JP7409055B2 - 検出器の出力を補正する方法、および多角度光散乱検出器 - Google Patents
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Description
本発明は、液体クロマトグラフィ等の分級装置の後段に複数の検出器を有するシステムにおいて、検出器の出力を補正するために用いられる方法、および出力補正機能を有する多角度光散乱検出器に関する。
液体試料中に分散しているタンパク質等の高分子を分離するための手法として、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）やゲルろ過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）が知られている。近年、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ：High Performance Liquid Chromatography）システムとして、紫外線（ＵＶ）吸光度検出器や示差屈折率（ＲＩ）検出器に加え、多角度光散乱検出器を用いる構成（つまり、２つ以上の検出器を有する構成）が実用に供されている。このように多角度光散乱検出器を用いることで、測定試料の分子量や粒子径が算出可能であるという特長がある。
このような２つ以上の検出器を有するＨＰＬＣシステムにおいては、各検出器からある時間幅を有するクロマトピーク信号が出力されるが、各検出器のセル容量や検出器間の配管容量により試料が拡散するため、後段の検出器ほどクロマトピーク信号が時間的に遅れ、かつクロマトピーク信号の時間幅が拡大する（つまり、バンドブロードニング（バンド拡大現象）が発生する）ことが知られている。
バンドブロードニングが発生すると、クロマトピーク信号の裾の部分では濃度を過小（または過大）評価することとなり、分子量が過大（または過小）に算出されてしまい、クロマトピーク信号内で一定であるはずの分子量との誤差がクロマトピーク信号の裾の部分で大きくなるといった問題が発生する。
そこで、このようなバンドブロードニングの影響を補正するために、クロマトピーク波形を数学的に拡大する方法が提案されている（特許文献１）。
バンドブロードニングが発生すると、クロマトピーク信号の裾の部分では濃度を過小（または過大）評価することとなり、分子量が過大（または過小）に算出されてしまい、クロマトピーク信号内で一定であるはずの分子量との誤差がクロマトピーク信号の裾の部分で大きくなるといった問題が発生する。
そこで、このようなバンドブロードニングの影響を補正するために、クロマトピーク波形を数学的に拡大する方法が提案されている（特許文献１）。
特許文献１には、２つ以上のディテクタ（検出器）ｉ（ｉは１～ｎ、ｎはディテクタの数）を有するシステムにおいて、ディテクタ間のバンド拡大現象を補正するために用いられる拡大モデルの最適フィットパラメータを定めるための方法であって、
（１）調節可能なパラメータαｊ（ｊは０，・・・，ｌ、ここでｌは調節可能な数）のセットを含む、拡大モデルＢ（α０，α１，・・・，αｌ，τ）を選択するステップ、
（２）分子量が単一の試料（参照用サンプル）を通液するステップ、
（３）試料由来のピーク信号を複数のディテクタ（紫外線吸光度検出器、ＭＡＬＳ検出器、ＲＩ検出器）により検出し、そのときの信号をＤi（ｔ）（ｉは、１～ｎ、ｎはディテクタの数）として集めるステップ、
（４）物理量（分子量）算出にあたり必要となる複数のＤi（ｔ）のうち、時間的に最も拡がったものを参照用信号Ｄｎ（ｔ）として規定するステップ、
（５）Ｄｎ（ｔ）と拡大関数Ｂ(αj, τ)とのコンボリューションによりＤi（ｔ）を拡大し、ピーク内でのＤｎ（ｔ）とＤi（ｔ）の差を最小化する最適フィットパラメータ（βi，τi，αij）を、以下の数式を用いて、最小二乗法により算出するステップ、
を含むものが記載されている。
ここで、βｉはディテクタｉのスケールファクタであり、αｉｊはディテクタｉとパラメータｊについての拡大の程度を表している。
（１）調節可能なパラメータαｊ（ｊは０，・・・，ｌ、ここでｌは調節可能な数）のセットを含む、拡大モデルＢ（α０，α１，・・・，αｌ，τ）を選択するステップ、
（２）分子量が単一の試料（参照用サンプル）を通液するステップ、
（３）試料由来のピーク信号を複数のディテクタ（紫外線吸光度検出器、ＭＡＬＳ検出器、ＲＩ検出器）により検出し、そのときの信号をＤi（ｔ）（ｉは、１～ｎ、ｎはディテクタの数）として集めるステップ、
（４）物理量（分子量）算出にあたり必要となる複数のＤi（ｔ）のうち、時間的に最も拡がったものを参照用信号Ｄｎ（ｔ）として規定するステップ、
（５）Ｄｎ（ｔ）と拡大関数Ｂ(αj, τ)とのコンボリューションによりＤi（ｔ）を拡大し、ピーク内でのＤｎ（ｔ）とＤi（ｔ）の差を最小化する最適フィットパラメータ（βi，τi，αij）を、以下の数式を用いて、最小二乗法により算出するステップ、
を含むものが記載されている。
ここで、βｉはディテクタｉのスケールファクタであり、αｉｊはディテクタｉとパラメータｊについての拡大の程度を表している。
つまり、特許文献１に記載のバンドブロードニングの補正方法では、単一分子量の試料のクロマトピーク信号の時間波形を一致させるフィッティングを行っているが、算出される分子量の絶対値に関しては不問である。
そして、紫外線吸光度検出器またはＲＩ検出器の出力が濃度cを表すように構成するためには、それぞれの検出器のセル内で濃度が一様であることが条件となるところ、クロマトグラフィのような通液しながらの測定の場合、セル内で濃度が一様になるとは限らないため、算出される分子量は誤差が大きくなるといった問題があった。
また、特許文献１に記載のバンドブロードニングの補正方法では、分子量が単一である必要があるため、補正に使用する試料は一般にタンパク質に限定されていた。つまり、例えば高分子化合物のように、重合比のばらつきにより分子量に分散があるような試料に対しては、バンドブロードニングの補正が適用できないといった問題もあった。
また、かかる課題は、分級装置として液体クロマトグラフィを用いた場合に限らず、フィールド・フロー・フラクショネーション装置など他の分級装置を用いた場合にも同様に生じていた。
そして、紫外線吸光度検出器またはＲＩ検出器の出力が濃度cを表すように構成するためには、それぞれの検出器のセル内で濃度が一様であることが条件となるところ、クロマトグラフィのような通液しながらの測定の場合、セル内で濃度が一様になるとは限らないため、算出される分子量は誤差が大きくなるといった問題があった。
また、特許文献１に記載のバンドブロードニングの補正方法では、分子量が単一である必要があるため、補正に使用する試料は一般にタンパク質に限定されていた。つまり、例えば高分子化合物のように、重合比のばらつきにより分子量に分散があるような試料に対しては、バンドブロードニングの補正が適用できないといった問題もあった。
また、かかる課題は、分級装置として液体クロマトグラフィを用いた場合に限らず、フィールド・フロー・フラクショネーション装置など他の分級装置を用いた場合にも同様に生じていた。
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、分級装置の後段に複数の検出器を有するシステムにおいて、検出器のセル内で濃度が一様でない場合であっても、分子量を正確に算出することができ、分子量に分散があるような試料に対してもバンドブロードニングの補正を行うことが可能な、検出器の出力を補正する方法を提供すること、およびこのような出力補正機能を有する光散乱検出器を提供することを目的とする。
本発明の第１の態様は、分級装置の後段に配置されるｎ個（ｎは２以上の整数）の検出器ｉ（ｉは１～ｎ）を有するシステムにおいて、検出器ｉの出力を補正する方法であって、検出器ｉは、分級装置を通過した試料が流れるセルと、セルの周囲に配置される複数の光検出部を有する多角度光散乱検出器を含み、分子量Ｍが既知の試料を分級装置に注入するステップと、検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を時間の関数として収集するステップと、多角度光散乱検出器の複数の光検出部の少なくとも１つの出力信号に基づいて、検出器ｉに対応する分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求めるステップと、分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が、既知の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に近づくように、検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正するステップと、を含む、方法に関する。
本発明の第２の態様は、液体の試料中の微粒子を検出するための多角度光散乱検出器であって、試料を保持する透明なフローセルと、フローセルにコヒーレント光を照射する光源と、フローセルから周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を受光する複数の光検出部と、複数の光検出部からの信号を受信し、試料の分子量を求める制御手段と、を備え、制御手段は、多角度光散乱検出器に直列に接続されるｎ個（ｎは１以上の整数）の検出器ｉ（ｉは１～ｎ）からの出力信号Ｄｉ（ｔ）を時間の関数として収集する信号収集手段と、複数の光検出部の少なくとも１つの信号に基づいて、検出器ｉに対応する分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求める分子量算出部と、分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が、既知の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に近づくように、検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正する補正部と、を有する、多角度光散乱検出器に関する。
