JP6938467B2 - 分離マトリックスおよび抗体の分離方法 - Google Patents

Description

本発明は、分離マトリックス、より詳細には、抗体分離に有用な分離マトリックスに関する。本発明は、前記マトリックス上で抗体を分離する方法にも関する。

治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の製造では、カップリングされたスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ（ＳｐＡ）またはＳｐＡの変異体を含むマトリックス上でのアフィニティークロマトグラフィーが、大部分の汚染物質を除去するための第１の分離工程として一般に使用される。治療用ｍＡｂの需要が増加するにつれて、分離プロセスの効率を改善するための強力な推進力があり、いくつかのアプローチが評価中である。

供給材料が第１カラムに適用され、次いで、第１カラムが飽和に近づくと供給材料は１または複数の後続のカラムに転送され、前記第１カラムは溶出され、後続の（１または複数の）カラムの溶出および再生の間に再度負荷されるように再生される、マルチカラム連続クロマトグラフィープロセスが利用可能である。このようなプロセスは、周期的向流分配クロマトグラフィー（ＰＣＣ）または擬似移動床式（ＳＭＢ）と表すことができ、治療用ｍＡｂの分離にはかなり興味深いものであり、米国特許第７９０１５８１号、米国特許出願第２０１３０２４８４５１号、米国特許出願第２０１３０２８０７８８号および米国特許第７２２０３５６号の明細書を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＰＣＣ／ＳＭＢプロセスは生産性を大幅に向上させる可能性があるが、従来のバッチクロマトグラフィー用に設計された現在利用可能な分離マトリックスでは最大限の可能性に到達することはできない。

したがって、連続クロマトグラフィープロセスために特別に設計された新しい分離マトリックスおよびこのようなマトリックスを使用するプロセスが必要とされている。

国際公開第２０１６／０７９０３３号

本発明の一態様は、高い生産性でｍＡｂの連続的分離を可能にする分離マトリックスを提供することである。これは、請求項１に記載のマトリックスによって達成される。

１つの利点は、マトリックスが非常に短い滞留時間で高い結合容量を有することである。

本発明の第２の態様は、高い生産性でｍＡｂの連続的分離を可能にするクロマトグラフィーカラムを提供することである。これは、特許請求の範囲に記載のカラムによって達成される。

本発明の第３の態様は、高い生産性でｍＡｂの連続的分離を可能にするマルチカラムクロマトグラフィーシステムを提供することである。これは、特許請求の範囲に記載のシステムによって達成される。

本発明の第４の態様は、抗体を分離する効率的な方法を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載の方法によって達成される。１つの利点は、この方法が非常に短い滞留時間と高い結合容量とを可能にすることである。

本発明のさらに適切な実施形態は従属請求項に記載される。

プロテインＡ Ｆｃ結合ドメインのアライメントを示す。 実施例１のクロマトグラムを示す。ＵＶ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅ＝供給材料のＵＶ吸光度、ＵＶ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｏｓｔ＝カラム流出液のＵＶ吸光度。 参照マトリックスと比較した、本発明のマトリックスの動的結合容量を示す。 本発明によるカラムを示す。 本発明によるクロマトグラフィーシステムを示す。

図１〜図３に例示される一態様において、本発明は、抗体結合タンパク質リガンドが共有結合的に固定化された、多孔性の、好適には球状の粒子を含む分離マトリックスを開示する。これらのリガンドの密度は、１０ｍｇ／ｍｌ超、例えば１０．５〜１５ｍｇ／ｍｌの範囲、例えば１０．５〜１２ｍｇ／ｍｌであり、粒子の体積加重メジアン径は３０〜５５μｍの範囲、例えば４５〜５５μｍまたは５０〜５５μｍである。リガンドの密度は、マトリックス堆積物の体積１ｍｌ当たりにカップリングされたリガンドの含量を示し、例えば、アミノ酸分析により同定することができる。ｄ５０、ｖとも表される体積加重メジアン径は、エレクトロゾーンセンシング（ｅｌｅｃｔｒｏｚｏｎｅ ｓｅｎｓｉｎｇ）（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ）、レーザー光回折または画像解析による顕微鏡検査によって測定することができる。好ましい方法は、当該マトリックスの細かいふるい分級物を用いて較正された計器によるエレクトロゾーンセンシングを使用することであり、ｄ５０、ｖは顕微鏡および画像解析で決定される。

