CN115792048A - 质谱定量检测多肽产品中酪蛋白糖巨肽的标准特征多肽序列 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了质谱定量检测多肽产品中酪蛋白糖巨肽的标准特征多肽序列，属于检验检测技术领域。由于酪蛋白糖巨肽具有多种可能的糖基化修饰，故对其质谱定量难度较大。本发明对样品脱脂、沉淀蛋白后，通过酶切酪蛋白糖巨肽得到不含糖基化修饰位点的标准特征多肽序列，以精准的质量数避免了糖基化对于酪蛋白糖巨肽定量的影响。本发明筛选得到三条用于定量检测酪蛋白糖巨肽的多肽，氨基酸序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示，其中，目标肽段3表现出更高的特异性，更适合用于定量分析待测样本中酪蛋白糖巨肽的含量。本发明实现了酪蛋白糖巨肽的精准定量分析，可用于确定产品中酪蛋白糖巨肽的含量是否达标。

Description

质谱定量检测多肽产品中酪蛋白糖巨肽的标准特征多肽序列
技术领域
本发明涉及质谱定量检测多肽产品中酪蛋白糖巨肽的标准特征多肽序列，具体涉及酪蛋白糖巨肽的标准特征多肽序列，利用此多肽序列结合质谱可定量检测样品中的酪蛋白糖巨肽，属于检验检测技术领域。
背景技术
酪蛋白糖巨肽是由κ-酪蛋白酶解得到的一种糖基化多肽，不含苯丙氨酸，其糖基含有丰富的唾液酸，具有抗菌消炎、抑菌解毒、促进婴幼儿大脑发育的功效，因此是一种理想的苯丙酮尿症人群的特殊医学用途配方食品和婴幼儿配方奶粉的食品成分。对该类产品中酪蛋白糖巨肽的定性鉴定和定量分析可以确定商家是否存在以次充好的行为及酪蛋白糖巨肽食品质量是否达标。
酪蛋白糖巨肽的氨基酸序列是从κ-酪蛋白106位的甲硫氨酸到169位的缬氨酸组成的64个氨基酸，氨基酸序列有11种变异型。自然界中A型酪蛋白糖巨肽占据主导地位，其中121、131、133、136、142位的Thr是可能的糖基化位点，均为乙酰氨基半乳糖类氧糖苷键，糖基后端主要有半乳糖、唾液酸两种糖类，一个糖基有单糖到四糖不同的组成方式。酪蛋白糖巨肽的理论分子量在7-11kDa之间，但是在特定的pH下可以形成多聚体，具有不同的表观分子量。由此可见，酪蛋白糖巨肽分子量大，且糖基化程度复杂，分子形式多样，因此目前还没有非常成熟的方法可以对其进行准确地定量。
目前酪蛋白糖巨肽的检测方法主要是间接检测方法，如间苯二酚盐酸法检测唾液酸含量从而间接反映酪蛋白糖巨肽的含量，电泳法检测酪蛋白糖巨肽多聚体等。这些检测方法误差大，易受干扰，无法在酪蛋白糖巨肽蛋白食品中精准检测酪蛋白糖巨肽，反映真实的酪蛋白糖巨肽含量。中国发明专利申请号CN201810316627.6，发明名称为“一种A1/A2β-酪蛋白的质谱检测方法”该方法的关键分析条件不适用于酪蛋白水解物等多肽产品中酪蛋白糖巨肽的分析和检测。中国发明专利申请号CN201810487863.4，发明名称为“一种用于检测牛乳品中A2β-酪蛋白含量的特征肽及方法”该方法所用的液相质谱法需要针对A2β酪蛋白的特定氨基酸片段设计处理过程，同时需要引入特定序列的内标肽，存在检测时间长、检测样本数量低、检测成本高等缺点，且该方法中关键的分析方法并不适用于酪蛋白水解物等多肽产品中酪蛋白糖巨肽的分析和检测。中国发明专利申请号CN201911419245.7，发明名称为“质谱检测乳制品中A1和A2型β-酪蛋白的标准特征多肽组”该方法所提取的目标肽段和关键分析条件也不适用于酪蛋白水解物等多肽产品中酪蛋白糖巨肽的分析和检测。
文献“Quantitative determination ofbovine k-casein macropeptide indairy products by Liquid chromatography/Electrospray coupled to massspectrometry(LC-ESI/MS)and Liquid chromatography/Electrospray coupled totamdem mass spectrometry(LC-ESI/MS/MS)”中使用RP-HPLC-ESI-MS技术实现了对A型和B型和总酪蛋白糖巨肽含量的检测，并分析了UV，SIM和MRM三种检测模式在定量总酪蛋白糖巨肽含量时的优缺点，但该法中没有对酪蛋白糖巨肽进行定性分析，且检测总酪蛋白糖巨肽含量仅使用水解酪蛋白糖巨肽后获取的一个多肽段(162-169)，因此可能无法检测出酪蛋白糖巨肽产品的掺假行为，其定量结果也可能产生偏差。
