JP5926484B2 - グリコサミノグリカンの新規な分析方法 - Google Patents
グリコサミノグリカンの新規な分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5926484B2 JP5926484B2 JP2010258385A JP2010258385A JP5926484B2 JP 5926484 B2 JP5926484 B2 JP 5926484B2 JP 2010258385 A JP2010258385 A JP 2010258385A JP 2010258385 A JP2010258385 A JP 2010258385A JP 5926484 B2 JP5926484 B2 JP 5926484B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- disaccharide
- glycosaminoglycan
- sugar chain
- analysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/96—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation using ion-exchange
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8836—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving saccharides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Description
グライコブロッティング法に従い糖鎖を捕捉した後、H2O/酢酸/アセトニトリルによる酸処理(80℃、45min)により糖鎖を遊離させた後、還元的アミノ化反応(60℃、2時間)により2−アミノベンズアミド(蛍光)ラベル化グリコサミノグリカン二糖を得た。両性イオン性カラムは、ZIC-HILIC (2 x 150 mm)を用いた。ZICカラムの固定相は、シリカ表面にN,N−ジメチル−N−メタクリオイルオキシエチル−N −(3−スルホプロピル)アンモニウムベタインを共有結合させたものである。溶離液A(ミリQ水)、溶離液B(アセトニトリル)、溶離液C(200 mM 酢酸アンモニウム)を用い、A/B/C=5/90/5(0 min)→ A/B/C=13/82/5(20 min)→A/B/C=35/60/5(60 min)のグラジエント溶出法を用いた。流速は0.2 mL/minで一定であり、カラムオーブンによりカラム温度は30℃に保った。蛍光検出は、励起波長 330 nm、蛍光波長 420nmで測定した。図2に蛍光ラベル化グリコサミノグリカン二糖を精製・調製する方法と、両性イオンカラムを用いた分離例を示す。その際、グリコサミノグリカン二糖として、図1で示した既知の18種の化合物(定量分析のための内標物質;イソマルトトリオースを含む)を用いた。この結果から、コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸、へパラン硫酸/へパリン、ヒアルロン酸の三種のグリコサミノグリカン二糖を分離させられることが分かった。
NIH/3T3(マウス線維芽細胞様細胞株)の細胞ペレット(1 x 106cell)を500μLのクロロホルム/メタノール比率が2/1, 1/1, 1/2の順に超音波処理・遠心分離を行い脱脂した後、プロナーゼによるタンパク質の消化を37℃で12時間行った。その後、終濃度が80%エタノール/5%酢酸ナトリウムになるように試料を調製し、4℃で2時間静置した。その後、遠心処理によりペレットを回収した。回収したペレットを、各5mUのコンドロイチナーゼABC(Proteus vulgaris)、ヘパリナーゼ(Flavobacterium heparinum)、ヘパリチナーゼ(Flavobacterium heparinum)、ヒアルロニダーゼSD(Streptococcus dysgalactiae)により、グリコサミノグリカンを分解した。その後、内部標準物質を加え、上述のグライコブロッティング法による精製と還元的アミノ化による蛍光ラベル化を行い、ZIC-HILICカラムにより分離・分析を行った。図3に培養細胞NIH/3T3(1 x 106 cell)より調製した蛍光ラベル化グリコサミノグリカン二糖を本方法により分析した結果を示す。この結果から、培養細胞など複雑な生体試料に含まれる微量なコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸、へパラン硫酸/へパリン、ヒアルロン酸の三種グリコサミノグリカン二糖を分離、分析できることが分かった。
図4に、上述と同様の実験操作により、培養細胞CHO-K1(チャイニーズハムスター由来上皮性細胞株)の細胞ペレット(2x106cell)に含まれるグリコサミノグリカン二糖分析を繰り返し行い、得られたデータの再現性例を示した。絶対量は添加した内標の量から見積もった。この結果から、培養細胞に含まれるグリコサミノグリカンの絶対量及び相対量ともに良い再現性を示すことが分かった。
図1の既知物質から蛍光ラベル化グリコサミノグリカン二糖を調製し、約10 pmolのサンプルをZIC-HILICカラムに導入し、分離液を直接ESI−MSに接続し、負イオンモードでの測定を行った。図5に、図1に示した既知物質を蛍光ラベル化したグリコサミノグリカン二糖をLC/MSで分析したマススペクトルの一部を示した。従来のグリコサミノグリカン二糖分析法では、一般的に逆相イオンペアークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法が用いられるため、多大なイオン化効率の低下を招くなど質量分析計との接続の相性が悪い方法であったが、本分析法では高濃度の有機溶媒(75%程度のアセトニトリル水溶液)、また揮発性かつ低濃度の塩溶媒(10 mM程度の酢酸アンモニウム)でHPLCの分離が可能であるため、質量分析計との接続も容易であることが示された。
Claims (6)
- 陰イオン及び陽イオン交換基を有する固定相を用いたカラムを利用した高速液体クロマトグラフィーによって、少なくとも2種以上のグリコサミノグリカンを同時に分析することを特徴とした糖鎖分析方法であって、
前記分析方法は:
被検物質であるグリコサミノグリカンを2以上の系に分け、該系の1つを酵素未処理とし、その他の系に対し、コンドロイチナーゼABC、コンドロイチナーゼAC I フラボ、コンドロイチナーゼAC II アルスロ、コンドロイチナーゼB、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒアルロニダーゼSD、ケラタナーゼ、及びケラタナーゼIIからなる群より選ばれる酵素で処理することによって、該グリコサミノグリカンを二糖類に分解し、
該二糖類をグライコブロッティングにより捕捉した後、酸処理することで遊離させ、続けて還元的アミノ化により該二糖類を蛍光ラベル化し、
該蛍光ラベル化した二糖類を前記高速液体クロマトグラフィーによって分析する、
ことにより行う、前記糖鎖分析方法。 - グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸或いはデルマタン硫酸からなる化合物類、ヘパラン硫酸或いはヘパリンからなる化合物類、ヒアルロン酸化合物類、ケラタン硫酸類のいずれかである、請求項1記載の糖鎖分析方法。
- 陰イオン交換基が4級アンモニウム基である、請求項1または2記載の糖鎖分析方法。
- 陽イオン交換基が硫酸基、及び/またはリン酸基である、請求項1〜3のいずれか1項記載の糖鎖分析方法。
- 前記蛍光ラベル化は、2−アミノベンズアミド、2−アミノピリジン、2−アミノアクリドンのいずれか1つ以上より選ばれる蛍光ラベル化剤を用いて行う、請求項1〜4のいずれか1項記載の糖鎖分析方法。
- 前記高速液体クロマトグラフィーによる分析に続けて質量分析を行う、請求項1〜5のいずれか1項記載の糖鎖分析方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010258385A JP5926484B2 (ja) | 2010-11-18 | 2010-11-18 | グリコサミノグリカンの新規な分析方法 |
