JP7361256B2 - コンドロイチン硫酸の分析法 - Google Patents
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Description
2.該コンドロイチン硫酸の分解における該加熱が,70分~110分間,65℃~75℃の温度で行われるものである,上記1に記載の方法。
3.該試料が,体液,細胞,組織,器官,細胞の培養液,組織の培養液,食品,及び飼料から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,上記1又は2に記載の方法。
4.該試料が,哺乳動物から得られた体液,細胞,組織,器官,血液,血清,血漿,尿,骨髄液,及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,上記1又は2に記載の方法。
5.該哺乳動物が,ヒト,サル,マウス,ラット,モルモット,ハムスター,ウサギ,ウマ,ウシ,ブタ,イヌ,及びネコからなる群から選択されるものである,上記4に記載の方法。
6.該哺乳動物がヒトであり,該ヒトが,コンドロイチン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者である,上記4に記載の方法。
7.該疾患が,マロトー・ラミー症候群,モルキオ症候群A型,モルキオ症候群B型,及びスライ症候群からなる群から選択されるものである,上記6に記載の方法。
8.該患者が,体内に存在するコンドロイチン硫酸を減少させる治療を受けたものである,上記6又は7に記載の方法。
9.試料中に含まれるコンドロイチン硫酸とヘパラン硫酸を,それぞれ,該コンドロイチン硫酸を下記の式(IV)で示される二糖に,及び
該コンドロイチン硫酸を,上記1又は2に記載の方法で分解するものである,方法。
10.該ヘパラン硫酸の分解における該加熱が,110分~130分間,78℃~82℃の温度で行われるものである,上記9に記載の方法。
11.試料中に含まれるコンドロイチン硫酸,ヘパラン硫酸,及びデルマタン硫酸を,それぞれ,該コンドロイチン硫酸を下記の式(IV)で示される二糖に,
該コンドロイチン硫酸及び該ヘパラン硫酸を,上記9又は10に記載の方法で分解するものである,方法。
12.該デルマタン硫酸の分解における該加熱が,30分~80分間,63℃~67℃の温度で行われるものである,上記11に記載の方法。
13.該試料が,体液,細胞,組織,器官,細胞の培養液,組織の培養液,食品,及び飼料から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,上記9乃至12の何れかに記載の方法。
14.該試料が,哺乳動物から得られた体液,細胞,組織,器官,血液,血清,血漿,尿,骨髄液,及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,上記9乃至12の何れかに記載の方法。
15.該哺乳動物が,ヒト,サル,マウス,ラット,モルモット,ハムスター,ウサギ,ウマ,ウシ,ブタ,イヌ,及びネコからなる群から選択されるものである,上記14に記載の方法。
16.該哺乳動物がヒトであり,該ヒトが,コンドロイチン硫酸,ヘパラン硫酸,及びデルマタン硫酸の何れか1つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患の患者である,上記14に記載の方法。
17.該疾患が,マロトー・ラミー症候群,モルキオ症候群A型,モルキオ症候群B型,ハンター症候群,ハーラー症候群,シャイエ症候群,ハーラー・シャイエ症候群,サンフィリッポ症候群,及びスライ症候群からなる群から選択されるものである,上記16に記載の方法。
18.該患者が,体内に存在するコンドロイチン硫酸,ヘパラン硫酸,及びデルマタン硫酸の何れか1つ又は複数のものを減少させる治療を受けたものである,上記16又は17に記載の方法。
19.試料中に含まれるコンドロイチン硫酸の量を測定する方法であって,
上記1乃至8の何れかに記載の方法で得られた二糖を,液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと,
該溶出液を質量分析に供するステップと,
を含んでなるものである,方法。
20.試料中に含まれるコンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸の量を測定する方法であって,
上記9乃至10の何れかに記載の方法により,コンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸を分解して得られた二糖を,液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと,
該溶出液を質量分析に供するステップと,
を含んでなるものである,方法。
21.試料中に含まれるコンドロイチン硫酸,ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の量を測定する方法であって,
上記10乃至18の何れかに記載の方法により,コンドロイチン硫酸,ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸を分解して得られた二糖を,液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと,