本発明の方法によれば、複数の検出器のセル内で濃度が一様でない場合であっても、分子量を正確に算出することができるため、分子量に幅があるような試料に対してもバンドブロードニングの補正を行うことが可能となる。また、このようなバンドブロードニングの補正機能（つまり、出力補正機能）を有する多角度光散乱検出器を実現できる。
以下、本発明の光散乱検出装置および光散乱検出方法を添付図面に示す好適な実施形態に基づいて詳細に説明する。
図１は、本発明の実施形態に係る高速液体クロマトグラフィシステムの構成を説明するブロック図である。図１に示すように、本実施形態の高速液体クロマトグラフィシステム１は、溶媒１１０と、ポンプ１１２と、インジェクタ１１４と、カラム１１６と、紫外線（ＵＶ）検出器２００と、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）検出器３００と、示差屈折率（ＲＩ）検出器４００と、制御装置５００と、を備えている。
測定の対象となる試料は、インジェクタ１１４から導入され、ポンプ１１２で送液される溶媒１１０（例えば、水、メタノールなど）中に注入され、カラム１１６で分離され、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００、ＲＩ検出器４００に順次導入され、廃液容器（不図示）に送られる。
制御装置５００は、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００に接続され、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００からデータを収集すると共に、後述の最適フィッティングパラメータの算出、およびバンドブロードニングの補正を行う装置である。
なお、本明細書においては、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００を総称して「検出器」という。
測定の対象となる試料は、インジェクタ１１４から導入され、ポンプ１１２で送液される溶媒１１０（例えば、水、メタノールなど）中に注入され、カラム１１６で分離され、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００、ＲＩ検出器４００に順次導入され、廃液容器（不図示）に送られる。
制御装置５００は、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００に接続され、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００からデータを収集すると共に、後述の最適フィッティングパラメータの算出、およびバンドブロードニングの補正を行う装置である。
なお、本明細書においては、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００を総称して「検出器」という。
図２は、本実施形態のＵＶ検出器２００の構成の一例を示すブロック図である。図２に示すように、ＵＶ検出器２００は、光源２０１、ミラー２０２、入射スリット２０３、回折格子２０４、出射スリット２０５、ミラー２０６、フローセル２０７、第１光検出器２０９、第２光検出器２０８、ビームスプリッタ２１０等を備えている。
光源２０１から出た光（紫外光又は可視光）はミラー２０２で反射され、入射スリット２０３を通って、回折格子２０４に入射する。回折格子２０４で分光された光のうち、特定の波長の光が出射スリット２０５を通り、ミラー２０６で反射されて、ビームスプリッタ２１０によって２つの光路に分岐される。一方の光は、フローセル２０７に入射され、フローセル２０７を透過した光は検出光として第１光検出器２０９で検出される。もう一方の光は、参照光として第２光検出器２０８で検出される。検出光と参照光の光強度は制御装置５００に伝達され、吸光度が求められる。インジェクタ１１４から導入された試料は、カラム１１６で分離され、フローセル２０７内に順次導入され、ＭＡＬＳ検出器３００に送られる。カラム１１６で分離された各成分について特定波長における吸光度の時間変化を計測することで各成分の濃度を求めることができる。
光源２０１から出た光（紫外光又は可視光）はミラー２０２で反射され、入射スリット２０３を通って、回折格子２０４に入射する。回折格子２０４で分光された光のうち、特定の波長の光が出射スリット２０５を通り、ミラー２０６で反射されて、ビームスプリッタ２１０によって２つの光路に分岐される。一方の光は、フローセル２０７に入射され、フローセル２０７を透過した光は検出光として第１光検出器２０９で検出される。もう一方の光は、参照光として第２光検出器２０８で検出される。検出光と参照光の光強度は制御装置５００に伝達され、吸光度が求められる。インジェクタ１１４から導入された試料は、カラム１１６で分離され、フローセル２０７内に順次導入され、ＭＡＬＳ検出器３００に送られる。カラム１１６で分離された各成分について特定波長における吸光度の時間変化を計測することで各成分の濃度を求めることができる。
図３および図４は、本実施形態のＭＡＬＳ検出器３００の構成の一例を示す図であり、図３は、ＭＡＬＳ検出器３００の基本構成例の平面図を示し、図４は側面図を示している。図３および図４に示すように、ＭＡＬＳ検出器３００は、フローセル３１０、光源３２０、ディテクタ３３０（光検出部）、ビームダンパ３４０等を備えている。円筒体状のフローセル３１０の内部にＵＶ検出器２００からの試料を通液し、フローセル３１０および流路中心を通るように光源３２０から光を照射する。なお、ＵＶ検出器２００から導入された試料は、フローセル３１０内に順次導入され、ＲＩ検出器４００に送られる。
光源３２０としては、通常、可視レーザ光が用いられる。光の進行方向からの角度θが水平面上（ＸＹ平面上）の散乱角として定義され、異なる散乱角を検出するようにフローセル３１０および流路中心を通る水平面上（ＸＹ平面上）にディテクタ３３０が複数配置される。各ディテクタ３３０の出力は制御装置５００（図３及び図４において不図示）に伝達される。そして、制御装置５００によって、ディテクタ３３０の散乱光強度の角度依存性を測定することにより、粒子径や分子量が算出される。なお、ＭＡＬＳ検出器３００による分子量Ｍの計算には、下式（１）が用いられる。
ここで、cは濃度であり、Ｋ*は光学定数と呼ばれる定数であり、下式（２）で定義される。
また、Ｎａはアボガドロ数、ｄｎ／ｄｃは試料の屈折率増分、ｎ０は溶媒の屈折率、λ０は真空における入射光の波長である。また、Ｒ(θ,t)は散乱角度θにおける過剰レイリー比であり、ＭＡＬＳ検出器３００の出力Ｄ（ｔ）に比例係数σθをかけて算出される。この比例係数σθは、トルエンなど過剰レイリー比が既知の試料でＭＡＬＳ検出器３００の出力を測定することで決定される。
式（１）に示すように、分子量Ｍを算出するためには、試料の濃度c(t)を別の検出器で測定する必要がある。このため、本実施形態の高速液体クロマトグラフィシステム１においては、試料の濃度c(t)を求めるために、ＵＶ検出器２００およびＲＩ検出器４００を使用している。
光源３２０としては、通常、可視レーザ光が用いられる。光の進行方向からの角度θが水平面上（ＸＹ平面上）の散乱角として定義され、異なる散乱角を検出するようにフローセル３１０および流路中心を通る水平面上（ＸＹ平面上）にディテクタ３３０が複数配置される。各ディテクタ３３０の出力は制御装置５００（図３及び図４において不図示）に伝達される。そして、制御装置５００によって、ディテクタ３３０の散乱光強度の角度依存性を測定することにより、粒子径や分子量が算出される。なお、ＭＡＬＳ検出器３００による分子量Ｍの計算には、下式（１）が用いられる。
ここで、cは濃度であり、Ｋ*は光学定数と呼ばれる定数であり、下式（２）で定義される。
式（１）に示すように、分子量Ｍを算出するためには、試料の濃度c(t)を別の検出器で測定する必要がある。このため、本実施形態の高速液体クロマトグラフィシステム１においては、試料の濃度c(t)を求めるために、ＵＶ検出器２００およびＲＩ検出器４００を使用している。
図５は、本実施形態のＲＩ検出器４００の構成の一例を示す図である。図５に示すように、ＲＩ検出器４００は、フローセル４０２、光源４０４、スリット４０８、レンズ４１０、ミラー４１２、ゼログラス４１４、受光素子４１６等を備えている。フローセル４０２は、スリット４０８を介して入射する光源４０４からの測定光４０６の光軸上に配置されている。フローセル４０２はＭＡＬＳ検出器３００からの試料が通液される試料セル４０２ａと参照セル４０２ｂとを有し、試料セル４０２ａと参照セル４０２ｂは透明な隔壁によって仕切られている。
フローセル４０２の前方にはレンズ４１０が配置され、フローセル４０２の後方にはフローセル４０２を透過した光を反射させるミラー４１２が配置されている。ミラー４１２により反射された測定光４０６の光路上にフォトダイオードなどの受光素子４１６が設けられており、ミラー４１２で反射してフローセル４０２を透過した測定光４０６が受光素子４１６上に結像されるようになっている。反射後の測定光４０６の光路上のレンズ４１０と受光素子４１６との間に、受光素子４１６上でのスリット像を平行移動させるためのゼログラス４１４が配置されている。
光源４から発せられた光はスリット４０８を通って測定光４０６となり、レンズ４１０を通ってフローセル４０２に照射され、フローセル４０２を透過してミラー４１２で反射される。ミラー４１２からの反射光は再びフローセル４０２を透過してレンズ４１０によって受光素子４１６上にスリット像として結像される。受光素子４１６は２つの受光領域４１６Ａと４１６Ｂを備え、それぞれの受光領域への入射光量に基づく検出信号が制御装置５００（図３及び図４において不図示）に出力されるようになっている。
試料セル４０２ａ内と参照セル４０２ｂ内の屈折率差が０であるときに、スリット像が受光領域４１６Ａ、４１６Ｂの境界部分を跨ぐようにして受光素子４１６の受光面上に結像されるように調整されており、試料セル４０２ａ内に試料成分が導入されて試料セル４０２ａ内の屈折率が変化すると、試料セル４０２ａ内と参照セル４０２ｂ内の屈折率差が変化し、受光素子４１６の受光面に結像するスリット像が変位する。その変位を受光領域４１６Ａと４１６Ｂの検出信号値の差分をとることにより検出し、試料セル４０２ａ内と参照セル４０２ｂ内の屈折率差を求める。そして、制御装置５００によって、分離カラム１１６で分離された各成分について屈折率差の時間変化を計測することで各成分の濃度を求めることができる。