PCT/JP2011/076691 WO2012067236A1 (ja) | 2010-11-18 | 2011-11-18 | グリコサミノグリカンの新規な分析方法 |
US13/988,418 US20130309703A1 (en) | 2010-11-18 | 2011-11-18 | Novel method for analyzing glycosaminoglycan |
EP11841620.5A EP2642286A4 (en) | 2010-11-18 | 2011-11-18 | NEW METHOD FOR THE ANALYSIS OF GLYKOSAMINOGLYKAN |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010258385A JP5926484B2 (ja) | 2010-11-18 | 2010-11-18 | グリコサミノグリカンの新規な分析方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012108056A JP2012108056A (ja) | 2012-06-07 |
JP5926484B2 true JP5926484B2 (ja) | 2016-05-25 |
Family
ID=46084155
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010258385A Expired - Fee Related JP5926484B2 (ja) | 2010-11-18 | 2010-11-18 | グリコサミノグリカンの新規な分析方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20130309703A1 (ja) |
EP (1) | EP2642286A4 (ja) |
JP (1) | JP5926484B2 (ja) |
WO (1) | WO2012067236A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6360738B2 (ja) * | 2014-07-10 | 2018-07-18 | 学校法人 愛知医科大学 | グリコサミノグリカン糖鎖の配列構造を決定する方法 |
WO2016190043A1 (ja) * | 2015-05-28 | 2016-12-01 | 昭和電工株式会社 | 糖類の分析方法 |
JP6972478B2 (ja) * | 2016-11-15 | 2021-11-24 | ポーラ化成工業株式会社 | 蛍光物質 |
US20210132040A1 (en) | 2017-02-21 | 2021-05-06 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Analytical method for glycosaminoglycans |
CN108802248B (zh) * | 2018-06-21 | 2021-03-02 | 福州大学 | 一种衍生化的含游离氨基的硫酸类肝素二糖的分离分析方法 |
JP7361256B2 (ja) * | 2018-08-21 | 2023-10-16 | Jcrファーマ株式会社 | コンドロイチン硫酸の分析法 |
CN109298112B (zh) * | 2018-12-11 | 2021-06-18 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种测定透明质酸含量的方法 |
CN114685571B (zh) * | 2022-04-18 | 2022-11-25 | 江南大学 | 一种寡糖荧光标记物及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3037987B2 (ja) * | 1990-09-28 | 2000-05-08 | 生化学工業株式会社 | グリコサミノグリカンの分析方法 |
SE9803838D0 (sv) | 1998-11-09 | 1998-11-09 | Knut Irgum | A chromatography method and a column material useful in said method |
CH693625A5 (it) | 1999-02-18 | 2003-11-28 | Inpharma Sa | Composizioni farmaceutiche contenenti composti ad attività promotrice di assorbimento di principi attivi. |
BR0312584A (pt) | 2002-07-08 | 2005-04-12 | Pliva Istrazivacki Inst D O O | Novas substâncias anti-inflamatórias não-esteróides, compostos e métodos para o uso das mesmas |
KR101066159B1 (ko) * | 2002-12-26 | 2011-09-20 | 시오노기 앤드 컴파니, 리미티드 | 당 사슬-포착 분자로 당 사슬을 정제/농축하는 방법 및 당 사슬 구조의 분석법 |
US7238426B2 (en) * | 2003-08-13 | 2007-07-03 | Sequant Ab | Column packing material |
US20060127950A1 (en) * | 2004-04-15 | 2006-06-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to the improved analysis of carbohydrates |
US20050238536A1 (en) * | 2004-04-21 | 2005-10-27 | Striepeke Steven K | Device and method for measuring glycosaminoglycans in body fluids |
WO2006127056A2 (en) * | 2005-05-25 | 2006-11-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Fluidics device |
JP4889400B2 (ja) * | 2005-08-29 | 2012-03-07 | 喜三郎 出口 | 糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子の分離分析方法 |
CN103257223B (zh) | 2006-08-09 | 2015-04-01 | 住友电木株式会社 | 糖链捕获物及其用途 |
JP5143841B2 (ja) | 2006-10-10 | 2013-02-13 | ロス アラモス ナショナル セキュリティー,エルエルシー | 高度な薬物開発及び製造 |
WO2010018834A1 (ja) * | 2008-08-12 | 2010-02-18 | 国立大学法人 北海道大学 | アンモニウム塩による還元性糖鎖遊離方法 |
GB0818255D0 (en) * | 2008-10-06 | 2008-11-12 | Agency Science Tech & Res | Isolation and identification of glycosaminoglycans |
-
2010
- 2010-11-18 JP JP2010258385A patent/JP5926484B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-11-18 WO PCT/JP2011/076691 patent/WO2012067236A1/ja active Application Filing
- 2011-11-18 EP EP11841620.5A patent/EP2642286A4/en not_active Withdrawn
