CN108025282A - 分离抗体的分离基质和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种包含抗体‑结合蛋白配体已被共价固定于其上的多孔球形粒子的分离基质，其中所述配体的密度在10.5‑15 mg/ml的范围内和所述粒子的体积‑加权中位直径在30‑55μm的范围内。本发明还公开一种通过在色谱柱中使用所述分离基质的亲和色谱分离抗体的方法。

Description

分离抗体的分离基质和方法
本发明的技术领域
本发明涉及分离基质，且更特别地涉及可用于抗体分离的分离基质。本发明还涉及在基质上分离抗体的方法。
发明背景
在治疗性单克隆抗体(mAb)的制备中，在包含偶联的葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白A(SpA)或SpA的变体的基质上的亲和色谱通常用作第一分离步骤，以除去大多数污染物。由于治疗性mAb的需求不断增加，对于提高分离过程的效率存在强大的驱动力，且几种方法正在评估中。
多柱连续色谱过程是可利用的，其中所述进料被施加于第一个柱，并且当第一个柱趋于饱和时则转移到一个或多个随后的柱中，在洗脱和再生随后的柱期间洗脱第一个柱并再生以再次加载。这样的过程可代表周期性反流色谱(PCC)或模拟移动床(SMB)并对分离治疗性mAb具有相当大的意义，见例如US7901581、US20130248451、US20130280788和US7220356，其通过引用以其整体结合到本文中。PCC/SMB过程可显著增加生产率，但似乎用目前可获得的分离基质(其被设计用于传统批量色谱)不能达到全部潜力。
因此，对专门设计用于连续色谱过程的新的分离基质和对使用这样的基质的方法存在着需求。
发明概述
本发明的一个方面是提供一种允许以高生产率连续分离mAb的分离基质。这用如在权利要求1中定义的基质实现。
一个优点是基质在非常短的停留时间内具有高结合能力。
本发明的第二方面是提供一种允许以高生产率连续分离mAb的色谱柱。这用如在权利要求书中定义的柱实现。
本发明的第三方面是提供一种允许以高生产率连续分离mAb的多柱色谱系统。这用如在权利要求书中定义的系统实现。
本发明的第四方面是提供一种分离抗体的有效方法。这用如在权利要求书中定义的方法实现。一个优点是该方法允许非常短的停留时间以及高结合能力。
本发明的其它合适的实施方案在所附权利要求书中描述。
附图
图1显示蛋白A Fc-结合结构域的比对。
图2显示来自实施例1的色谱图。UV样本前(UV Sample Pre) = 进料的UV吸光度，UV样本后(UV Sample Post) =柱流出物的UV吸光度。
图3显示与参考基质比较，本发明的基质的动态结合能力。
图4显示依据本发明的柱。
图5显示依据本发明的色谱系统。
实施方案的详细描述
在一个方面，由图1-3所说明的，本发明公开一种包含多孔的、适当球形的、抗体-结合蛋白配体已被共价固定于其上的粒子的分离基质。这些配体的密度大于10 mg/ml，例如在10.5-15 mg/ml，例如10.5-12 mg/ml的范围内，和粒子的体积-加权中位直径在30-55 μm，例如45-55 μm或50-55 μm的范围内。配体的密度表示每毫升基质沉积体积中偶联的配体的含量，且其可例如通过氨基酸分析测定。体积加权中位直径，也指d50,v，可通过电臭氧感应(Coulter Counter)、激光衍射或显微镜与图像分析来测定。一种优选的方法是使用电臭氧感应与用所提及基质的狭窄筛分数校准的设备，对于其的d50,v已用显微镜和图像分析测定。
