JP6502534B2 - 糖タンパク質のn結合型糖鎖の解析方法及び解析システム - Google Patents
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Description
(1) N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化して糖ペプチド含有試料を得る、糖タンパク質断片化工程、
糖ペプチド含有試料の一部をエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼと反応させ、糖鎖とアスパラギン(Asn)残基との結合部に存在するキトビオースのβ-1,4結合を切断することにより、1残基のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)(ただし該GlcNAcには1残基のフコース(Fuc)が結合していてもよい)をペプチド上に残して糖鎖を切断する、糖鎖切断工程、
糖鎖切断工程で得られた糖鎖切断ペプチド試料に対して液体クロマトグラフィー/質量分析を行ない、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを得る、事前液体クロマトグラフィー/質量分析工程、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定工程、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定工程、
糖ペプチド含有試料の残部を液体クロマトグラフィー/質量分析に供し、前記保持時間及び前記m/zの推定結果に従い分析すべきプリカーサーイオンピークを選定し、選定されたピークに対してプリカーサーイオン選択質量分析を行ない、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、本分析工程、
を含む、糖タンパク質のN結合型糖鎖の解析方法。
(2) エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼが、Endo F1、Endo F2、Endo F3、Endo M、Endo H及びEndo Sから選択される1種又は2種以上を含む、(1)記載の方法。
(3) 糖ペプチド含有試料として、糖鎖が結合していないペプチドを除去して糖ペプチドを濃縮した試料を用いる、(1)又は(2)記載の方法。
(4) 糖鎖切断工程で得られた糖鎖切断ペプチド試料を内部標準として、糖ペプチド含有試料の残部に添加して本分析工程を実施し、当該糖鎖結合部位に存在する糖鎖を相対定量することをさらに含む、(1)〜(3)のいずれか1項に記載の方法。
(5) 前記内部標準として、糖鎖未切断の糖ペプチドを除去した糖鎖切断ペプチド試料を用いる、(4)記載の方法。
(6) 糖鎖未切断の糖ペプチドの除去は、冷却したアセトンを添加し、糖鎖未切断の糖ペプチドを沈殿させて分離する方法により、又は親水性相互作用クロマトグラフィーを用いて糖鎖未切断の糖ペプチドを吸着除去することにより行われる、(5)記載の方法。
(7) N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化した糖ペプチド含有試料より調製された、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより1残基のGlcNAc(ただし該GlcNAcには1残基のFucが結合していてもよい)をペプチド中のAsn残基上に残して糖鎖が切断された糖鎖切断ペプチド試料について、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得する、事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部と、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定部と、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定部と、
本分析用試料である糖鎖切断前の糖ペプチド含有試料について、本分析を行なう、本分析部であって、
本分析用試料について、クロマトグラム、及び推定された保持時間の画分のマススペクトルを取得する、本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
m/zの推定結果に従い、前記推定された保持時間の画分のマススペクトルより分析すべきプリカーサーイオンピークを選定する、分析対象ピーク選定部、及び
選定された分析対象ピークについてのプリカーサーイオン選択質量分析データを取得し、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、糖鎖構造決定部
