JP4889400B2 - 糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子の分離分析方法 - Google Patents
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さらに、上述のように、特に糖ペプチド異性体分子の場合は、そのままの分子を分析することはできず、また、発現定量プロテオミックスにおいても、糖ペプチド異性体分子をそのまま測定することはできなかった。
[1]糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子から成る群から選ばれる少なくとも2種の分子を含む試料を、陰イオン及び陽イオン交換基を有する固定相を用いたカラムに供給し、前記試料に含まれる前記糖鎖異性体分子および/または糖ペプチド異性体分子をカラムから溶出させて分離し、分離した分子を分析することを含む、糖鎖異性体分子および/または糖ペプチド異性体分子の分離分析方法。
[2]糖鎖異性体分子および/または糖ペプチド異性体分子の分離を、前記カラムに有機溶媒または有機溶媒と水または水溶液の混合物を供給することで行う[1]に記載の方法。
[3]有機溶媒がアセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン、ピリジン、メタノール、エタノール、1−プロパノールおよび2−プロパノールから成る群から選ばれる少なくとも1種である[2]に記載の方法。
[4]水溶液が塩を含む[2]に記載の方法。
[5]塩が酢酸アンモニウムである[4]に記載の方法。
[6]糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子が、500から10000の分子量を有する[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]陰イオン及び陽イオン交換基を有する固定相を用いたカラムが、ZIC(Zwitterionic Ion Chromatography)カラムである[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]カラムから溶出した分子または分析した分子を少なくとも1回同じカラムにリサイクルする[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]カラムから溶出した分子または分析した分子を、さらに分取する[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]分離した分子の分析を、質量分析(MS)または核磁気共鳴(NMR)で行う[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]糖ペプチド異性体分子が、ペプチド鎖のN−末端及び/またはC−末端に水素/重水素同位体化合物を標識した分子であり、分離した分子の分析を質量分析により行う[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[12]糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子が、それぞれシアル酸糖鎖異性体分子およびシアル酸糖ペプチド異性体分子である[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13]糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子が、それぞれ硫酸化糖鎖異性体分子および硫酸化糖ペプチド異性体分子である[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[14]糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子は、糖タンパク質をトリプシンで消化して得られたものである[1]〜[13]のいずれかに記載の方法。
陰イオン及び陽イオン交換基を有する固定相は、例えば、有機樹脂で構成されるコアの表面に共有結合した多数の非芳香族両性イオン基を有するものであることができる。このような固定相は、例えば、特表2002−529714号公報に記載されている。より具体的には以下に説明する。
実施例1
図8は、安定同位体(重水素)標識法と質量分析計を用いた発現定量グライコプロテオミックスにおけるクロマトグラムである。
人由来のIgGから酵素によって切り出された糖鎖を2分割し、それぞれを2−アミノピリジン(H)と重水素置換された2−アミノピリジン(D)で標識化した後、両サンプルを混合し、逆相カラムとZICカラムで分離分析し比較した。
図10Aは、Alpha-1-Acid糖タンパク質(AGP)のトリプシン酵素消化物のZICカラム(ZIC-HILIC (2×150mm)での分離分析例である。ZICカラムは実施例1と同様のものを使用した。溶離液A(50%アセトニトリル)、溶離液B(アセトニトリル)、溶離液C(100mM酢酸アンモニウム(pH=6.8))の直線グラジエント溶出法(A/B/C=36/64/10(0.0分)→ 54/36/10(120分)を用いた。流量は0.2mL/minで一定である。カラムオーブン(恒温槽)により、カラム温度は40℃に保った。
ZICカラムは実施例1と同様のものを使用し、ピリジルアミノ化(PAラベル化)したヒト由来のシアリル糖鎖異性体混合物(標準試料)を分離した。溶離液A(50%アセトニトリル)、溶離液B(90%アセトニトリル)、溶離液C(250mM酢酸アンモニウム(pH=6.8))の直線グラジエント溶出法(A)20mM酢酸アンモニウム:A/B/C=30/62/8(0.0分)→ 58/34/8(120分)(B)5mM酢酸アンモニウム:A/B/C=42/56/2(0.0分)→ 70/28/2(120分)を用いた。グラジエント溶出法中の酢酸アンモニウム濃度は一定に保たれている。流量は0.2mL/minで一定である。カラムオーブン(恒温槽)により、カラム温度は40℃に保った。結果を図12に示す。図12は中性およびシアリル糖鎖の保持時間に対する塩濃度の影響を示している。この図から、中性糖鎖の保持はほとんど変化しないが、シアリル糖鎖の保持時間は大きく変化し、塩濃度が高いほどカラムへの保持が強いことが分かる。
ピリジルアミノ化(PAラベル化)したヒト由来の糖鎖異性体混合物(標準試料)を分離した。分離条件は酢酸アンモニウム濃度が10mMに保たれている以外は、図12と同じである。結果を図13に示す。(A)は中性糖鎖の異性体の分離、(B)はトリシアリル糖鎖異性体の分離を示している。(B)に示すトリシアリル糖鎖異性体は、保持時間が小さいにもかかわらず分離度が良い。言い換えると、ZICカラムは、シアリル糖鎖の構造(α2−3およびα2−6結合様式)認識能が高いといえる。
2、3 分離用溶液
4 ソレノイドバルブ
5 試料注入装置
6 分離カラム
7 検出器
8 リサイクルバルブ
9 マニホールド
10 フラクションコレクター
Claims (14)
- 糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子から成る群から選ばれる少なくとも2種の分子を含む試料を、陰イオン及び陽イオン交換基を有する固定相を用いたカラムに供給し、前記試料に含まれる前記糖鎖異性体分子および/または糖ペプチド異性体分子をカラムから溶出させて分離し、分離した分子を分析することを含む、糖鎖異性体分子および/または糖ペプチド異性体分子の分離分析方法。
- 糖鎖異性体分子および/または糖ペプチド異性体分子の分離を、前記カラムに有機溶媒または有機溶媒と水または水溶液の混合物を供給することで行う請求項1に記載の方法。
- 有機溶媒がアセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン、ピリジン、メタノール、エタノール、1−プロパノールおよび2−プロパノールから成る群から選ばれる少なくとも1種である請求項2に記載の方法。
- 水溶液が塩を含む請求項2に記載の方法。
- 塩が酢酸アンモニウムである請求項4に記載の方法。
- 糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子が、500から10000の分子量を有する請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 陰イオン及び陽イオン交換基を有する固定相を用いたカラムが、ZIC(ZwitterionicIon Chromatography)カラムである請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- カラムから溶出した分子または分析した分子を少なくとも1回同じカラムにリサイクルする請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- カラムから溶出した分子または分析した分子を、さらに分取する請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 分離した分子の分析を、質量分析(MS)または核磁気共鳴(NMR)で行う請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 糖ペプチド異性体分子が、ペプチド鎖のN−末端及び/またはC−末端に水素/重水素同位体化合物を標識した分子であり、分離した分子の分析を質量分析により行う請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子が、それぞれシアル酸糖鎖異性体分子およびシアル酸糖ペプチド異性体分子である請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子が、それぞれ硫酸化糖鎖異性体分子および硫酸化糖ペプチド異性体分子である請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 糖鎖異性体分子および糖ペプチド異性体分子は、糖タンパク質をトリプシンで消化して得られたものである請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
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