多孔粒子可包含交联多糖，其提供用于配体偶联的大的亲水表面，伴有在mAb或污染物和所述粒子之间的非特异性相互作用的最小风险。多糖适当地具有零或极低(例如< 5微摩尔/ml)含量的荷电基团以防止非特异性相互作用。交联增加刚度和化学稳定性并可通过本领域已知的方法，特别是通过环氧化物交联，使用例如表氯醇或双环氧化物作为交联剂实现。多糖的实例可以是葡聚糖、纤维素和琼脂糖。琼脂糖具有特殊的优点，即高度多孔的刚性凝胶可通过琼脂糖水溶液的热凝胶化获得。琼脂糖可合适地通过在US6602990、US7396467或US8309709中描述的方法交联，其通过引用以其整体结合到本文中。用这些方法交联的琼脂糖，所谓的高流量琼脂糖，具有高刚度和高孔隙度/孔隙体积的特别有利的组合，允许高流动速率和快速质量运输。高刚度对于具有小粒径的基质是特别重要的，允许高流动速率且无基质的坍塌。琼脂糖可例如在凝胶化之前用试剂(像烯丙基缩水甘油醚或烯丙基卤化物)烯丙基化，如在US6602990中所述。为允许高结合能力和快速质量运输，粒子可有利地具有可接近大分子种类(像IgG抗体)的大体积孔隙。这可如在“Handbook ofProcess Chromatography, A Guide to Optimization, Scale-Up and Validation”(1997) Academic Press, SanDiego, Gail Sofer & Lars Hagel eds. ISBN 0-12-654266-X, p. 368中所述，通过逆尺寸排阻色谱(SEC)测定。用于可接近的孔隙体积的合适参数是对定义大小的探针分子测定的凝胶相分配系数，KD。这是依据KD = (VR-V0)/(Vt-V0)，从探针分子的保留体积VR、柱的间隙空位体积V0和柱的总液体体积Vt计算的柱-独立的变量。对于作为探针分子的分子量110 kDa的葡聚糖，多孔粒子可合适地具有在0.6-0.8，例如0.65-0.75或0.65-0.70的范围内的KD值。
配体可例如从抗体-结合细菌蛋白，例如SpA (蛋白A)、消化链球菌(Peptostreptococcus)蛋白L或链球菌(Streptococcus)蛋白G衍生。它们可结合于抗体，以致相互作用的KD值是至多1 x 10-6 M，例如至多1 x 10-7 M，例如至多5 x 10-8 M。它们可包含Fc-结合蛋白，例如SpA或/和SpA变体，其结合于IgG分子的Fc部分。它们可包含天然或突变蛋白A Fc-结合结构域的单体、二聚体或多聚体。天然蛋白A Fc-结合结构域E、D、A、B和C与突变的变体Z和Zvar一起示于图1中。在一些实施方案中，配体中的一个或多个结构域衍生自蛋白Z，或蛋白A的B或C结构域，其中在位置23的氨基酸残基为苏氨酸。这样的结构域具有为生物过程应用所需的改进的碱稳定性(见例如US8329860、US7834158、US 14/961164和WO2016079033，通过引用以其整体结合到本文中)，其可例如通过于22 +/- 2℃，在0.5 MNaOH中孵育分离基质5 h来评估。合适地，然后基质保留至少90%或至少95%的孵育前原始IgG-结合能力。在某些实施方案中，一个或多个结构域包含如由SEQ ID NO: 8或9定义的氨基酸序列。SEQ ID NO:8是减去接头序列VDAKFD的Zvar结构域和SEQ ID NO:9是减去接头序列ADNKFN的C结构域。一个或多个结构域，例如全部结构域，还可通过一个或多个氨基酸取代、插入或缺失来突变。因此例如，在SEQ ID NO: 8或9内可存在至多10、9、8、7、6、5、4、3或2个突变，例如取代。
SEQ ID NO:8
KEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO:9
KEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK
配体可合适地在各结构域之间额外包含1-10个氨基酸残基的一个或多个接头序列，例如VDNKFN、ADNKFN、VDAKFD、AD或FN。此外，配体可包含偶联部分，例如在配体的C-末端或N-末端，合适地在C-末端的半胱氨酸或多个赖氨酸。配体还可包含在N-末端的前导序列，例如在信号肽和任选地还有接头序列的拷贝裂解后的斑痕(scar)或残基。这样的前导序列可例如是1-15个氨基酸(例如1-10个氨基酸)肽，例如AQ、AQGT、AQVDAKFD、AQGTVDAKFD或AQVDNKFN。因此，配体的典型结构可例如是前导序列 – (结构域-接头)n-1 – 结构域 – 偶联部分。n可例如是1-7，例如1、2、3、4、5、6或7。
在第二方面，由图4说明的，本发明公开一种包含如上所述的分离基质的色谱柱1。色谱柱可例如是轴向填充床柱1，其中基质粒子的圆柱形填充床2被限制在两个网状物/玻璃料3、4和两个分配器结构5、6之间，允许进料流通过入口7、入口分配器5和入口网状物/玻璃料3，穿过填充床2，然后通过出口玻璃料/网状物4、出口分配器6和出口8。填充床的高度h可例如是至多5 cm或至多10 cm，例如2-5 cm或2-4 cm。填充床的直径d可例如是至少1 cm，例如至少1.5 cm或1.5-200 cm、1.5-100 cm、1.5-50 cm或1.5-30 cm。
在第三方面，由图5说明的，本发明公开一种包含多个如上公开的色谱柱11、12、13的色谱系统10。系统可合适地被安排执行连续的色谱。它可例如包含至少两个，例如至少3个如上公开的色谱柱11、12、13，其填充有相同的分离基质并与一个或多个连接管道14、15、16连接，以致液体可从一个柱11、12流向随后的柱12、13和从最后的柱13流向第一个柱11，并且两个柱之间的各个连接管道可包含至少一个开/关阀17、18、19，其可以是三通阀或四通阀。该系统还可包含进料泵20，例如经由第一检测器21连接于第一个阀组件22。缓冲液泵23也可连接于该第一个阀组件22。第一个阀组件22还可经由第一个阀23连接于第一个柱11的入口。第一个柱11的出口端可通过第二检测器24连接于第二个阀17。第一个阀组件22还可经由第二个阀或阀组件25连接于第二个柱12的入口。第二个柱12的出口端可经由第三检测器26连接于阀18。此外，阀27可在阀17和阀18之间连接。阀27还可连接于阀28，其还连接于阀23和第二个阀组件25。由此来自第一个柱11的流出物可通过连接管道14、阀17、27、28和25导向第二柱12的入口。而且第一个阀组件22可经由阀29连接于第三个柱13的入口。第三个柱13的出口端可经由第四个检测器30连接于阀19。此外阀31可在阀18和阀19之间连接。阀31可还连接于阀32，后者还可连接于第二阀组件25和阀29。由此来自第二个柱12的流出物可通过连接管道15导入第三个柱13的入口。来自第三个柱13的流出物可经由阀19和23，通过连接管道16导入第一个柱11的入口。此外，第一、第二、第三和第四检测器21、24、26、30都可连接于测定单元32。测定单元可适合于使用来自检测器的检测信号以确定3个不同的柱的突破点和饱和点。测定单元32和所有的阀组件、阀和泵还可连接于控制单元33(所有的连接均未在图中示出)，其适合于在从荷载区移除柱或向荷载区加入柱，改变流动速率，开始新的洗涤步骤等时，控制色谱系统。检测器21、24、26、30可例如是UV检测器。控制单元33可被配置以依据从测定单元32获得的突破点数据控制系统。或者，控制单元33可使用固定的预定步骤时间，以切换操作。
在第四方面，本发明公开一种通过亲和色谱分离抗体的方法。该方法包括以下步骤：
a) 输送过程进料穿过如上公开的至少第一色谱柱，以吸附来自进料的抗体。过程进料可例如包含至少4 mg/ml的抗体，例如4-15、4-10或4-5 mg/ml，和/或在这个步骤中的停留时间可例如少于2 min，例如0.3-1 min或0.3-0.8 min；
