CN109459505B

CN109459505B - 一种测定甘露糖醛酸类物质重均分子量和含量的方法

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Publication number: CN109459505B
Application number: CN201710796485.3A
Authority: CN
Inventors: 曾洋洋; 黄道林; 张真庆
Original assignee: Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2037-09-06
Also published as: CN109459505A

Abstract

本发明属于天然药物化学和质量控制领域，涉及一种测定甘露糖醛酸类物质的可溶性盐重均分子量和含量的方法，包括使用甘露糖醛酸类物质的可溶性盐样品中的金属离子含量对SEC‑MALS测定酸性糖的重均分子量和含量结果进行校正。利用本发明方法可快速、准确测定甘露糖醛酸类物质的可溶性盐w的重均分子量、含量。

Description

一种测定甘露糖醛酸类物质重均分子量和含量的方法

技术领域

本发明属于天然药物化学和质量控制领域，涉及一种测定甘露糖醛酸类物质、特别是其可溶性盐的重均分子量和含量的方法。

背景技术

甘露糖醛酸类物质主要来源于海藻酸钠。海藻酸钠经酸解分级后，得到聚甘露糖醛酸(分子量约在2k-10kDa)，聚甘露寡糖醛酸经氧化得到甘露寡糖二酸(分子量在400-3000Da之间)。甘露寡糖二酸是具有特定分子骨架的低分子海洋酸性寡糖类化合物，可用于抗阿尔兹海默病(AD)。临床前药效学等研究结果表明甘露寡糖二酸具有对神经细胞的保护作用，最终改善记忆功能障碍，从而有效治疗阿尔兹海默病。通常以其可溶性盐的形式用于制备药物。中国专利申请CN1933845A及国际专利申请PCT/CN2016/113879公开了聚甘露糖醛酸及甘露寡糖二酸的相关情况。

中间体聚甘露糖醛酸及终产物甘露寡糖二酸的可溶性盐的重均分子量和含量是研制甘露寡糖二酸药物的重要测定参数。目前，中国药典中，高效液相凝胶渗透色谱法(GelPermeation Chromatography,GPC)是测定分子量的常规做法，其是按照排阻色谱的原理，不同分子量的多糖按照其大小顺序先后流出色谱柱，通过一系列不同分子量标准多糖与保留时间的相关性测得的校正曲线并计算相应的待测多糖的相对分子量。但该常规方法必须要有相应的多糖标准品而有一定的局限性。

此外，多糖和寡糖含量的测定常用方法为硫酸咔唑法，该方法首先以浓度及单糖标准品的显色做标准曲线，再在标准曲线上读出待测样品的含量。但是酸性糖的单糖甘露糖醛酸并没有标准品出售，若以葡萄糖醛酸为标准品，其与酸性糖的结构及显色效率存在差异，不能对酸性糖进行精确定量。

近年来出现的尺寸排阻色谱联用多角度激光散射(Size-ExclusionChromatography/Multi-Angle Laser Light Scattering，SEC-MALS)测定样品绝对重均分子量、分子量分布和含量在业界引起了广泛的关注。18角度激光光散射仪(MALS)工作原理是：激光束通过溶液会产生光散射，散射光强度与样品分子量及溶液浓度成正比，不同散射角度的光强及分子尺寸有关，因此在样品池周围不同位置设立多个检测探头(分子量的测量精度与角度数目的平方根成正比)同时接收不同角度的散射光强度信号。依照光散射方程K*c/R(θ)＝1/M_WP(θ)+2A₂c作Zimm图，即可得到大分子的重均绝对分子量Mw，均方旋转半径rg及第二维利系数A₂。MALS和尺寸排阻色谱(SEC)联用，不必依赖泵的流速、校正曲线及其他错误的假设，即可直接求的分子量及分子量分布等数据。MALS利用色谱柱分离出的样品在不同角度的光散射量，由示差折光(RI)检测器得到洗脱液浓度及dn/dc值计算得到质量，综合两者即可计算出各个切片的分子量。该方法不需标准品校准，克服了样品与标准品的化学组成、分子结构及大小不同带来的相对分子量测定的误差。已有研究者采用这一方法测定了壳聚糖、透明质酸的平均分子量(Monica Fee,Neil Errington,Kornelia Jumel,et al.Correlation of SEC/MALLS with ultracentrifμge andviscometric data for chitosans.Eur Biophys J(2003)32:457～464；Sanya Hokputsa,Kornelia Jumel,Catherine Alexander,et al.Comparison of molecular massdetermination of Hyaluronic acid using SEC/MALLS and sedimentationequilibrium.Eur Biophys J(2003)32:450～456)，还有研究者采用该方法对天然中性多糖进行定量，并预测该方法将成为多糖定量的一种常规技术(Kit-Leong Cheong,Ding taoWu,Jing Zhao,et al.A rapid and accurate method for the quantitativeestimation of natural polysaccharides and their fractions using highperformance size exclusion chromatography coupled with multi-angle laserlight scattering and refractive index detector.Journal of Chromatography A(2015)1400:98～106)。目前欧洲药典已经采用此方法作为羟乙基淀粉重均分子量及分子量分布的测定方法(European pharmacopoeia 8.0,p3307-3308,starcheshydroxyethyl)。