多孔性粒子は架橋多糖類を含むことができ、これは、ｍＡｂまたは汚染物質と粒子との間の非特異的相互作用のリスクを最小限に抑えながら、リガンドのカップリングのための大きな親水性表面を提供する。多糖類は適切には、ゼロまたは非常に低い（例えば、５マイクロモル／ｍｌ未満）荷電基含有量を有し、非特異的相互作用を防止する。架橋は、剛性および化学的安定性を増加させ、当技術分野で公知の方法、特に、例えば架橋剤としてエピクロロヒドリンまたはジエポキシドを使用する、エポキシド架橋によって達成することができる。多糖類の例は、デキストラン、セルロースおよびアガロースであり得る。アガロースは、水性アガロース溶液の熱ゲル化によって高度に多孔性の剛性ゲルを達成できるという特別な利点を有する。アガロースは、米国特許第６６０２９９０号、米国特許第７３９６４６７号または米国特許第８３０９７０９号の明細書に記載されている方法によって適切に架橋することができ、当該特許はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらの方法によって架橋されたアガロース、いわゆる高流動アガロースは、高剛性および高多孔率／細孔容積の特に有利な組み合わせを有し、高い流量および迅速な物質輸送を可能にする。高剛性は、マトリックスの崩壊なしに高い流量を可能にするために、粒径が小さいマトリックスにとって特に重要である。アガロースは、例えば、米国特許第６６０２９９０号明細書に記載されているように、ゲル化の前にアリルグリシジルエーテルまたはアリルハライドのような試薬でアリル化することができる。高い結合容量および迅速な物質輸送を可能にするために、粒子は、ＩｇＧ抗体のような巨大分子種にアクセス可能な大容積の細孔を有し得ることが有利である。これは、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ」（１９９７）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｇａｉｌ Ｓｏｆｅｒ ＆ Ｌａｒｓ Ｈａｇｅｌ ｅｄｓ．ＩＳＢＮ ０−１２−６５４２６６−Ｘ，ｐ．３６８に記載の逆サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定することができる。アクセス可能な細孔容積の適切なパラメータは、規定されたサイズのプローブ分子について決定されたゲル相分配係数、Ｋ_Ｄである。これは、Ｋ_Ｄ＝（Ｖ_Ｒ−Ｖ_０）／（Ｖ_ｔ−Ｖ_０）に従って、プローブ分子の保持体積Ｖ_Ｒ、カラムの格子間空隙体積Ｖ_０およびカラムの全液体体積Ｖｔから計算される、カラム非依存性変数である。多孔性粒子は、適切には、プローブ分子としての分子量１１０ｋＤａのデキストランに対して、０．６〜０．８、例えば０．６５〜０．７５または０．６５〜０．７０の範囲のＫ_Ｄ値を有することができる。

リガンドは、例えば、ＳｐＡ（プロテインＡ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＬまたはストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＧなどの抗体結合細菌タンパク質に由来してもよい。これらは、相互作用のＫ_Ｄ値が最大で１×１０^−６Ｍ、例えば最大１×１０^−７Ｍ、例えば最大で５×１０^−８Ｍであるように抗体に結合することができる。これらは、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に結合するＦｃ結合タンパク質、例えばＳｐＡまたはＳｐＡ変異体を挙げることができる。これらは、天然または変異したプロテインＡ Ｆｃ結合ドメインの単量体、二量体または多量体を含むことができる。天然のプロテインＡ Ｆｃ結合ドメインＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣは、突然変異体ＺおよびＺｖａｒと共に図１に示されている。いくつかの実施形態において、リガンド中のドメインの１または複数は、プロテインＺまたはプロテインＡのＢもしくはＣドメインに由来し、２３位のアミノ酸残基はスレオニンである。このようなドメインは、バイオプロセス使用に望ましい、改善されたアルカリ安定性を有し（例えば、米国特許第８３２９８６０号、米国特許第７８３４１５８号、ベイコック特許出願第１４／９６１１６４号の明細書および国際公開第２０１６０７９０３３号を参照されたく、当該特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、このことは、分離マトリックスを２２±２℃で５時間、０．５Ｍ ＮａＯＨ中でインキュベートすることによって評価することができる。適切には、マトリックスは、その後、インキュベーション前の元のＩｇＧ結合容量の少なくとも９０％または少なくとも９５％を保持する。特定の実施形態において、ドメインの１または複数は、配列番号８または９によって定義されるアミノ酸配列を含む。配列番号８はＺｖａｒドメインからリンカー配列ＶＤＡＫＦＤを差し引いたものであり、配列番号９はＣドメインからリンカー配列ＡＤＮＫＦＮを差し引いたものである。１また複数のドメイン、例えばすべてのドメインはまた、１または複数のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって変異していてもよい。したがって、１０、９、８、７、６、５、４、３または２までの変異、例えば、配列番号８または９内の置換が存在し得る。

