CN103874921A - 利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法以及利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法 - Google Patents

利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法以及利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法 Download PDF

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Abstract

本发明目的在于提供一种通过液相色谱法可以在短时间内重现性良好地测定稳定型血红蛋白A1c的方法。本发明的测定方法中，将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过表面的过滤器设置在液相色谱仪的流路中，将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。

Description

利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法以及利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法
技术领域
本发明涉及利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法。另外，本发明还涉及利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法。
背景技术
利用液相色谱法的血红蛋白类的测定可以在短时间内高精度测定稳定型血红蛋白A1c，因此特别应用于糖尿病患者的血红蛋白A1c值的控制。该用途要求在重现性试验中血红蛋白A1c值的CV值（%）达到1%以下左右的精度。
用于通过液相色谱法在短时间内重现性良好地测定稳定型血红蛋白A1c的一般方法是使柱填充剂粒子的粒径小而均一。但是，若使柱填充剂粒子的粒径变小，则测定体系中产生的压力值变高。例如，专利文献1中公开了使用平均粒径值为3～4μm的柱填充剂粒子的液相色谱法血红蛋白类的测定方法，由于采用了专利文献1的技术的测定体系的压力值变高到5MPa以上，需要耐压性高的液相色谱仪。另外，长期在这样的高压状态下使用的情况下，容易引起配管的连接部分恶化所致的漏液、柱寿命缩短等。
另外，测定体系的压力值也随用于液相色谱仪的过滤器的堵塞而变化。过滤器通常设置在液相色谱仪的流路中，用于除去从测定试样、试剂类等混入流路的夹杂物。例如，专利文献2公开了一种在柱的末端部件（エンドフィッティング）内设置有不锈钢纤维经层叠、烧结而成的纤维烧结过滤器作为滤头（フリット）的液相色谱法用柱。不锈钢烧结过滤器是最一般的液相色谱仪用过滤器，但在测定血液等生物试样的情况下，由于血液中的蛋白质等吸附于过滤器的表面，测定体系的压力值容易升高。由于过滤器的堵塞造成的测定体系压力升高，容易引起与上述所示使用粒径小的填充剂在高压下测定时同样的问题。另外，过滤器的非特异性吸附导致测定体系的压力值变动，引起色谱图变形，因此测定重现性容易降低。
作为抑制这样的过滤器的非特异性吸附的方法，例如，专利文献3公开了使用硅酮类的过滤器涂布处理技术。专利文献3中指出，根据该处理技术，在宽泛的pH范围内血红蛋白的回收率高，非特异性吸附少，不会给稳定型血红蛋白A1c值带来不好的影响。但是，使用硅酮类的涂布处理存在如下缺点：根据涂布条件，涂布厚度增高容易引起堵塞，有长时间地连续使用引起压力升高的情况，缩短测定时间的情况下分离性能变差，等。这些缺点，尤其在用于专利文献1这样的高压测定体系的情况下有显著体现。
另外，同时测定稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的情况下，由于分离峰数增加，分离性能的降低导致测定值大幅度变化。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平05-005730号公报
专利文献2：日本特开平07-260763号公报
专利文献3：日本特开2000-131302号公报
发明内容
发明要解決的问题
本发明提供一种通过液相色谱法能够在短时间内重现性良好地测定稳定型血红蛋白A1c的方法。本发明还提供一种能够在短时间内重现性良好地同时测定稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的方法。
解决问题的手段
本发明人发现，采用液相色谱法对血红蛋白类进行测定时，通过使设置在液相色谱仪的流路中的过滤器和柱主体中至少任意一个经过含有一定浓度范围的硅油的溶液或含有一定浓度范围的硅树脂的溶液处理，并在一定压力范围内进行测定，可以在短时间内重现性良好地完成稳定型血红蛋白A1c的测定以及稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定。
本发明的第1发明为一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法，其中，将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过表面的过滤器设置在液相色谱仪的流路中，将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
本发明的第2发明为一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法，其中，将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过内表面的柱主体设置在液相色谱仪的流路中，将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
本发明的第3发明为一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法，其中，将用含有1～50重量%硅油的溶液、或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过表面的过滤器、以及用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过内表面的柱主体设置在液相色谱仪的流路中，将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