综上，SEC-MALS可以测定中性多糖重均分子量及含量。

发明内容

但是，本申请的发明人发现，使用SEC-MALS测定甘露糖醛酸类物质可溶性盐样品时常常无法准确获得的测定结果。为此，本发明的目的在于提供一种能够准确、高效、简单、稳定的检测甘露糖醛酸类物质可溶性盐重均分子量、含量的方法。

本发明的一个方面提供了甘露糖醛酸类物质可溶性盐重均分子量和含量的测定方法，包含以下步骤：

(1)测定甘露糖醛酸类物质可溶性盐样品中金属离子的重量百分含量A；

(2)使用SEC-MALS测定重均分子量Mw1和含量X；

(3)使用以下公式进行计算，分别得到甘露糖醛酸类物质可溶性盐的校正后的重均分子量和含量：

以上公式(1)中：Mw1为SEC-MALS法直接得到甘露糖醛酸类物质重均分子量(Da)；A为甘露糖醛酸类物质可溶性盐中金属离子的含量；

以上公式(2)中：X为图谱处理软件计算得到的质量；Y为进样的质量；A为甘露糖醛酸类物质可溶性盐中金属离子的含量。

利用本发明提供的测定方法，可以精确测定甘露糖醛酸类物质可溶性盐的重均分子量和含量，成功解决了甘露糖醛酸类物质可溶性盐重均分子量测定偏差大、含量定量不准的问题。

附图说明

图1所示为溶剂(A)和甘露寡糖二酸钠(B)的SEC-ICP-MS谱图和甘露寡糖二酸钠的SEC-MALS示差谱图(C)。

图2所示为甘露寡糖二酸钠五糖的总离子流图(A)、质谱图(B)和理论质量数列表(C)。

具体实施方式

定义

除非另外说明，否则所有的百分数、比例、比率或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练技术人员所熟知的熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本文中使用的术语“dn/dc”指折光指数增量，可使用本领域常用的方法进行测定(刘莉莉等.医用透明质酸钠凝胶的绝对分子量及其分布的测定方法[J]药物分析杂志2013，33(8)，1435-1438)；也可从本领域公开的相关技术文献中查询获得。

本文中使用的术语“SEC-MALS”指尺寸排阻色谱联用多角度激光散射(Size-Exclusion Chromatography/Multi-Angle Laser Light Scattering)，近年来被广泛应用于测定样品绝对重均分子量、分子量分布和含量，具体测定方法可采用本领域公知的方法(Monica Fee,Neil Errington,Kornelia Jumel,et al.Correlation of SEC/MALLS withultracentrifuge and viscometric data for chitosans.Eur Biophys J(2003)32:457～464；SanyaHokputsa,Kornelia Jumel,Catherine Alexander,et al.Comparison ofmolecular mass determination of Hyaluronic acid using SEC/MALLS andsedimentation equilibrium.Eur Biophys J(2003)32:450～456；Kit-Leong Cheong,Ding tao Wu,Jing Zhao,et al.A rapid and accurate method for the quantitativeestimation of natural polysaccharides and their fractions using highperformance size exclusion chromatography coupled with multi-angle laserlight scattering and refractive index detector.Journal of Chromatography A(2015)1400:98～106)。

本文中使用的术语“ICP-MS”指电感耦合等离子体质谱法(Inductively coupledplasma mass spectrometry)是当代元素组成测定技术中的重大发展，具有高灵敏度，干扰少、超痕量检测限、多元素同时分析等诸多优点，具体测定方法可采用本领域公知的方法，例如冯先进，屈太原.电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)最新应用进展.中国无机化学分析.(2011)1:46～52所记载的方法。