配列番号８
ＫＥＱＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９
ＫＥＱＱ ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
リガンドは、個々のドメイン間に適切に１〜１０アミノ酸残基の１または複数のリンカー配列、例えば、ＶＤＮＫＦＮ、ＡＤＮＫＦＮ、ＶＤＡＫＦＤ、ＡＤまたはＦＮをさらに含み得る。さらに、リガンドは、カップリング部分、例えば、システインまたは複数のリジンをリガンドのＣ末端またはＮ末端に、適切にはＣ末端に含んでいてもよい。リガンドはまた、Ｎ末端にリーダー配列、例えばシグナルペプチド切断後の瘢痕または残基および場合によりリンカー配列のコピーを含んでいてもよい。このようなリーダー配列は、例えば、１〜１５アミノ酸（例えば、１〜１０アミノ酸）のペプチド、例えばＡＱ、ＡＱＧＴ、ＡＱＶＤＡＫＦＤ、ＡＱＧＴＶＤＡＫＦＤまたはＡＱＶＤＮＫＦＮであり得る。したがって、リガンドの典型的な構造は、例えば、リーダー−（ドメイン−リンカー）_ｎ−１−ドメイン−カップリング部分である。ｎは１〜７、例えば、１、２、３、４、５、６または７などであってよい。

図４により例示される第２の態様において、本発明は、上記の分離マトリックスを含むクロマトグラフィーカラム１を開示する。クロマトグラフィーカラムは、例えば、マトリックス粒子の円筒状充填床２が２つのネット／フリット３、４および２つの分配構造５、６の間に閉じ込められ、供給材料が、入口７、入口分配器５および入口ネット／フリット３を介して充填床２を通って流動し、次いで出口フリット／ネット４、出口分配器６および出口８を通って流動する、軸方向充填床カラム１であってよい。充填床の高さｈは、例えば、５ｃｍまで、または１０ｃｍまで、例えば２〜５ｃｍまたは２〜４ｃｍであってよい。充填床の直径ｄは、例えば、少なくとも１ｃｍ、例えば少なくとも１．５ｃｍまたは１．５〜２００ｃｍ、１．５〜１００ｃｍ、１．５〜５０ｃｍまたは１．５〜３０ｃｍであってよい。