フローセル４０２の前方にはレンズ４１０が配置され、フローセル４０２の後方にはフローセル４０２を透過した光を反射させるミラー４１２が配置されている。ミラー４１２により反射された測定光４０６の光路上にフォトダイオードなどの受光素子４１６が設けられており、ミラー４１２で反射してフローセル４０２を透過した測定光４０６が受光素子４１６上に結像されるようになっている。反射後の測定光４０６の光路上のレンズ４１０と受光素子４１６との間に、受光素子４１６上でのスリット像を平行移動させるためのゼログラス４１４が配置されている。
光源４から発せられた光はスリット４０８を通って測定光４０６となり、レンズ４１０を通ってフローセル４０２に照射され、フローセル４０２を透過してミラー４１２で反射される。ミラー４１２からの反射光は再びフローセル４０２を透過してレンズ４１０によって受光素子４１６上にスリット像として結像される。受光素子４１６は２つの受光領域４１６Ａと４１６Ｂを備え、それぞれの受光領域への入射光量に基づく検出信号が制御装置５００（図３及び図４において不図示）に出力されるようになっている。
試料セル４０２ａ内と参照セル４０２ｂ内の屈折率差が０であるときに、スリット像が受光領域４１６Ａ、４１６Ｂの境界部分を跨ぐようにして受光素子４１６の受光面上に結像されるように調整されており、試料セル４０２ａ内に試料成分が導入されて試料セル４０２ａ内の屈折率が変化すると、試料セル４０２ａ内と参照セル４０２ｂ内の屈折率差が変化し、受光素子４１６の受光面に結像するスリット像が変位する。その変位を受光領域４１６Ａと４１６Ｂの検出信号値の差分をとることにより検出し、試料セル４０２ａ内と参照セル４０２ｂ内の屈折率差を求める。そして、制御装置５００によって、分離カラム１１６で分離された各成分について屈折率差の時間変化を計測することで各成分の濃度を求めることができる。
このように、本実施形態の高速液体クロマトグラフィシステム１は、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００が直列に配置されており、カラム１１６により分離された試料は、各検出器において、ある時間幅を有するクロマトピーク信号として出力されるようになっている。
図６は、本実施形態のＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００から出力されるクロマトピーク信号を示す図である。図６に示すように、本実施形態の高速液体クロマトグラフィシステム１は、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００が直列に配置されているため、各検出器のセル容量や検出器間の配管容量により試料が拡散し、後段の検出器ほどクロマトピーク信号が遅れ、かつピークの時間幅は拡大する（つまり、バンドブロードニングが発生する）。
そして、バンドブロードニングが発生すると、クロマトピーク信号の裾の部分では濃度を過小（または過大）評価することとなり、分子量が過大（または過小）に算出されてしまい、クロマトピーク信号内で一定であるはずの分子量との誤差がクロマトピーク信号の裾の部分で大きくなるといった問題が発生する。
そこで、かかる問題を解決するため、本実施形態の高速液体クロマトグラフィシステム１では、各検出器の出力を補正する機能（以下、「出力補正機能」又は「出力補正方法」という。）を備える構成を採っている。
図６は、本実施形態のＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００から出力されるクロマトピーク信号を示す図である。図６に示すように、本実施形態の高速液体クロマトグラフィシステム１は、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００が直列に配置されているため、各検出器のセル容量や検出器間の配管容量により試料が拡散し、後段の検出器ほどクロマトピーク信号が遅れ、かつピークの時間幅は拡大する（つまり、バンドブロードニングが発生する）。
そして、バンドブロードニングが発生すると、クロマトピーク信号の裾の部分では濃度を過小（または過大）評価することとなり、分子量が過大（または過小）に算出されてしまい、クロマトピーク信号内で一定であるはずの分子量との誤差がクロマトピーク信号の裾の部分で大きくなるといった問題が発生する。
そこで、かかる問題を解決するため、本実施形態の高速液体クロマトグラフィシステム１では、各検出器の出力を補正する機能（以下、「出力補正機能」又は「出力補正方法」という。）を備える構成を採っている。
以下、本実施形態の高速液体クロマトグラフィシステム１で実行される出力補正方法について詳述する。
（出力補正方法）
本実施形態の出力補正方法は、高速液体クロマトグラフィシステム１で実行される、各検出器のキャリブレーション方法であり、以下の（ａ）～（ｄ）のステップを含む。
（ａ）分子量Ｍが既知の試料を高速液体クロマトグラフィシステム１に注入する。
（ｂ）制御装置５００によって、試料のピークを各検出器によって検出し、そのときのＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００の出力信号をそれぞれ、時間の関数Ｄｉ（ｔ）（ｉは検出器の数を示す添字）として収集する。
（ｃ）制御装置５００によって、ＭＡＬＳ検出器３００の複数のディテクタ３３０の少なくとも１つの信号に基づいて、ＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００における分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求める。
（ｄ）制御装置５００によって、分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が、既知の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に近づくように、ＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正する。より具体的には、ＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００について、下式（３）のχｉ ２モデルを形成し、制御装置５００によって、ＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）と、調節可能なパラメータαｊ（ｊは０，・・・，ｌ、ここでｌは調節可能な数）のセットを含む拡大モデルＢ（α０，α１，・・・，αｌ，β，τ）とのコンボリューションを計算し、ピーク内で試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）と分子量相当値Ｍｉ（ｔ）との差を最小化するパラメータαｉｊ、βｉ、γｉを最小二乗法により算出し、パラメータαｉｊ、βｉ、γｉに基づいてＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正する。
ここで、βｉは検出器ｉのスケールファクタであり、αｉｊは検出器ｉとパラメータｊについての拡大の程度を表す係数であり、γｉは比例係数である。
本実施形態の出力補正方法は、高速液体クロマトグラフィシステム１で実行される、各検出器のキャリブレーション方法であり、以下の（ａ）～（ｄ）のステップを含む。
（ａ）分子量Ｍが既知の試料を高速液体クロマトグラフィシステム１に注入する。
（ｂ）制御装置５００によって、試料のピークを各検出器によって検出し、そのときのＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００の出力信号をそれぞれ、時間の関数Ｄｉ（ｔ）（ｉは検出器の数を示す添字）として収集する。
（ｃ）制御装置５００によって、ＭＡＬＳ検出器３００の複数のディテクタ３３０の少なくとも１つの信号に基づいて、ＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００における分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求める。
（ｄ）制御装置５００によって、分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が、既知の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に近づくように、ＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正する。より具体的には、ＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００について、下式（３）のχｉ ２モデルを形成し、制御装置５００によって、ＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）と、調節可能なパラメータαｊ（ｊは０，・・・，ｌ、ここでｌは調節可能な数）のセットを含む拡大モデルＢ（α０，α１，・・・，αｌ，β，τ）とのコンボリューションを計算し、ピーク内で試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）と分子量相当値Ｍｉ（ｔ）との差を最小化するパラメータαｉｊ、βｉ、γｉを最小二乗法により算出し、パラメータαｉｊ、βｉ、γｉに基づいてＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正する。
ここで、βｉは検出器ｉのスケールファクタであり、αｉｊは検出器ｉとパラメータｊについての拡大の程度を表す係数であり、γｉは比例係数である。
つまり、本実施形態の出力補正方法では、ＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００によって測定される分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に一致するような拡大関数Ｂのパラメータαｉｊ、βｉ、γｉ（以下、これらを総称して「最適フィッティングパラメータ」という。）を求め、この最適フィッティングパラメータを用いて各検出器の出力を補正している。