を含む、本分析部と、
分析結果を出力する出力部と
を備える、糖タンパク質のN結合型糖鎖の解析システム。
(8) N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化した糖ペプチド含有試料より調製された、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより1残基のGlcNAc(ただし該GlcNAcには1残基のFucが結合していてもよい)をペプチド中のAsn残基上に残して糖鎖が切断された糖鎖切断ペプチド試料について、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得する、事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部と、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定部と、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定部と、
本分析用試料である糖鎖切断前の糖ペプチド含有試料について、本分析を行なう、本分析部であって、
前記糖鎖切断ペプチド試料が内部標準として添加された本分析用試料について、クロマトグラム、及び推定された保持時間の画分のマススペクトルを取得する、本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
m/zの推定結果に従い、前記推定された保持時間の画分のマススペクトルより分析すべきプリカーサーイオンピークを選定する、分析対象ピーク選定部、
選定された分析対象ピークについてのプリカーサーイオン選択質量分析データを取得し、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、糖鎖構造決定部、及び
内部標準と各糖ペプチドの抽出イオンクロマトグラムを取得して、内部標準に対する各糖ペプチドの相対強度を算出することにより、当該糖鎖結合部位に存在する糖鎖を相対定量する、糖鎖定量部
を含む、本分析部と、
分析結果を出力する出力部と
を備える、糖タンパク質のN結合型糖鎖の解析システム。
(9) 糖タンパク質のN結合型糖鎖を解析するために、1又は複数のコンピューターを、
N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化した糖ペプチド含有試料より調製された、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより1残基のGlcNAc(ただし該GlcNAcには1残基のFucが結合していてもよい)をペプチド中のAsn残基上に残して糖鎖が切断された糖鎖切断ペプチド試料について、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得する、事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定部、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定部、
本分析用試料である、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼによる糖鎖切断処理を受けていない糖ペプチド含有試料について、本分析を行なう、本分析部であって、
本分析用試料について、クロマトグラム、及び推定された保持時間の画分のマススペクトルを取得する、本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
m/zの推定結果に従い、前記推定された保持時間の画分のマススペクトルより分析すべきプリカーサーイオンピークを選定する、分析対象ピーク選定部、及び
選定された分析対象ピークについてのプリカーサーイオン選択質量分析データを取得し、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、糖鎖構造決定部
を含む、本分析部、並びに
分析結果を出力する出力部
として機能させるためのプログラム。
(10) 糖タンパク質のN結合型糖鎖を解析するために、1又は複数のコンピューターを、
N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化した糖ペプチド含有試料より調製された、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより1残基のGlcNAc(ただし該GlcNAcには1残基のFucが結合していてもよい)をペプチド中のAsn残基上に残して糖鎖が切断された糖鎖切断ペプチド試料について、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得する、事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定部、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定部、