b) 任选地洗涤第一色谱柱；
c) 输送洗脱液穿过第一色谱柱以洗脱抗体；和
d) 回收含抗体的洗脱液。
该方法可合适地在如上公开的色谱系统10中进行。
在该方法的某些实施方案中，在步骤a)中，使来自第一色谱柱11的流出物通过填充有与第一个柱相同的分离基质的第二色谱柱12；
在步骤a)后，在步骤a’)中，使过程进料重新导向第二色谱柱12且使来自第二色谱柱的流出物通过填充有与第一和第二个柱相同的分离基质的第三色谱柱13；
在步骤a’)后，在步骤a’’)中，使过程进料重新导向第三色谱柱13且使来自第三色谱柱的流出物通过第一色谱柱11；
步骤c)在步骤a’’)之前执行；
在步骤a’)后，在步骤c’)中，输送洗脱液穿过第二色谱柱12以洗脱抗体；
在步骤a’’)后，在步骤c’’)中，输送洗脱液穿过第三色谱柱13以洗脱抗体；和
步骤a)、a’)、a’’)、c)、c’)和c’’)的顺序任选地重复一或多次。
在步骤a)、a’)和a’’)中的停留时间可例如少于2 min，例如0.3-1 min或0.3-0.8min。
该方法还可分别在步骤c)、c’)和c’’)之后包括步骤e)、e’)和e’’)，各自包括输送清洁液体分别通过所述第一、第二和第三色谱柱。清洁液体可以是包含至少0.1M (例如0.1- 1M或0.1-0.5 M)碱的水性碱溶液。碱可以是例如NaOH，但也可以是例如KOH。清洁(也称为就地清洗-CIP)步骤确保任何残余的进料组分在结合和洗脱步骤的重复之前从柱中除去。合适地，配体能够承受重复的碱处理，例如如上讨论的，其中基质在用0.5 M NaOH孵育5h后保留至少95%的其原始IgG-结合能力。
分别在步骤e)、e’)和e’’)后，该方法还可包括平衡步骤f)、f’)和f’’)，以分别再平衡用于步骤a)、a’)和a’’)的柱。
实施例
实施例1
柱：用高度交联的球形琼脂糖珠填充3个HiTrap 5 mL塑料柱(内径7.0 mm)至3.0 cm的床高。珠含有11 mg/ml SpA变体配体(Zvar的四聚体)，经由C-末端半胱氨酸共价偶联至52微米体积-加权中位直径(d50,v)的高刚度(依据在US6602990中描述的程序交联)琼脂糖珠，具有对应于对Mw 110 kDa的葡聚糖的0.66的KD值的孔隙率。
进料：使含有4.0 g/L单克隆IgG抗体的澄清的CHO细胞上清液，通过0.22微米滤器过滤。在加载到柱上之前，使752 g进料与1253 g PBS缓冲液(pH 7.4)混合，得到1.5 g/L的mAb浓度。该混合物的UV吸光度(300 nm)是695 mAu。
色谱：将柱安装于具有类似于图5的流动路径的ÄKTATM PCC (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden)系统，在如表1中所述的条件下，采用3-柱PCC方法，在柱上连续捕获稀释的进料。缓冲液：平衡10mM磷酸盐27mM、KCl 140mM NaCl pH 7.4，洗涤1 10mM磷酸盐27mM KCl 140mM NaCl pH 7.4，洗涤2 50mM乙酸盐缓冲液pH 6，洗脱50mM乙酸盐缓冲液pH3.5，CIP 100mM NaOH。系统按预定的固定步骤时间运行。
表1. 实施例1的PCC步骤。
步骤 柱体积(CV) 流速(ml/min) 停留时间(RT) (min) 步骤持续时间(min)
加载 28.9 (32.3 CV 首次加载) 10 0.5 14.5 (16.2首次加载)
洗涤1 2 10 0.5 1
洗涤2 1 10 0.5 0.5
洗脱 3 5.0 1 3
就地清洁(CIP) 1 1.0 5 5
平衡 5 10 0.5 2.5