そして、かかる出力補正方法によって得られた、パラメータαｉｊ、βｉ、γｉに基づいて、ＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）を拡幅処理すると、バンドブロードニングが補正されるようになっている。
なお、上記（ｃ）のステップにおいて、分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を求めるときには、散乱角度依存性を無視することができるため、９０°の位置に配置されたディテクタ３３０の出力信号Ｄ９０°（ｔ）のみに基づいて、下式（４）、（５）によって分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を求めることができる。
ここで、Ｎａはアボガドロ数、ｄｎ／ｄｃは試料の屈折率増分、ｎ０は溶媒の屈折率、λ０は真空における入射光の波長、γｉ、σは比例係数である。
なお、式（３）、（４）より、出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも各検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが小さい場合（つまり、ＭＡＬＳ検出器３００が濃度検出器の後段に配置されている場合）、
となるため、ＵＶ検出器２００の出力信号Ｄｉ（ｔ）に対して最適フィッティングパラメータを求める場合、式（６）を適用することができる。
図７は、分子量が単一の試料（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に対して、本発明を適用した結果を示す図であり、ＵＶ検出器２００の出力信号に対して最適フィッティングパラメータを求めたときの、ＭＡＬＳ検出器３００の出力信号Ｄ９０°（ｔ）と、式（４）、（５）によって求めた分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を示す図である。なお、図７の分子量相当値Ｍｉ（ｔ）は、式（４）、（５）によって求めた分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）（既定値：67,000g/mol）で割った値とした。また、ＵＶ検出器２００の出力信号は波長２８０ｎｍにおける吸光度である。また、γはＢＳＡの波長２８０ｎｍにおけるモル吸光係数ε 0.67[mL/mg]から、γ= 1/εを用いた。
図７に示すように、分子量相当値Ｍｉ（ｔ）は、ピーク範囲内において略１．０となり、試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）（既定値：67,000g/mol）と略一致していることが分かる。
図７は、分子量が単一の試料（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に対して、本発明を適用した結果を示す図であり、ＵＶ検出器２００の出力信号に対して最適フィッティングパラメータを求めたときの、ＭＡＬＳ検出器３００の出力信号Ｄ９０°（ｔ）と、式（４）、（５）によって求めた分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を示す図である。なお、図７の分子量相当値Ｍｉ（ｔ）は、式（４）、（５）によって求めた分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）（既定値：67,000g/mol）で割った値とした。また、ＵＶ検出器２００の出力信号は波長２８０ｎｍにおける吸光度である。また、γはＢＳＡの波長２８０ｎｍにおけるモル吸光係数ε 0.67[mL/mg]から、γ= 1/εを用いた。
図７に示すように、分子量相当値Ｍｉ（ｔ）は、ピーク範囲内において略１．０となり、試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）（既定値：67,000g/mol）と略一致していることが分かる。
また、式（３）、（４）より、出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも各検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが大きい場合（つまり、ＭＡＬＳ検出器３００が濃度検出器の前段に配置されている場合）、
となるため、ＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）に対して最適フィッティングパラメータを求める場合、式（６）を適用することができる。
図８は、分子量が単一の試料（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に対して、本発明を適用した結果を示す図であり、ＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）に対して最適フィッティングパラメータを求めたときの、ＲＩ検出器４００の信号Ｄｉ（ｔ）と、式（４）、（５）によって求めた分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を示す図である。なお、図８の分子量相当値Ｍｉ（ｔ）は、式（４）、（５）によって求めた分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）（既定値：67,000g/mol）で割った値とした。また、タンパク質の屈折率増分dn/dcは0.185[mL/g]から、γ = 1 /（dn/dc）を用いた。
図８に示すように、分子量相当値Ｍｉ（ｔ）は、ピーク範囲内において略１．０となり、試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）（既定値：67,000g/mol）と略一致していることが分かる。
図８は、分子量が単一の試料（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））に対して、本発明を適用した結果を示す図であり、ＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）に対して最適フィッティングパラメータを求めたときの、ＲＩ検出器４００の信号Ｄｉ（ｔ）と、式（４）、（５）によって求めた分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を示す図である。なお、図８の分子量相当値Ｍｉ（ｔ）は、式（４）、（５）によって求めた分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）（既定値：67,000g/mol）で割った値とした。また、タンパク質の屈折率増分dn/dcは0.185[mL/g]から、γ = 1 /（dn/dc）を用いた。
図８に示すように、分子量相当値Ｍｉ（ｔ）は、ピーク範囲内において略１．０となり、試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）（既定値：67,000g/mol）と略一致していることが分かる。
また、上記（ａ）のステップにおいて、分子量に分散がある試料（例えば、高分子）が用いられる場合、下式（８）、（９）より、Ｍｎ／Ｍｗを算出し、算出したＭｎ／Ｍｗが試料の既知のＭｎ／Ｍｗと一致するように、下式（１０）のρを求め、下式（１０）より試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）を算出することができる。なお、本明細書では、試料が高分子など分子量に実質的な分散がある試料については、下式（１０）で算出されるＭ（ｔ）を「分子量」と称する。
ここで、Ｍｎは数平均分子量、Ｍｗは重量平均分子量、Ｍｐは各検出器ｉの出力信号が最大値となるときのピークトップ分子量、Ｃ（ｔ）は各検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）から求まる濃度である。
図９は、分子量に分散がある試料（Mw / Mn = 1.2）に対して、本発明を適用した結果を示す図であり、ＭＡＬＳ検出器３００の出力信号Ｄ９０°（ｔ）と、ＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）と、式（４）、（５）によって求めた分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を示す図である。なお、図９の分子量相当値Ｍｉ（ｔ）は、式（４）、（５）によって求めた分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を試料のピークトップ分子量Ｍｐで割った値とした。
図９に示すように、ＭＡＬＳ検出器３００をバンドブロードニングする場合、分子量に幅がある（分散がある）試料に対しても補正が可能である。
図９は、分子量に分散がある試料（Mw / Mn = 1.2）に対して、本発明を適用した結果を示す図であり、ＭＡＬＳ検出器３００の出力信号Ｄ９０°（ｔ）と、ＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）と、式（４）、（５）によって求めた分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を示す図である。なお、図９の分子量相当値Ｍｉ（ｔ）は、式（４）、（５）によって求めた分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を試料のピークトップ分子量Ｍｐで割った値とした。
図９に示すように、ＭＡＬＳ検出器３００をバンドブロードニングする場合、分子量に幅がある（分散がある）試料に対しても補正が可能である。
なお、上記（ａ）のステップにおいて、試料がタンパク質のように分子量一定である場合には、試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）が時間に依存しない定数となり、Ｍｎ／Ｍｗ＝１．０、ρ＝０となる。