本文中使用的术语“ICP-OES”指电感耦合等离子体发射光谱法(InductivelyCoupled Plasma Optical Emission Spectrometer)，是本领域用于测定金属离子含量的常用方法，具体测定方法可采用本领域公知的方法。

技术问题的发现

本申请的发明人发现，使用已有的SEC-MALS方法测定甘露寡糖二酸钠样品时，样品峰后有未知峰，且计算得到甘露寡糖二酸钠的纯度不合理，MALS在此含量基础上得到的重均分子量亦有偏差。然而，目前没有针对这一现象的文献报道和解释。通常未知峰被认为是样品在色谱柱上发生吸附造成含量降低，但是发明人发现，这种情况在使用柱子多次分离后也未得到解决。

为探索该问题，发明人对SEC-MALS测定甘露寡糖二酸钠的未知峰进行解析，结果发现该未知峰对于得到甘露寡糖二酸钠的准确重均分子量和含量至关重要。

本发明的发明人发现，未知峰归属于甘露寡糖二酸钠结构中的金属离子钠，因此，甘露寡糖二酸钠的重均分子量和含量还应考虑金属离子含量的影响，进行校正，即SEC-MALS测定的重均分子量和含量除以甘露寡糖二酸钠中糖链部分所占的质量分数(1-钠离子含量)得甘露寡糖二酸钠的重均分子量和含量，即采用以下计算公式1、公式2进行校正：

以上公式(1)中：Mw1为SEC-MALS法直接得到甘露寡糖二酸重均分子量(Da)；A为钠离子的含量；

以上公式(2)中：X为图谱处理软件计算得到的质量(μg)；Y为进样的质量(μg)；A为钠离子的含量。

以上发现也适用于聚甘露糖醛酸类物质。

在本发明的一些实施方案中，所述甘露糖醛酸类物质，选自聚甘露糖醛酸或甘露寡糖二酸。

在本发明的一些实施方案中，所述甘露糖醛酸类物质的可溶性盐，选自甘露糖醛酸类物质的钠盐、钾盐、钙盐或镁盐；优选钠盐。

在本发明的一些实施方案中，所述甘露糖醛酸类物质的可溶性盐为甘露寡糖二酸的钠盐。

本发明的方法中，适用的甘露寡糖二酸类物质的定量下限可达20微克。

金属离子含量的测定

在本发明的实施方案中，所述甘露糖醛酸类物质可溶性盐中金属离子含量的测定方法选自：ICP-MS、ICP-OES、原子吸收或离子色谱法。优选ICP-MS、离子色谱法，更优选离子色谱法。这些测定方法如前文所描述。

电感耦合等离子体质谱法(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry,ICP-MS)是当代元素组成测定技术中的重大发展，具有高灵敏度，干扰少、超痕量检测限、多元素同时分析等诸多优点(冯先进，屈太原.电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)最新应用进展.中国无机化学分析.(2011)1:46～52)。发明人首次尝试将SEC与ICP-MS联用，成功确认了SEC-MALS测定甘露寡糖二酸可溶性盐样品峰后的未知峰为金属离子，同时能够获得金属离子的种类及含量的相关数据。

在此基础上，通过测定离子的种类及其含量来以期对SEC-MALS法测定的重均分子量和含量进行校正：通过将测得的重均分子量和含量分别除以甘露糖醛酸类物质可溶性盐中糖链部分所占的质量分数，进而分别得到甘露糖醛酸类物质可溶性盐的重均分子量和含量。

SEC-MALS方法测定分子量和含量及其校正

在本发明中，SEC-MALS方法用于测定甘露糖醛酸类物质可溶性盐的分子量和含量。在采用SEC-MALS方法进行解析时，发明人发现甘露寡糖二酸可溶性盐样品进入SEC柱分析时发生解离(可参见实施例1)，可见SEC-MALS方法得到是解离后不含金属离子的酸性糖的重均分子量和含量，因此甘露糖醛酸类物质可溶性盐的重均分子量和含量还应考虑金属离子含量的影响，进行校正。

在本发明采用的SEC-MALS方法中，可以使用醇+盐的溶液作为流动相；其流速可能为0.05-0.2mL/min；其中，所述流动相中醇的含量为0-20％。所述醇可为甲醇、乙醇、丙醇、环己醇或其混合物，所述盐选自NH₄Ac、NaCl或Na₂SO₄，盐溶液的浓度为0.02mol/L。