該溶出液を質量分析に供するステップと,
を含んでなるものである,方法。
22.上記19に記載の方法により得られた,該試料中に含まれるコンドロイチン硫酸の測定値に基づいて,該試料を提供した哺乳動物の中から,コンドロイチン硫酸が体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
23.上記20に記載の方法により得られた,該試料中に含まれるコンドロイチン硫酸又は/及びヘパラン硫酸の測定値に基づいて,該試料を提供した哺乳動物の中から,コンドロイチン硫酸又は/及びヘパラン硫酸が体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
24.上記21に記載の方法により得られた,該試料中に含まれるコンドロイチン硫酸,ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の測定値に基づいて,該試料を提供した哺乳動物の中から,コンドロイチン硫酸,ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の何れか1つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
25.該疾患が,マロトー・ラミー症候群,モルキオ症候群A型,モルキオ症候群B型,ハンター症候群,ハーラー症候群,シャイエ症候群,ハーラー・シャイエ症候群,サンフィリッポ症候群,及びスライ症候群からなる群から選択されるものである,上記22乃至24の何れかに記載の方法。
26.該試料が,コンドロイチン硫酸,ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の何れか1つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患であって,該体内に蓄積した物質を減少させる治療を受けた患者から,該治療の前及び該治療の後にそれぞれ得られたものであり,該試料中に含まれる該体内に蓄積した物質の量を,上記19乃至21の何れかに記載の方法により測定することにより得られた測定値に基づいて,該治療の効果を確認する方法。
特に,式(I)中,R1はNHCOCH3又はその塩;R2はOH;R3はOH;R4はCOOH又はその塩;R5はCH2OH;R6はOSO3H,又はその塩であるものは,コンドロイチン4-硫酸という。
また,式(I)中,R1はNHCOCH3又はその塩;R2はOH;R3はOH;R4はCOOH又はその塩;R5はCH2OSO3H,又はその塩;R6はOHであるものは,コンドロイチン6-硫酸という。
また,式(I)中,R1はNHCOCH3又はその塩;R2はOSO3H又はその塩;R3はOH;R4はCOOH又はその塩;R5はCH2OSO3H,又はその塩;R6はOHであるものは,コンドロイチン硫酸Dという。
また,式(I)中,R1はNHCOCH3又はその塩;R2はOH;R3はOH;R4はCOOH又はその塩;R5はCH2OSO3H,又はその塩;R6はOSO3H,又はその塩であるものは,コンドロイチン硫酸Eという。
また,式(I)中,R1はNHCOCH3又はその塩;R2はOH;R3はOSO3H又はその塩;R4はCOOH又はその塩;R5はCH2OH;R6はOSO3H,又はその塩であるものは,コンドロイチン硫酸Kという。〕
以下の実施例1~6はコンドロイチン硫酸の分析法に関するものである。試験に用いる(a)~(k)の溶液を以下の手順で調製した。
(a)10%炭酸アンモニウム溶液:
10 gの炭酸アンモニウムを100 mLの注射用水で溶解し,10%炭酸アンモニウム溶液とした。
(b)重水素ラベル化溶媒:
氷浴下で,1.5 mLのメタノール-d4(Sigma-Aldrich社)に240 μLのアセチルクロリドを滴下し,これを重水素ラベル化溶媒とした。
(c)MeCN/water:
2 mLの注射用水と18 mLのアセトニトリルを混合し,これをMeCN/waterとした。
(d)移動相A:
475 mLの注射用水に,25 mLの1 Mギ酸アンモニウム水溶液を添加して混合したものを,移動相Aとした。
(e)移動相B:
930 mLのアセトニトリルに,70 mLの移動相Aを混合したものを,移動相Bとした。
(f)コンドロイチン硫酸標準原液(CS標準原液):
1.5 mLマイクロチューブにChondroitin sulfate A(Sigma-Aldrich社)を秤量し,注射用水を加えて溶解し,5.0 mg/mLの濃度の溶液を調製した。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに15 μLずつ分注し,使用時まで冷凍(-15℃以下)して保存した。この溶液をCS標準原液とした。
(g)検量線作成用溶液:
990 μLの注射用水を計り取り,これにCS標準原液を10 μL添加し,コンドロイチン硫酸を50 μg/mLの濃度で含有する溶液を調製した。この溶液を注射用水で希釈し,コンドロイチン硫酸を5000 ng/mLの濃度で含有する溶液を調製した。この溶液を注射用水で2段階希釈し,コンドロイチン硫酸を,25~5000 ng/mLの濃度で含有する溶液を調製した。この溶液を検量線作成用溶液とした。