また、上記（ｄ）のステップにおいて、拡大モデルＢは、下式（１１）によって与えられる指数－ガウス分布関数を適用することができる。図１０は、A = β = 5.0, tc = -1.0，w = 1.0，t0 = 3.0 としたときの、指数－ガウス分布関数の拡大モデルＢを示す図である。
また、拡大モデルＢは、下式（１２）によって与えられるガウス分布関数を適用することができる。図１１は、A = β = 5.0, tc = -1.0，w = 1.0，t0 = 3.0 としたときの、ガウス分布関数の拡大モデルＢを示す図である。
ここで、ｔｃはクロマトグラムの保持時間、ｗはガウス分布の標準偏差、ｔ０は指数分布の時定数、Ａはピーク面積であり、ｔｃ、ｗ、ｔ０は、拡大関数Ｂのαの一例である。
ここで、ｔｃはクロマトグラムの保持時間、ｗはガウス分布の標準偏差、ｔ０は指数分布の時定数、Ａはピーク面積であり、ｔｃ、ｗ、ｔ０は、拡大関数Ｂのαの一例である。
また、上述のように、出力補正方法によって得られた、パラメータαｉｊ、βｉ、γｉに基づいて、ＵＶ検出器２００及びＲＩ検出器４００の出力信号Ｄｉ（ｔ）を拡幅処理すると、バンドブロードニングが補正されるが、ピーク内での時間積分値が等しくなる必要があるため、拡幅処理後の出力信号をＤｉ＊（ｔ）としたときに、下式（１３）を満たすように構成されている。
また、濃度ｃ（ｔ）については、出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも各検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが小さい場合（つまり、ＭＡＬＳ検出器３００が濃度検出器の後段に配置されている場合）、下式（１４）で補正し、
出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも各検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが大きい場合（つまり、ＭＡＬＳ検出器３００が濃度検出器の前段に配置されている場合）、下式（１５）で補正することができる。
このように、濃度ｃ（ｔ）を補正することにより、通液時のセル内での濃度ムラによる出力値と濃度算出値との差を補償することができる。
このように、濃度ｃ（ｔ）を補正することにより、通液時のセル内での濃度ムラによる出力値と濃度算出値との差を補償することができる。
以上が本実施形態の説明であるが、本発明は、上記の構成に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内において様々な変形が可能である。例えば、本実施形態においては、制御装置５００は、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００とは別体の装置であるとしたが、このような構成に限定されるものではなく、制御装置５００は、例えば、ＭＡＬＳ検出器３００内に組み込まれていてもよい。
また、本実施形態の高速液体クロマトグラフィシステムは、ＵＶ検出器２００、ＭＡＬＳ検出器３００及びＲＩ検出器４００を備えるものとしたが、ＭＡＬＳ検出器３００とｎ個（ｎは１以上の整数）の濃度検出器ｉ（ｉは１～ｎ）を備えればよく、必ずしもＵＶ検出器２００やＲＩ検出器４００に限定されるものではない。
また、本実施形態においては、分子量に分散がある試料（例えば、高分子）が用いられる場合に、式（８）、（９）、（１０）によって試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）を算出したが、これに代えて、式（１）によって分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）を算出することもできる。
また、本実施形態においては、分級装置としてカラム１１６を備えた高速液体クロマトグラフィを用いる構成を示したが、本発明は、このような構成に限定されるものではなく、他の分級装置に適用することも可能である。分級装置の他の例としては、フィールド・フロー・フラクショネーション（ＦＦＦ）装置を含み、より具体的には、ＣＦ３（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｅｌｄ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）装置、ＡＦ４（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｆｌｏｗ Ｆｉｅｌｄ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）装置を含む。
なお、今回開示された実施の形態は、全ての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は、上記した説明ではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
［態様］
上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
（第１項）一態様に係る方法は、
分級装置（１）の後段に配置されるｎ個（ｎは２以上の整数）の検出器ｉ（ｉは１～ｎ）を有するシステムにおいて、前記検出器ｉの出力を補正する方法であって、
前記検出器ｉは、前記分級装置を通過した試料が流れるセルと前記セルの周囲に配置される複数の光検出部を有する多角度光散乱検出器を含み、
分子量Ｍが既知の試料を前記分級装置に注入するステップ（ステップ（ａ））と、
前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を時間の関数として収集するステップ（ステップ（ｂ））と、
前記多角度光散乱検出器の複数の光検出器の少なくとも１つの出力信号に基づいて、前記検出器ｉに対応する分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求めるステップ（ステップ（ｃ））と、
前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が、前記既知の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に近づくように、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正するステップ（ステップ（ｄ））と、を含む。
分級装置（１）の後段に配置されるｎ個（ｎは２以上の整数）の検出器ｉ（ｉは１～ｎ）を有するシステムにおいて、前記検出器ｉの出力を補正する方法であって、
前記検出器ｉは、前記分級装置を通過した試料が流れるセルと前記セルの周囲に配置される複数の光検出部を有する多角度光散乱検出器を含み、
分子量Ｍが既知の試料を前記分級装置に注入するステップ（ステップ（ａ））と、
前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を時間の関数として収集するステップ（ステップ（ｂ））と、
前記多角度光散乱検出器の複数の光検出器の少なくとも１つの出力信号に基づいて、前記検出器ｉに対応する分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求めるステップ（ステップ（ｃ））と、
前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が、前記既知の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に近づくように、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正するステップ（ステップ（ｄ））と、を含む。
第１項に記載の方法によれば、分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が、既知の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に近づくように、検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）が補正されるため、検出器のセル内で濃度が一様でない場合であっても、分子量を正確に算出することができ、分子量に分散があるような試料に対してもバンドブロードニングの補正を行うことができる。
（第２項）第１項に記載の方法において、
前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正するステップは、前記検出器ｉについて、下式（１）のχｉ ２モデルを形成し、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）と、調節可能なパラメータαｊ（ｊは０，・・・，ｌ、ここでｌは調節可能な数）のセットを含む拡大モデルＢ（α０，α１，・・・，αｌ，β，τ）とのコンボリューションを計算し、ピーク内で前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）と前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）との差を最小化するパラメータαｉｊ、βｉ、γｉを最小二乗法により算出する。
ここで、βｉは前記検出器ｉのスケールファクタであり、αｉｊは前記検出器ｉとパラメータｊについての拡大の程度を表す係数であり、γｉは比例係数である。
前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正するステップは、前記検出器ｉについて、下式（１）のχｉ ２モデルを形成し、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）と、調節可能なパラメータαｊ（ｊは０，・・・，ｌ、ここでｌは調節可能な数）のセットを含む拡大モデルＢ（α０，α１，・・・，αｌ，β，τ）とのコンボリューションを計算し、ピーク内で前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）と前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）との差を最小化するパラメータαｉｊ、βｉ、γｉを最小二乗法により算出する。