- 2011-11-18 US US13/988,418 patent/US20130309703A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20130309703A1 (en) | 2013-11-21 |
EP2642286A4 (en) | 2015-06-03 |
EP2642286A1 (en) | 2013-09-25 |
WO2012067236A1 (ja) | 2012-05-24 |
JP2012108056A (ja) | 2012-06-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5926484B2 (ja) | グリコサミノグリカンの新規な分析方法 | |
Zaia | On‐line separations combined with MS for analysis of glycosaminoglycans | |
Yang et al. | Hyphenated techniques for the analysis of heparin and heparan sulfate | |
Zaia et al. | Tandem mass spectrometry of sulfated heparin-like glycosaminoglycan oligosaccharides | |
Chai et al. | Characterization of heparin oligosaccharide mixtures as ammonium salts using electrospray mass spectrometry | |
Lamari et al. | Analysis of glycosaminoglycan‐derived disaccharides in biologic samples by capillary electrophoresis and protocol for sequencing glycosaminoglycans | |
Lin et al. | Analysis of heparin oligosaccharides by capillary electrophoresis–negative-ion electrospray ionization mass spectrometry | |
Ziegler et al. | Size-exclusion chromatography of heparin oligosaccharides at high and low pressure | |
Huang et al. | Discovery of a heparan sulfate 3-O-sulfation specific peeling reaction | |
Ucakturk et al. | Capillary electrophoresis for total glycosaminoglycan analysis | |
Fasciano et al. | Ion chromatography for the separation of heparin and structurally related glycoaminoglycans: A review | |
Skidmore et al. | High sensitivity separation and detection of heparan sulfate disaccharides | |
JP4889400B2 (ja) | 糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子の分離分析方法 | |
Gao et al. | Preparation and characterization of hyaluronan oligosaccharides for angiogenesis study | |
Yates et al. | Recent innovations in the structural analysis of heparin | |
Sutton et al. | Chiral capillary electrophoresis with noncyclic oligo‐and polysaccharide chiral selectors | |
Hitchcock et al. | Improved workup for glycosaminoglycan disaccharide analysis using CE with LIF detection | |
Turková et al. | Hydroxyalkyl methacrylate gels derivatized with epichlorohydrin as supports for large-scale and high-performance affinity chromatography | |
JP6238087B2 (ja) | 標識糖鎖試料の調製方法 | |
Sadowski et al. | Recent developments in the separation of low molecular weight heparin anticoagulants | |
Du et al. | Ion-pairing liquid chromatography with on-line electrospray ion trap mass spectrometry for the structural analysis of N-unsubstituted heparin/heparan sulfate | |
Jackson et al. | A laboratory guide to glycoconjugate analysis | |
Kinoshita et al. | Analysis of the interaction between hyaluronan and hyaluronan-binding proteins by capillary affinity electrophoresis: significance of hyaluronan molecular size on binding reaction | |
Lamari et al. | Capillary electrophoresis: a superior miniaturized tool for analysis of the mono-, di-, and oligosaccharide constituents of glycan moieties in proteoglycans | |
Delattre et al. | Purification of oligouronides using hollow-fiber membrane functionalised with L-histidine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131118 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141204 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150202 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150728 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150928 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160324 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160422 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5926484 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |