JPWO2015152135A1 - 糖ペプチドの合成と分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(ii)糖ペプチドの電気泳動ピークを標準物質の電気泳動ピークと比較するステップ、
を含む糖ペプチドの糖鎖構造を分析する方法。
ならびに以下の構造を有するG0F
ならびに以下の構造を有するG1
ならびに以下の構造を有するG1'
ならびに以下の構造を有するG1F
ならびに以下の構造を有するG2
ならびに以下の構造を有するG2F
のいずれか1以上を含み、式中のペプチドRは、分析対象であるプロテアーゼ消化されたタンパク質由来の糖ペプチドのペプチド部分のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなり、かつ、当該アミノ酸配列中のアスパラギンがGn基と結合している、[1]に記載の方法。
および/または以下の構造を有するG2FS1
および/または以下の構造を有するG2FS1'
および/または以下の構造を有するG2FS2
の1以上を含む、[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
および/または以下の構造を有するG1'S1'
および/または以下の構造を有するG2S1
および/または以下の構造を有するG2S1'
および/または以下の構造を有するG2S2
の1以上を含む、[1]〜[12]のいずれかに記載の方法。
以下の構造を有するG0
ならびに以下の構造を有するG0F
ならびに以下の構造を有するG1
ならびに以下の構造を有するG1'
ならびに以下の構造を有するG1F
ならびに以下の構造を有するG2
ならびに以下の構造を有するG2F
のいずれか1以上を含み、式中のペプチドRは、分析対象である糖ペプチドのペプチド部分のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなり、かつ当該アミノ酸配列中のアスパラギンがGn基と結合している、前記キット。
および/または以下の構造を有するG2FS1
および/または以下の構造を有するG2FS1'
および/または以下の構造を有するG2FS2
のいずれか1以上を含む、[14]〜[17]のいずれかに記載のキット。
および/または以下の構造を有するG1'S1'
および/または以下の構造を有するG2S1
および/または以下の構造を有するG2S1'
および/または以下の構造を有するG2S2
のいずれか1以上を含む、[14]〜[18]のいずれかに記載のキット。
本発明の標準物質は、糖鎖修飾ペプチドを1以上含む。以下に本発明の標準物質を構成する糖鎖修飾ペプチドの略記号及び構造を示す。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG1糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG1'糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG1糖ペプチドおよび/またはG1'糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG2糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG0F糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG1F糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG2F糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG1S1糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG1FS1糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG1'S1'糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG2S1'糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG2S1糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG2S2糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG2FS1糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG2FS2糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG0B糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG0糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG1糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG2糖ペプチドを含む。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG1'F糖ペプチドを含み得る。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG1'FS1'糖ペプチドを含み得る。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG2B糖ペプチドを含み得る。
ある実施形態において、本発明の標準物質はG2BF糖ペプチドを含み得る。
ある実施形態において、本発明の標準物質はαG2-G2F糖ペプチドを含み得る。これらの構造を以下に示す。
標準物質糖鎖修飾ペプチドの作製法を簡単に説明すると、まずフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)保護されたFmoc-Asn-糖鎖を糖転移酵素により調製する。次いでこれをエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼなどの複合型糖鎖分解酵素を用いたデグリコシレーション反応に供し、種々の糖鎖を得る。次いでこれをグライコシンターゼを用いたトランスグリコシレーション反応に供し、ペプチドを糖鎖修飾する。この糖鎖修飾ペプチドを用いるか、場合によりさらに糖転移酵素により糖鎖をさらに修飾した修飾糖ペプチドを得る。以下に本発明のある実施形態を具体的に説明する。
糖鎖転移反応を効率よく行なうために、まずオキサゾリン化したN-型糖鎖を調製する。これには例えばエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)を用いてN-型糖鎖を切断する。ENGaseとしては、例えばメタノール資化性酵母Ogataeta minuta由来のEndo-Omが挙げられる(WO 2013/051608参照)。切断物の確認はHPLC等の適当な分析手段により行う。必要に応じて不純物をイオン交換樹脂等を用いて除去する。次に得られた糖鎖をオキサゾリン化する。目的の糖鎖と、適当なオキサゾリル化試薬を反応させる。反応生成物の確認は薄層クロマトグラフィー(TLC)等の適当な分析手段により行う。場合によりこれをさらに精製してもよい。
免疫グロブリン1(IgG1)をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG0型糖鎖含有ペプチドを合成する。アスパラギン残基の側鎖にGlcNAc残基が結合した糖ペプチドとオキサゾリン化G0糖鎖を適当な条件下で反応させる。反応生成物の確認はHPLC等により行う。場合によりHPLC分取したG0-糖ペプチドを質量分析に供してもよい。さらにペプチド:N−グリカナーゼ(PNGase)による処理を行い、HPLC等の手段により、反応生成物が基質である糖ペプチドのGlcNAc上にG0糖鎖が付加したものであることを確認する。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG1型糖鎖含有ペプチドを合成する。GlcNAc付加されたペプチドとオキサゾリン化G1糖鎖を適当な条件下で、例えばEndo-M N175Q などのGlycosynthaseを用いて反応させる。反応生成物(G1-糖ペプチド)はHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG1'型糖鎖含有ペプチドを合成する。GlcNAc残基が付加されたペプチドとオキサゾリン化G1'糖鎖を適当な条件下で、例えばGlycosynthaseを用いて反応させる。反応生成物(G1'-糖ペプチド)はHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2型糖鎖含有ペプチドを合成する。GlcNAc基が付加されたペプチドとオキサゾリン化G2糖鎖を適当な条件下で、例えばGlycosynthaseを用いて反応させる。反応生成物(G2-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG0F型糖鎖含有ペプチドを合成する。上記の方法で製造したG0型糖鎖付加されたペプチドと適当な試薬、例えばGDP-フコース等を混合し、α1,6-フコース転移酵素(FUT8)等のフコース転移酵素を用いて反応させる。反応生成物(G0F-糖ペプチド)をHPLC等により分取し、場合により質量分析等により確認する。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG1F型糖鎖含有ペプチドを合成する。上記の方法で製造したG1型糖鎖付加されたペプチドと適当な試薬、例えばGDP-フコース等を混合し、FUT8等のフコース転移酵素を用いて反応させる。反応生成物(G1F-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
FUT8はガラクトースを2残基含む糖ペプチドにはフコースを転移できない。よってIgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2F型糖鎖含有ペプチドは以下の方法で合成する。上記1.6の方法で製造したG0型糖鎖付加ペプチドと適当な試薬、例えばUDP-ガラクトース等を混合し、β1,4-ガラクトース転移酵素(β4GalT-I)等のガラクトース転移酵素を用いて反応させる。反応生成物(G2F-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG1S1型糖鎖含有ペプチドを合成する。上記1.3で製造したG1型糖鎖付加されたペプチドと適当な試薬、例えばCMP-N-アセチルノイラミン酸を混合し、α2,3-シアル酸転移酵素(ST3Gal-III)等のシアル酸転移酵素を用いて反応させる。反応生成物(G1S1-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG1FS1型糖鎖含有ペプチドを合成する。上記1.7の方法で製造したG1F型糖鎖付加されたペプチドと適当な試薬、例えばCMP-N-アセチルノイラミン酸を混合し、ST3Gal-III等のシアル酸転移酵素を用いて反応させる。反応生成物(G1FS1-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2S1'型糖鎖含有ペプチドを合成する。上記の1.4の手法で製造したG1'型糖鎖付加されたペプチドと適当な試薬、例えばCMP-N-アセチルノイラミン酸を混合し、ST3Gal-III等のシアル酸転移酵素を用いて反応させる。反応生成物(G1'S1-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2S1'型糖鎖含有ペプチドを合成する。上記1.11の手法で製造したG1'S1'型糖鎖付加されたペプチドと適当な試薬、例えばUDP-ガラクトース等を混合し、β4GalT-I等のガラクトース転移酵素を用いて反応させる。反応生成物(G2S1'-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2S1型糖鎖含有ペプチドを合成する。上記1.9の手法で製造したG1S1型糖鎖付加されたペプチドβ4GalT-I等のガラクトース転移酵素を用いて反応させる。反応生成物(G2S1-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2S2型糖鎖含有ペプチドを合成する。上記1.5の手法で製造したG2型糖鎖付加されたペプチドと適当な試薬、例えばCMP-N-アセチルノイラミン酸を混合し、ST3Gal-III等のシアル酸転移酵素を用いて反応させる。反応生成物(G2S2-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2FS1型糖鎖含有ペプチドを合成する。上記1.10の手法で製造したG1FS1型糖鎖付加されたペプチドと適当な試薬、例えばUDP-ガラクトース等を混合し、β4GalT-I等のガラクトース転移酵素を用いて反応させる。反応生成物(G2FS1-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2FS2型糖鎖含有ペプチドを合成する。上記1.8の手法で製造したG2F型糖鎖付加されたペプチドと適当な試薬、例えばCMP-N-アセチルノイラミン酸を混合し、ST3Gal-III等のシアル酸転移酵素を用いて反応させる。反応生成物(G2FS2-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG0B型糖鎖含有ペプチドを合成する。上記1.2の手法で製造したG0型糖鎖付加されたペプチドと適当な試薬、例えばUDP-N-アセチルグルコサミンを混合し、β1,4-N-アセチルグルコサミン転移酵素-III(MGAT-III)等のN-アセチルグルコサミン転移酵素を用いて反応させる。反応生成物(G0B糖-ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
ヒトイムノグロブリン(IgG)2をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG0型糖鎖含有ペプチドを合成する。アスパラギン残基の側鎖にGlcNAc残基が結合した糖ペプチド(GlcNAcペプチド)と、オキサゾリン化G0糖鎖を混合し、Glycosynthaseを用いて反応させる。反応生成物(G0-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析により確認してもよい。
IgG2をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG1型糖鎖含有ペプチドを合成する。GlcNAc付加されたペプチドと適当な試薬、例えばオキサゾリン化G1糖鎖を混合し、Glycosynthaseを用いて反応させる。反応生成物(G1-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
IgG2をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2型糖鎖含有ペプチドを合成する。GlcNAc付加されたペプチドと適当な試薬、例えばオキサゾリン化G2糖鎖を混合し、Glycosynthaseを用いて反応させる。反応生成物(G2-糖ペプチド)をHPLC等により分取する。生成物は質量分析等により確認してもよい。
G1'F糖ペプチドはG0Fにガラクトシル基(Gal)を付加することにより製造し得る。反応生成物をHPLC等により分取し、質量分析等により確認してもよい。
上記の手法により製造した糖ペプチドは、タンパク質の糖鎖分析のための標準物質(標準品、標準)として利用することができる。これによりキャピラリー電気泳動、HPLC等を用いて高分解能に分離したタンパク質(例えば抗体)由来の糖ペプチドの構造を同定することができる。ある実施形態において、本発明の標準物質は、均一な糖ペプチドを1種以上含む。
本発明の分析方法においては、内部標準を用いることができる。ある実施形態においては、内部標準として糖鎖修飾されていないペプチドを用いることができる。また、ある実施形態において内部標準は、分析対象の糖鎖修飾ペプチドに対応する糖鎖修飾されていないペプチドあるいはそれと同様の泳動位置あるいは溶出位置に検出されるペプチド類とすることができる。しかしながら内部標準はこれに限られず、標準物質に含まれる内部標準と試料に含まれる内部標準とが同一であれば、内部標準として用いる糖鎖修飾されていないペプチドのアミノ酸配列はどのようなものであってもよい。例えばトリプシン消化された抗体由来の糖鎖修飾ペプチドEEQYNSTYR(ここでNは糖鎖修飾されている)を分析する場合には、標準物質と試料とに同一の内部標準を追加してもよく、内部標準は任意の適当なアミノ酸配列を有する糖鎖修飾されていないペプチドとすることができ、さらに、内部標準は当該糖鎖修飾ペプチドに対応する非糖鎖修飾ペプチドEEQYNSTYR(ここでNは糖鎖修飾されていない)を内部標準として用いることもできる。抗体由来の糖鎖修飾ペプチドEEQFNSTFR(ここでNは糖鎖修飾されている)を分析する場合には、標準物質と試料とに同一の内部標準を追加してもよく、内部標準は任意の適当なアミノ酸配列を有する糖鎖修飾されていないペプチドとすることができ、さらに、内部標準は非糖鎖修飾ペプチドEEQFNSTFR(ここでNは糖鎖修飾されていない)とすることもできる。また非糖鎖修飾ペプチドEEQYNSTYRと同様の泳動位置あるいは溶出位置に検出されるペプチドを内部標準として用いてもよい。
に従って行うことができる。
Endo-M N175Q(グライコシンターゼ)による糖鎖転移反応を効率よく行なうためには、オキサゾリン化したN-型糖鎖を調製する必要がある(Umekawa M, Higashiyama T, Koga Y, Tanaka T, Noguchi M, Kobayashi A, Shoda S, Huang W, Wang LX, Ashida H, Yamamoto K. Biochim Biophys Acta. 2010 Nov;1800(11):1203-9.)。大量の糖鎖調製が必要となるため、新たな調製法の開発を行なった。
ヒトイムノグロブリン(IgG)1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG0型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG1型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG1'型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG0F型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG1F型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
実施例6、7ではそれぞれの基となる糖ペプチドに対し転移酵素によりフコース残基を導入した。しかしFUT8はガラクトースを2残基含む糖ペプチドにはフコースを転移できないため、IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2F型糖鎖含有ペプチドは以下の方法で合成を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG1S1型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG1FS1型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2S1'型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2S1'型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2S1型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2S2型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2FS1型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2FS2型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG1をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG0B型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
ヒトイムノグロブリン(IgG)2をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG0型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG2をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG1型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
IgG2をトリプシン消化した際に得られるFc領域のG2型糖鎖含有ペプチドを合成するため、以下の反応を行なった。
本実施例では、作製した糖ペプチドの活用例を示す。作製した糖ペプチドを標準物質として利用することで、キャピラリー電気泳動、HPLC等により高分解能に分離した糖ペプチドの構造同定が可能となるため、従来法に比べて低コストで、迅速簡便な抗体の糖鎖分析法の確立が期待できる。具体的には、糖ペプチド標準物質をキャピラリー電気泳動により分析し、各糖ペプチド標品に固有の泳動時間を得る。続いて、抗体製剤などから調製した糖ペプチドを同様に分析し、各ピークの泳動時間を標準物質の泳動時間と比較することで、各ピークの構造を同定する。
装置:P/ACE MDQ glycoprotein system(ベックマンコールター社)。キャピラリー:DB-1(内径100μm、分離有効長47 cm、ジーエルサイエンス社)。泳動緩衝液:0.5% ポリエチレングリコール500000を含む50 mM四ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH 9.4)。印加電圧:15 kV。試料導入:加圧法(1 psi、10秒間)。各試料に内部標準としてEEQYNSTYRペプチドを添加した。
抗体2 mgを含む製剤溶液100μlに、1 M塩酸グアニジンを含む42 mMトリス塩酸緩衝液(pH 8.6)400 μlを加えた。室温まで放冷後、上記緩衝液で調製したトリプシン溶液20 μl(80 μg相当)を加え、37℃で18時間インキュベートしたものをトリプシン消化物とした。
抗体由来糖ペプチドの調製は既報に従い行った(参考文献:Reusch et al., Anal. Biochem. 432, 82-89, 2013)。上記のトリプシン消化物34μlにアセトニトリル166μlを加え、Sepharose CL-4B(40 μl)と10分間混合した。なおこの処理は、マイクロタイタープレートの1ウェル中で行い、1検体あたり8ウェル分を同時に処理した。Sepharose CL-4Bを0.1% トリフルオロ酢酸を含む83%アセトニトリル溶液200 μlと83%アセトニトリル溶液200 μlでそれぞれ2回ずつ洗浄した後、50 μlの蒸留水で糖ペプチドを溶出した。溶出液400 μl(8ウェル分)を乾燥させた後、100 μlの蒸留水に再溶解し、キャピラリー電気泳動(CE)により分析した。
G0、G0F、G1、G1'、G1F、G2およびG2Fを混合したものを本発明の糖ペプチド標準物質として用いた。また内部標準として糖鎖修飾されていないEEQYNSTYRペプチドを用いた。
糖ペプチド標準物質7種類の混合物と抗体製剤から調製した糖ペプチドに、それぞれ内部標準としてEEQYNSTYRペプチドを添加し、キャピラリー電気泳動により分析した結果を図21に示す。糖ペプチド標準物質由来の溶出ピークは26分〜32分の間に観察され、分子量の大きなものから順に早く泳動された。G1とG1'はこの条件下では一つのピークとして観察された。2種類の抗体製剤(製剤1、2)から調製した糖ペプチドも、同様の時間帯にピークを示した。製剤由来糖ペプチドの泳動時間を内部標準により補正し(参考文献:Li et al., J. Chromatogr. A, 869, 375-384, 2000)、各糖ペプチド標準物質に固有の泳動時間と比較することで各ピークの構造を同定した。その結果、製剤1の糖鎖は、ピーク1がG2F、ピーク2がG1F、ピーク3がG0Fであることが分かった。一方、製剤2の糖鎖は、ピーク1がG1、ピーク2がG0であることが分かった。また、それぞれの糖鎖の存在比率をピークエリアから算出した(図22)。
配列番号1 糖鎖修飾ペプチドEEQYNSTYR (配列中N残基が糖鎖修飾を受ける)
配列番号2 糖鎖修飾されていないペプチドEEQYNSTYR
配列番号3 糖鎖修飾ペプチドEEQFNSTFR(配列中N残基が糖鎖修飾を受ける)
配列番号4 糖鎖修飾されていないペプチドEEQFNSTFR
配列番号5 EEQYDSTYR
Claims (22)
- (i)プロテアーゼ消化されたタンパク質由来の糖ペプチドをキャピラリー電気泳動により分離するステップ、及び
(ii)糖ペプチドの電気泳動ピークを標準物質の電気泳動ピークと比較するステップ、
を含む糖ペプチドの糖鎖構造を分析する方法。 - 標準物質が、以下の構造を有するG0
ならびに以下の構造を有するG0F
ならびに以下の構造を有するG1
ならびに以下の構造を有するG1'
ならびに以下の構造を有するG1F
ならびに以下の構造を有するG2
ならびに以下の構造を有するG2F
のいずれか1以上を含み、式中のペプチドRは、分析対象であるプロテアーゼ消化されたタンパク質由来の糖ペプチドのペプチド部分のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなり、かつ、当該アミノ酸配列中のアスパラギンがGn基と結合している、請求項1に記載の方法。 - 標準物質がG0、G0F、G1、G1'、G1F、G2及びG2Fの2以上、3以上、4以上、5以上、6以上または7つを含む、請求項2に記載の方法。
- (i)のステップの前に、(iii)プロテアーゼを用いてタンパク質を消化するステップをさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- プロテアーゼ消化されるタンパク質が抗体であり、抗体のFc領域由来ペプチドの糖鎖構造を分析する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体のFc領域由来糖ペプチドのペプチド部分のアミノ酸配列がEEQYNSTYR(配列番号1)またはEEQFNSTFR(配列番号3)であり、かつ標準物質の各式中のペプチドRのアミノ酸配列がEEQYNSTYR(配列番号1)またはEEQFNSTFR(配列番号3)である、請求項5に記載の方法。
- さらに(iv)抗体のFc領域に付加されている各糖鎖の割合を分析するステップを含む、請求項5または6に記載の方法。
- さらに(v)糖鎖修飾されていないペプチドを内部標準として用い、電気泳動時間の補正を行うステップを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 内部標準の糖鎖修飾されていないペプチドのアミノ酸配列が、分析対象であるプロテアーゼ消化されたタンパク質由来の糖ペプチドのペプチド部分のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなる、請求項8に記載の方法。
- 内部標準の糖鎖修飾されていないペプチドのアミノ酸配列がEEQYNSTYR(配列番号2)またはEEQFNSTFR(配列番号4)である、請求項9に記載の方法。
- 標準物質がさらに、以下の構造を有するG1FS1
および/または以下の構造を有するG2FS1
および/または以下の構造を有するG2FS1'
および/または以下の構造を有するG2FS2
の1以上を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。 - 標準物質がさらに、以下の構造を有するG1S1
および/または以下の構造を有するG1'S1'
および/または以下の構造を有するG2S1
および/または以下の構造を有するG2S1'
および/または以下の構造を有するG2S2
の1以上を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 標準物質を含む、糖ペプチドの糖鎖構造分析用キット、ここで該標準物質は、
以下の構造を有するG0
ならびに以下の構造を有するG0F
ならびに以下の構造を有するG1
ならびに以下の構造を有するG1'
ならびに以下の構造を有するG1F
ならびに以下の構造を有するG2
ならびに以下の構造を有するG2F
のいずれか1以上を含み、式中のペプチドRは、分析対象である糖ペプチドのペプチド部分のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなり、かつ当該アミノ酸配列中のアスパラギンがGn基と結合している、前記キット。 - 標準物質がG0、G0F、G1、G1'、G1F、G2及びG2Fの2以上、3以上、4以上、5以上、6以上または7つを含む、請求項14に記載のキット。
- ペプチドRのアミノ酸配列がEEQYNSTYR(配列番号1)またはEEQFNSTFR(配列番号3)である、請求項14または15に記載のキット。
- 標準物質がさらに、以下の構造を有するG1FS1
および/または以下の構造を有するG2FS1
および/または以下の構造を有するG2FS1'
および/または以下の構造を有するG2FS2
のいずれか1以上を含む、請求項14〜17のいずれか1項に記載のキット。 - 標準物質がさらに、以下の構造を有するG1S1
および/または以下の構造を有するG1'S1'
および/または以下の構造を有するG2S1
および/または以下の構造を有するG2S1'
および/または以下の構造を有するG2S2
のいずれか1以上を含む、請求項14〜18のいずれか1項に記載のキット。 - キットがさらに内部標準を含み、内部標準が糖鎖修飾されていないペプチドである、請求項14〜19のいずれか1項に記載のキット。
- 内部標準が分析対象である糖ペプチドのペプチド部分のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなる糖鎖修飾されていないペプチドである、請求項20に記載のキット。
- 内部標準がアミノ酸配列EEQYNSTYR(配列番号2)またはEEQFNSTFR(配列番号4)からなる糖鎖修飾されていないペプチドである、請求項21に記載のキット。
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