第２項に記載の方法によれば、試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）と分子量相当値Ｍｉ（ｔ）の差が最小となるパラメータαｉｊ、βｉ、γｉが求まるため、これによってフィッティングを行うと、検出器のセル内で濃度が一様でない場合であっても、分子量を正確に算出することができ、分子量に分散があるような試料に対してもバンドブロードニングの補正を行うことができる。
（第３項）第１項又は第２項に記載の方法において、
前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求めるステップは、前記多角度光散乱検出器が有する複数の光検出部（３３０）のうち、９０°の位置に配置された光検出部の出力信号Ｄ９０°（ｔ）に基づいて、下式（２）、（３）によって分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を求める。
ここで、Ｎａはアボガドロ数、ｄｎ／ｄｃは試料の屈折率増分、ｎ０は溶媒の屈折率、λ０は真空における入射光の波長、σは比例係数である。
前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求めるステップは、前記多角度光散乱検出器が有する複数の光検出部（３３０）のうち、９０°の位置に配置された光検出部の出力信号Ｄ９０°（ｔ）に基づいて、下式（２）、（３）によって分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を求める。
第３項に記載の方法によれば、９０°の位置に配置された光検出部のみの出力信号から、簡単に分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を求めることができる。
（第４項）第３項に記載の方法において、
前記出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが小さい場合、前記式（１）は、下式（４）に展開され、
前記出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが大きい場合、前記式（１）は、下式（５）に展開される。
前記出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが小さい場合、前記式（１）は、下式（４）に展開され、
前記出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが大きい場合、前記式（１）は、下式（５）に展開される。
第４項に記載の方法によれば、９０°の位置に配置された光検出部のみの出力信号から、簡単に最適なパラメータαｉｊ、βｉ、γｉを得ることができる。
（第５項）第１項から第４項に記載の方法において、
前記試料は、分子量に分散がある試料であり、
下式（６）、（７）より、Ｍｎ／Ｍｗを算出し、該算出したＭｎ／Ｍｗが前記試料の既知のＭｎ／Ｍｗと一致するように、下式（８）のρを求め、下式（８）より前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）を算出するステップをさらに含む。
ここで、Ｍｎは数平均分子量、Ｍｗは重量平均分子量、Ｍｐは前記検出器ｉの出力信号が最大値となるときのピークトップ分子量、Ｃ（ｔ）は前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）から求まる濃度である。
前記試料は、分子量に分散がある試料であり、
下式（６）、（７）より、Ｍｎ／Ｍｗを算出し、該算出したＭｎ／Ｍｗが前記試料の既知のＭｎ／Ｍｗと一致するように、下式（８）のρを求め、下式（８）より前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）を算出するステップをさらに含む。
第５項に記載の方法によれば、分子量に分散がある試料であっても試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）を容易に算出することができる。
（第６項）第１項から第４項に記載の方法において、
前記試料は、単一分子量の試料であり、前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）が時間に依存しない定数である。
前記試料は、単一分子量の試料であり、前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）が時間に依存しない定数である。
第６項に記載の方法によれば、単一分子量の試料の場合、演算が簡単になる。
（第７項）第１項から第６項に記載の方法において、
前記拡大モデルＢは、下式（９）によって与えられる指数－ガウス分布関数である。
ここで、ｔｃはクロマトグラムの保持時間、ｗはガウス分布の標準偏差、ｔ０は指数分布の時定数、Ａはピーク面積である。
前記拡大モデルＢは、下式（９）によって与えられる指数－ガウス分布関数である。
第７項に記載の方法によれば、指数－ガウス分布関数を用いて、正確なフィティングを行うことができる。
（第８項）第１項から第６項に記載の方法において、
前記拡大モデルＢは、下式（１０）によって与えられるガウス分布関数である。
ここで、ｔｃはクロマトグラムの保持時間、ｗはガウス分布の標準偏差、ｔ０は指数分布の時定数、Ａはピーク面積である。
前記拡大モデルＢは、下式（１０）によって与えられるガウス分布関数である。
ここで、ｔｃはクロマトグラムの保持時間、ｗはガウス分布の標準偏差、ｔ０は指数分布の時定数、Ａはピーク面積である。
第８項に記載の方法によれば、ガウス分布関数を用いて、正確なフィティングを行うことができる。
（第９項）第１項から第８項に記載の方法において、
前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正するステップは、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を拡幅する処理である。
前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正するステップは、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を拡幅する処理である。
第９項に記載の方法によれば、検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）に発生するバンドブロードニングを補正することができる。
（第１０項）第９項に記載の方法において、
前記拡幅処理後の出力信号をＤｉ＊（ｔ）としたときに、下式（１１）を満たす。
ここで、ｋは比例係数である。
前記拡幅処理後の出力信号をＤｉ＊（ｔ）としたときに、下式（１１）を満たす。
第１０項に記載の方法によれば、ピーク内での時間積分値が等しくなるように、バンドブロードニングが補正される。
（第１１項）一態様に係る多角度光散乱検出器（３００）は、
液体の試料中の微粒子を検出するための多角度光散乱検出器（３００）であって、
前記試料を保持する透明なフローセル（３１０）と、
前記フローセルにコヒーレント光を照射する光源（３２０）と、
前記フローセルから周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を受光する複数の光検出部（３３０）と、
前記複数の光検出部からの信号を受信し、前記試料の分子量を求める制御手段（５００）と、
を備え、
前記制御手段（５００）は、
前記多角度光散乱検出器に直列に接続されるｎ個（ｎは１以上の整数）の検出器ｉ（ｉは１～ｎ）からの出力信号Ｄｉ（ｔ）を時間の関数として収集する信号収集手段（ステップ（ｂ））と、
前記複数の光検出部の少なくとも１つの信号に基づいて、前記検出器ｉに対応する分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求める分子量算出部（ステップ（ｃ））と、
前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が、前記既知の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に近づくように、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正する補正部（ステップ（ｄ））と、
を有する。
液体の試料中の微粒子を検出するための多角度光散乱検出器（３００）であって、
前記試料を保持する透明なフローセル（３１０）と、
前記フローセルにコヒーレント光を照射する光源（３２０）と、
前記フローセルから周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を受光する複数の光検出部（３３０）と、
前記複数の光検出部からの信号を受信し、前記試料の分子量を求める制御手段（５００）と、
を備え、
前記制御手段（５００）は、
前記多角度光散乱検出器に直列に接続されるｎ個（ｎは１以上の整数）の検出器ｉ（ｉは１～ｎ）からの出力信号Ｄｉ（ｔ）を時間の関数として収集する信号収集手段（ステップ（ｂ））と、
前記複数の光検出部の少なくとも１つの信号に基づいて、前記検出器ｉに対応する分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求める分子量算出部（ステップ（ｃ））と、
前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が、前記既知の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に近づくように、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正する補正部（ステップ（ｄ））と、
を有する。