柱运行周转时间(包括泵洗涤)是14.5 min。洗脱液中的mAb浓度通过在比色皿中测量280 nm UV吸光度并从预定的校准曲线计算来确定。
来自实验的色谱图示于图4中。量化结果示于表2中。
表2. 来自实施例1的结果。
加载# 加载体积(mL) 加载的mAb (mg) 洗脱液(g) mAb浓度(mg/ml) 洗脱液中的mAb (mg) 得率(%)
1 161.5 242 8.9 23.2 206 85.2*
2 144.5 217 8.9 23.7 211 97.5*
3 144.3 216 9.2 23.7 218 100.6
4 144.3 216 9.2 23.7 218 100.7
5 144.4 217 9.0 24.5 221 101.8
6 144.3 216 9.7 22.9 222 102.5
7 144.4 217 9.2 24.3 224 103.4
8 144.5 217 9.1 24.7 224 103.6
9 144.4 217 9.6 23.2 223 102.8
10 144.4 217 9.2 24.3 224 103.4
11 144.4 217 9.0 24.5 221 101.8
12 144.2 216 9.3 24.3 226 104.6
*达到稳定状态前。
在稳定状态，以45%突破点和0.5 min停留时间，动态能力平均是43 g/L。生产率，计算为mAb浓度/(停留时间*柱的数量)，其中停留时间以h计，是60 g/L h。
实施例2
这种3-柱PCC实验用实施例1的未稀释的4.0 mg/L上清液作为进料运行。在加载期间的停留时间是2.5 min，条件在表3中列出。在该实验中，测量各柱后的UV吸收，并用于自动切换在5%突破点的柱。
表3. 实施例2的PCC步骤。
各柱洗脱液中的mAb的平均量是270 mg和动态结合能力平均是54 g/L。
实施例3
使用标准方法测定作为停留时间的函数的对mAb的动态结合能力(10%突破点，Qb10)，所述mAb来自与实施例1相同类型的柱上的实施例1的细胞上清液。a)在与实施例1相同的基质(原型)上和b) 在具有较大的珠尺寸的基质(参考)上进行测量。在后一种情况下，基质含有10.5 mg/ml SpA变体配体(Zvar的四聚体)，经由C-末端半胱氨酸共价偶联至85微米体积-加权中位直径(d50,v)的高刚度(依据在US6602990中描述的程序交联)琼脂糖珠，具有对应于对Mw 110 kDa的葡聚糖的0.69的KD值的孔隙率。结果在图3中按动态结合能力vs.停留时间作图。
本书面描述采用实施例公开本发明，包括最佳模式，并且还能够使本领域任何技术人员实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统并执行任何结合的方法。本发明的可专利范围由权利要求书限定，并且可包括本领域技术人员想到的其它实施例。如果这样的其它实施例具有不同于权利要求书的文字语言的结构要素，或如果它们包括与权利要求书的文字语言无实质性差异的等价结构要素，则它们意欲落入权利要求书的范围内。本文提及的任何专利或专利申请通过引用以其整体结合到本文中，如同它们各自结合到本文中一样。

Claims (26)

1. 一种包含抗体-结合蛋白配体已被共价固定于其上的多孔球形粒子的分离基质，其中所述配体的密度大于10 mg/ml和所述粒子的体积-加权中位直径在30-55 μm的范围内。
2. 权利要求1的分离基质，其中所述配体的密度在10.5-15 mg/ml的范围内，例如11-15 mg/ml。
3.权利要求1或2的分离基质，其中所述多孔球形粒子包含交联多糖。
4.任一项前述权利要求的分离基质，其中所述多孔球形粒子包含交联琼脂糖。
5.权利要求4的分离基质，其中琼脂糖在凝胶化之前已被烯丙基化。