本分析用試料である糖鎖切断前の糖ペプチド含有試料について、本分析を行なう、本分析部であって、
前記糖鎖切断ペプチド試料が内部標準として添加された本分析用試料について、クロマトグラム、及び推定された保持時間の画分のマススペクトルを取得する、本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
m/zの推定結果に従い、前記推定された保持時間の画分のマススペクトルより分析すべきプリカーサーイオンピークを選定する、分析対象ピーク選定部、
選定された分析対象ピークについてのプリカーサーイオン選択質量分析データを取得し、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、糖鎖構造決定部、及び
内部標準と各糖ペプチドの抽出イオンクロマトグラムを取得して、内部標準に対する各糖ペプチドの相対強度を算出することにより、当該糖鎖結合部位に存在する糖鎖を相対定量する、糖鎖定量部
を含む、本分析部、並びに
分析結果を出力する出力部
として機能させるためのプログラム。
(11) EEQYNSTYR、EEQFNSTFR、EEQYNSTFR、又はEEQFNSTYRのアミノ酸配列からなるペプチドのアスパラギン残基に、1残基のGlcNAc、又は1残基のFucが結合した1残基のGlcNAcが結合してなるペプチドからなる、IgG型抗体のトリプシン消化物に含まれる糖ペプチド上の糖鎖を定量解析するための内部標準物質。
(12) IgG型抗体を断片化したペプチド混合物から糖ペプチドを分離回収し、糖ペプチドをエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼと反応させた後、糖鎖未切断の糖ペプチドを除去することを含む、IgG型抗体の糖鎖を定量解析するための内部標準の製造方法。
(13) EEQYNSTYRのアミノ酸配列からなるペプチドのアスパラギン残基に、1残基のGlcNAc、又は1残基のFucが結合した1残基のGlcNAcが結合してなるペプチドの、IgG型抗体のトリプシン消化物に含まれる糖ペプチドを定量解析するための内部標準物質としての使用。
RtGlycosylated=RtPeptide+GlcNAc±Δt ・・・式1
(12−3+1)×(9−1+1)×(4−0+1)×(4−0+1)=2250通り
あるので、これをすべて計算機で書き出して、GlcNAc(又はGlcNAc-Fuc)を残して糖鎖が切断されたペプチドのモノアイソトピック質量に加算すれば、糖ペプチドのモノアイソトピック質量を網羅することができる。N結合型糖鎖を構成する各単糖の数は、生物種によってある程度決まっている。例えばヒトでは、N結合型糖鎖生合成経路の仕組みから、ヘキソース(マンノース、グルコース、ガラクトース)は基本的に上記した通り合計で3個〜12個の範囲となる。下記表はヒトの糖タンパク質のN結合型糖鎖で各単糖がとり得る個数である。
各糖ペプチドのピーク面積/内部標準のピーク面積×100 ・・・式2
(1) 分析用試料の調製
糖タンパク質試料として、N結合型糖タンパク質である、とあるIgG1抗体(とあるmAb)医薬品候補を用いた。この糖タンパク質試料100μgを100μgの50 mM トリスヒドロキシメチルアミノメタン、2 M 尿素、pH 8.0に溶解させた。1μgの1 M ジチオトレイトールを加えて室温で1時間放置し糖タンパク質を還元した後、2.8μgの1 M ヨード酢酸を加えて暗闇の中で1時間放置しアルキル化した。その後、1μgの1 M ジチオトレイトールを加えてアルキル化を停止した。
アルキル化した試料に100μLの水を加えた後、2μgのトリプシンを加えて、37℃で16時間インキュベートすることにより、糖タンパク質を消化して断片化した。次いで、このトリプシン消化物をセルロース親水性相互作用クロマトグラフィーに供し、トリプシン消化物から糖ペプチドを分離回収して糖ペプチドを濃縮し、糖ペプチド試料とした。
糖ペプチド試料の半分を糖鎖切断に供し、残り半分を本分析用試料とした。0.001 unitのEndo F2及び0.001 unitのEndo F3を半分量の糖ペプチド試料に加え、37℃で16時間処理することにより、還元末端のGlcNAcをペプチド上に残して糖鎖を切断した。
糖鎖切断後の試料をLC/MS/MSに付し、Asn-GlcNAc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチを行なった。