図５に例示される第３の態様において、本発明は、上に開示した複数のクロマトグラフィーカラム１１、１２、１３を含むクロマトグラフィーシステム１０を開示する。このシステムは、連続クロマトグラフィーを行うために適切に配置することができる。例えばこのシステムは、同一の分離マトリックスが充填された少なくとも２つ、例えば少なくとも３つの上記で定義されたクロマトグラフィーカラム１１、１２、１３を含み、１または複数の接続ライン１４、１５、１６により、液体が１つのカラム１１、１２から後続のカラム１２、１３に流れ、最後のカラム１３から第１カラム１１に流れ得るように接続され、２つのカラムの間の各接続ラインが少なくとも１つの、三方弁または四方弁であり得るオン／オフバルブ１７、１８、１９を備えることができる。このシステムは、例えば第１検出器２１を介して第１バルブブロック２２に接続されている、供給ポンプ２０をさらに備えてもよい。この第１バルブブロック２２には、緩衝液ポンプ２３が接続されていてもよい。第１バルブブロック２２は、第１バルブ２３を介して第１カラム１１の入口にさらに接続することができる。第１カラム１１の出口端は、第２検出器２４を通って第２バルブ１７に接続することができる。第１バルブブロック２２は、さらに、第２バルブまたはバルブブロック２５を介して第２カラム１２の入口に接続することができる。第２カラム１２の出口端は、第３検出器２６を介してバルブ１８に接続することができる。さらに、バルブ２７は、バルブ１７とバルブ１８との間に接続することができる。バルブ２７はさらにバルブ２８に接続することができ、バルブ２８はさらにバルブ２３および第２バルブブロック２５に接続される。これによって、第１カラム１１からの流出液を、接続ライン１４、バルブ１７、２７、２８および２５を通って第２カラム１２の入口に向かわせることができる。さらに、第１バルブブロック２２は、バルブ２９を介して第３カラム１３の入口に接続することができる。第３カラム１３の出口端は、第４検出器３０を介してバルブ１９に接続することができる。さらに、バルブ３１は、バルブ１８とバルブ１９との間に接続することができる。バルブ３１はまたバルブ３２に接続することができ、バルブ３２は第２バルブブロック２５およびバルブ２９に接続することができる。これによって、第２カラム１２からの流出液を、接続ライン１５を通って第３カラム１３の入口に向かわせることができる。第３カラム１３からの流出液は、バルブ１９および２３を介して接続ライン１６を通って第１カラム１１の入口に向かわせることができる。さらに、第１、第２、第３および第４の検出器２１、２４、２６、３０はすべて判定ユニット３２に接続することができる。判定ユニットは、検出器からの検出シグナルを使用して、３つの異なるカラムの貫流点および飽和点を判定するように構成されている。判定ユニット３２およびすべてのバルブブロック、バルブおよびポンプは、さらに、制御ユニット３３に接続され（すべての接続は図示しない）、これは負荷ゾーンからカラムを除去するか、または負荷ゾーンにカラムを加える時、流量を変える時、新しい洗浄ステップを開始する時に関してクロマトグラフィーシステムを制御するように適合させられる。検出器２１、２４、２６、３０は、例えば、ＵＶ検出器であってよい。制御ユニット３３は、判定ユニット３２から得られる貫流データに基づいてシステムを制御するように構成することができる。あるいは、制御ユニット３３は、スイッチング動作に一定の所定の工程時間を使用することができる。

第４の態様において、本発明は、アフィニティークロマトグラフィーによる抗体の分離方法を開示する。この方法は、
ａ）プロセス供給材料を、上記で開示した少なくとも第１クロマトグラフィーカラムを通して輸送し、抗体を供給材料から吸着させる工程（前記プロセス供給材料は、例えば、少なくとも４ｍｇ／ｍｌの抗体、例えば４〜１５、４〜１０または４〜５ｍｇ／ｍｌの抗体を含むか、および／またはこの工程の滞留時間は、例えば２分未満、例えば０．３〜１分または０．３〜０．８分である）、
ｂ）場合により、第１クロマトグラフィーカラムを洗浄する工程、
ｃ）溶出液を、第１クロマトグラフィーカラムを通して輸送して、抗体を溶出させる工程、ならびに
ｄ）抗体を含む溶出液を回収する工程、
を含む。

この方法は、上記に開示したクロマトグラフィーシステム１０において適切に実施することができる。

この方法の特定の実施形態において、工程ａ）において、第１クロマトグラフィーカラム１１からの流出液は、第１カラムと同じ分離マトリックスを充填した第２クロマトグラフィーカラム１２を通過し、
工程ａ）の後、工程ａ’）において、プロセス供給材料は第２クロマトグラフィーカラム１２に向け直され、第２クロマトグラフィーカラムからの流出液は、第１および第２カラムと同じ分離マトリックスが充填された第３クロマトグラフィーカラム１３を通過し、
工程ａ’）後、工程ａ’’）において、プロセス供給材料は第３クロマトグラフィーカラム１３に向け直され、第３クロマトグラフィーカラムからの流出液は第１クロマトグラフィーカラム１１を通過し、
ステップｃ）がステップａ’）の前に実行され、
ステップａ’）の後、ステップｃ’）において、溶出液は第２クロマトグラフィーカラム１２を通って輸送されて抗体を溶出し、
ステップａ”）の後、ステップｃ”）において、溶出液は第３クロマトグラフィーカラム１３を通って輸送され、抗体を溶出し、ならびに
工程ａ）、ａ’）、ａ’’）、ｃ）、ｃ’）およびｃ”）の順序は、場合により１または複数回繰り返される。