在本发明的另一优选实施方案中，SEC-MALS测定采用20％甲醇+80％80mmol/LNH₄Ac作为流动相；其流速为0.1mL/min。

在本发明的一些实施方案中，SEC-MALS测定采用适用分离的分子量范围400-20000Da，优选500-10000Da的色谱柱，例如Waters ACQUITY UPLC@BEH125

SEC 1.7um 4.6×300mm柱、AdvanceBio SEC

2.7μm 4.6×150mm柱(Agilent)、Shodex OHpak SB-802HQ 7.8×300mm(Shodex)、TSK G3000PWXL 7.8×300mm(TOSOH)、xBrige SEHSEC200

SEC 3.5um 7.8×300mm柱(Waters)。

在本发明的另一些实施方案中，聚甘露糖醛酸SEC-MALS测定采用适用分离的分子量范围2000-10000Da的色谱柱；甘露寡糖二酸类物质SEC-MALS测定采用适用分离的分子量范围400-3000Da的色谱柱。

在本发明的另一实施方案中，所述的测定方法还包括测定甘露寡糖二酸类物质折光指数增量(dn/dc)的步骤。例如，该测定包含以下必须的步骤：

(1)使用SEC-MALS测定的流动相溶解甘露寡糖二酸类物质样品，并将样品稀释，得到0.1mg/ml-2mg/ml浓度区间内的5-6个浓度点的系列溶液；

(2)用示差折光检测器(例如Wyatt，Optilab T-rEX(WTREX-08)分别依次进样流动相、步骤2中制备的样品溶液，并采集信号；

(3)由Astra软件计算得到dn/dc。

在本发明的一个实施方案中，甘露寡糖二酸类物质的重均分子量和含量测定方法如下：

步骤1：ICP-MS、ICP-OES、原子吸收或离子色谱法测定甘露寡糖二酸类物质中金属离子的重量百分含量A。

步骤2：测定甘露寡糖二酸类物质的dn/dc

(1)称定恒重的甘露寡糖二酸类物质样品，加入流动相溶解，配置成0.1-5mg/ml，优选0.2-2mg/ml的系列溶液，该系列溶液的浓度可以例如是0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml；使用醇+盐的溶液作为流动相；其中，所述流动相中醇的含量为0-20％。所述醇可为甲醇、乙醇、丙醇、环己醇或其混合物，所述盐选自NH₄Ac、NaNO₃、NaAc、NaCl或Na₂SO₄，盐溶液的浓度为0.02-0.5mol/L。

(2)用示差折光检测器(例如Wyatt，Optilab T-rEX(WTREX-08)分别依次进样流动相、和上述(1)中的系列溶液，并采集信号，

(3)由Astra软件计算得到dn/dc。

步骤3：SEC-MALS测定甘露寡糖二酸类物质的分子量和含量

(1)根据预估待测酸性糖分子量的范围，选择适合的色谱柱；

(2)配制甘露寡糖二酸类物质浓度为约1至1000mg/mL，优选2-500mg/ml的溶液，分3-10个梯度；例如约2、10、50、100、300mg/mL(浓度＝重量/体积)的溶液。

(3)使用醇+盐的溶液作为流动相；其流速可能为0.05-0.5mL/min；其中，所述流动相中醇的含量为0-20％。所述醇可为甲醇、乙醇、丙醇、环己醇或其混合物，所述盐选自NH₄Ac、NaCl或Na₂SO₄，盐溶液的浓度为0.02-0.5mol/L，检测器采用十八角激光检测器和示差折光检测器；

(4)使用Zimm图用外推法计算得到甘露寡糖二酸钠重均分子量Mw1；

(5)使用图谱处理软件计算得到的样品中甘露寡糖二酸钠质量X；

(6)使用以下公式进行计算，分别得到甘露寡糖二酸钠的重均分子量和含量：

以上公式(1)中：M_w1为SEC-MALS法直接得到甘露寡糖二酸钠的重均分子量(Da)；A为甘露寡糖二酸钠中金属离子的含量；

以上公式(2)中：X为图谱处理软件计算得到的质量；Y为进样的质量；A为金属离子的含量。

SEC-MALS法测定重均分子量和含量的其他具体操作条件可以根据常规的实验方案进行。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

(1)对甘露寡糖二酸类样品SEC-MALS分析中的未知峰进行解释。

(2)可以准确测定甘露寡糖二酸类样品的重均分子量和含量，重复性好，定量下限可达20微克。

(3)重均分子量和含量可在一次分析中得到，操作简单。

(4)可用于筛选在常温下具有良好的稳定性的甘露寡糖二酸可溶性盐样品，为多糖的产业化应用提供筛选条件。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例部分所使用的仪器包括：