(h)デルマタン硫酸標準原液(DS標準原液):
1.5 mLマイクロチューブにChondroitin sulfate B(Sigma-Aldrich社)を秤量し,注射用水を加えて溶解し,5.0 mg/mLの濃度の溶液を調製した。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに15 μLずつ分注し,使用時まで冷凍(-15℃以下)して保存した。この溶液をDS標準原液とした。
(i)デルマタン硫酸内部標準溶液(DS内部標準溶液):
ホウケイ酸ねじ口試験管に40 μLのDS標準原液を計り取り,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に400 μLの重水素ラベル化溶媒を添加し,撹拌した後,65℃で75分間反応させて,重水素化メタノール分解(deuteriomethanolysis)を行った。反応後,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に500 μLのMeCN/waterを添加し,超音波処理を30分間行った。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに20 μLずつ分注し,冷凍(-15℃以下)して保存した。この溶液をデルマタン硫酸内部標準溶液(DS内部標準溶液)とした。
(j)内標準溶液:
4 mLのメタノールに,4 μLのDS内部標準溶液を添加して撹拌した。この溶液を内標準溶液とした。本溶液は用時調製とした。
(k)細胞抽出溶液
9 μLのポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテルに2961 μLの生理食塩液及び30 μLのプロテアーゼ阻害剤を添加し,細胞抽出溶液とした。
培養細胞をPBSで洗浄した後,細胞抽出溶液を添加して細胞を1.5 mLチューブに回収した。氷上で90分間静置した後,遠心(12000 rpm,4℃,10分間)して上清を回収した。この細胞抽出液に注射用水を添加してタンパク質濃度を100 μg/mLに調整し,これを細胞サンプル溶液とした。
上記実施例1で調製した検量線作成用溶液を,それぞれ20 μL計り取り,個別にホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。また,ブランクとして,注射用水をホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。試験管中の溶媒を窒素気流下で留去した(N=1)。乾固物に,20 μLの2, 2-ジメトキシプロパンと,200 μLの塩酸の濃度が3 Nである塩酸メタノールとを添加して撹拌した後,恒温水槽を用いて70℃,90分間でメタノリシス反応を行った。反応後,氷冷した後に200 μLの10%炭酸アンモニウム溶液を添加し,反応を停止させた。50 μLの内標準溶液を添加した後,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に250 μLの注射用水を添加して溶解後,固相カートリッジ(OASIS HLB (1 cc, 30 mg))を用いて精製した。溶媒を窒素気流下で留去した。200 μLのMeCN/waterを添加して溶解し,上清をバイアルに採取した。
LC/MS/MS分析は,親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィーとタンデム四重極型質量分析装置とを組み合わせたものを用いて実施した。質量分析装置(MS/MS装置)として,QTRAP5500(エー・ビー・サイエックス社)を用い,これにHPLC装置として,Nexera X2(島津製作所)をセットした。また,LCカラムとして,Acquity UPLCTM BEH Amide 1.7 μm (2.1 X 150 mm,Waters社)を用いた。移動相として,実施例1で調製した移動相A及び移動相Bを用いた。また,カラム温度は60℃に設定した。
検量線作成用溶液の測定値から得られた検量線は, 25.0~5000 ng/mLの濃度範囲において良好な直線性を示した(図2)。相関係数(r)は0.9998であった。
実施例2で調製した培養細胞の抽出液である細胞サンプル溶液を,実施例3に記載の方法でメタノリシス反応させた後,実施例4に記載の方法で分析し,コンドロイチン硫酸に由来する検出ピークの面積(細胞サンプル溶液検出ピーク面積)を求めることができる。更に,この面積とDS-IS検出ピーク面積の比(細胞サンプル溶液検出ピーク面積/DS-IS検出ピーク面積)を求め,これを実施例4で得られた検量線に内挿することにより,細胞サンプル溶液中に含まれるコンドロイチン硫酸を定量することができる。
以下の実施例7~14はヘパラン硫酸又は/及びデルマタン硫酸の分析法に関するものである。試験に用いる(l)~(w)の溶液を以下の手順で調製した。
(l)MeCN/water:
0.5 mLの注射用水と4.5 mLのアセトニトリルを混合し,これをMeCN/waterとした。本溶液は用時調製とした。
(m)重水素ラベル化溶媒:
氷浴下で,1.5 mLのメタノール-d4(Sigma-Aldrich社)に240 μLのアセチルクロリドを滴下し,これを重水素ラベル化溶媒とした。本溶液は用時調製とした。
(n)PBS/クエン酸溶液:
クエン酸を純水に溶解して10 mMの濃度のクエン酸溶液を作製した。更に,クエン酸三ナトリウム二水和物を純水に溶解して10 mMの濃度のクエン酸ナトリウム溶液を作製した。クエン酸溶液にクエン酸ナトリウム溶液を滴下してpH 3.0に調整した。この溶液を10 mM クエン酸緩衝液(pH 3.0)とした。また,18 mLの10 mM クエン酸緩衝液(pH 3.0)に2 mLのPBSを加えた溶液をPBS/クエン酸溶液とした。
(o)移動相A:
247.5 mLの純水に,2.5 mLの1 Mギ酸アンモニウム水溶液と400 μLの水酸化アンモニウム水溶液 (25% NH4OH)を添加して混合したものを,移動相Aとした。本溶液は用時調製とした。
(p)移動相B:
45 mLの純水に,5 mLの1 Mギ酸アンモニウム水溶液と,450 mLのアセトニトリルと,800 μLの水酸化アンモニウム水溶液 (25% NH4OH)とを混合したものを,移動相Bとした。本溶液は用時調製とした。
(q)ヘパラン硫酸標準原液(HS標準原液):
1.5 mLマイクロチューブにHeparan sulfate(Iduron社)を秤量し,注射用水を加えて溶解し,5.0 mg/mLの濃度の溶液を調製した。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに15 μLずつ分注し,使用時まで冷凍(-15℃以下)して保存した。この溶液をHS標準原液とした。
(r)デルマタン硫酸標準原液(DS標準原液):
1.5 mLマイクロチューブにChondroitin sulfate B sodium salt from porcine intestinal mucosa(Sigma-Aldrich社)を秤量し,注射用水を加えて溶解し,5.0 mg/mLの濃度の溶液を調製した。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに15 μLずつ分注し,使用時まで冷凍(-15℃以下)して保存した。この溶液をDS標準原液とした。
(s)デルマタン硫酸内部標準溶液(DS内部標準溶液):
ホウケイ酸ねじ口試験管に40 μLのDS標準原液を計り取り,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に400 μLの重水素ラベル化溶媒を添加し,撹拌した後,65℃で75分間反応させて,重水素化メタノール分解(deuteriomethanolysis)を行った。反応後,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に500 μLのMeCN/waterを添加し,超音波処理を30分間行った。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに20 μLずつ分注し,冷凍(-15℃以下)して保存した。この溶液をデルマタン硫酸内部標準溶液(DS内部標準溶液)とした。
(t)ヘパラン硫酸内部標準溶液(HS内部標準溶液):
ホウケイ酸ねじ口試験管に40 μLのHS標準原液を計り取り,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に400 μLの重水素ラベル化溶媒を添加し,撹拌した後,65℃で75分間反応させて,重水素化メタノール分解(deuteriomethanolysis)を行った。反応後,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に500 μLのMeCN/waterを添加し,超音波処理を30分間行った。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに20 μLずつ分注し,冷凍(-15℃以下)して保存した。この溶液をヘパラン硫酸内部標準溶液(HS内部標準溶液)とした。
(u)サンプル溶解用溶液:
5 mLのMeCN/waterに,1 μLのHS内部標準溶液及び1 μLのDS内部標準溶液を添加して撹拌した後,超音波処理を30分間行った。この溶液をサンプル溶解用溶液とした。本溶液は用時調製とした。
(v)検量線作成用溶液:
480 μLのPBS/クエン酸溶液を計り取り,これにHS標準原液とDS標準原液をそれぞれ10 μLずつ添加し,デルマタン硫酸とヘパラン硫酸を,それぞれ100 μg/mLずつ含有する溶液を調製した。この溶液をPBS/クエン酸溶液で希釈し,デルマタン硫酸とヘパラン硫酸を,それぞれ2500 ng/mLずつ含有する溶液を調製した。この溶液をPBS/クエン酸溶液で2段階希釈し,デルマタン硫酸とヘパラン硫酸を,それぞれ25~2500 ng/mLの濃度で含有する溶液を調製した。この溶液を検量線作成用溶液とした。
(w)組織抽出溶液
1 mLのポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテルに生理食塩液を添加し,全量を500 mLとした。この溶液を組織抽出溶液とした。