工程ａ）、ａ’）およびａ’’）における滞留時間は、例えば、２分未満、例えば０．３〜１分または０．３〜０．８分である。

この方法は、工程ｃ）、ｃ’）およびｃ”）それぞれの後に、工程ｅ）、ｅ’）およびｅ”）を含むことができ、それぞれは、洗浄液を前記第１、第２および第３のクロマトグラフィーカラムをそれぞれ通して輸送する工程を含む。洗浄液は、少なくとも０．１Ｍ（例えば０．１〜１Ｍまたは０．１〜０．５Ｍ）のアルカリを含むアルカリ水溶液であってよい。アルカリは、例えば、ＮａＯＨでもよいが、例えばＫＯＨであってもよい。洗浄（定置洗浄−ＣＩＰとも呼ばれる）工程は、結合および溶出工程を繰り返す前に、確実にすべての残留供給材料成分をカラムから除去する。適切なリガンドは、繰り返されるアルカリ処理に耐えることができ、例えば上述のように、マトリックスは、０．５Ｍ ＮａＯＨとの５時間のインキュベーション後に元のＩｇＧ結合容量の少なくとも９５％を保持している。

工程ｅ）、ｅ’）およびｅ”）それぞれの後に、本方法は、工程ａ）、ａ’）およびａ’’）のためにカラムを再較正する平衡化工程ｆ）、ｆ’）およびｆ”）をそれぞれ含んでもよい。

カラム：３つのＨｉＴｒａｐ ５ｍＬプラスチックカラム（内径７．０ｍｍ）に、高度に架橋した球状アガロースビーズを３．０ｃｍの床高さに充填した。このビーズは、Ｃ末端システインを介して、Ｍｗ１１０ｋＤａのデキストランに対して０．６６のＫ_Ｄ値に相当する多孔性を有する、５２マイクロメーターの体積加重メジアン径（ｄ５０，ｖ）の、高剛性（米国特許第６６０２９９０号明細書に記載された手順に従って架橋されている）アガロースビーズに共有結合された１１ｍｇ／ｍｌのＳｐＡ変異体リガンド（Ｚｖａｒの四量体）を含有した。

供給材料：４．０ｇ／ＬのモノクローナルＩｇＧ抗体を含有する清澄化したＣＨＯ細胞上清を、０．２２μｍのフィルターで濾過した。７５２ｇの供給材料を１２５３ｇのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）と混合して、カラムに負荷する前の１．５ｇ／ＬのｍＡｂ濃度を得た。この混合物のＵＶ吸光度（３００ｎｍ）は６９５ｍＡｕであった。

クロマトグラフィー：カラムは、図５と同様の流路を有するＡＫＴＡ（商標）ＰＣＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン）システムに取り付けられ、希釈供給材料は、表１に記載の条件下で３カラムＰＣＣ法を使用して連続的にカラムに捕捉された。緩衝液：平衡化 １０ｍＭ リン酸塩 ２７ｍＭ ＫＣｌ １４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、洗浄１ １０ｍＭリン酸塩 ２７ｍＭ ＫＣｌ １４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、洗浄２ ５０ｍＭ 酢酸緩衝液 ｐＨ６、溶出 ５０ｍＭ 酢酸緩衝液 ｐＨ３．５、ＣＩＰ １００ｍＭ ＮａＯＨ。所定の固定工程時間でシステムを運転した。

ポンプ洗浄を含むカラムターンアラウンド時間は、１４．５分であった。溶出液中のｍＡｂ濃度は、キュベットにおいて２８０ｎｍのＵＶ吸光度を測定し、所定の較正曲線から計算することによって決定した。

実験によるクロマトグラムを図４に示す。定量化した結果を表２に示す。

定常状態では、動的容量は平均４３ｇ／Ｌであり、４５％で貫流および滞留時間０．５分であった。ｍＡｂ濃度／（滞留時間＊カラム数）として計算した生産性は、滞留時間をｈとして６０ｇ／Ｌｈであった。

この３カラムＰＣＣ実験は、実施例１の４．０ｍｇ／Ｌの上清を未希釈で供給材料として用いて行った。負荷中の滞留時間は２．５分であり、条件は表３に記載された通りであった。この実験では、各カラム後のＵＶ吸収を測定し、貫流５％でカラムを自動的に切り替えるために使用した。