综上，关于酪蛋白糖巨肽的检测方法依旧存在谱图信息杂、分析难、精确性不高的缺陷。因此，有必要建立谱图信息更简单、易于分析、精确性较高、基于液质的酪蛋白糖巨肽检测方法。
发明内容
本发明提供了质谱定量检测多肽产品中酪蛋白糖巨肽的标准特征多肽序列以及利用该标准特征多肽序列检测多肽产品中酪蛋白糖巨肽的方法，可以对多肽产品中酪蛋白糖巨肽进行定量分析，具有操作简单、快速，成本低、高通量等优势。
本发明第一个发明原理在于从整蛋白层面研究酪蛋白糖巨肽分子量特征，而后根据模拟酶切结果选择蛋白酶对酪蛋白糖巨肽进一步酶解，获得数个非糖基化的小肽段。
本发明第二个原理在于通过质谱结果，对上述酶切获得的非糖基化小肽段进行分析评价，选出三个合适的肽段作为酪蛋白糖巨肽潜在的定量肽段，最终筛选出一个肽段作为酪蛋白糖巨肽的定量肽段。
本发明第三个原理是基于上述原理的情况下，通过检测酪蛋白水解物等多肽产品中的定量肽段，完成对酪蛋白水解物等多肽产品中酪蛋白糖巨肽的定量检测。
因此，本发明第一个目的是提供一种多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。
本发明的第二个目的是提供了一种利用所述多肽检测酪蛋白糖巨肽的方法，所述方法为利用质谱技术检测所述多肽。
在一种实施方式中，所述方法为以所述多肽的671.0/455.1(5‰)离子对应的MRM质谱峰用于检测酪蛋白糖巨肽。
在一种实施方式中，所述质谱的流动相条件为：初始流动相A所占比例100％，40～45min流动相A所占比例70％，流动相B所占比例30％；45～50min流动相A所占比例20％，流动相B所占比例80％；50～55min流动相B所占比例100％，55min流动相A所占比例100％；
流动相A为100％0.1甲酸，流动相B为乙腈。
在一种实施方式中，所述流动相流速设置为0.1～0.5mLmin-1，
在一种实施方式中，色谱柱为BEH C18 2.1×120mm 1.7μm，柱温35～45℃。
在一种实施方式中，所述质谱的检测条件为：正离子模式，扫描模式：MRM，去簇电压：30～40V，入口电压：8～15V，离子源电压：4000～5000V，离子源温度：550℃，碰撞能：20～50V。
本发明还提供了一种定量检测酪蛋白糖巨肽的方法，所述方法的具体步骤如下：
(1)前处理：使用低极性有机溶剂处理待检测样品，收集水相，使用蛋白酶酶解后终止反应，经滤膜过滤后，得到样品前处理液；
(2)检测酪蛋白糖巨肽：利用上述一种利用所述多肽检测酪蛋白糖巨肽的方法检测样品前处理液，获得待检测样品中多肽的离子流色谱图和质谱图；
(3)含量计算：将步骤(2)中多肽的离子流色谱图的峰面积带入标准曲线分析计算，从而获得样品中酪蛋白糖巨肽的含量。
在一种实施方式中，所述标准曲线的构建方法为：利用上述方法测定一系列浓度的酪蛋白糖巨肽标准溶液，获得峰面积值，将峰面积值与相应酪蛋白糖巨肽标准溶液的浓度构建标准曲线。
在一种实施方式中，所述低极性有机溶剂选自C5～C12的烷烃或环烷烃、C1～C8的卤代烷烃或其混合物。
在一个实施方案中，所述低极性有机溶剂为正己烷。
在一个实施方案中，所述蛋白酶为蛋白酶K。
在一种实施方式中，所述蛋白酶的工作浓度不低于0.05mg mL-1。
在一种实施方式中，所述酶解的条件为55～65℃酶解8h。
有益效果：
1、通过本发明的方法实现了对产品中酪蛋白糖巨肽的定量分析。
2、本发明采用HPLC-ESI-QTOF-MS方法，提出通过识别酪蛋白糖巨肽的特征多肽序列质谱峰实现了产品中酪蛋白糖巨肽的相对定量。
3、本发明提供的方法无需额外添加内标，操作过程中只需要针对待测样品进行前处理，即可进行检测，具有操作简单、快速，成本低、高通量等优势；本发明的方法中所涉及的剂耗材均为易于购买的常规试剂耗材，适合广大实验室实施检测，易于推广。
附图说明
图1为目标肽段1的(a)提取离子流色谱图、(b)对应保留时间的一级质谱图、(c)649.3m/z离子放大图和(d)1297.6m/z离子放大图。
图2为目标肽段1的(a)肽链方向断裂产生的碎片离子和(b)二级质谱图。
图3为目标肽段2的(a)提取离子流色谱图、(b)对应保留时间的一级质谱图、(c)675.3m/z离子放大图。
图4为目标肽段2的(a)肽链方向断裂产生的碎片离子和(b)二级质谱图。
图5为目标肽段3的(a)提取离子流色谱图、(b)对应保留时间的一级质谱图、(c)671.3m/z离子放大图。
