JP5123847B2 - 流体工学装置 - Google Patents
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Description
本出願は、2005年5月25日に出願された米国仮特許出願第60/684,177号明細書(「流体工学装置」(Fluidics Device)、ボスケッティ(Boschetti)ら)および2005年7月28日に出願された米国仮特許出願第60/702,989号明細書(「固相バッファーを使用した等電点に基づくタンパク質の分離」(Separation Of Proteins Based On Isoelectric Point Using Solid−Phase Buffers)、ボスケッティ(Boschetti)ら)の優先日の利益を主張する。
本発明の実施形態は、特に、プレート内に配列された少なくとも3つのチャンバーを含む装置を扱う。この装置は、プレートの一方の側の上の第1の面と、プレートの反対側の第2の側の上の第2の面とを有する。各チャンバーは、あらゆる他のチャンバーとは独立に、一方の面に入口開口部を有し、他方の面に出口開口部を有する。複数のチャンバーは、取り外し可能な導管を介して連続的に直列に接続され、各導管は、1つのチャンバーの出口を別のチャンバーの入口に接続している。これらのチャンバーおよび導管の系列によって、第1のチャンバーの入口を、すべての中間チャンバーのそれぞれを介して、最終チャンバーの出口まで接続する流体経路が画定される。
本発明の現在好ましい実施形態を図面で説明する。複数の図面で同じ参照番号を使用して同じまたは類似の部分を示している。
に従うアクリルアミド誘導体であり、上式中、Rは、特徴的なpIを提供する基を含む。たとえば、米国特許第4,971,670号明細書を参照されたい。原則的にこの特性決定は多くの分子を含んでいるが、アマシャム(Amersham)は、商標イモビリン(IMMOBILINE)(登録商標)で販売され、等電性ゲルおよびポリマーの生成に特に適している分子を製造している。イモビリン(IMMOBILINE)(登録商標)コレクションの分子としては、括弧内に示されるpIを有する以下の分子が挙げられる:N−アクリロイルグリシン(pK3.6);4−アクリルアミドブチル酸(4−acrylamidobutyrric acid)(pK4.6);2−モルホリノエチル−アクリルアミド(pK6.2);3−モルホリノプロピルアクリルアミド(pK7.0);N,N−ジメチルアミノ−エチルアクリルアミド(pK8.5);およびN,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(pK9.3)(一括して「イモビリン」と呼ぶ)。いずれのイモビリンも、モノマーとして組み合わし、アクリルアミドおよびN,N’−メチレンビスアクリルアミドまたは別の好適な架橋剤と共重合させることで、所望のpI特異性ポリマーを生成することができる。アクリルアミドは、N−イソプロピルアクリルアミド、メチルアクリルアミド、メチロールアクリルアミド ジメチルアクリルアミド、ジエチルアクリルアミド、トリス(ヒドロキシメチル)メチルアクリルアミドなどの別の非イオン性アクリルアミド誘導体で置き換えることができる。
pH8.5の固相バッファーの調製は、pK8.5を有するN,N−ジメチル−アミノプロピル−アクリルアミド10mmol(これは1420mgの遊離塩基である)を50mLの水中に溶解させることによって行うことができる。この溶液を、pK3.1のモノマーのアクリルアミドグリコール酸(遊離酸)をゆっくり添加することによって、pH8.5まで滴定する。次に、30gのアクリルアミドおよび2gのメチレン−ビス−アクリルアミドをこの溶液に加える。次に、この溶液の体積を100mLまで増加させる。この最終溶液に、過硫酸アンモニウムおよびTEMEDなどの重合触媒を加える。次に、この溶液を、多孔質粒子の含浸などに使用する。ヒドロゲルが粒子の細孔内で重合してから、材料を洗浄して、副生成物および過剰の試薬を除去する。この固相バッファーは、20%エタノールの存在下で保管することができる。