<使用機器及び分析条件>
1. 還元末端のGlcNAcをペプチド上に残して糖鎖を切断し、乾燥させた試料を25μLの0.1% ギ酸水溶液に溶解させた。
2.トラップカラム (PepMap100 C18 3μm、直径75μm×長さ20 mm; Thermo Scientific, 米国MA州) と分析カラム (Nano HPLC capillary column; 日京テクノス株式会社、日本国東京) を装着したナノ液体クロマトグラフ (EASY-nLC 1000; Thermo Scientific) をハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計 (Q Exactive; Thermo Scientific) に接続し、溶解させた試料5μLをトラップカラムにインジェクション、脱塩した後、分析カラムで試料の分離を行った。試料の分離には、A溶媒に0.1% ギ酸水溶液、B溶媒に0.1% ギ酸アセトニトリルを用いて、0分から40分でB溶媒0%からB溶媒35%のリニアグラジエント、40分から45分でB溶媒35%からB溶媒100%のリニアグラジエントを用いた。全測定を通じてポジティブイオンモード (印加電圧 2,000 V) で測定した。
糖ペプチド試料の残部を本分析したときの糖ペプチドの保持時間及び質量電荷比(m/z)を推定した。
糖鎖を切断していない残り半分の糖ペプチド試料をLC/MS/MSに付した。
<使用機器及び分析条件>
1. 還元末端のGlcNAcをペプチド上に残して糖鎖を切断し、乾燥させた試料を25μLの0.1% ギ酸水溶液に溶解させた。
2.トラップカラム (PepMap100 C18 3μm、直径75μm×長さ20 mm; Thermo Scientific, 米国MA州) と分析カラム (Nano HPLC capillary column; 日京テクノス株式会社、日本国東京) を装着したナノ液体クロマトグラフ (EASY-nLC 1000; Thermo Scientific) をハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計 (Q Exactive; Thermo Scientific) に接続し、溶解させた試料5μLをトラップカラムにインジェクション、脱塩した後、分析カラムで試料の分離を行った。試料の分離には、A溶媒に0.1% ギ酸水溶液、B溶媒に0.1% ギ酸アセトニトリルを用いて、0分から40分でB溶媒0%からB溶媒35%のリニアグラジエント、40分から45分でB溶媒35%からB溶媒100%のリニアグラジエントを用いた。全測定を通じてポジティブイオンモード (印加電圧 2,000 V) で測定した。
(1) 分析用試料の調製
糖タンパク質試料として、N結合型糖タンパク質である、とあるmAb及びヒト骨髄腫由来IgG1を用いた。各試料100μgを、100μgの50 mM トリスヒドロキシメチルアミノメタン、2 M 尿素、pH 8.0に溶解させた。1μgの1 M ジチオトレイトールを加えて室温で1時間放置し糖タンパク質を還元した後、2.8μgの1 M ヨード酢酸を加えて暗闇の中で1時間放置しアルキル化した。その後、1μgの1 M ジチオトレイトールを加えてアルキル化を停止した。
アルキル化した試料に100μLの水を加えた後、2μgのトリプシンを加えて、37℃で16時間インキュベートすることにより、糖タンパク質を消化して断片化し、糖ペプチドを含むペプチド試料とした。
ヒト骨髄腫由来IgG1のペプチド試料の半分をセルロース親水性相互作用クロマトグラフィーに供し、ペプチド試料から糖ペプチドを分離回収し、ヒト骨髄腫由来IgG1の糖ペプチド試料とした。これに0.001 unitのEndo F2及び0.001 unitのEndo F3を加え、37℃で16時間処理することにより、還元末端のGlcNAcをペプチド上に残して糖鎖を切断した。
本分析における目的の糖ペプチドの溶出時間及びm/zの推定のため、ヒト骨髄腫由来IgG1試料から調製した上記の糖鎖切断試料(内部標準物質)をLC/MS/MSに付した。LC/MS/MSの条件は実施例1と同様とした。ペプチド配列及び糖鎖結合部位は上記実施例1で既に同定できているため、Asn-GlcNAc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチのステップは省略した。
とあるmAb及びヒト骨髄腫由来IgG1のトリプシン消化物試料(ペプチド試料)を本分析したときの糖ペプチドの保持時間及び質量電荷比(m/z)を推定した。
(6-1) 糖鎖構造の決定
とあるmAb及びヒト骨髄腫由来IgG1のトリプシン消化物試料に一定量の内部標準を添加し、LC/MS/MSを行なった。なお、本実施例2ではトリプシン消化物試料の糖ペプチド濃縮を省略して本分析を行なったが、実施例1と同様に、糖ペプチドを濃縮したものを用いて本分析を行なっても良い。