本发明的第4发明为一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法，其中，将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过表面的过滤器设置在液相色谱仪的流路中，将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
本发明的第5发明为一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法，其中，将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过内表面的柱主体设置在液相色谱仪的流路中，将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
本发明的第6发明为一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法，其中，将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过表面的过滤器、以及用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过内表面的柱主体设置在液相色谱仪的流路中，将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
以下，对第1发明和第4发明进行具体说明。
第1发明的稳定型血红蛋白A1c的测定方法与第4发明的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法中，将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过表面的过滤器设置在液相色谱仪的流路中。
本说明书中，硅油和硅树脂也仅合称为“硅酮”。含有硅油的溶液或含有硅树脂的溶液二者也合称为“硅酮溶液”。另外，硅酮溶液处理前的过滤器仅称为“过滤器”，硅酮溶液处理后的过滤器称为“硅酮处理过滤器”，指代二者的情况下称“过滤器类”。
用于第1发明和第4发明的过滤器可以使用金属制、树脂制、玻璃制等用于液相色谱法的公知的过滤器材料。
过滤器的材料优选具体如，铝、铜、钛、镍、铁、铬、锡等金属类，不锈钢等合金类，尼龙树脂、氟树脂、纤维树脂、聚砜树脂、聚醚砜树脂、聚丙烯树脂、聚乙烯树脂、丙烯酸树脂、聚酯树脂、维尼龙树脂、聚碳酸酯树脂、聚氨酯树脂、聚氯乙烯树脂、聚醚醚酮树脂、环氧树脂、酚醛树脂、NORYL树脂等树脂类，氧化锆等陶瓷类，硼硅酸玻璃、石英玻璃等玻璃类等。
过滤器的形状优选面向洗脱液等液体试剂的流入方向的过滤面为圆形的圆盘体、圆柱体、圆锥体等。
过滤器的表面可以设有凸部、凹部。
过滤器的过滤面为圆形的情况下，直径的优选下限为0.5mm，优选上限为20mm。若过滤器的直径低于0.5mm，则过滤器容易发生堵塞。若过滤器的直径超过20mm，则有时测定试样、移动相在过滤器内扩散，分离性能降低。过滤器的直径的更优选下限为1mm、更优选上限为10mm。
过滤器的厚度的优选下限为0.1mm，优选上限为10mm。若过滤器的厚度低于0.1mm，则容易引起堵塞。若过滤器的厚度超过10mm，则有时测定试样、移动相在过滤器内扩散，分离性能降低。过滤器的厚度的更优选下限为0.2mm，更优选上限为5mm。
过滤器孔径的优选下限为0.1μm，优选上限为20μm。若过滤器的孔径低于0.1μm，则过滤器容易发生堵塞。若过滤器的孔径超过20μm，则有时过滤精度下降。过滤器的孔径的更优选下限为1μm，更优选上限为15μm。
另外，如日本特开平2-262054号公报所公开的，也可以使用内部有孔径不同的部分的过滤器。
用于第1发明和第4发明的过滤器可以使用采用公知的方法加工成的过滤器。具体举例为例如，将上述材料加工成纤维状、膜状、薄片状、滤纸状等薄膜状的过滤器，将包含上述材料的纤维加工成无纺布、织布、编织物状的过滤器，将包含上述材料的纤维或粉状物层叠并通过压缩等方法加工成的过滤器，将包含上述材料的纤维或粉状物层叠后烧结而成的过滤器等。
用于第1发明和第4发明的硅酮处理过滤器为，上述过滤器的表面经硅酮溶液处理过的过滤器。
上述“过滤器的表面”包括测定试样接触的过滤器的外表面和内表面。
硅酮溶液通过硅酮、以及溶解硅酮的溶剂而构成。
硅酮溶液中含有的硅酮优选通过固化反应形成被膜的硅酮，更优选通过缩合反应或加成反应形成交联构造而固化的硅酮。
作为硅酮，优选例如包括二甲基硅酮、甲基苯基硅酮、甲基氢硅酮等烷基硅酮化合物、或烷基硅酮的烷基的一部分被氨基、醚基、环氧基、二醇基、羧基、甲基丙烯酸基、氟等取代的改性硅酮化合物等硅酮化合物的硅油或硅树脂。
作为市场上出售的硅酮，例如可以举例为，东丽道康宁硅酮公司制造的AY系列、BY系列、DY系列、SE系列、SF系列、SH系列、SR系列、FZ系列、以及800RESIN系列，信越化学工业公司制造的KC系列、KE系列、KF系列、KM系列、KR系列、KS系列、X系列、以及ES系列，CHISSO公司制造的DMS系列和PDS系列，三菱化学公司制造的MS系列，昭和电工公司制造的GR系列，MOMENTIVE PERFORMANCEMATERIALS Japan合同会社制造的TSF系列和TSR系列，BYK Japan公司制造的BYK系列等。可以单独使用这些硅酮，也可以使用2种以上的组合。
溶解硅酮的溶剂，如果是可以溶解所用硅酮的液体则没有特别限制，但优选有机溶剂类。
作为有机溶剂类，可以举例为例如，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇等醇类，戊烷、己烷、辛烷等支链状或支链状的烃类，苯、甲苯、二甲苯等芳香族烃类等。
硅酮溶液中硅酮浓度的下限为1重量%，上限为50重量%。若硅酮的浓度低于1重量%，则不能充分通过硅酮进行处理。若硅酮的浓度超过50重量%，则高浓度的硅酮会导致过滤器的堵塞。硅酮浓度的优选下限为2重量%，优选上限为45重量%。
通过硅酮溶液对过滤器进行的处理，优选使硅酮溶液中的硅酮覆盖过滤器表面的处理，更优选包括以下工序的处理：使过滤器接触硅酮溶液的工序，以及使接触过滤器的硅酮溶液中的硅酮覆盖过滤器表面的工序。
使过滤器接触硅酮溶液的方法可以举出例如，将过滤器浸渍在硅酮溶液中的方法、使硅酮溶液通过过滤器的方法、向过滤器涂布硅酮溶液的方法等。
使硅酮溶液中的硅酮覆盖过滤器表面的方法优选，使过滤器接触硅酮溶液后，通过室温下、加热下、紫外线等能量线照射、有机溶剂的添加等方法在过滤器表面发生缩合反应、加成反应等交联反应使硅酮固化的方法。使过滤器接触硅酮溶液时或在过滤器表面使硅酮固化时，可以添加交联剂等公知的添加剂。
另外，第1发明和第4发明中使用的硅酮处理过滤器可以通过封闭试剂进行封闭处理。
作为封闭试剂可以举例为例如，牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂牛乳、明胶、血红蛋白、肌红蛋白、球蛋白、乳铁蛋白等蛋白，磷脂等极性脂质，十二烷基硫酸钠、聚乙二醇单-4-辛基苯基醚（Triton X-100）等表面活性剂等。
封闭处理可以通过例如将硅酮处理过滤器浸渍在封闭试剂的溶液中的方法，使封闭试剂的溶液通过硅酮处理过滤器的方法，向硅酮处理过滤器涂布封闭试剂的溶液的方法等进行。
第1发明是将上述硅酮处理过滤器设置在液相色谱仪的流路中的利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法。另外，第4发明是将上述硅酮处理过滤器设置在液相色谱仪的流路中的利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法。
硅酮处理过滤器设置在液相色谱仪的流路中。特别优选设置在测定试样通过的流路中。硅酮处理过滤器优选例如作为设置在流路配管中途的管路过滤器、紧接设置在分离用柱之前的预过滤器、在柱的末端部件内与填充剂相接设置的滤头等用于公知使用方法的过滤器使用。其中，优选作为预过滤器或滤头使用。
另外，使用硅酮处理过滤器作为滤头的情况下，可以将硅酮处理过滤器设置在末端部件内，也可以在过滤器设置在末端部件后，对包含过滤器的末端部件进行硅酮处理。
第1发明和第4发明中，测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
本说明书中，“测定体系中产生的压力值（以下、也只称为压力值）”意为，在液相色谱仪的流路中，包括柱的输液泵之后的流路整体产生的压力值。例如为，可以通过输液泵与柱之间连接的压力计测定的值。另外，所述“9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下”的压力范围为本发明的“压力规定值”。
压力值设定为低于9.8×103Pa的情况下，血红蛋白类测定值的重现性降低测定时间变长。另外，由于设定压力值非常小，因此难以使压力值稳定。压力值设定为超过19.6×105Pa的值的情况下，测定值的重现性降低。
第1发明和第4发明的液相色谱法，通过在具有输液用泵、分离用柱、检测器、试样导入机构等公知的液相色谱仪中设置上述硅酮处理过滤器进行。液相色谱仪的构成例如图1所示。
作为液相色谱法中使用的洗脱液，优选使用含有公知盐类化合物的缓冲液类和有机溶剂类。可以举出例如，有机酸、无机酸、及它们的盐类、氨基酸类、Good的缓冲液等。
上述有机酸可以举出例如，柠檬酸、丁二酸、酒石酸、苹果酸等。
上述无机酸可以举出例如，盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、硼酸、乙酸等。
上述氨基酸类可以举出例如，甘氨酸、氨基乙磺酸、精氨酸等。
另外，缓冲液中可以适当添加其他一般添加的物质，例如，表面活性剂、各种聚合物、亲水性低分子化合物、离液序列高的（chaotropic）化合物等。
进行血红蛋白类测定时，上述缓冲液的盐浓度的优选下限为10mmol/L、优选上限为1000mmol/L。上述缓冲液的盐浓度低于10mmol/L的情况下，有时不进行充分的离子交换反应，难以分离血红蛋白类。上述缓冲液的盐浓度超过1000mmol/L的情况下，有时缓冲液中的盐析出而给液相色谱仪带来不好的影响。
通过第1发明可以在短时间内重现性良好地测定稳定型血红蛋白A1c。第1发明在测定稳定型血红蛋白A1c的同时，可以在短时间内重现性良好地测定健康人血中含有的其他血红蛋白类，例如血红蛋白A0、血红蛋白F（胎儿性血红蛋白）、血红蛋白A2等。
另外，通过第4发明，可以与稳定型血红蛋白A1c的测定同时地测定一般被称为异常血红蛋白的血红蛋白类例如血红蛋白S、血红蛋白C、血红蛋白D、血红蛋白E等中的1种或2种以上。
另外，此处“同时”意为，在1次测定中将稳定型血红蛋白A1c的峰与其他血红蛋白类的峰显示在色谱图上，示出测定对象的各血红蛋白类的含有率。
第4发明可以在稳定型血红蛋白A1c的基础上，与异常血红蛋白同时在短时间内重现性良好地测定健康人血中含有的其他血红蛋白类，例如血红蛋白A0、血红蛋白F（胎儿性血红蛋白）、血红蛋白A2等。
本发明的第2发明为一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法，其中，将用硅酮溶液处理过内表面的柱主体设置在液相色谱仪的流路中，将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
另外，本发明的第5发明为一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法，其中，将用硅酮溶液处理过内表面的柱主体设置在液相色谱仪的流路中，将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
本说明书中，“柱主体”为一般使用的液相色谱法用柱中除去末端部件部分的筒状部分，是指容纳柱填充剂的部分。另外，本说明书中，包含硅酮处理前的柱主体的柱只称为“柱”，包含硅酮溶液处理后的柱主体的柱称为“硅酮处理柱”，指代二者的情况下称为“柱类”。
用于第2发明和第5发明的柱主体可以使用金属制、树脂制、玻璃制等液相色谱仪中使用的公知的柱主体材料。
柱主体的材料优选具体例如，铝、钛等金属类，不锈钢等合金类，尼龙树脂、氟树脂、纤维树脂、聚砜树脂、聚醚砜树脂、聚丙烯树脂、聚乙烯树脂、丙烯酸树脂、聚酯树脂、维尼龙树脂、聚碳酸酯树脂、聚氨酯树脂、聚氯乙烯树脂、聚醚醚酮树脂、环氧树脂、酚醛树脂、NORYL树脂等的树脂类，氧化锆等的陶瓷类，硼硅酸玻璃、石英玻璃等玻璃类等。另外，末端部件的材料可以与柱主体相同或不同。
柱主体的形状为用于公知的液相色谱法用柱的形状，优选圆筒状。
柱主体内径的优选下限值为0.5mm，优选上限值为10mm。若柱主体的内径低于0.5mm，则有时难以将压力值维持在第2发明或第5发明的压力规定值内，重现性降低。若柱主体的内径超过10mm，则有时发生柱内的测定试样、移动相的扩散变大，分离性能降低。柱主体内径的更优选下限值为1.0mm，更优选上限值为6.0mm。