各カラム溶出液中のｍＡｂの平均量は２７０ｍｇであり、動的結合容量は平均５４ｇ／Ｌであった。

実施例１と同じ型のカラム上の実施例１の細胞上清からのｍＡｂの動的結合容量（１０％貫流、Ｑｂ１０）を、標準的な方法を使用して滞留時間の関数として決定した。測定は、ａ）実施例１と同じマトリックス（プロトタイプ）およびｂ）より大きいビーズサイズを有するマトリックス（参照）で行った。後者の場合、マトリックスは、Ｃ末端システインを介して、Ｍｗ１１０ｋＤａのデキストランに対して０．６９のＫ_Ｄ値に相当する多孔性を有する、８５マイクロメーターの体積加重メジアン径（ｄ５０，ｖ）の、高剛性（米国特許第６６０２９９０号明細書に記載された手順に従って架橋されている）アガロースビーズに共有結合された１０．５ｍｇ／ｍｌのＳｐＡ変異体リガンド（Ｚｖａｒの四量体）を含有した。結果を動的結合容量対滞留時間として図３にプロットした。

本明細書は、最良の様式を含む本発明を開示するため、およびどのような当業者も、任意のデバイスまたはシステムの作製および使用ならびに任意の組み込まれた方法の実行を含む本発明の実践を可能にするために、実施例を使用している。本発明の特許可能な範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者が想到する他の実施例を含むことができる。そのような他の実施例は、それらが特許請求の範囲の文言から相違しない構造要素を有する場合、または特許請求の範囲の文言から実質的には相違しない同等の構造要素を含む場合、特許請求の範囲の技術的範囲に包含される。本文において言及した特許または特許出願はいずれも、それらの全体が、それらがあたかも個別に援用されているかのように、ここでの言及によって本明細書に援用される。
［実施態様１］
抗体結合タンパク質リガンドが共有結合的に固定化された多孔性球状粒子を含む分離マトリックスであって、前記リガンドの密度が１０ｍｇ／ｍｌ超であり、前記粒子の体積加重メジアン径が３０〜５５μｍの範囲にある分離マトリックス。
［実施態様２］
前記リガンドの密度が、１０．５〜１５ｍｇ／ｍｌの範囲、例えば１１〜１５ｍｇ／ｍｌである、実施態様１に記載の分離マトリックス。
［実施態様３］
前記多孔性球状粒子が架橋多糖類を含む、実施態様１または２に記載の分離マトリックス。
［実施態様４］
前記多孔性球状粒子が架橋アガロースを含む、実施態様１乃至３のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様５］
前記アガロースがゲル化前にアリル化されている、実施態様４に記載の分離マトリックス。
［実施態様６］
前記多孔性球状粒子が、分子量１１０ｋＤａのデキストランに対してＫ_Ｄとして表されるゲル相分配係数が０．６〜０．８、例えば０．６〜０．７である、実施態様１乃至５のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様７］
前記リガンドがＦｃ結合タンパク質を含む、実施態様１乃至６のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様８］
前記Ｆｃ結合タンパク質がプロテインＡである、実施態様７に記載の分離マトリックス。
［実施態様９］
前記リガンドが、プロテインＡドメインの単量体、二量体または多量体を含む、実施態様１乃至８のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様１０］
前記ドメインの１または複数が変異している、実施態様９に記載の分離マトリックス。
［実施態様１１］
前記ドメインの１または複数が、プロテインＺまたはプロテインＡのＢもしくはＣドメインに由来し、２３位のアミノ酸残基がスレオニンである、実施態様１０に記載の分離マトリックス。
［実施態様１２］
前記ドメインの１または複数が、配列番号８または９によって定義されるアミノ酸配列を含む、実施態様９乃至１１のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様１３］
２０±２℃で０．５Ｍ ＮａＯＨ中で５時間インキュベートした後に、元の結合容量の少なくとも９５％を保持する、実施態様１乃至１２のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様１４］
実施態様１乃至１３のいずれか１項に記載の分離マトリックスを含むクロマトグラフィーカラム（１）。
［実施態様１５］
５または１０ｃｍまで、例えば２〜５ｃｍまたは２〜４ｃｍの床高さ（ｈ）を有する、前記分離マトリックスの充填床（２）を含む、実施態様１４に記載のクロマトグラフィーカラム（１）。
［実施態様１６］
実施態様１４または１５に記載の複数のクロマトグラフィーカラム（１１、１２、１３）を含むクロマトグラフィーシステム（１０）。
［実施態様１７］
連続クロマトグラフィーを行うように構成された、実施態様１６に記載のクロマトグラフィーシステム（１０）。
［実施態様１８］
同一の分離マトリックスが充填された少なくとも２つ、例えば少なくとも３つの、実施態様１２または１３に記載のクロマトグラフィーカラム（１１、１２、１３）を含み、１または複数の接続ライン（１４、１５、１６）により、液体が１つのカラムから後続のカラムに流れ、最後のカラム（１３）から第１カラム（１１）に流れ得るように接続され、２つのカラム（１１，１３）の間の各接続ライン（１４，１５，１６）が少なくとも１つのオン／オフバルブ（１７、１８、１９）を備える、実施態様１６または１７に記載のクロマトグラフィーシステム（１０）。
［実施態様１９］
アフィニティークロマトグラフィーによる抗体の分離方法であって、
ａ）プロセス供給材料を、実施態様１４乃至１５のいずれか１項に記載の少なくとも第１クロマトグラフィーカラム（１１）を通して輸送し、抗体を前記供給材料から吸着させる工程、
ｂ）場合により、前記第１クロマトグラフィーカラム（１１）を洗浄する工程、
ｃ）溶出液を、前記第１クロマトグラフィーカラム（１１）を通して輸送して、抗体を溶出させる工程、ならびに
ｄ）抗体を含む前記溶出液を回収する工程、
を含む方法。
［実施態様２０］
実施態様１６乃至１８のいずれか１項に記載のクロマトグラフィーシステム（１０）において実施される、実施態様１９に記載の方法。
［実施態様２１］
工程ａ）において、前記第１クロマトグラフィーカラム（１１）からの流出液は、前記第１カラム（１１）と同じ分離マトリックスを充填した第２クロマトグラフィーカラム（１２）を通過し、
工程ａ）の後、工程ａ’）において、プロセス供給材料は前記第２クロマトグラフィーカラム（１２）に向け直され、前記第２クロマトグラフィーカラム（１２）からの流出液は、前記第１および第２カラム（１１，１２）と同じ分離マトリックスが充填された第３クロマトグラフィーカラム（１３）を通過し、
工程ａ’）後、工程ａ’’）において、前記プロセス供給材料は前記第３クロマトグラフィーカラム（１３）に向け直され、前記第３クロマトグラフィーカラム（１３）からの流出液は前記第１クロマトグラフィーカラム（１１）を通過し、
ステップｃ）がステップａ’）の前に実行され、
ステップａ’）の後、ステップｃ’）において、前記溶出液は前記第２クロマトグラフィーカラム（１２）を通って輸送されて抗体を溶出し、
ステップａ”）の後、ステップｃ”）において、前記溶出液は前記第３クロマトグラフィーカラム（１３）を通って輸送され、抗体を溶出し、ならびに
工程ａ）、ａ’）、ａ’’）、ｃ）、ｃ’）およびｃ”）の順序は、場合により１または複数回繰り返される、実施態様１９または２０に記載の方法。
［実施態様２２］
工程ａ）において、滞留時間が２分未満、例えば０．３〜１分または０．３〜０．８分である、実施態様１９乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２３］
工程ａ）、ａ’）およびａ’’）において、滞留時間が２分未満、例えば０．３〜１分または０．３〜０．８分である、実施態様２１に記載の方法。
［実施態様２４］
前記プロセス供給材料が、少なくとも４ｍｇ／ｍｌの抗体、例えば４〜１５または４〜１０ｍｇ／ｍｌの抗体を含む、実施態様１９乃至２３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２５］
工程ｃ）、ｃ’）およびｃ”）の後に、それぞれ、工程ｅ）、ｅ’）およびｅ”）をさらに含み、前記第１、第２および第３のクロマトグラフィーカラム（１１，１２，１３）を通して洗浄液を輸送する工程を含む、実施態様２１乃至２４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２６］
前記洗浄液が、ＮａＯＨなどの少なくとも０．１Ｍのアルカリを含む、実施態様２５に記載の方法。

１ クロマトグラフィーカラム、軸方向充填床カラム
２ 分離マトリックスの充填床
３ 入口ネット／フリット
４ 出口ネット／フリット
５ 入口分配器
６ 出口分配器
７ 入口
８ 出口
１０ クロマトグラフィーシステム
１１ 第１クロマトグラフィーカラム
１２ 第２クロマトグラフィーカラム
１３ 第３クロマトグラフィーカラム
１４ 接続ライン
１５ 接続ライン
１６ 接続ライン
１７ 第２オン／オフバルブ
１８ オン／オフバルブ
１９ オン／オフバルブ
２０ 供給ポンプ
２１ 第１検出器
２２ 第１バルブブロック
２３ 第１バルブ、緩衝液ポンプ
２４ 第２検出器
２５ 第２バルブブロック
２６ 第３検出器
２７ バルブ
２８ バルブ
２９ バルブ
３０ 第４検出器
３１ バルブ
３２ バルブ、判定ユニット
３３ 制御ユニット

Claims (9)

1. アフィニティークロマトグラフィーによる抗体の分離方法であって、
   ａ）少なくとも４ｍｇ／ｍｌの抗体を含むプロセス供給材料を、少なくとも第１クロマトグラフィーカラムを通し、抗体を前記供給材料から吸着させ、前記第１クロマトグラフィーカラムからのプロセス供給材料を含む流出液を、第２クロマトグラフィーカラムに通過させる工程、
   ａ’）工程ａ）の後、プロセス供給材料を前記第２クロマトグラフィーカラムに向け直し、前記第２クロマトグラフィーカラムからの流出液を、第３クロマトグラフィーカラムに通過させる工程、
   ｂ）場合により、前記第１クロマトグラフィーカラムを洗浄する工程、
   ｃ）溶出液を、前記第１クロマトグラフィーカラムを通し、抗体を前記第１クロマトグラフィーカラムから溶出させる工程、
   ａ’’）工程ａ’）及び工程ｃ）の後、プロセス供給材料を前記第３クロマトグラフィーカラムに向け直し、前記第３クロマトグラフィーカラムからの流出液を、前記第１クロマトグラフィーカラムに通過させる工程、
   ｃ’）工程ａ’）の後、溶出液を、前記第２クロマトグラフィーカラムを通して、抗体を溶出させる工程、
   ｃ’’）工程ａ’’）の後、溶出液を、前記第３クロマトグラフィーカラムを通して、抗体を溶出させる工程、ならびに
   ｄ）抗体を含む前記溶出液を回収する工程、
   を含み、
   工程ａ）、ａ’）、ａ’’）、ｃ）、ｃ’）およびｃ”）の順序は、場合により１または複数回繰り返され、
   前記第１、第２及び第３クロマトグラフィーカラムがそれぞれ２〜５ｃｍの床高さ（ｈ）を有する分離マトリックスの充填床（２）を含み、
   ｉ）前記分離マトリックスが、抗体結合タンパク質リガンドが共有結合的に固定化された多孔性球状粒子を含み、
   ｉｉ）前記リガンドの密度が１０ｍｇ／ｍｌ超であり、
   ｉｉｉ）前記粒子の体積加重メジアン径が４０〜５５μｍの範囲にあり、
   ｉｖ）前記多孔性球状粒子が、分子量１１０ｋＤａのデキストランに対してＫ_Ｄとして表されるゲル相分配係数が０．６〜０．８であり、
   工程ａ）において、滞留時間が２分未満である、
   方法。
2. 工程ａ）において、滞留時間が０．３〜１分または０．３〜０．８分であり、
   場合により、工程ａ’）およびａ’’）において、滞留時間が２分未満、例えば０．３〜１分または０．３〜０．８分である、請求項１に記載の方法。
3. 工程ｃ）、ｃ’）およびｃ”）それぞれの後に、洗浄液を前記第１、第２及び第３クロマトグラフィーカラムに通して輸送する工程ｅ）、ｅ’）およびｅ”）をそれぞれさらに含み、
   前記洗浄液は、少なくとも０．１Ｍのアルカリ、例えばＮａＯＨを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記多孔性球状粒子が、架橋アガロースを含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記多孔性球状粒子が、分子量１１０ｋＤａのデキストランに対してＫ_Ｄとして表されるゲル相分配係数が０．６〜０．７である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記リガンドがＦｃ結合タンパク質、例えばプロテインＡドメインを含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記リガンドが、プロテインＡドメインの単量体、二量体または多量体を含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記ドメインの１または複数が変異しており、場合により：
   ａ）前記ドメインの１または複数がプロテインＺまたはプロテインＡのＢもしくはＣドメインに由来し、２３位のアミノ酸残基がスレオニンである、および／または
   前記ドメインの１または複数が、配列番号８または９によって定義されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記充填床が２〜４ｃｍの床高さ（ｈ）を有する、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。

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