pH4.6の固相バッファーの調製は、100mMのN−アクリロイルグリシン(pK4.6)を1リットルの蒸留水中に溶解させることによって行うことができる。次にこの溶液を、N,N,N−トリエチルアミノエチルアクリルアミドの濃厚溶液(水中50%)を加えることによって、pH4.6まで滴定する。得られた溶液に、200グラムのアクリルアミドおよび10グラムのN,N’−メチレン−ビス−アクリルアミドを加える。この混合物を完全に溶解するまで撹拌する。N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムで構成される触媒系を使用直前に溶液に加える。38mLの最終溶液を、約75μM(100グラムで細孔容積が38mL)の多孔質ジルコニアビーズ100mLに加え、この無機ビーズの多孔質容積内に溶液が完全に吸収されるまで混合する。次に、含浸させたビーズを、交互に窒素を導入しながら真空下で3回脱気する。次に、この混合物を、モノマーが重合するまで窒素の存在下、室温で保管する。得られた固体バッファーは、水、同じpHのバッファー(たとえば、酢酸バッファーpH4.6)、さらに再び水で十分に洗浄する。続いて、この固体バッファーは、イオン交換体の存在下ですぐに使用することができる。
pH9.3の固体バッファーの調製は、100mMのN,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(pK9.3)を1リットルの蒸留水中に溶解させることによって行うことができる。次にこの溶液を、アクリル酸の濃厚溶液(水中50%)を加えることによって、pH9.3まで滴定する。得られた溶液に、200グラムのジメチル−アクリルアミドおよび10グラムのN,N’−メチレン−ビス−アクリルアミドを加える。得られた混合物を、完全に溶解するまで撹拌する。N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムで構成される触媒系を使用直前に加える。38mLの最終溶液を、約75μM(100グラムで細孔容積が38mL)の多孔質ジルコニアビーズ100mLに加え、このビーズの多孔質容積内に溶液が完全に吸収されるまで混合する。次に、含浸させたビーズを、交互に窒素を導入しながら真空下で3回脱気する。次に、この混合物を、モノマーが重合するまで窒素の存在下、室温で保管する。得られた材料は、水、同じpHのバッファー(たとえば、Tris−HClバッファー、pH9.3)、さらに再び水で十分に洗浄する。続いて、この固体バッファーは、イオン交換体の存在下ですぐに使用することができる。
pH7.7の固体バッファーの調製は、50mMの3−モルホリノプロピルアクリルアミド(pK7.0)および50mMのN,N−ジメチルアミノエチルアクリルアミド(pK8.5)を1リットルの蒸留水中に溶解させることによって行うことができる。次にこの溶液を、2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸の濃厚溶液(水中50%)を加えることによって、pH7.7まで滴定する。得られた溶液に、200グラムのアクリルアミドおよび10グラムのN,N’−メチレン−ビス−アクリルアミドを加え、得られた混合物を、完全に溶解するまで撹拌する。N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムで構成される触媒系を使用直前に加える。38mLの最終溶液を、約75μM(100グラムで細孔容積が38mL)の多孔質ジルコニアビーズ100mLに加え、このビーズの多孔質容積内に溶液が完全に吸収されるまで混合する。次に、含浸させたビーズを、交互に窒素を導入しながら真空下で3回脱気する。次に、この混合物を、モノマーが重合するまで窒素の存在下、室温で保管する。得られた材料は、水、同じpHのバッファー(たとえば、モルホリン−HClバッファーpH7.7)、さらに再び水で十分に洗浄する。続いて、この固体バッファーは、イオン交換体の存在下ですぐに使用することができる。
pH4.6の固体バッファーは、150mMのN−アクリロイルグリシン(pK4.6)および10mMのN,N’−メチレン−ビス−アクリルアミドを1リットルの蒸留水中に溶解させることによって行うことができる。次にこの溶液を、N,N,N−トリエチルアミノエチルアクリルアミドの濃厚溶液(水中50%)を加えることによって、pH4.6まで滴定する。N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムで構成される触媒系を使用直前に加える。