图6为目标肽段3的(a)肽链方向断裂产生的碎片离子和(b)二级质谱图。
图7为标准品目标肽段3的标准曲线图。
图8为实施例5中待测牛乳乳粉酶解样品目标肽段3的(a)提取离子流色谱图、(b)对应保留时间的一级质谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是实例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明中酪蛋白糖巨肽纯品的提取方法参考文献：Pan X，Chen Y，Zhao P，etal.Highly efficient solid-phase labeling of saccharides within boronic acidfunctionalized mesoporous silica nanoparticles[J].Angewandte ChemieInternational Edition，2015，54(21):6173-6176.根据该文献提供的方法，本发明提供的酪蛋白糖巨肽纯品的紫外检测法相对纯度达0.957。
实施例1.酶解肽段模拟
1.酶解肽段模拟
使用PeptideMass程序模拟蛋白酶切与质谱对应质荷比。模拟条件：获得单一同位素分子量，无半胱氨酸处理，显示质量数大于500Da的肽段。
2.结果分析
使用PeptideMass应用程度模拟常见的蛋白内切酶酶解酪蛋白糖巨肽，分析酶解结果，如表1所示：
表1.酶解酪蛋白糖巨肽得到的片段
Figure BDA0003760970820000051
从表1可以看出，其中蛋白酶K可以有效将酪蛋白糖巨肽酶解成小肽段，而蛋白酶K价格低廉、酶解条件温和且易于终止反应和分离，因此是酶解酪蛋白糖巨肽的理想酶，以下实施例均采用蛋白酶K进行酶解。
实施例2.蛋白酶K酶解酪蛋白糖巨肽与目标肽段筛选
1.蛋白酶K酶解酪蛋白糖巨肽
a)配制20mg mL-1蛋白酶K储备液：称取20mg蛋白酶K，溶于1mL纯净水中，轻轻振摇直至完全溶解，50μL一管分装，-20℃下保存。
b)50mM pH＝7.5Tris-HCl，10mM CaCl2缓冲液的配制：称取6.06g Tris和1.11gCaCl2溶于900mL纯净水中，滴加浓HCl不断搅拌调节pH至7.5，加水定容至1000mL。
c)取10mg冻干的酪蛋白糖巨肽纯品，溶于10mL上述缓冲液，加入蛋白酶K储备液25μL，58℃酶解8h。
d)酶解结束后95℃灭酶10min，8000rpm离心10min。
e)300Da透析袋透析2d，保留透析内液，4℃保存待测。
2.目标肽段筛选
依据蛋白酶K酶解酪蛋白糖巨肽的位点，选取含五个氨基酸残基及以上的肽段。其中酶解产生的五肽以上的肽段有4个，如表2所示，分别是位于109-119位的11肽PPKKNQDKTEI，位于127-138位的12肽SGEPTSTPTTEA，位于147-152位的6肽EDSPEV，以及位于154-159位的6肽ESPPEI。其中位于127-138位的12肽由于含有糖基化位点，因此不是一个理想的定量肽段。故选取位于109-119位的11肽PPKKNQDKTEI(SEQ ID No.1)、位于147-152位的6肽EDSPEV(SEQ ID No.2)以及位于154-159位的6肽ESPPEI(SEQ ID No.3)分别作为3个标准特征多肽。根据其位点特征，可以看出，氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQID No.3所述的三个肽段分别位于酪蛋白糖巨肽的N端、中部和C端。
表2蛋白酶K酶解肽段(五肽以上)
Figure BDA0003760970820000061
实施例3.目标肽段的检测与分析
1.HPLC-ESI-Q-TOF MS检测酶解片段
本实施例采用的质谱仪为：QTRAP 4500型液相色谱质谱联用仪(美国Ab Sciex公司)。
本实施例采用的液相条件和质谱模式如下：
液相条件：色谱柱为BEH C18 2.1×120mm 1.7μm，流动相A为100％0.1甲酸，流动相B为乙腈，梯度洗脱，初始100％A，40min 70％A+30％B，45min 20％A+80％B，50min 100％B，55min 100％A。流速0.3mL min-1，柱温45℃，进样量5μL。