<使用機器及び分析条件>
1. 還元末端のGlcNAcをペプチド上に残して糖鎖を切断した内部標準5μgを50μgのとあるmAb及びヒト骨髄腫由来IgG1のトリプシン消化物試料に添加し、総量を50μLとした。
2.トラップカラム (PepMap100 C18 3μm、直径75μm×長さ20 mm; Thermo Scientific, 米国MA州) と分析カラム (Nano HPLC capillary column; 日京テクノス株式会社、日本国東京) を装着したナノ液体クロマトグラフ (EASY-nLC 1000; Thermo Scientific) をハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計 (Q Exactive; Thermo Scientific) に接続し、内部標準が添加された試料1μLをトラップカラムにインジェクション、脱塩した後、分析カラムで試料の分離を行った。試料の分離には、A溶媒に0.1% ギ酸水溶液、B溶媒0.1% ギ酸アセトニトリルを用いて、0分から10分でB溶媒0%からB溶媒35%のリニアグラジエント、10分から12分でB溶媒35%からB溶媒100%のリニアグラジエントを用いた。全測定を通じてポジティブイオンモード (印加電圧 2,000 V) で測定した。
次に、当該糖鎖結合部位における糖鎖の相対定量を行なった。内部標準(m/z 769.83)及び各糖ペプチド(m/z 879.02、933.04等)の抽出イオンクロマトグラムを作成し、それぞれのピーク面積を算出し、内部標準のピーク面積で各糖ペプチドのピーク面積を割り、100を掛けることにより、図12に示すように、とあるmAbとヒト骨髄腫由来IgG1のそれぞれについて、当該糖鎖結合部位における糖鎖の比較定量結果を得た。
数種類のモデル糖タンパク質を本発明の糖鎖解析方法により解析した解析例を示す。以下の解析例では、事前LC/MS/MSの結果から糖鎖切断前の糖ペプチドの保持時間とm/zを推定し、推定結果に従って糖鎖切断前の糖ペプチドのLC/MS/MSまたはLC/MSnを実施する工程をG-ILIS(Glycopeptide-inclusion list data-dependent acquisition MS)と表現する。
実施例1、2で用いたIgG1抗体とは異なるIgG1(ヒト抗体)の糖鎖を以下の手順で解析した。基本的な操作は実施例1と同様に行った。
IgG1のトリプシン消化物から糖ペプチドを回収した糖ペプチド濃縮試料をエンドグリコシダーゼF1〜F3で処理し、アスパラギン残基上に1残基のGlcNAc又はGlcNAc-Fucを残して糖鎖が切断されたペプチド試料(以下、G-TAGと呼ぶ)を調製した。G-TAGのLC/MS/MSを実施し、G-TAGのベースピーククロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを得た。
事前LC/質量分析により取得したG-TAGの保持時間と質量から、糖鎖切断前の糖ペプチドの保持時間とm/zを推定し、m/zの推定値(実施例1と同様の方法にて算出)をリスト化した。事前LC/質量分析と同条件で、リスト依存的LC/MS/MS(G-ILIS)を実施し、IgG1糖ペプチドのベースピーククロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得して、糖鎖構造を決定した。
nanoLC, EASY-nLCTM 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA); トラップカラム, AcclaimTM PepMapTM 100 C18 (3 μm, 0.075 mm × 10 mm; Thermo Fisher Scientific); 分析カラム, NTCC-360/75-3-125 (C18, particle diameter 3 μm, 0.075 mm × 125 mm; Nikkyo Technos); hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, Q ExactiveTM (Thermo Fisher Scientific); 溶出条件, a linear gradient of solution A (0.1% (v/v) formic acid/water) and solution B (0.1% (v/v) formic acid/acetonitrile) at 300 nL/min (0-15 min, 0-35% solution B; 15-20 min, 35-100% solution B.
解析例1と同様の方法にて、リボヌクレアーゼB(RNase B)(ウシ膵臓由来:SIGMA-ALDRICH)の糖鎖解析を行なった。
解析例1と同様の方法にて、トランスフェリン(Tf)(ヒト;SIGMA-ALDRICH)の糖鎖解析を行なった。
シアル酸結合複合型糖鎖修飾タンパク質のさらなる解析例として、3本鎖糖鎖を有するフェツイン(牛胎児血清由来;SIGMA-ALDRICH)及び4本鎖糖鎖を有するα1-酸性糖タンパク質(ヒト血漿由来;SIGMA-ALDRICH)の糖鎖解析も解析例1と同様の方法にて行なった。
10 事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部
12 糖鎖結合位置決定部
14 保持時間・m/z推定部
16 本分析部
161 本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部
162 分析対象ピーク選定部
163 糖鎖構造決定部
164 糖鎖定量部
20 入力部
30 出力部
Claims (13)
- N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化して糖ペプチド含有試料を得る、糖タンパク質断片化工程、
糖ペプチド含有試料の一部をエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼと反応させ、糖鎖とアスパラギン(Asn)残基との結合部に存在するキトビオースのβ-1,4結合を切断することにより、1残基のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)(ただし該GlcNAcには1残基のフコース(Fuc)が結合していてもよい)をペプチド上に残して糖鎖を切断する、糖鎖切断工程、
糖鎖切断工程で得られた糖鎖切断ペプチド試料に対して液体クロマトグラフィー/質量分析を行ない、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを得る、事前液体クロマトグラフィー/質量分析工程、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定工程、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定工程、
糖ペプチド含有試料の残部を液体クロマトグラフィー/質量分析に供し、前記保持時間及び前記m/zの推定結果に従い分析すべきプリカーサーイオンピークを選定し、選定されたピークに対してプリカーサーイオン選択質量分析を行ない、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、本分析工程、
を含む、糖タンパク質のN結合型糖鎖の解析方法。 - エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼが、Endo F1、Endo F2、Endo F3、Endo M、Endo H及びEndo Sから選択される1種又は2種以上を含む、請求項1記載の方法。
- 糖ペプチド含有試料として、糖鎖が結合していないペプチドを除去して糖ペプチドを濃縮した試料を用いる、請求項1又は2記載の方法。
- 糖鎖切断工程で得られた糖鎖切断ペプチド試料を内部標準として、糖ペプチド含有試料の残部に添加して本分析工程を実施し、当該糖鎖結合部位に存在する糖鎖を相対定量することをさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内部標準として、糖鎖未切断の糖ペプチドを除去した糖鎖切断ペプチド試料を用いる、請求項4記載の方法。
- 糖鎖未切断の糖ペプチドの除去は、冷却したアセトンを添加し、糖鎖未切断の糖ペプチドを沈殿させて分離する方法により、又は親水性相互作用クロマトグラフィーを用いて糖鎖未切断の糖ペプチドを吸着除去することにより行われる、請求項5記載の方法。
- N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化した糖ペプチド含有試料より調製された、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより1残基のGlcNAc(ただし該GlcNAcには1残基のFucが結合していてもよい)をペプチド中のAsn残基上に残して糖鎖が切断された糖鎖切断ペプチド試料について、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得する、事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部と、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定部と、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定部と、
本分析用試料である糖鎖切断前の糖ペプチド含有試料について、本分析を行なう、本分析部であって、
本分析用試料について、クロマトグラム、及び推定された保持時間の画分のマススペクトルを取得する、本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
m/zの推定結果に従い、前記推定された保持時間の画分のマススペクトルより分析すべきプリカーサーイオンピークを選定する、分析対象ピーク選定部、及び
選定された分析対象ピークについてのプリカーサーイオン選択質量分析データを取得し、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、糖鎖構造決定部
を含む、本分析部と、
分析結果を出力する出力部と
を備える、糖タンパク質のN結合型糖鎖の解析システム。 - N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化した糖ペプチド含有試料より調製された、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより1残基のGlcNAc(ただし該GlcNAcには1残基のFucが結合していてもよい)をペプチド中のAsn残基上に残して糖鎖が切断された糖鎖切断ペプチド試料について、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得する、事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部と、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定部と、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定部と、
本分析用試料である糖鎖切断前の糖ペプチド含有試料について、本分析を行なう、本分析部であって、
前記糖鎖切断ペプチド試料が内部標準として添加された本分析用試料について、クロマトグラム、及び推定された保持時間の画分のマススペクトルを取得する、本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
m/zの推定結果に従い、前記推定された保持時間の画分のマススペクトルより分析すべきプリカーサーイオンピークを選定する、分析対象ピーク選定部、
選定された分析対象ピークについてのプリカーサーイオン選択質量分析データを取得し、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、糖鎖構造決定部、及び
内部標準と各糖ペプチドの抽出イオンクロマトグラムを取得して、内部標準に対する各糖ペプチドの相対強度を算出することにより、当該糖鎖結合部位に存在する糖鎖を相対定量する、糖鎖定量部
を含む、本分析部と、
分析結果を出力する出力部と
を備える、糖タンパク質のN結合型糖鎖の解析システム。 - 糖タンパク質のN結合型糖鎖を解析するために、1又は複数のコンピューターを、
N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化した糖ペプチド含有試料より調製された、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより1残基のGlcNAc(ただし該GlcNAcには1残基のFucが結合していてもよい)をペプチド中のAsn残基上に残して糖鎖が切断された糖鎖切断ペプチド試料について、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得する、事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定部、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定部、
本分析用試料である、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼによる糖鎖切断処理を受けていない糖ペプチド含有試料について、本分析を行なう、本分析部であって、
本分析用試料について、クロマトグラム、及び推定された保持時間の画分のマススペクトルを取得する、本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
m/zの推定結果に従い、前記推定された保持時間の画分のマススペクトルより分析すべきプリカーサーイオンピークを選定する、分析対象ピーク選定部、及び
選定された分析対象ピークについてのプリカーサーイオン選択質量分析データを取得し、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、糖鎖構造決定部
を含む、本分析部、並びに
分析結果を出力する出力部
として機能させるためのプログラム。 - 糖タンパク質のN結合型糖鎖を解析するために、1又は複数のコンピューターを、
N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化した糖ペプチド含有試料より調製された、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより1残基のGlcNAc(ただし該GlcNAcには1残基のFucが結合していてもよい)をペプチド中のAsn残基上に残して糖鎖が切断された糖鎖切断ペプチド試料について、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得する、事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定部、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定部、
本分析用試料である糖鎖切断前の糖ペプチド含有試料について、本分析を行なう、本分析部であって、
前記糖鎖切断ペプチド試料が内部標準として添加された本分析用試料について、クロマトグラム、及び推定された保持時間の画分のマススペクトルを取得する、本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
m/zの推定結果に従い、前記推定された保持時間の画分のマススペクトルより分析すべきプリカーサーイオンピークを選定する、分析対象ピーク選定部、
選定された分析対象ピークについてのプリカーサーイオン選択質量分析データを取得し、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、糖鎖構造決定部、及び
内部標準と各糖ペプチドの抽出イオンクロマトグラムを取得して、内部標準に対する各糖ペプチドの相対強度を算出することにより、当該糖鎖結合部位に存在する糖鎖を相対定量する、糖鎖定量部
を含む、本分析部、並びに
分析結果を出力する出力部
として機能させるためのプログラム。 - EEQFNSTFR、EEQYNSTFR、又はEEQFNSTYRのアミノ酸配列からなるペプチドのアスパラギン残基に、1残基のGlcNAc、又は1残基のFucが結合した1残基のGlcNAcが結合してなるペプチドからなる、IgG型抗体のトリプシン消化物に含まれる糖ペプチド上の糖鎖を定量解析するための内部標準物質。
- IgG型抗体を断片化したペプチド混合物から糖ペプチドを分離回収し、糖ペプチドをエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼと反応させた後、糖鎖未切断の糖ペプチドを除去することを含む、IgG型抗体の糖鎖を定量解析するための内部標準の製造方法。
- EEQYNSTYRのアミノ酸配列からなるペプチドのアスパラギン残基に、1残基のGlcNAc、又は1残基のFucが結合した1残基のGlcNAcが結合してなるペプチドの、IgG型抗体のトリプシン消化物に含まれる糖ペプチドを定量解析するための内部標準物質としての使用。
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