pH6.5の固体バッファーの調製は、150mMの3−モルホリノプロピルアクリルアミド(pK7.0)を1リットルの蒸留水中に溶解させることによって行うことができる。次にこの溶液を、N−アクリロイルグリシン(pK3.6)の濃厚溶液(水中50%)を加えることによって、pH6.5まで滴定する。得られた溶液に、400グラムのアクリルアミドおよび30グラムのN,N’−メチレン−ビス−アクリルアミドを加え、得られた混合物を、完全に溶解するまで撹拌する。N,N,N’、N’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムで構成される触媒系を使用直前に加える。100mLのこの溶液を、3%のアラセル(arlacel)C(油溶性乳化剤)を含有する500mLのパラフィン油中に分散させる。この懸濁液を65℃で3時間撹拌し続けて、モノマーをともに共重合させる。重合中に形成されたヒドロゲルビーズを、濾過により回収し、非極性溶媒で十分に洗浄して、微量のパラフィン油を除去する。次に、このビーズを、水、同じpHのバッファー、さらに再び水で十分に洗浄する。続いて、この固体バッファーは、イオン交換体の存在下ですぐに使用することができる。
pH6.5の固体バッファーの調製は、150mMのN,N,N−トリエチル−アミノエチル−アクリルアミド(pK12)を1リットルの蒸留水中に溶解させることによって行うことができる。次にこの溶液を、アクリルアミドグリコール酸(pK3.1)の濃厚溶液(水中50%)を加えることによって、pH9.0まで滴定する。得られた溶液に、300グラムのジメチル−アクリルアミドおよび20グラムのN,N’−メチレン−ビス−アクリルアミドを加え、得られた混合物を、完全に溶解するまで撹拌する。N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミンおよび過硫酸アンモニウムで構成される触媒系を使用直前に加える。次にこの溶液を、窒素下で65℃の温浴に入れる。5時間後、充満したヒドロゲル下で重合が完了する。このヒドロゲルを小さな断片に切断し、粉砕して約100μmの粒子を得る。次に、粒子となった生成物を、水、次に同じpHのバッファー、さらに再び水で十分に洗浄する。続いて、この固体バッファーは、イオン交換体の存在下ですぐに使用することができる。
3種類のクロマトグラフィー材料の系列を、相互接続された部分カラムまたはチャンバー102/510(先行の出口が後続の入口と出会う)カラムまたはチャンバー102/510の系列として組み立てる。各クロマトグラフィー材料は、同じ陰イオン交換体(QハイパーZ(Q HyperZ)収着剤)を含むが、異なるpH、特にそれぞれ5.4、7.7、および9.5の異なる固体バッファーを含む。クロマトグラフィー部分カラムまたはチャンバー102は、pHが増加する順序で位置合わせされ、すなわち、第1の部分カラムまたはチャンバー102/510がpH5.4を有し、最終の吸着剤がpH9.5を有する。
3種類のクロマトグラフィー材料の系列を、相互接続された部分カラムまたはチャンバー102(先行の出口が後続の入口と出会う)カラムの系列として組み立てる。各クロマトグラフィー材料は、同じ陽イオン交換体を含むが、異なるpH、特にそれぞれ5.4、7.7、および9.5の異なる固体バッファーを含む。クロマトグラフィー部分カラムまたはチャンバー102は、pHが減少する順序で位置合わせされ、すなわち、第1の部分カラムまたはチャンバー102/510がpH9.5を有し、最終の吸着剤がpH5.4を有する。
本明細書において本発明者らが説明する方法以外に疎水性インデックスによる他の分離方法が存在するのであれば、それらについて言及すべきである。
前述の実施形態の1つを使用したヒト血清の分離プロトコールの1つを以下に説明する。
Claims (32)
- プレート内に配列された少なくとも3つのチャンバーを含む装置であって、
(i)前記装置は、前記プレートの一方の側の上の第1の面と、前記プレートの反対側の第2の側の上の第2の面とを有し、
(ii)各チャンバーは、あらゆる他のチャンバーとは独立に、一方の面に入口開口部を有し、他方の面に出口開口部を有し、
(iii)複数の前記チャンバーは、取り外し可能な導管を介して連続的に直列に接続され、各導管は、1つのチャンバーの出口を別のチャンバーの入口に接続し;
(iv)前記チャンバーおよび導管の系列によって、第1のチャンバーの入口を、すべての中間チャンバーのそれぞれを介して、最終チャンバーの出口まで接続する流体経路が画定され、
少なくとも一部の前記導管が、前記プレートを貫通して、前記第2の面の出口開口部を前記第1の面の入口開口部に接続している、装置。 - 前記導管のすべてが、前記第2の面の出口開口部を前記第1の面の入口開口部に接続している、請求項1に記載の装置。
- 前記系列中の複数の前記チャンバーが、ライナー系列で配列しており、前記チャンバーのそれぞれが、両面で開放するチャネルに隣接しており、少なくとも1つの出口および入口の間の前記流体流路が前記チャネルを貫通している、請求項1に記載の装置。
- 少なくとも一部の前記導管が、前記第1の面の出口開口部を前記第1の面の入口開口部に接続するか、または前記第2の面の出口開口部を前記第2の面の入口開口部に接続する、請求項1に記載の装置。