柱主体长度的优选下限值为5mm，优选上限值为100mm。若柱主体的长度低于5mm，则有时由于与测定试样相互作用的填充剂量少，因此分离性能降低。若柱主体的长度超过100mm，则有时由于在血红蛋白类的洗脱上花费时间，因此测定时间延长。柱主体长度的更优选下限值为10mm，更优选上限值为50mm。
第2发明和第5发明中使用的硅酮处理柱中，上述柱主体的内表面经硅酮溶液处理。第2发明和第5发明使用的硅酮溶液优选与上述第1发明和第4发明同样的硅酮溶液。
使用硅酮溶液对柱主体进行的处理与第1发明和第4发明中过滤器的处理同样。即，优选包括以下工序的处理：使柱主体接触硅酮溶液的工序，以及使与柱主体接触的硅酮溶液中的硅酮覆盖柱主体的内表面的工序。
使柱主体接触硅酮溶液的方法可以举出例如，使柱主体浸渍在硅酮溶液中的方法、使硅酮溶液通过柱主体的方法、向柱主体涂布硅酮溶液的方法。
使与柱主体接触的硅酮溶液中的硅酮固化的方法可以使用与第1发明和第4发明同样的方法。
另外，在柱主体的基础上，可以对柱的末端部件进行同样的硅酮溶液处理。
另外，第2发明和第5发明中使用的硅酮处理柱可以用封闭试剂进行封闭处理。所使用的封闭试剂以及封闭处理方法与第1发明和第4发明同样。
第2发明为将上述硅酮处理柱设置在液相色谱仪的流路中的利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法。另外，第5发明为将上述硅酮处理柱设置在液相色谱仪的流路中的利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法。
液相色谱法通过将填充了填充剂的硅酮处理柱与图1的液相色谱仪的流路（图1的7）连接而进行。
填充于硅酮处理柱的填充剂优选含有离子交换基的填充剂，更优选含有阳离子交换基的填充剂。
作为阳离子交换基，优选羧基、磷酸基、磺酸基等，其中，优选磺酸基。
填充剂粒子的平均粒径值优选的下限为1μm、上限为50μm。填充剂粒子的平均粒径值低于1μm的情况下，有时难以将压力值维持在压力规定值内，重现性降低。若填充剂粒子的平均粒径值超过50μm，则有时测定试样在填充剂粒子间扩散，分离性能降低。填充剂粒子的平均粒径值的更优选下限值为2μm，更优选上限值为30μm。
另外，填充剂粒子的平均粒径值可以使用粒度分布测定装置测定。
第2发明和第5发明中，测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。压力值设定为低于9.8×103Pa的情况下，由于设定压力值非常小，难以使压力值稳定。另外，有时测定时间变长。压力值设定为超过19.6×105Pa的情况下，重现性降低。
第2发明和第5发明中使用的液相色谱仪与第1发明和第4发明同样。另外，第2发明和第5发明中使用的洗脱液与第1发明和第4发明同样。
采用第2发明，可以与第1发明同样地测定稳定型血红蛋白A1c和健康人血中含有的其他血红蛋白类。另外，采用第5发明，可以与第4发明同样地同时测定稳定型血红蛋白A1c和健康人血中含有的其他血红蛋白类、以及一般被称为异常血红蛋白的血红蛋白类。
本发明的第3发明为一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法，其中，将用含有1～50重量%硅油的溶液、或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过表面的过滤器、以及用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过内表面的柱主体设置在液相色谱仪的流路中，将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
本发明的第3发明中，由于将第1发明中的硅酮处理过滤器和第2发明中的硅酮处理柱二者设置在液相色谱仪的流路中，并将测定体系中产生的压力值设定为本发明的压力规定值，可以在更短时间内重现性良好地测定稳定型血红蛋白A1c。
另外，本发明的第6发明为一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法，其中，将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过表面的过滤器、以及用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过内表面的柱主体设置在液相色谱仪的流路中，将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
本发明的第6发明中，由于使用第4发明中的硅酮处理过滤器和第5发明中的硅酮处理柱二者，并将测定体系中产生的压力值设定为本发明的压力规定值，可以在更短时间内重现性良好地同时测定稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白。
发明效果
根据本发明，在液相色谱法中使用用含有规定浓度的硅酮的硅酮溶液处理过的过滤器和用含有规定浓度的硅酮溶液处理过的柱主体中至少任意一个，并将压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下，由此可以在短时间内重现性良好地完成稳定型血红蛋白A1c的测定，以及稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定。
附图说明
图1是表示本发明中使用的液相色谱仪的例子的构成图。
图2是评价（3）中通过测定例1得到的色谱图。
图3是评价（3）中通过测定例8得到的色谱图。
图4是评价（5）中通过测定例1得到的色谱图。
图5是评价（5）中通过测定例8得到的色谱图。
图6是评价（6）中通过测定例1得到的色谱图。
图7是评价（6）中通过测定例8得到的色谱图。
图8是评价（7）中表示测定例13、14、15的平均压力值与压力值的CV值之间关系的图表。
图9是评价（7）中表示测定例16、17、18的平均压力值与压力值的CV值之间关系的图表。
图10是评价（8）中表示测定例13、14、15的平均压力值与稳定型血红蛋白A1c（稳定型HbA1c）值的CV值之间关系的图表。
图11是评价（8）中表示测定例16、17、18的平均压力值与稳定型血红蛋白A1c（稳定型HbA1c）值的CV值之间关系的图表。
图12是评价（9）中表示测定例13、14、15的平均压力值与压力值的CV值之间关系的图表。
