34×10-7 | 3.058 | 50 | 5.74 | 8.70 |
| 2 | 2.34×10-7 | 3.060 | 49 | 5.45 | 8.99 |
| 3 | 2.34×10-7 | 3.064 | 52 | 5.37 | 9.68 |
结论：葡萄糖醛酸定量限为2.34×10-7g/ml，样品中葡萄糖醛酸LOQ为31.2μg/g。
7、验证范围内的方法精密度
操作步骤：选择一批含有葡萄糖醛酸杂质的葡醛内酯样品，于相对于样品溶液配制浓度的80％、100％和120％三个浓度点配制样品溶液，每个浓度点各配制三份，按相关物质测试方法进行测试。计算每个样品溶液中各相关物质的含量。计算样品溶液中各相关物质的含量及相应的RSD。
表6方法精密度测试结果
8、验证范围的确认及方法准确度
操作步骤：按精密度测定80％、100％和120％浓度点的葡萄糖醛酸含量计算回收率及回收率的RSD。
表7准确度测试数据
结论：回收率均在95.0％～105.0％之间，回收率RSD＜2.0％，满足方法准确度要求。
9、验证范围内的线性测定
操作步骤：取葡萄糖醛酸对照品，在验证范围(定量限～杂质限度的120％)分别配制7个浓度进行测试。以浓度对应相应的峰面积做回归曲线，计算回归方程及相应的线性回归系数。
表8葡萄糖醛酸线性测试结果(LOQ～限度的120％)
结论：线性良好，符合要求。
方法耐用性：
10、溶液稳定性
取葡萄糖醛酸钠对照品约45.4mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；取1ml至50ml容量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀。按如下时间点测试。取葡醛内酯样品约375mg，精密称定后置50ml容量瓶中，流动向溶解并稀释至刻度，按如下时间点测试。用百分面积法测试并计算每个时间点葡萄糖醛酸的变化，在可接受范围确定葡醛内酯溶液的稳定性时间。时间点：0(初始点)，0.5小时
表9溶液稳定性测试表
结果：葡萄糖醛酸对照溶液在0.5h内稳定，样品溶液在0.5h内不稳定，从0.02％变到0.06％，葡醛内酯不断向葡萄糖醛酸转化，测定时样品应临用新配。
11、对照溶液进样重复性
取葡萄糖醛酸钠对照品约45.4mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；取1ml至50ml容量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀。重复进样5次。
表10进样重复性测试表
| 进样次数 | 峰面积(mAU) |
| 1 | 11825 |
| 2 | 11796 |
| 3 | 11815 |
| 4 | 11747 |
| 5 | 11772 |
| 平均值 | 11791 |
| RSD％ | 0.27％ |
结论：系统进样重复性良好。
实施例2葡醛内酯含量测定
1、流动相的配制
称取辛烷磺酸钠1.0g，溶解于1000ml水中，摇匀，用稀磷酸调节其pH在2.9～3.1之间。
供试品溶液的配制：取葡醛内酯样品约50mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(临用新配)。
对照品溶液的配制：取葡醛内酯对照品(在60℃，真空度1.5kPa～2.5kPa条件下干燥至3小时)约50mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(临用新配)。
2、测定方法
分别取对照品溶液和供试品溶液取20μl按上述色谱条件进样，记录色谱图，计算样品中葡醛内酯的含量。
式中：
mS——对照品质量，g；
AS——对照品溶液中主峰响应值的平均值；
PS——对照品含量；
mX——供试品质量，g；
AX——供试品溶液中的主峰响应值；
LOD——供试品的干燥失重。
3、系统适应性实验
操作步骤：取对照品溶液20μl进样，连续6次，计算葡醛内酯峰峰面积的RSD，对称因子及理论塔板数。
表11系统适应性实验数据
| 进样次数 | 保留时间(min) | 葡醛内酯峰面积 | 理论塔板数 | 对称因子 |
| 1 | 3.670 | 827396 | 7411 | 1.17 |
| 2 | 3.671 | 828873 | 7170 | 1.16 |
| 3 | 3.671 | 829648 | 7356 | 1.17 |
| 4 | 3.671 | 832452 | 7272 | 1.17 |
| 5 | 3.671 | 831487 | 7415 | 1.17 |
| 6 | 3.671 | 832964 | 7356 | 1.17 |
| 平均值 | 3.671 | 830470 | 7330 | 1.17 |
| RSD | 0.01％ | 0.26％ | 1.28％ | 0.35％ |
结论：葡醛内酯峰峰面积的RSD小于2.0％，理论板数大于3000，拖尾因子在0.8～1.5的范围内，满足系统适应性要求。
4、方法专属性
操作步骤：取样品稀释剂溶液(流动相)进样，证明该稀释剂对样品测试无干扰。单独配置适量浓度的主要合成原料、中间体及它们的混合溶液，以确认各主要合成原料和中间体及各种杂质与葡醛内酯主峰的分离度达到1.5以上。降解试验详见实例1的方法验证。
5、葡醛内酯定量限
操作步骤：配制浓度为7.5mg/ml的葡醛内酯对照品溶液，逐级稀释至一定浓度进样，连续2次。计算主峰峰高与噪声的比值，信噪比(S/N)为10∶1的样品进样浓度即为定量限浓度。
测试结果
表12葡醛内酯定量限数据
| 次数 | 浓度(g/ml) | 保留时间(min) | 主峰峰高 | 噪音 | S/N |
| 1 | 1.5×10-6 | 3.671 | 197 | 19 | 10.6 |
| 2 | 1.5×10-6 | 3.671 | 186 | 18 | 10.3 |
结论：信噪比(S/N)满足10∶1的要求，定量限浓度为1.5×10-6g/ml。
6、溶液稳定性
对照品溶液：取葡醛内酯对照品约375mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。分别于0、2、4、6小时取样测定，考察溶液稳定性。
表13溶液稳定性
| 时间点(h) | 0 | 2 | 4 | 6 | 平均 | RSD |
| 葡醛内酯面积 | 823757 | 829860 | 831338 | 833558 | 829471 | 0.40％ |
结论：对照品溶液在6小时内均稳定。
7、验证范围内的方法精密度
操作步骤：配制相对测定方法规定进样浓度的80％、100％和120％三个浓度点供试品溶液，每个浓度点各配制三份，按含量测试方法进行测试。计算每个供试品溶液中葡醛内酯的含量。计算供试品溶液中葡醛内酯含量及含量的RSD。
测试结果见表14。
表14方法精密度测试结果
结论 本测定方法精密度良好，符合要求。
Claims (5)
1.高效液相色谱法测定葡萄糖醛酸内酯含量或测定葡萄糖醛酸内酯中葡萄糖醛酸含量的方法，其特征为所用流动相中各组分的体积比是：
烷基磺酸盐水溶液:乙腈:水＝5～8:0～3:1～5；
所述烷基磺酸盐水溶液的浓度是0.01%～1.0%（W/V），且所述流动相的pH为2.5～3.5。
2.权利要求1所述的方法，所述烷基磺酸盐是辛烷磺酸钠或庚烷磺酸钠。
3.权利要求1所述的方法，所述的烷基磺酸盐溶液用稀酸调节pH至2.5～3.5。
4.权利要求1所述的方法，高效液相色谱法所用色谱柱的填充剂是十八烷基硅烷键合硅胶。
5.权利要求1所述的方法，所述色谱柱的柱温为20℃～40℃。
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