第１１項に記載の多角度光散乱検出器によれば、分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が、既知の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に近づくように、検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）が補正されるため、検出器のセル内で濃度が一様でない場合であっても、分子量を正確に算出することができ、分子量に分散があるような試料に対してもバンドブロードニングの補正を行うことができる。
（第１２項）第１１項に記載の多角度光散乱検出器において、
前記補正部（ステップ（ｄ））は、前記検出器ｉについて、下式（１）のχｉ ２モデルを形成し、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）と、調節可能なパラメータαｊ（ｊは０，・・・，ｌ、ここでｌは調節可能な数）のセットを含む拡大モデルＢ（α０，α１，・・・，αｌ，β，τ）とのコンボリューションを計算し、ピーク内で前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）と前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）との差を最小化するパラメータαｉｊ、βｉ、γｉを最小二乗法により算出する。
ここで、βｉは前記検出器ｉのスケールファクタであり、αｉｊは前記検出器ｉとパラメータｊについての拡大の程度を表す係数であり、γｉは比例係数である。
前記補正部（ステップ（ｄ））は、前記検出器ｉについて、下式（１）のχｉ ２モデルを形成し、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）と、調節可能なパラメータαｊ（ｊは０，・・・，ｌ、ここでｌは調節可能な数）のセットを含む拡大モデルＢ（α０，α１，・・・，αｌ，β，τ）とのコンボリューションを計算し、ピーク内で前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）と前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）との差を最小化するパラメータαｉｊ、βｉ、γｉを最小二乗法により算出する。
第１２項に記載の多角度光散乱検出器によれば、試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）と分子量相当値Ｍｉ（ｔ）の差が最小となるパラメータαｉｊ、βｉ、γｉが求まるため、これによってフィッティングを行うと、検出器のセル内で濃度が一様でない場合であっても、分子量を正確に算出することができ、分子量に分散があるような試料に対してもバンドブロードニングの補正を行うことができる。
（第１３項）第１１項又は第１２項に記載の多角度光散乱検出器において、
前記分子量算出部は、前記複数の光検出部のうち、９０°の位置に配置された光検出部の出力信号Ｄ９０°（ｔ）に基づいて、下式（２）、（３）によって分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を求める。
ここで、Ｎａはアボガドロ数、ｄｎ／ｄｃは試料の屈折率増分、ｎ０は溶媒の屈折率、λ０は真空における入射光の波長、σは比例係数である。
前記分子量算出部は、前記複数の光検出部のうち、９０°の位置に配置された光検出部の出力信号Ｄ９０°（ｔ）に基づいて、下式（２）、（３）によって分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を求める。
ここで、Ｎａはアボガドロ数、ｄｎ／ｄｃは試料の屈折率増分、ｎ０は溶媒の屈折率、λ０は真空における入射光の波長、σは比例係数である。
第１３項に記載の多角度光散乱検出器によれば、９０°の位置に配置された光検出部のみの出力信号から、簡単に分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を求めることができる。
（第１４項）第１３項に記載の多角度光散乱検出器において、
前記出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが小さい場合、前記式（１）は、下式（４）に展開され、
前記出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも前記検出器ｉの信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが大きい場合、前記式（１）は、下式（５）に展開される。
前記出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが小さい場合、前記式（１）は、下式（４）に展開され、
前記出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも前記検出器ｉの信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが大きい場合、前記式（１）は、下式（５）に展開される。
第１４項に記載の多角度光散乱検出器によれば、９０°の位置に配置された光検出部のみの出力信号から、簡単に最適フィッティングパラメータを得ることができる。
（第１５項）第１１項から第１４項に記載の多角度光散乱検出器において、
前記試料は、分子量に分散がある試料であり、
前記補正部は、下式（６）、（７）より、Ｍｎ／Ｍｗを算出し、該算出したＭｎ／Ｍｗが前記試料の既知のＭｎ／Ｍｗと一致するように、下式（８）のρを求め、下式（８）より前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）を算出する。
ここで、Ｍｎは数平均分子量、Ｍｗは重量平均分子量、Ｍｐは前記検出器ｉの出力信号が最大値となるときのピークトップ分子量、Ｃ（ｔ）は前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）から求まる濃度、ρは比例定数である。
前記試料は、分子量に分散がある試料であり、
前記補正部は、下式（６）、（７）より、Ｍｎ／Ｍｗを算出し、該算出したＭｎ／Ｍｗが前記試料の既知のＭｎ／Ｍｗと一致するように、下式（８）のρを求め、下式（８）より前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）を算出する。
ここで、Ｍｎは数平均分子量、Ｍｗは重量平均分子量、Ｍｐは前記検出器ｉの出力信号が最大値となるときのピークトップ分子量、Ｃ（ｔ）は前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）から求まる濃度、ρは比例定数である。
第１５項に記載の多角度光散乱検出器によれば、分子量に分散がある試料であっても試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）を容易に算出することができる。
（第１６項）第１１項から第１４項に記載の多角度光散乱検出器において、
前記試料は、単一分子量の試料であり、前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）が時間に依存しない定数である。
前記試料は、単一分子量の試料であり、前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）が時間に依存しない定数である。
第１６項に記載の多角度光散乱検出器によれば、単一分子量の試料の場合、演算が簡単になる。
（第１７項）第１１項から第１６項に記載の多角度光散乱検出器において、
前記拡大モデルＢは、下式（９）によって与えられる指数－ガウス分布関数である。
ここで、ｔｃはクロマトグラムの保持時間、ｗはガウス分布の標準偏差、ｔ０は指数分布の時定数、Ａはピーク面積である。
前記拡大モデルＢは、下式（９）によって与えられる指数－ガウス分布関数である。
第１７項に記載の多角度光散乱検出器によれば、指数－ガウス分布関数を用いて、正確なフィティングを行うことができる。
（第１８項）第１１項から第１６項に記載の多角度光散乱検出器において、
前記拡大モデルＢは、下式（１０）によって与えられるガウス分布関数である。
ここで、ｔｃはクロマトグラムの保持時間、ｗはガウス分布の標準偏差、ｔ０は指数分布の時定数、Ａはピーク面積である。
前記拡大モデルＢは、下式（１０）によって与えられるガウス分布関数である。
ここで、ｔｃはクロマトグラムの保持時間、ｗはガウス分布の標準偏差、ｔ０は指数分布の時定数、Ａはピーク面積である。
第１８項に記載の多角度光散乱検出器によれば、ガウス分布関数を用いて、正確なフィティングを行うことができる。
（第１９項）第１１項から第１８項に記載の多角度光散乱検出器において、
前記補正部は、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を拡幅する。
前記補正部は、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を拡幅する。
第１９項に記載の多角度光散乱検出器によれば、検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）に発生するバンドブロードニングを補正することができる。
（第２０項）第１９項に記載の多角度光散乱検出器において、
前記補正部は、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を拡幅した後の出力信号をＤｉ＊（ｔ）としたときに、下式（１１）を満たすように、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正する。
ここで、ｋは比例係数である。
前記補正部は、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を拡幅した後の出力信号をＤｉ＊（ｔ）としたときに、下式（１１）を満たすように、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正する。
第２０項に記載の多角度光散乱検出器によれば、ピーク内での時間積分値が等しくなるように、バンドブロードニングが補正される。