图13是评价（9）中表示测定例16、17、18的平均压力值与压力值的CV值之间关系的图表。
图14是评价（10）中表示测定例13、14、15的平均压力值与稳定型血红蛋白A1c（稳定型HbA1c）值的CV值之间关系的图表。
图15是评价（10）中表示测定例16、17、18的平均压力值与稳定型血红蛋白A1c（稳定型HbA1c）值的CV值之间关系的图表。
图16是评价（10）中表示测定例13、14、15的平均压力值与血红蛋白S值的CV值之间关系的图表。
图17是评价（10）中表示测定例16、17、18的平均压力值与血红蛋白S值的CV值之间关系的图表。
图18是评价（10）中表示测定例13、14、15的平均压力值与血红蛋白C值的CV值之间关系的图表。
图19是评价（10）中表示测定例16、17、18的平均压力值与血红蛋白C值的CV值之间关系的图表。
图20是评价（11）中表示测定例16、19、20在重复测定时平均压力值的推移的图表。
图21是评价（11）中表示测定例16、19、20在重复测定时压力值的CV值的推移的图表。
图22是评价（11）中表示测定例16、19、20在重复测定时稳定型血红蛋白A1c（稳定型HbA1c）值的CV值的推移的图表。
图23是评价（12）中表示测定例16、19、20在重复测定时平均压力值的推移的图表。
图24是评价（12）中表示测定例16、19、20在重复测定时压力值的CV值的推移的图表。
图25是评价（12）中表示测定例16、19、20在重复测定时稳定型血红蛋白A1c（稳定型HbA1c）值的CV值的推移的图表。
图26是评价（12）中表示测定例16、19、20在重复测定时血红蛋白S值的CV值的推移的图表。
图27是评价（12）中表示测定例16、19、20在重复测定时血红蛋白C值的CV值的推移的图表。
具体实施方式
以下举实施例更详细地说明本发明，但本发明不仅限于这些实施例。
（制造例1）
制造例1～3中，制备了平均粒径值不同的血红蛋白类测定用柱填充剂。
在四乙二醇二甲基丙烯酸酯（交联性单体，新中村化学工业公司制造）150g、三乙二醇二甲基丙烯酸酯（交联性单体，新中村化学工业公司制造）140g、和2-羟基-1，3-二甲基丙烯酰氧基丙烷（交联性单体，新中村化学工业公司制造）60g的单体混合物中，混合并溶解作为聚合引发剂的过氧化苯甲酰（KISHIDA化学公司制造）1.0g，将所得物在5重量%的聚乙烯醇（日本合成化学公司制造，“高先诺尔（Gohsenol）GH-20”）水溶液2000mL中分散。反应体系以350rpm的速度搅拌的同时，在氮气氛中加热到80℃，进行1.2小时的聚合反应。接着，将溶解了2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸（亲水性单体，东亚合成公司制造）180g、以及聚乙二醇单甲基丙烯酸酯（亲水性单体，日油公司制造）60g、甲醇100g的离子交换水200mL添加到反应体系中，在80℃进行2小时的聚合反应。洗涤得到的聚合物，得到了柱填充剂。采用粒度分布测定装置（Nicomp公司制造、“AccuSizer780”）测定平均粒径值的结果是4.7μm。
（制造例2）
制造例1中的反应体系的搅拌条件变更为300rpm，除此之外，与制造例1同样操作得到了柱填充剂。与制造例1同样测定平均粒径值的结果是6.4μm。
（制造例3）
制造例1中的反应体系的搅拌条件变更为250rpm，除此之外，与制造例1同样操作得到了柱填充剂。与制造例1同样测定平均粒径值的结果是9.5μm。
以上制造例1～3得到的柱填充剂的平均粒径值如表1所示。
[表1]
平均粒径值(μm)
制造例1 4.7
制造例2 6.4
制造例3 9.5
（实施例1）
实施例1～3制备了硅酮处理过滤器。
以不锈钢烧结体的一体成形品的形式制造了直径4mm、厚度1.5mm的圆柱形过滤器（以下也称该过滤器为“未处理过滤器”）。硅酮溶液使用了含有3重量%的硅酮（信越化学工业公司制造，“KF-96”）的乙醇溶液。将上述过滤器在室温下浸渍在硅酮溶液中30分钟后，从硅酮溶液中取出过滤器，在100℃加热60分钟使硅酮固化得到了硅酮处理过滤器。
（实施例2）
将硅酮溶液从实施例1中含有3重量%的硅酮的乙醇溶液变更为含有20重量%的硅酮（东丽道康宁公司制造，“SR2410”）的乙醇溶液，进行了硅酮处理。
将实施例1中使用的未处理过滤器在室温下浸渍在上述硅酮溶液中30分钟后，从硅酮溶液中取出过滤器，在120℃加热100分钟使硅酮固化得到了硅酮处理过滤器。
（实施例3）
将硅酮溶液从实施例1中含有3重量%的硅酮的乙醇溶液变更为含有45重量%的硅酮（东丽道康宁公司制造，“SR2309”）的丁醇溶液，进行了硅酮处理。
将实施例1中使用的未处理过滤器在室温下浸渍在上述硅酮溶液中30分钟后，从硅酮溶液中取出过滤器，在120℃加热100分钟使硅酮固化得到了硅酮处理过滤器。
（比较例1）
比较例1制备了未经硅酮处理的过滤器。
未经硅酮处理的过滤器是实施例1中使用的未处理过滤器不经过硅酮溶液的处理照原样使用的。
（比较例2）
比较例2制备了经过含有低于本发明的第1发明和第4发明规定浓度的硅酮的硅酮溶液处理的过滤器。
将硅酮溶液从实施例1中含有3重量%的硅酮的乙醇溶液变更为含有0.5重量%的硅酮（信越化学工业公司制造，“KF-96”）的乙醇溶液，进行了硅酮处理。
将实施例1中使用的未处理过滤器在室温下浸渍在上述硅酮溶液中30分钟后，从硅酮溶液中取出过滤器，在120℃加热100分钟使硅酮固化得到了硅酮处理过滤器。
（比较例3）
比较例3制备了经过含有超过本发明的第1发明和第4发明规定浓度的硅酮的硅酮溶液处理的过滤器。
将硅酮溶液从实施例2中含有20重量%的硅酮的乙醇溶液变更为含有70重量%的硅酮（东丽道康宁公司制造，“SR2410”）的乙醇溶液进行了硅酮处理。
将实施例1中使用的未处理过滤器在室温下浸渍在上述硅酮溶液中30分钟后，从硅酮溶液中取出过滤器，在120℃加热100分钟使硅酮固化得到了硅酮处理过滤器。
（实施例4）
实施例4和实施例5制备了硅酮处理柱。
将不锈钢SUS314制的柱主体（巴制作所公司制造，长度35mm，内径4.6mm，以下也称“未处理柱主体”）在室温下浸渍在作为硅酮溶液的含有3重量%的硅酮（信越化学工业公司制造，“KF-96”）的乙醇溶液中30分钟。之后，从硅酮溶液中取出柱主体，在100℃加热60分钟使硅酮固化得到了硅酮处理柱主体。装载有实施例1使用的未处理过滤器作为滤头的不锈钢SUS314制末端部件（硅酮未处理）安装在上述硅酮处理过的柱主体的两端，得到了硅酮处理柱。
（实施例5）