野生型マウス(C57BL/6N)及びIDS遺伝子を含む染色体領域を欠損するヘミ接合体マウス(IDSヘミ接合体マウス,C57BL/6N)から血液を採取した。採取した血液をチューブに移して室温で30分間以上静置した後,遠心(2000 g,20分間)して血清を回収した。8 μLの血清に8 μLのPBSと144 μLの10mM クエン酸緩衝液(pH 3.0)を加えて撹拌した。これを20 μL計り取り,ホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。これを血液サンプル溶液とした。
上記実施例7で調製した検量線作成用溶液を,それぞれ20 μL計り取り,個別にホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。また,ブランクとして,PBS/クエン酸溶液をホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。試験管中の溶媒を窒素気流下で留去した(N=1)。乾固物に,20 μL の2, 2-ジメトキシプロパンと,200 μLの塩酸の濃度が3Nである塩酸メタノールとを添加して撹拌した後,表4に示す3種類の条件(条件A~C)でメタノリシス反応を行った。反応後,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に50 μLのサンプル溶解用溶液を添加して溶解後,遠心(15000 rpm,10分間,室温)し,上清をバイアルに採取した。
LC/MS/MS分析は,親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィーとタンデム四重極型質量分析装置とを組み合わせたものを用いて実施した。質量分析装置(MS/MS装置)として,QTRAP5500(エー・ビー・サイエックス社)を用い,これにHPLC装置として,Nexera X2(島津製作所)をセットした。また,LCカラムとして,Acquity UPLCTM BEH Amid 1.7 μm (2.1 X 50 mm,Waters社)を用いた。移動相として,実施例7で調製した移動相A及び移動相Bを用いた。また,カラム温度は50℃に設定した。
精度(%)=測定値の標準偏差/測定値の平均値×100
真度(%)=測定値の平均値/理論濃度×100
なお,真度(%)の計算式中の理論濃度とは,QC試料に添加されたデルマタン硫酸又はヘパラン硫酸の濃度のことをいう。
上記表4に示す条件Aでメタノリシスを行った検量線作成用溶液の測定値から得られた検量線(条件Aの検量線)は,デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸のいずれについても,25.0~2500 ng/mLの濃度範囲において良好な直線性を示した(データは示さない)。相関係数(r)は,デルマタン硫酸については0.9995,ヘパラン硫酸については0.9938であった。
条件A,B及びCでメタノリシスを行った検量線作成用溶液の測定値から得られた検量線はいずれも,デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸のいずれについても,25~2500 ng/mLの濃度範囲において良好な直線性を示した(データは示さない)。それぞれの条件における検量線の相関係数(r)を表10に示す。
生体由来の試料中に含まれるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の測定方法として,条件A,B及びCの何れのメタノリシス反応が好適であるかを,実施例9に記載した野生型マウス及びIDSヘミ接合体マウスの血液から調製した血液サンプル溶液のメタノリシス反応物を用いて調べた。各メタノリシス反応物を実施例10に記載の方法で分析し,デルマタン硫酸に由来する検出ピークの面積(血液サンプル溶液DS検出ピーク面積)を求めた。更に,この面積とDS-IS検出ピーク面積の比(血液サンプル溶液DS検出ピーク面積/DS-IS検出ピーク面積)を求め,これを実施例10で得られた対応するメタノリシス反応条件の検量線に内挿することにより,血液サンプル溶液中に含まれるデルマタン硫酸を定量した。また,各メタノリシス反応物を実施例10に記載の方法で分析し,ヘパラン硫酸に由来する検出ピークの面積(血液サンプル溶液HS検出ピーク面積)を求め,更に,この面積とHS-IS検出ピーク面積の比(血液サンプル溶液HS検出ピーク面積/HS-IS検出ピーク面積)を求めた。これを実施例10で得られた対応するメタノリシス反応条件の検量線に内挿することにより,血液サンプル溶液中に含まれるヘパラン硫酸を定量した。IDSは,デルマタン硫酸,ヘパラン硫酸を含むGAGを分解する活性を有する酵素である。従って,IDSヘミ接合体マウスの血中のGAGの濃度は,野生型マウスと比較して高いことが知られている。