- 少なくとも1つの前記導管が、前記第2の面の出口開口部を前記第2の面の入口開口部に接続し、少なくとも1つの前記導管が前記第1の面の出口開口部を前記第1の面の入口開口部に接続する、請求項3に記載の装置。
- 前記導管が前記装置から取り外し可能である、請求項1に記載の装置。
- 前記系列中の少なくとも1つチャンバーが分離媒体を含有する、請求項1に記載の装置。
- 前記系列中の前記チャンバーのそれぞれが分離媒体を含有する、請求項7に記載の装置。
- 前記系列中の複数の前記チャンバーが異なる分離媒体を含有する、請求項7に記載の装置。
- 前記分離媒体の系列が、前記流体流路の方向に沿って:(a)高選択性媒体、中間の選択性の媒体、および低選択性媒体;あるいは(b)低選択性媒体、中間の選択性の媒体、および高選択性媒体、を含む、請求項9に記載の装置。
- 前記装置中の前記複数のチャンバーが8の倍数である、請求項1に記載の装置。
- 前記装置中の前記複数のチャンバーが12の倍数である、請求項1に記載の装置。
- 前記チャンバーが少なくとも1つの直線系列で配列されている、請求項1に記載の装置。
- 前記チャンバーが複数の横列および縦列で配列されている、請求項1に記載の装置。
- 前記チャンバーが、8×12の配列で配列されている、請求項14に記載の装置。
- 流体流路を画定する複数の系列のチャンバーおよび導管を含む、請求項1に記載の装置。
- 前記装置の前記チャンバーに対応して、横列および縦列で配列された複数のウェルを含む収集プレートをさらに含み:
前記収集プレートの前記ウェルのそれぞれが入口を有し;
前記導管を外すと、前記収集プレートの前記ウェルの前記入口が、前記装置の前記チャンバーと位置合わせされるように構成される、請求項1に記載の装置。 - 前記流体流路に沿って流体サンプルを押圧する、または吸引するように構成されたポンプをさらに含む、請求項1に記載の装置。
- 前記チャンバーに対応したウェルを含むドリップスルー(drip−through)マイクロタイタープレートをさらに含む、請求項1に記載の装置。
- 装置であって:
(a)チャンバーの少なくとも1つの横列を含むプレートであって、各チャンバーが、前記プレートの第1の面の上の入口と、前記プレートの反対側の第2の面の上の出口とを含むプレートと;
(b)前記プレートの前記第1の面に密封係合する取り外し可能な第1の部材であって:
(I)1組の奇数番目のウェルの入口に位置合わせされた複数の開口部と、
(II)1組の偶数番目のウェルに位置合わせされた複数の開放端導管とを含み、前記導管が、前記偶数番目のウェルの入口から出口までを通る、第1の部材と;
(c)前記第1の部材に密封係合する取り外し可能な第2の部材であって:
(I)第1のチャンバーの前記入口に位置合わせされることによって、前記第1のチャンバーへの入口を形成する開口部と;
(II)複数の導管と、を含み、前記導管のそれぞれが、前記第1の部材の開口部を前記第1の部材の導管に接続する、第2の部材と;
(d)前記プレートの前記第2の面に密封係合する取り外し可能なガスケットであって、前記チャンバーの前記出口に位置合わせされた複数の開口部を含むガスケットと;
(e)前記ガスケットに密封係合する取り外し可能な第3の部材であって、前記ガスケット内の前記開口部に位置合わせされた複数の溝を含み、これらを合わせたものが複数の導管を形成し、各導管が、奇数番目のウェルの前記出口を偶数番目のウェルの前記出口に接続する、第3の部材と、を含み、
前記チャンバーと導管との組み合わせによって、奇数番目のウェルを入口から出口まで貫通し、偶数番目のウェルを出口から入口まで貫通する流体流路が画定される、装置。 - 前記奇数番目のチャンバーのそれぞれが分離媒体を含有する、請求項20に記載の装置。
- 装置であって:
(a)プレートであって、ウェルの第1および第2の横列の少なくとも1組を含み、各ウェルが、前記プレートの第1の面の上の入口と、前記プレートの反対側の第2の面の上の出口とを含む、プレートと;
(b)前記プレートの前記第1の面に密封係合する取り外し可能な第1の部材であって:
(I)第1の横列中のウェルの前記入口に位置合わせされ、それによってチャンバーが画定される複数の開口部と、
(II)第2の横列中のウェルに位置合わせされた複数の開放端チャネルであって、前記ウェルの前記入口から前記出口まで通る導管を画定する、複数の開放端チャネルと、を含む第1の部材と;
(c)前記第1の部材に密封係合する取り外し可能な第2の部材であって:
(I)第1の横列中の第1のウェルの入口に位置合わせされた前記第1の部材中の開口部に位置合わせされ、それによって前記第1のチャンバーに前記入口を形成する開口部と;
(II)前記第1の部材の前記開口部に位置合わせされた複数の溝であって、これらを合わせたものが複数の導管を形成し、各導管が、第1の横列中のウェルのn番目の入口を、第2の横列中のウェルのn番目の入口に接続する、複数の溝と、を含む第2の部材と;
(d)前記プレートの前記第2の面に密封係合する取り外し可能なガスケットであって、前記ウェルの前記出口に位置合わせされた複数の開口部を含む、ガスケットと;
(e)前記ガスケットに密封係合する取り外し可能な第3の部材であって:
(I)前記ガスケット内の前記開口部に位置合わせされた複数の溝であって、これらを合わせたものが複数の導管を形成し、各導管が、第1の横列中のウェルのn番目の出口を、第2の横列中のウェルのn+1番目の出口に接続する、複数の溝と;
(II)最終チャンバーの出口に位置合わせされた開口部と、を含む第3の部材と、を含み;
前記ウェルと導管との組み合わせによって、第1の横列中の前記ウェルの入口から出口まで通る流体流路が画定される、装置。 - (i)前記第2の取り外し可能な部材が、第1の副部品と第2の副部品とを含み:
(1)前記第1の副部品が、前記第1の部材中の前記開口部に位置合わせされた開口部を含み、
(2)前記第2の副部品が、前記第1の部材中の前記開口部に位置合わせされた開口部と、前記第1の副部品を前記第2の副部品に押し付けた場合に前記溝を形成する複数の開口部と、を含み;
(ii)前記第3の取り外し可能な部材が、第3の副部品と第4の副部品とを含み:
(1)前記第3の副部品が、前記最終チャンバーの前記出口に位置合わせされた開口部を含み、
(2)前記第4の副部品が、前記最終チャンバーの前記出口に位置合わせされた開口部と、前記第3の副部品を前記第4の副部品に押し付けた場合に前記溝を形成する複数の開口部とを含む、請求項22に記載の装置。 - 奇数番目のウェルが分離媒体を含有する、請求項22に記載の装置。
- a)プレート内に配列された少なくとも3つのチャンバーを含む装置を提供するステップであって、
(i)前記装置が、前記プレートの一方の側の上の第1の面と、前記プレートの反対側の第2の側の上の第2の面とを有し、
(ii)各チャンバーが、あらゆる他のチャンバーとは独立に、一方の面に入口開口部、および他方の面に出口開口部を有し;
(iii)複数の前記チャンバーが、取り外し可能な導管を介して連続的に直列に接続され、各導管が1つのチャンバーの出口を別のチャンバーの入口に接続し;
(iv)前記チャンバーおよび導管の系列によって、第1のチャンバーの入口を、すべての中間チャンバーのそれぞれを介して、最終チャンバーの出口まで接続する流体流路が画定され;
(v)前記系列中の各チャンバーは異なる分離媒体を含有する、ステップと;
b)複数の検体を含むサンプルを、前記流体流路に沿って、第1のチャンバーの前記入口から、前記最終チャンバーの前記出口に通すことによって、前記分離媒体が、前記媒体に対して親和性を有する検体を捕捉するステップと;
c)出口と入口を接続する前記導管を前記装置から取り外すステップと;
d)捕捉された検体を独立に前記チャンバーから溶出させるステップと;
e)前記溶出した検体を収集するステップと、を含む方法。 - 少なくとも1つのチャンバーから溶出した検体を検出するステップをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 前記検体を検出するステップが質量分析またはゲル電気泳動によって実施される、請求項25に記載の方法。
- 前記溶出ステップが、少なくとも1つのチャンバーから複数の分画を溶出させるステップを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記サンプルが、血液、尿、脳脊髄液、およびそれらの派生物からなる群より選択される、請求項25に記載の方法。
- (b)(1)前記分離媒体によって捕捉された少なくとも1つの前記検体を2つ以上のミニサンプルに分離するステップをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- (b)(1)前記分離媒体によって捕捉された少なくとも1つの前記検体を、質量分析、等電点電気泳動、疎水性、および/または親水性の1つ以上のプロトコールを使用して、2つ以上のミニサンプルに分離するステップをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 請求項1に記載の装置、を含むキット。
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