6. 任一项前述权利要求的分离基质，其中所述多孔球形粒子具有0.6-0.8，例如0.6-0.7的凝胶相分配系数，其表示为对于分子量110 kDa的葡聚糖的KD。
7.任一项前述权利要求的分离基质，其中所述配体包含Fc-结合蛋白。
8.权利要求7的分离基质，其中所述Fc-结合蛋白是蛋白A。
9.任一项前述权利要求的分离基质，其中所述配体包含蛋白A结构域的单体、二聚体或多聚体。
10.权利要求9的分离基质，其中一个或多个所述结构域已被突变。
11.权利要求10的分离基质，其中一个或多个所述结构域衍生自蛋白Z，或蛋白A的B或C结构域，并且其中在位置23的氨基酸残基是苏氨酸。
12. 权利要求9-11的任一项的分离基质，其中一个或多个所述结构域包含如由SEQ IDNO: 8或9定义的氨基酸序列。
13. 任一项前述权利要求的分离基质，其在20 +/- 2℃，在0.5 M NaOH中孵育5小时后保留至少95%的其原始结合能力。
14.一种色谱柱(1)，其包含依据任一项前述权利要求的分离基质。
15. 权利要求14的色谱柱，其包含所述分离基质的填充床(2)，其中所述填充床具有至多5或10 cm，例如2-5 cm或2-4 cm的床高(h)。
16.一种色谱系统(10)，其包含多个依据权利要求14或15的色谱柱(11、12、13)。
17.权利要求16的色谱系统，其被安排执行连续的色谱。
18.权利要求16或17的色谱系统(10)，其包含至少两个，例如至少三个，依据权利要求12或13的色谱柱(11、12、13)，所述色谱柱填充有相同的分离基质并与一个或多个连接管道(14、15、16)连接，以致液体可从一个柱流向随后的一个柱并从最后的柱流向第一个柱，且其中两个柱之间的每个连接管道包括至少一个开/关阀(17、18、19)。
19.一种通过亲和色谱分离抗体的方法，该方法包括以下步骤：
a) 输送过程进料穿过至少依据权利要求14-15的任一项的第一色谱柱，以吸附来自所述进料的抗体；
b) 任选地洗涤所述第一色谱柱；
c) 输送洗脱液穿过所述第一色谱柱以洗脱抗体；和
d) 回收含抗体的所述洗脱液。
20.权利要求19的方法，其在权利要求16-18的任一项的色谱系统中进行。
21.权利要求19或20的方法，其中：
在步骤a)中，使来自所述第一色谱柱的流出物通过填充有与第一个柱相同的分离基质的第二色谱柱；
在步骤a)后，在步骤a’)中，使过程进料重新导向第二色谱柱且使来自第二色谱柱的流出物通过填充有与第一和第二个柱相同的分离基质的第三色谱柱；
在步骤a’)后，在步骤a’’)中，使过程进料重新导向第三色谱柱且使来自第三色谱柱的流出物通过第一色谱柱；
步骤c)在步骤a’’)之前执行；
在步骤a’)后，在步骤c’)中，输送洗脱液穿过第二色谱柱以洗脱抗体；
在步骤a’’)后，在步骤c’’)中，输送洗脱液穿过第三色谱柱以洗脱抗体；和
步骤a)、a’)、a’’)、c)、c’)和c’’)的顺序任选地重复一或多次。
22. 权利要求19-21的任一项的方法，其中在步骤a)中，停留时间少于2 min，例如0.3-1 min或0.3-0.8 min。
23. 权利要求21的方法，其中在步骤a)、a’)和a’’)中，停留时间少于2 min，例如0.3-1min或0.3-0.8 min。
24. 权利要求19-23的任一项的方法，其中所述过程进料包含至少4 mg/ml抗体，例如4-15或4-10 mg/ml。
25.权利要求21-24的任一项的方法，其还包括分别在步骤c)、c’)和c’’)之后的步骤e)、e’)和e’’)，其包括输送清洁液体穿过所述第一、第二和第三色谱柱。
26. 权利要求25的方法，其中所述清洁液体包含至少0.1 M碱，例如NaOH。
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