１ ：高速液体クロマトグラフィシステム
１１０ ：溶媒
１１２ ：ポンプ
１１４ ：インジェクタ
１１６ ：カラム
２００ ：ＵＶ検出器
２０１ ：光源
２０２ ：ミラー
２０３ ：入射スリット
２０４ ：回折格子
２０５ ：出射スリット
２０６ ：ミラー
２０７ ：フローセル
２０８ ：第２光検出器
２０９ ：第１光検出器
２１０ ：ビームスプリッタ
３００ ：ＭＡＬＳ検出器
３１０ ：フローセル
３２０ ：光源
３３０ ：ディテクタ
３４０ ：ビームダンパ
４００ ：ＲＩ検出器
４０２ ：フローセル
４０２ａ ：試料セル
４０２ｂ ：参照セル
４０４ ：光源
４０６ ：測定光
４０８ ：スリット
４１０ ：レンズ
４１２ ：ミラー
４１４ ：ゼログラス
４１６ ：受光素子
４１６Ａ ：受光領域
４１６Ｂ ：受光領域
５００ ：制御装置
１１０ ：溶媒
１１２ ：ポンプ
１１４ ：インジェクタ
１１６ ：カラム
２００ ：ＵＶ検出器
２０１ ：光源
２０２ ：ミラー
２０３ ：入射スリット
２０４ ：回折格子
２０５ ：出射スリット
２０６ ：ミラー
２０７ ：フローセル
２０８ ：第２光検出器
２０９ ：第１光検出器
２１０ ：ビームスプリッタ
３００ ：ＭＡＬＳ検出器
３１０ ：フローセル
３２０ ：光源
３３０ ：ディテクタ
３４０ ：ビームダンパ
４００ ：ＲＩ検出器
４０２ ：フローセル
４０２ａ ：試料セル
４０２ｂ ：参照セル
４０４ ：光源
４０６ ：測定光
４０８ ：スリット
４１０ ：レンズ
４１２ ：ミラー
４１４ ：ゼログラス
４１６ ：受光素子
４１６Ａ ：受光領域
４１６Ｂ ：受光領域
５００ ：制御装置
Claims (18)
- 分級装置の後段に配置されるｎ個（ｎは２以上の整数）の検出器ｉ（ｉは１～ｎ）を有するシステムにおいて、前記検出器ｉの出力を補正する方法であって、
前記検出器ｉは、前記分級装置を通過した試料が流れるセルと、前記セルの周囲に配置される複数の光検出部を有する多角度光散乱検出器と、濃度検出器とを含み、
分子量Ｍが既知の試料を前記分級装置に注入するステップと、
前記濃度検出器の出力信号Ｄｉ（ｔ）を時間の関数として収集するステップと、
前記多角度光散乱検出器の複数の光検出部の少なくとも１つの出力信号に基づいて、前記濃度検出器に対応する分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求めるステップと、
前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が、前記既知の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に近づくように、前記出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正するステップと、を含み、
前記検出器ｉの出力信号Ｄ ｉ （ｔ）を補正するステップは、前記検出器ｉについて、下式（１）のχ ｉ ２ モデルを形成し、前記検出器ｉの出力信号Ｄ ｉ （ｔ）と、調節可能なパラメータα ｊ （ｊは０，・・・，ｌ、ここでｌは調節可能な数）のセットを含む拡大モデルＢ（α ０ ，α １ ，・・・，α ｌ ，β，τ）とのコンボリューションを計算し、ピーク内で前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）と前記分子量相当値Ｍ ｉ （ｔ）との差を最小化するパラメータα ｉｊ 、β ｉ 、γ ｉ を最小二乗法により算出する、方法。
- 前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求めるステップは、前記多角度光散乱検出器が有する複数の光検出部のうち、９０°の位置に配置された光検出部の出力信号Ｄ９０°（ｔ）に基づいて、下式（２）、（３）によって分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を求める、請求項１に記載の方法。
- 前記出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが小さい場合、前記式（１）は、下式（４）に展開され、
前記出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが大きい場合、前記式（１）は、下式（５）に展開される、
請求項２に記載の方法。
- 前記試料は、分子量に分散がある試料であり、
下式（６）、（７）より、Ｍｎ／Ｍｗを算出し、該算出したＭｎ／Ｍｗが前記試料の既知のＭｎ／Ｍｗと一致するように、下式（８）のρを求め、下式（８）より前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）を算出するステップをさらに含む、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料は、単一分子量の試料であり、前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）が時間に依存しない定数である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記拡大モデルＢは、下式（９）によって与えられる指数－ガウス分布関数である、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記拡大モデルＢは、下式（１０）によって与えられるガウス分布関数である、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正するステップは、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を拡幅する処理である、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を拡幅する処理の後の出力信号をＤｉ＊（ｔ）としたときに、下式（１１）を満たす、請求項８に記載の方法。
- 液体の試料中の微粒子を検出するための多角度光散乱検出器であって、
前記試料を保持する透明なフローセルと、
前記フローセルにコヒーレント光を照射する光源と、
前記フローセルから周囲に異なる散乱角を以て散乱する光を受光する複数の光検出部と、
前記複数の光検出部からの信号を受信し、前記試料の分子量を求める制御手段と、
を備え、
前記制御手段は、
前記多角度光散乱検出器に直列に接続されるｎ個（ｎは１以上の整数）の検出器ｉ（ｉは１～ｎ）からの出力信号Ｄｉ（ｔ）を時間の関数として収集する信号収集手段と、
前記複数の光検出部の少なくとも１つの信号に基づいて、前記検出器ｉに対応する分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を時間の関数として求める分子量算出部と、
前記分子量相当値Ｍｉ（ｔ）が、既知の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）に近づくように、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正する補正部と、
を有し、
前記補正部は、前記検出器ｉについて、下式（１）のχ ｉ ２ モデルを形成し、前記検出器ｉの出力信号Ｄ ｉ （ｔ）と、調節可能なパラメータα ｊ （ｊは０，・・・，ｌ、ここでｌは調節可能な数）のセットを含む拡大モデルＢ（α ０ ，α １ ，・・・，α ｌ ，β，τ）とのコンボリューションを計算し、ピーク内で前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）と前記分子量相当値Ｍ ｉ （ｔ）との差を最小化するパラメータα ｉｊ 、β ｉ 、γ ｉ を最小二乗法により算出する、多角度光散乱検出器。
- 前記分子量算出部は、前記複数の光検出部のうち、９０°の位置に配置された光検出部の出力信号Ｄ９０°（ｔ）に基づいて、下式（２）、（３）によって分子量相当値Ｍｉ（ｔ）を求める、請求項１０に記載の多角度光散乱検出器。
- 前記出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが小さい場合、前記式（１）は、下式（４）に展開され、
前記出力信号Ｄ９０°（ｔ）よりも前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）の方がピークの拡がりが大きい場合、前記式（１）は、下式（５）に展開される、
請求項１１に記載の多角度光散乱検出器。
- 前記試料は、分子量に分散がある試料であり、
前記補正部は、下式（６）、（７）より、Ｍｎ／Ｍｗを算出し、該算出したＭｎ／Ｍｗが前記試料の既知のＭｎ／Ｍｗと一致するように、下式（８）のρを求め、下式（８）より前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）を算出する、請求項１０から請求項１２のいずれか一項に記載の多角度光散乱検出器。
- 前記試料は、単一分子量の試料であり、前記試料の分子量Ｍの時間の関数Ｍ（ｔ）が時間に依存しない定数である、請求項１０から請求項１２のいずれか一項に記載の多角度光散乱検出器。
- 前記拡大モデルＢは、下式（９）によって与えられる指数－ガウス分布関数である、請求項１０から請求項１４のいずれか一項に記載の多角度光散乱検出器。
- 前記拡大モデルＢは、下式（１０）によって与えられるガウス分布関数である、請求項１０から請求項１４のいずれか一項に記載の多角度光散乱検出器。
- 前記補正部は、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を拡幅する、請求項１０から請求項１６のいずれか一項に記載の多角度光散乱検出器。
- 前記補正部は、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を拡幅した後の出力信号をＤｉ＊（ｔ）としたときに、下式（１１）を満たすように、前記検出器ｉの出力信号Ｄｉ（ｔ）を補正する請求項１７に記載の多角度光散乱検出器。
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