将实施例4使用的未处理柱主体和末端部件在室温下浸渍在作为硅酮溶液的含有45重量%的硅酮（东丽道康宁公司制造，“SR2309”）的丁醇溶液中30分钟。之后，从硅酮溶液中取出柱主体和末端部件，在120℃加热100分钟使硅酮固化得到了硅酮处理柱。
（比较例4）
比较例4制备了未经硅酮溶液处理的柱。
未经硅酮溶液处理的柱是实施例4使用的未处理柱和末端部件不经过硅酮溶液处理照原样使用的。
（比较例5）
比较例5制备了经过含有低于本发明的第2发明和第5发明中规定浓度的硅酮的硅酮溶液处理的柱。
将硅酮溶液从实施例4中含有3重量%的硅酮的乙醇溶液变更为含有0.5重量%的硅酮（信越化学工业公司制造，“KF-96”）的乙醇溶液，进行了硅酮处理。
将实施例4中使用的未处理柱主体在室温下浸渍在上述硅酮溶液中30分钟后，从硅酮溶液中取出柱主体，在120℃加热100分钟使硅酮固化得到了硅酮处理柱主体。装载有实施例1使用的未处理过滤器作为滤头的不锈钢SUS314制末端部件（硅酮未处理）安装在上述硅酮处理过的柱主体的两端，得到了硅酮处理柱。
（比较例6）
比较例6制备了经过含有超过本发明的第2发明和第5发明规定浓度的硅酮的硅酮溶液处理得到的柱。
将硅酮溶液从实施例4中含有3重量%的硅酮的乙醇溶液变更为含有70重量%的硅酮（信越化学工业公司制造，“KF-96”）的乙醇溶液，进行了硅酮处理。
将实施例4中使用的未处理柱主体在室温下浸渍在上述硅酮溶液中30分钟后，从硅酮溶液中取出柱主体，在120℃加热100分钟使硅酮固化得到了硅酮处理柱主体。装载有实施例1使用的未处理过滤器作为滤头的不锈钢SUS314制末端部件（硅酮未处理）安装在上述硅酮处理过的柱主体的两端，得到了硅酮处理柱。
以上实施例1～5和比较例1～6的处理内容如表2所示。
[表2]
（评价）
将实施例1～5和比较例1～6得到的过滤器类和柱类进行组合，制备了表3所示测定例1～12的测定体系。
另外，对于表3的“预过滤器”，“滤头”，“柱主体”，经过本发明规定范围内浓度的硅酮溶液处理的记“○”，经过本发明规定范围外浓度的硅酮溶液处理的记“△”，未经硅酮处理的记“×”。
Figure BDA0000484028860000201
（1）血红蛋白类测定用柱的制备
制造例1～3中得到的柱填充剂填充于实施例和比较例中得到的柱类，制备了血红蛋白类测定用柱。
制造例1～3中得到的各柱填充剂0.8g添加到50mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）30mL中搅拌后，经5分钟超声波处理制备了填充剂浆。向连接着实施例4、5、比较例4、5或6制备的各柱类的柱填充用装填机（容量30mL、亚速旺（AS ONE）公司制造）注入全部填充剂浆。在装填机上连接输液泵（GL SCIENCE公司制造，“PU-614”），在20MPa的压力下填充得到血红蛋白类测定用柱。
（2）测定条件
将上述“（1）血红蛋白类测定用柱的制备”中得到的血红蛋白类测定用柱连接到图1的液相色谱仪1（图1的7）。另外，实施例1～3或比较例1～3的过滤器连接在进样阀5与分离用柱7之间（图1的6）。压力值通过在输液泵3与进样阀5之间连接压力计4（长野计器公司制造，“数码压力计GC61”）测定。
测定条件如表4所示。
[表4]
评价（3）稳定型血红蛋白A1c的测定
采用测定例1～12的测定体系，对健康人血液中的稳定型血红蛋白A1c在表4所述的测定条件下进行测定。
测定试样使用以加氟化钠的采血管采集的健康人血液在含有0.05%的TritonX-100（SIGMA-ALDRICH JAPAN公司制造）的磷酸缓冲液（pH6.7）中溶血稀释至120倍的试样。通过测定例1得到的色谱图如图2所示。另外，测定时的压力值如表3所示。使用测定例1的测定体系测定的情况下，可以在1分钟以内从其他血红蛋白类中良好地分理出稳定型血红蛋白A1c（峰1）。使用测定例2～7的测定体系的情况下也可以良好地分离稳定型血红蛋白A1c，得到与图2同样的色谱图。
通过不使用硅酮处理过滤器和硅酮处理柱的测定例8得到的色谱图如图3所示。使用测定例8的测定体系测定的情况下，与使用测定例1的测定体系测定的情况下相比分离性能差，稳定型血红蛋白A1c不能分离。
另外，测定例9和测定例11的、使用经过低于本发明规定量浓度的硅酮溶液处理的过滤器或柱的情况下，显示出与图3同样的色谱图。这是由于硅酮浓度低，硅酮处理的効果没能得到体现。
测定例10和测定例12的、使用经过超过本发明规定量的硅酮浓度的硅酮溶液处理过滤器或柱主体的情况下，也显示出与图3同样的色谱图。可以认为这是由于高浓度的硅酮溶液处理使压力值超过规定量，分离性能没有提升。
评价（4）修饰血红蛋白类的测定
采用测定例1～12的测定体系，将含有人为制备的修饰血红蛋白类的试样在表4所述的测定条件下进行测定。作为含有修饰血红蛋白类的试样，将含有不稳定型血红蛋白A1c的试样（试样L）、含有乙酰化血红蛋白的试样（试样A）、含有氨甲酰化血红蛋白的试样（试样C）3种类按照公知的方法制备。
试样L通过在健康人血中添加葡萄糖到2000mg/dL，在37℃加热3小时而制备成。试样A通过在健康人血中添加乙醛到50mg/dL，在37℃加热2小时而制备成。试样C通过在健康人血中添加氰酸钠到50mg/dL，在37℃加热2小时而制备成。
分离性能是在计算含有修饰血红蛋白类的试样（试样L、试样A、试样C）的稳定型血红蛋白A1c值减去用于制备含有修饰血红蛋白类的试样的健康人血（非修饰品）的稳定型血红蛋白A1c值的差值（Δ值）的基础上，通过比较进行评价的。结果如表3所示。
使用测定例1～7的硅酮处理过滤器或硅酮处理柱的情况下的Δ值低于0.2%，对于含有修饰血红蛋白类的试样，也可以准确地测定稳定型血红蛋白A1c。尤其是使用了硅酮处理过滤器和硅酮处理柱二者的测定例7中，Δ值小，可以得知稳定型血红蛋白A1c的分离性能优良。
使用测定例8的硅酮未处理的过滤器和柱的情况下，Δ值为0.3%以上，受修饰血红蛋白类的影响不能准确地测定稳定型血红蛋白A1c。
测定例9和测定例11的、使用经过低于本发明规定量浓度的硅酮溶液处理的过滤器或柱的情况下，以及，测定例10和测定例12的、使用经过超过本发明规定量的硅酮浓度的硅酮溶液处理过滤器或柱主体的情况下，Δ值也为0.3%以上，受修饰血红蛋白类的影响不能准确地测定稳定型血红蛋白A1c。
评价（5）稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定
采用测定例1～12的测定体系，将含有异常血红蛋白的血红蛋白S和血红蛋白C的试样（HELENA研究所公司制造，“AFSC Hemocontrol”）在表5所述的测定条件下进行测定。
使用测定例1的硅酮处理过滤器的情况下（图4），血红蛋白S（峰24）和血红蛋白C（峰25）可以良好地分离。
采用测定例2～7的测定体系的情况下，也得到了与图4同样的色谱图。
采用测定例8的测定体系的情况下（图5），血红蛋白S和血红蛋白C不能分离。
采用测定例9～12的测定体系的情况下也与采用测定例8的测定体系的情况下同样，不能良好地分离，得到与图5同样的色谱图。
对上述试样重复20次测定，确认稳定型血红蛋白A1c、血红蛋白S、血红蛋白C的同时重现性（表3）。
测定例1～7中，各血红蛋白的CV值都在1%以下，表现出良好的重现性。
测定例8～12中的CV值大，重现性不好。
[表5]
Figure BDA0000484028860000251
评价（6）血红蛋白A2的测定
采用测定例1～7的测定体系，将含有血红蛋白A2（HbA2）的试样（Bio-Rad公司制造“A2Control Level2”）在表5所述的测定条件下进行测定。
使用测定例1的硅酮处理过滤器的情况下（图6），可以良好地分离血红蛋白A2（峰26）。
测定例2～7的情况下也得到与图6同样的色谱图。
采用测定例8的测定体系的情况下（图7），不能分离血红蛋白A2。
采用测定例9～12的测定体系的情况下也与采用测定例8的测定体系的情况下同样，不能得到良好的分离，得到与图7同样的色谱图。
对上述试样重复20次测定，可以确认血红蛋白A2的同时重现性（表3）。
测定例1～7的CV值为1%以下，表现出良好的重现性。
测定例8～12的CV值大，重现性不好。
通过上述评价（3）～（6），可以确认通过使用经过含有本发明规定浓度的硅酮的硅酮溶液处理的过滤器和柱主体中至少任意一个，血红蛋白类的分离性能提高。
评价（7）压力值的评价1
评价（7）～（10）中有意改变测定时的流速，改变测定体系的压力值进行测定。用于这些评价的测定例13～20的条件示于表6、表7。
另外，对于表6中“预过滤器”，“滤头”，“柱主体”，使用本发明规定范围内浓度的硅酮溶液进行处理的记“○”、未经硅酮处理的记“×”。
Figure BDA0000484028860000271
Figure BDA0000484028860000281
首先，通过测定例13～15，使用制造例1～3的填充剂和实施例2的硅酮处理过滤器将健康人血液中的稳定型血红蛋白A1c在流速以外如表4所述的测定条件下进行测定。使流速在0.1～3.3mL/分钟之间变化，各进行20次测定的情况下，平均压力值与压力值的CV值的关系如图8所示。在本发明的压力规定值内，压力值的CV值良好且稳定。
使用制造例1～3的填充剂和比较例1的过滤器（硅酮未处理过滤器），在同样改变流速进行测定的情况下，测定例16～18的平均压力值与压力值的CV值的关系如图9所示。与图8相比，压力值的CV值大，本发明压力规定值内的压力值的CV值也没有提高。
通过以上可以确认若使用本发明的硅酮处理过滤器，则在本发明压力规定值内可以稳定地得到良好的压力值的CV值。
评价（8）稳定型血红蛋白A1c值的重现性试验
上述“（7）压力值的评价1”时可以确认稳定型血红蛋白A1c值的同时重现性。计算了按各流速测定时，连续20次测定健康人血液试样时的稳定型血红蛋白A1c值的CV值。使用硅酮处理过滤器的测定例13～15的测定时平均压力值和稳定型血红蛋白A1c值的CV值之间的关系如图10所示。在本发明的压力规定值内，CV值为1.0%以下，得到了良好的重现性。使用硅酮处理过滤器的情况下，在压力规定值外CV值也不大。
使用测定例16～18的硅酮未处理过滤器的情况下，测定时的平均压力值和稳定型血红蛋白A1c值的CV值之间的关系如图11所示。CV值不在1.0%以下，重现性不好。
通过以上可以确认，使用硅酮处理过滤器且压力值在本发明的压力规定值内的情况下，压力值稳定，稳定型血红蛋白A1c值的测定重现性提高。另外，硅酮处理柱和未经硅酮处理的柱相比较的情况下也表现出同样的行为差异。
评价（9）压力值的评价2
首先，通过测定例13～15，使用制造例1～3的柱填充剂和实施例2的硅酮处理过滤器，将含有异常血红蛋白的试样（AFSC Hemocontrol）在流速以外如表5所示的测定条件下进行测定。
使流速在0.1～3.3mL/分钟之间变化，各进行20次测定的情况下，平均压力值和压力值的CV值之间的关系如图12所示。
在本发明的压力规定值内，压力值的CV值良好且稳定。
使用制造例1～3的填充剂和比较例1的过滤器（硅酮未处理过滤器），同样改变流速测定的情况下，测定例16～18的平均压力值与压力值的CV值之间的关系如图13所示。
与图12相比，压力值的CV值大，本发明的压力规定值内的压力值的CV值也没有提高。
通过以上可以确认，通过使用本发明的硅酮处理过滤器，可以在本发明的压力规定值内稳定地得到良好的压力值的CV值。
另外，还可以确认即使使用硅酮处理过滤器，在本发明的压力规定值外的情况下CV值也变差。
评价（10）稳定型血红蛋白A1c值和异常血红蛋白值的重现性试验
上述“（9）压力值的评价2”时可以确认稳定型血红蛋白A1c值和异常血红蛋白的同时重现性。
计算了按各流速测定时，连续20次测定含有异常血红蛋白的试样（AFSC Hemocontrol）的情况下的稳定型血红蛋白A1c值、血红蛋白S值、血红蛋白C值的CV值。
使用测定例13～15的硅酮处理过滤器的情况下，测定时的平均压力值和稳定型血红蛋白A1c值的CV值之间的关系如图14所示。
在本发明的压力规定值内，CV值为1.0%以下，得到了良好的重现性。
使用硅酮处理过滤器的情况下，在压力规定值外CV值也不大。
使用测定例16～18的硅酮未处理过滤器的情况下，测定时的平均压力值与稳定型血红蛋白A1c值的CV值之间的关系如图15所述。
CV值不在1.0%以下，重现性不好。
同样地使用测定例13～15的硅酮处理过滤器的情况下的血红蛋白S值的CV值的推移如图16，使用测定例16～18的硅酮未处理过滤器的情况下的血红蛋白S值的CV值的推移如图17所示。
另外，使用测定例13～15的硅酮处理过滤器的情况下的血红蛋白C值的CV值的推移如图18，使用测定例16～18的硅酮未处理过滤器的情况下的血红蛋白C值的CV值的推移如图19所示。
使用测定例13～15的硅酮处理过滤器且在本发明的压力规定值内的测定得到了良好的CV值，使用硅酮处理过滤器的情况下，在压力规定值外CV值变大。
另外，使用测定例16～18的硅酮未处理过滤器的情况下重现性不好。
通过以上可以确认，使用硅酮处理过滤器且压力值在本发明的压力规定值内的情况下，压力值稳定，稳定型血红蛋白A1c值和异常血红蛋白值的测定重现性提高。