医療用に市販されている遺伝子組換えヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(rhIDS)を生理食塩液で希釈し,0.1 mg/mLのrhIDS溶液を調製した。このrhIDS溶液を,IDS遺伝子を含む染色体領域を欠損するヘミ接合体マウス(IDSヘミ接合体マウス,C57BL/6N)に,0.5 mg/kg体重の用量で,7日毎に計4回,静脈内投与した。最後に投与した日から7日後に,マウスを放血により安楽死させた。このとき血液をチューブに採取して,室温で30分間以上静置した後,遠心(2000 g, 20分間)して血清を回収した。同様にして,rhIDS非投与のIDSヘミ接合体マウス(rhIDS非投与IDSヘミ接合体マウス)及び野生型マウスからも,血清を回収した。
Claims (21)
- 該コンドロイチン硫酸の分解における該加熱が,70分~110分間,65℃~75℃の温度で行われるものである,請求項1に記載の方法。
- 該試料が,体液,細胞,組織,器官,細胞の培養液,組織の培養液,食品,及び飼料から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,請求項1又は2に記載の方法。
- 該試料が,哺乳動物から得られた体液,細胞,組織,器官,血液,血清,血漿,尿,骨髄液,及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,請求項1又は2に記載の方法。
- 該哺乳動物が,ヒト,サル,マウス,ラット,モルモット,ハムスター,ウサギ,ウマ,ウシ,ブタ,イヌ,及びネコからなる群から選択されるものである,請求項4に記載の方法。
- 該哺乳動物がヒトであり,該ヒトが,コンドロイチン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者である,請求項4に記載の方法。
- 該疾患が,マロトー・ラミー症候群,モルキオ症候群A型,モルキオ症候群B型,及びスライ症候群からなる群から選択されるものである,請求項6に記載の方法。
- 該患者が,体内に存在するコンドロイチン硫酸を減少させる治療を受けたものである,請求項6又は7に記載の方法。
- 該ヘパラン硫酸の分解における該加熱が,110分~130分間,78℃~82℃の温度で行われるものである,請求項9に記載の方法。
- 該デルマタン硫酸の分解における該加熱が,30分~80分間,63℃~67℃の温度で行われるものである,請求項11に記載の方法。
- 該試料が,体液,細胞,組織,器官,細胞の培養液,組織の培養液,食品,及び飼料から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,請求項9乃至12の何れかに記載の方法。
- 該試料が,哺乳動物から得られた体液,細胞,組織,器官,血液,血清,血漿,尿,骨髄液,及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,請求項9乃至12の何れかに記載の方法。
- 該哺乳動物が,ヒト,サル,マウス,ラット,モルモット,ハムスター,ウサギ,ウマ,ウシ,ブタ,イヌ,及びネコからなる群から選択されるものである,請求項14に記載の方法。
- 該哺乳動物がヒトであり,該ヒトが,コンドロイチン硫酸,ヘパラン硫酸,及びデルマタン硫酸の何れか1つ又は複数のものが体内に蓄積する疾患の患者である,請求項14に記載の方法。
- 該疾患が,マロトー・ラミー症候群,モルキオ症候群A型,モルキオ症候群B型,ハンター症候群,ハーラー症候群,シャイエ症候群,ハーラー・シャイエ症候群,サンフィリッポ症候群,及びスライ症候群からなる群から選択されるものである,請求項16に記載の方法。
- 該患者が,体内に存在するコンドロイチン硫酸,ヘパラン硫酸,及びデルマタン硫酸の何れか1つ又は複数のものを減少させる治療を受けたものである,請求項16又は17に記載の方法。
- 試料中に含まれるコンドロイチン硫酸の量を測定する方法であって,
請求項1乃至8の何れかに記載の方法で得られた二糖を,液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと,
該溶出液を質量分析に供するステップと,
を含んでなるものである,方法。 - 試料中に含まれるコンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸の量を測定する方法であって,
請求項9乃至10の何れかに記載の方法により,コンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸を分解して得られた二糖を,液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと,
該溶出液を質量分析に供するステップと,
を含んでなるものである,方法。 - 試料中に含まれるコンドロイチン硫酸,ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の量を測定する方法であって,
請求項10乃至18の何れかに記載の方法により,コンドロイチン硫酸,ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸を分解して得られた二糖を,液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと,
該溶出液を質量分析に供するステップと,
を含んでなるものである,方法。
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