LC：Agilent 1260液相色谱仪

18角度激光检测器：Wyatt DAWN HELEOS II

示差折光检测器：Wyatt Optilab T-rEX

ICP-MS：Agilent 7900 ICP-MS

离子色谱：瑞士万通

ICP-OES：美国Perkin-Elmer公司Optima7000DV电感耦合等离子发射光谱仪

火焰原子吸收：北京瑞利WFX-120B型火焰原子吸收光谱仪

实施例1 SEC与ICP-MS揭示酸性糖在尺寸排阻色谱的分离机理

(1)测试的样品为甘露寡糖二酸钠盐，将样品溶于水中，浓度2mg/ml，进样0.1ul。通过SEC色谱柱Waters ACQUITY UPLC@BEH125

(SEC 1.7um 4.6×300mm柱，购自Waters)，流动相为0.08mol/L NH4Ac，流速0.1mL/min；将SEC与ICP-MS联用，采集²³Na的信号。同时，使用溶剂水作为对照。

(2)将SEC与MALS联用，样品甘露寡糖二酸钠盐溶于流动相中，浓度10mg/ml，进样20ul。

附图1为溶剂水(图1A)和甘露寡糖二酸钠盐(图1B)的SEC-ICP-MS谱图，以及甘露寡糖二酸钠盐的SEC-MALS示差谱图(图1C)。结果显示，在SEC-ICP-MS谱图中，相比于阴性对照，甘露寡糖二酸钠盐在a处有明显Na盐峰，比较图1B和图1C可知，甘露寡糖二酸钠盐在SEC-ICP-MS谱图a处的Na盐峰与示差谱图b处的峰出峰位置一致，说明示差谱图b处的未知峰为钠盐峰，这意味着甘露寡糖二酸进入SEC柱分析时发生解离，SEC-MALS方法得到是解离后不含金属离子的甘露寡糖二酸的重均分子量和含量，提示为了准确计算出酸性糖可溶性盐的重均分子量和含量，采用SEC-MALS方法时，必须考虑酸性糖可溶性盐中的金属离子进行校正，具体计算见公式1、公式2。

以上公式(1)中：M_w1为Zimm图用外推法计算得到重均分子量(Da)；A为金属离子的含量。

以上公式(2)中：X为图谱处理软件计算得到的质量(μg)；Y为进样的质量(μg)；A为金属离子的含量。

实施例2 SEC-MALS方法和质谱方法互证

样品：甘露寡糖二酸五糖(Na型)、甘露寡糖二酸五糖(H型)

甘露寡糖二酸五糖(H型)样品的制备：取甘露寡糖二酸五糖(Na型)200mg，溶于5ml超纯水中，将甘露寡糖二酸五糖(Na型)溶液经过阳离子交换树脂(AG 50W-X8Resin，Bio-Rad)进行Na-H交换，收集流出液并干燥，即得甘露寡糖二酸五糖(H型)样品。

(1)色谱柱Waters ACQUITY UPLC@BEH125

SEC 1.7um4.6×300mm柱，10％甲醇+80％0.15mol/L NaCl为流动相，流速0.1mL/min。

(2)将SEC与MALS联用，样品溶于流动相中，浓度10mg/ml，进样20ul。

(3)将SEC与质谱联用，质谱条件见表1，将样品溶于水中，浓度10mg/ml，进样10ul。

表1质谱参数

(4)火焰原子吸收法测定金属离子含量：

采集Na 330.2nm的谱线，配制1mg/L、10mg/L、50mg/L、75mg/L和100mg/L的Na标准溶液；样品溶液浓度配制为200mg/L。

实施例2的结果见表2和图2。

表2甘露寡糖二酸五糖的SEC-MALS结果

Y为200ug，*：指采用实施例1中的公式校正

由表2甘露寡糖二酸五糖SEC-MALS结果可知，SEC-MALS测定的Na型和H型的M_w1相近(908Da和910Da)，说明SEC-MALS法直接测得为糖部分的重均分子量；通过离子色谱法测定金属离子含量得到A值后，采用实施例1中的公式校正，发现二者的差异明显增加；H型的X/Y％接近100％，而Na型校正后含量近于100％，表明SEC-MALS法直接测得为糖部分的含量。