另外，硅酮处理柱和未经硅酮处理的柱相比较的情况下也表现出同样的行为差异。
评价（11）重复测定的影响评价1
通过表6的测定例16、19、20确认了将健康人血液试样按表4所述的测定条件合计测定3000次时的压力值和稳定型血红蛋白A1c值的重现性的推移。每200次测定实施上述“（8）稳定型血红蛋白A1c值的重现性试验”（n=20）时的平均压力值的推移如图20，压力值的CV值的推移如图21，稳定型血红蛋白A1c值的CV值的推移如图22所示。
测定例16的使用未经硅酮处理的过滤器的情况下，在约500次测定平均压力值开始升高，与此相比，使用硅酮处理过的过滤器的测定例19到约2000次测定为止，使用硅酮处理过的过滤器和硅酮处理过的柱的测定例20到3000次测定为止平均压力值是稳定的。
另外，压力值的CV值和稳定型血红蛋白A1c值的CV值在测定例19和20中小且稳定。尤其是测定例20在3000次测定中也表现出良好的CV值。
通过以上可以确认，使用硅酮处理过滤器和硅酮处理柱可以抑制压力值的上升和不均增大，其结果可以维持稳定型血红蛋白A1c值的良好的重现性。
评价（12）重复测定的影响评价2
通过表7的测定例16、19、20确认了，含有异常血红蛋白的试样（AFSCHemocontrol）在如表5所述的测定条件下合计测定3000次时的同时重现性的推移。
每200次测定实施上述“（10）稳定型血红蛋白A1c值和异常血红蛋白值的重现性试验”（n=20）时的平均压力值的推移如图23，压力值的CV值的推移如图24，稳定型血红蛋白A1c值的CV值的推移如图25所示。
使用测定例16的未经硅酮处理的过滤器的情况下，通过约500次测定后平均压力值开始上升，与此相比，使用硅酮处理过的过滤器的测定例19到约2000次测定为止，使用硅酮处理过的过滤器和硅酮处理过的柱的测定例20到3000次测定为止平均压力值是稳定的。
另外，压力值的CV值和稳定型血红蛋白A1c值的CV值在测定例19和20中小且稳定。
尤其是测定例20在3000次测定中也表现出良好的CV值。
另外，血红蛋白S值的CV值的推移如图26，血红蛋白C值的CV值的推移如图27所示。
这些异常血红蛋白值的CV值的推移也和稳定型血红蛋白A1c值的CV值表现出同样的推移。
通过以上可以确认，使用硅酮处理过滤器和硅酮处理柱可以抑制压力值的升高和不均增大，其结果可以维持稳定型血红蛋白A1c值和异常血红蛋白值的良好的重现性。
产业上的使用可能性
根据本发明，可以提供一种通过液相色谱法能够在短时间内重现性良好地测定稳定型血红蛋白A1c的方法。另外，根据本发明，可以提供一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法。
符号说明
1 液相色谱仪
2 洗脱液切换阀
3 输液泵
4 压力计
5 进样阀
6 预过滤器
7 分离用柱
8 检测器
9 洗脱液
10 自动取样器
11 废液容器
21 血红蛋白F（胎儿性血红蛋白）
22 稳定型血红蛋白A1c
23 血红蛋白A0
24 血红蛋白S
25 血红蛋白C
26 血红蛋白A2

Claims (6)

1.一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法，其中，
将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过表面的过滤器设置在液相色谱仪的流路中，
将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
2.一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法，其中，
将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过内表面的柱主体设置在液相色谱仪的流路中，
将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
3.一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c的测定方法，其中，
将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过表面的过滤器、以及
用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过内表面的柱主体设置在液相色谱仪的流路中，
将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
4.一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法，其中，
将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过表面的过滤器设置在液相色谱仪的流路中，
将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
5.一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法，其中，
将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过内表面的柱主体设置在液相色谱仪的流路中，
将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
6.一种利用液相色谱法的稳定型血红蛋白A1c和异常血红蛋白的同时测定法，其中，
将用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过表面的过滤器、以及
用含有1～50重量%硅油的溶液或含有1～50重量%硅树脂的溶液处理过内表面的柱主体设置在液相色谱仪的流路中，
将该液相色谱仪的测定体系中产生的压力值设定为9.8×103Pa以上且19.6×105Pa以下。
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PB01 Publication
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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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