液质联用结果详见附图2，结果显示，质谱图B为总离子流图中出峰位置a段的累积质谱图，从图B和表C可知，质谱测得的甘露寡糖二酸五糖的质量数同理论质量数一致，即甘露寡糖二酸五糖(H型)分子量为854-914Da，与SEC-MALS测定的结果(908Da和910Da)一致，进一步说明SEC-MALS的计算结果是不含金属离子的氢型甘露寡糖二酸五糖的重均分子量和含量，与实施例1的结论一致。综上，经过校正后，甘露寡糖二酸五糖(Na型)的重均分子量为1035Da，含量为97.7％。

实施例3用于测定甘露寡糖二酸钠盐的重均分子量和含量的SEC-MALS方法的建立和验证

步骤1：离子色谱测定甘露寡糖二酸钠盐中金属离子的比例

Na离子标准溶液配置为25、10、12.5、6.25、3.125ppm。样品浓度为2mg/ml。离子色谱条件：预柱：Metrosep C4 Guard/4.0；分离柱：Metrosep C5-150/4.0；流动相：5mM硝酸的超纯水溶液；流速：0.9ml/min；进样量20ul。以外标法进行金属离子含量的测定。

步骤2：测定甘露寡糖二酸钠盐的dn/dc

(1)称定恒重的样品20mg至10ml容量瓶中，加入流动相溶解，振摇，即得母液。分别取母液0.2、0.4、0.8、1.2、1.8ml，用流动相稀释至2ml，得0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml的一系列溶液。

(2)用示差折光检测器(Wyatt，Optilab T-rEX(WTREX-08)分别依次手动进样流动相、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml样品溶液，并采集信号，dn/dc由Astra软件计算得到dn/dc，平均值为0.145。

步骤3：SEC-MALS测定甘露寡糖二酸分子量、分子量分布和含量的方法学验证

(1)配制甘露寡糖二酸钠盐浓度约为2、10、50、100、300mg/mL(浓度＝重量/体积)的溶液，每个浓度各5份样品。

(2)色谱柱Waters ACQUITY UPLC@BEH125

SEC 1.7um4.6×300mm柱，20％甲醇+80％0.08mol/L NH4Ac为流动相，流速0.1mL/min，检测器：十八角激光检测器和示差折光检测器；进样量200ug。定量下限选择2mg/ml的样品，进样量分别为1、10、20ul。

(3)精密度与准确度：

准确度：分析方法的准确度以质控样品浓度的含量表示，要求回收率在100±10％之间。在该实验中，含量＝(实测浓度/理论浓度)×100％，与回收率的计算方式一致，后续统一以含量表示。

批内精密度：要求每批每浓度5个质控样品实测浓度的RSD％不大于5％，重均分子量的RSD％不大于5％。

批间精密度：要求每批5个浓度质控样品实测浓度的RSD％不大于5％，重均分子量的RSD％不大于5％。

(4)定量下限：要求准确度在85％-115％之间。

(5)供试品稳定性：考察300mg/mL、2mg/mL的溶液在室温放置1天，2-8℃冰箱中放置7天的稳定性。要求供试品稳定性样品的含量介于90％-110％，重均分子量的RSD％不大于5％。

实施例3的结果见表3，表4，表5、表6、表7、表9和表10。

表3离子色谱法测定的Na比例结果

样品编号	1	2	3	4	5	平均值
							Na％	12.18	12.44	12.23	12.54	12.73	12.43

表4：dn/dc测定结果

表5：5个浓度的5个平行样的重均分子量(已采用实施例1中的公式校正)

表6：5个浓度的5个平行样的含量(已采用实施例1中的公式校正)

表7：定量下限结果

表8：高低浓度下常温1天、2-8℃3天和7天样品的含量

表9：高低浓度下常温1天、2-8℃3天和7天样品的重均分子量(已采用实施例1中的公式校正)

由表3可知，甘露寡糖二酸中Na离子比例为12％(A＝12％)；由表4可知，甘露寡糖二酸的dn/dc为0.145ml/g。将Astra软件计算得到的Mw1及X值(Y＝200ug，为液相的实际进样量)用公式1、公式2进行校正，得表5、表6、表7、表8和表9的结果。

从表6看出，样品的含量均在100±10％范围之内，方法符合准确度要求；样品每浓度5个质控样品实测浓度的RSD％≤5％，重均分子量的RSD％≤5％(见表5)，方法符合批内精密度要求；样品5个浓度质控样品实测浓度的RSD％≤5％，重均分子量的RSD％≤5％(见表5)，方法符合批间精密度要求。从表7中看出，检测量为20ug时，RSD％≤10％，准确度在85％-115％之间，为方法的定量下限。常温放置1天、2-8℃放置3天和7天的供试品样品的含量介于90％-110％(表8)，重均分子量的RSD％＜5％(表9)，认为供试品在该放置条件下稳定。

综上，SEC-MALS用于甘露寡糖二酸重均分子量、分子量分布和含量的测定，具有很好的重现性、准确性和精密度，该方法定量下限为20ug，甘露寡糖二酸溶液样品在常温放置1天、2-8℃放置3天和7天稳定。

比较例硫酸咔唑法测定甘露寡糖二酸钠盐含量

步骤1甘露寡糖二酸钠标注曲线贮备液、线性溶液及样品溶液制备

贮备液：取60℃减压干燥16个小时的甘露寡糖二酸钠原料药0.012g，精密称定，置100ml容量瓶中，溶解，加水，定容，摇匀(120ug/ml)。线性溶液：精密量取甘露寡糖二酸钠贮备液0、0.1、0.3、0.5、0.8、1ml，分别加水补至1.0ml，摇匀。

样品溶液：取60℃减压干燥16个小时的甘露寡糖二酸钠原料药约0.010g，精密称定，置100ml容量瓶中，溶解，加水，定容，摇匀，平行配制六份。

步骤2硫酸咔唑反应

向上述溶液中加入硫酸(100ml硫酸含硼砂0.95g)3.5ml，0.1％的咔唑乙醇溶液0.2ml，混匀，沸水浴中加热10分钟。以水为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版二部附录ⅣA)，于530nm波长处测定吸光度，以吸光度作为纵坐标，微克数作为横坐标，绘制标准曲线，

并在该标准曲线上读出样品溶液的含量。

比较例的结果见表10和表11。

表10：140302批甘露寡糖二酸原料药的线性

表11：6个平行样的含量结果及平均值和RSD％值

1	2	3	4	5	6	平均值	RSD(％)
								120.08	97.01	113.45	102.00	96.96	103.00	105.42	8.12

从比较例结果(表10和表11)可以看出，6个平行样的含量平均值为105.42％，与理论含量100％相差较大，并且比较例RSD％为8.12％，远大于实施例3的RSD％(最大为3.8％)，说明比较例所采用的硫酸咔唑法方法重复性差，实施例3的方法优于比较例。

实施例4SEC-MALS用于测定甘露寡糖二酸钾盐的重均分子量和含量

步骤1：SEC-ICP-MS测定金属离子的比例

(1)色谱柱Waters ACQUITY UPLC@BEH125

SEC 1.7um4.6×300mm柱，0.05mol/LNH₄Ac为流动相，流速0.1mL/min。

(2)将SEC与ICP-MS联用，采集³⁹K的信号，样品溶于水中，浓度0.02mg/ml，进样20ul。

(3)K离子标准溶液分别配置，浓度为0.1ppm,0.5ppm,1.0ppm,5.0ppm and10.0ppm，进样20ul。

步骤2：测定dn/dc

(1)同实施例3步骤2。

步骤3：SEC-MALS测定重均分子量和含量

(1)色谱柱Waters ACQUITY UPLC@BEH 200

SEC 3.5um7.8×300mm柱(Waters)，300mmol/L Na₂SO₄为流动相，流速0.5mL/min。

(2)将SEC与MALS联用，样品溶液流动相中，浓度为10mg/ml，进样量20ul。

实施例4的结果见表12。

表12：甘露寡糖二酸钾盐的重均分子量和含量

Y为200ug；*:采用实施例1中的公式校正

从表12可以看出，经过校正后，SEC-MALS可以准确计算出甘露寡糖二酸钾盐的重均分子量和含量。

实施例5 SEC-MALS用于测定甘露寡糖二酸钙盐和甘露寡糖二酸镁盐的重均分子量和含量

步骤1：ICP-OES测定金属离子含量：

采集Ca和Mg的分析谱线，配制1mg/L、5mg/L、10mg/L的Na标准溶液；样品溶液浓度配制为20mg/L。具体仪器参数见表13。

表13：ICP-OES仪器参数

步骤2：测定dn/dc

方法同实施例3步骤2。

步骤3：SEC-MALS测定重均分子量和含量

(1)色谱柱Waters ACQUITY UPLC@BEH200

SEC 1.7um4.6×150mm柱，0.02mol/LNH₄Ac为流动相，流速0.2mL/min。

实施例5的结果见表14。

表14：甘露寡糖二酸钙盐和甘露寡糖二酸镁盐的金属离子比例、dn/dc及重均分子量和含量

Y为200ug；*:采用实施例1中的公式校正

从表14可以看出，经过校正，SEC-MALS可以准确计算出甘露寡糖二酸钙盐和甘露寡糖二酸镁盐的重均分子量和含量。

实施例6SEC-MALS用于测定聚甘露糖醛酸钠盐的重均分子量和含量

步骤1：离子色谱测定聚甘露糖醛酸钠盐中金属离子的比例

同实施例3步骤1。

步骤2：测定dn/dc

方法同实施例3步骤2。

步骤3：SEC-MALS测定重均分子量和含量

(1)色谱柱AdvanceBio SEC

，2.7μm 4.6×150mm柱(Agilent)，0.5mol/LNaCl为流动相，流速0.2mL/min。

实施例6的结果见表15。

表15：聚甘露糖醛酸钠盐的金属离子比例、dn/dc及重均分子量和含量

Y为200ug；*:采用实施例1中的公式校正

从表15可以看出，经过校正，SEC-MALS可以准确计算出聚甘露糖醛酸钠盐的重均分子量和含量。

实施例7 SEC-MALS用于测定聚甘露糖醛酸镁盐的重均分子量和含量

步骤1：离子色谱测定聚甘露糖醛酸镁盐中金属离子的比例

同实施例3步骤1。

步骤2：测定dn/dc

方法同实施例3步骤2。

步骤3：SEC-MALS测定重均分子量和含量

(1)色谱柱Shodex OHpak SB-803HQ 7.8×300mm(Shodex)；TSK G3000PWXL 7.8×300mm(TOSOH)，0.15mol/L NaNO₃为流动相，流速0.7mL/min。

实施例7的结果见表16。

表16:聚甘露糖醛酸镁盐的金属离子比例、dn/dc及重均分子量和含量

Y为200ug；*:采用实施例1中的公式校正

从表16可以看出，经过校正，SEC-MALS可以准确计算出聚甘露糖醛酸镁盐的重均分子量和含量。

实施例8 SEC-MALS用于测定聚甘露糖醛酸的重均分子量和含量

步骤1：离子色谱测定聚甘露糖醛酸中金属离子的比例

同实施例3步骤1。

步骤2：测定dn/dc

方法同实施例3步骤2。

步骤3：SEC-MALS测定重均分子量和含量

(1)色谱柱TSK G3000PWXL 7.8×300mm(TOSOH)，0.2mol/L NaAc为流动相，流速0.5mL/min。

实施例8的结果见表17。

表17聚甘露糖醛酸的金属离子比例、dn/dc及重均分子量和含量

Y为200ug；*:采用实施例1中的公式校正

从表17可以看出，经过校正，SEC-MALS可以准确计算出聚甘露糖醛酸的重均分子量和含量。

Claims

1.一种测定甘露糖醛酸类物质的可溶性盐的重均分子量和含量的方法，其特征在于，所述测定方法包含以下步骤：

(1)测定甘露糖醛酸类物质的可溶性盐样品中金属离子的重量百分含量A；

(2)使用尺寸排阻色谱联用多角度激光散射法测定重均分子量M_w1和质量X；

(3)使用以下公式进行计算，分别得到甘露糖醛酸类物质的可溶性盐的重均分子量和含量：

以上公式(1)中：Mw1为尺寸排阻色谱联用多角度激光散射法直接得到甘露糖醛酸类物质的重均分子量(Da)；A为甘露糖醛酸类物质的可溶性盐样品中金属离子的含量；

以上公式(2)中：X为图谱处理软件计算得到的质量；Y为进样的质量；A为甘露糖醛酸类物质的可溶性盐样品中金属离子的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘露糖醛酸类物质的可溶性盐选自甘露糖醛酸类物质的钠盐、钾盐、钙盐或镁盐。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘露糖醛酸类物质的可溶性盐为甘露糖醛酸类物质的钠盐。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中尺寸排阻色谱联用多角度激光散射法测定使用的流动相为甲醇+盐溶液，其流速为0.05-0.2mL/min。

5.如权利要求2或3所述的方法，其中，所述流动相中甲醇的含量为0-20％，盐选自NH₄Ac，NaCl或Na₂SO₄，盐溶液的浓度为0.05-0.5mol/L。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属离子含量的测定方法选自：ICP-MS、ICP-OES、原子吸收或离子色谱法。