质谱条件：正离子模式，毛细管电压3.5kV，锥孔电压30V，离子源温度：100℃，脱溶剂气温度：400℃，去溶剂化气体流量：700lit hr-1，锥形气体流量：50lit hr-1，碰撞能量：6/20V，质量范围50-2000m/z，检测器电压：1800V。
2.多肽序列检索
使用蛋白数据库Uniprot的BLAST功能检索肽段，数据库选择UniprotKBreference proteomes plus Swiss-Prot，E-threshold为1000，Matrix选择Auto，Filtering选择None，Gapped选择yes，Hits选择1000，检索结果如表3、表4、表5所示。
表3目标肽段1 BLAST检索结果
Figure BDA0003760970820000062
Figure BDA0003760970820000071
表4目标肽段2 BLAST检索结果
Figure BDA0003760970820000081
表5目标肽段3BLAST检索结果
Figure BDA0003760970820000082
3.目标肽段分析与评价
根据图1-图6所示的目标肽段1、目标肽段2、和目标肽段3所获的质谱谱图、表3-5所示的BLAST多肽序列检索结果和表1所示的模拟酶切结果，从离子峰强度、碎片峰强度、特异性和水解度四个方面分别对3个目标肽段进行评价，评价结果如表6所示。
表6三种肽段的比较
Figure BDA0003760970820000083
3个目标肽段的串联四级杆飞行时间质谱主要特征峰如表7所示。
表7串联四级杆飞行时间质谱主要特征峰列表
名称 单电荷/双电荷 m/z 允许偏移范围
目标肽段1 单电荷 1297.9 ±5‰以内
目标肽段1 双电荷 649.3 ±5‰以内
目标肽段2 单电荷 675.3 ±5‰以内
目标肽段3 单电荷 671.3 ±5‰以内
根据表3-表7的结果综合评价比较，目标肽段3具有较高的特异性，因此目标肽段3是作为定量检测酪蛋白糖巨肽的理想肽段。
实施例4.HPLC-ESI-QqQ MS定性和定量检测酪蛋白糖巨肽
1.HPLC-ESI-QqQ MS检测酪蛋白糖巨肽
本发明采用的质谱仪为：MALDI SYNAPT MS型超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用仪(美国沃特世公司)。
本实施例采用的液相条件和质谱模式如下：
液相条件：色谱柱为Agilent Advance Peptidemapping
Figure BDA0003760970820000091
2.1×150mm 2.7μm，流动相A为100％甲酸，流动相B为乙腈，梯度洗脱，0-5min 98％A+2％B，5-20min 70％A+30％B，20-25min 70％A+30％B，25-28min 98％A+2％B，28-30min 98％A+2％B。流速0.3mLmin-1，柱温40℃，进样量10μL。
质谱模式：正离子模式，扫描模式：MRM，去簇电压：35V，入口电压：10V，离子源电压：4500V，离子源温度：550℃，碰撞能：40V，离子源气1：60psi，离子源气2：40psi。
(1)目标肽段3标准品的制备：
①合成顺序：从序列C端到N端，步骤如下：
a.称取n当量树脂放入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入目标肽段1序列中的第一个氨基酸2n当量，加2n当量的二异丙基乙胺(DIEA)及适量的二甲基甲酰胺(DMF)、DCM(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，DIEA、DMF、DCM，氮气鼓泡反应60min，然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、甲醇(MEOH)洗净；
b.往反应器中加入2n当量目标肽段1序列中第二个氨基酸，2n当量1-羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐(HBTU)及DIEA，氮气鼓泡反应30min，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端；最后洗净，加入适量的脱帽液去除9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护基，洗净，茚三酮检测；
c.依步骤b的方式依次加入目标肽段3序列中其他氨基酸并进行各种修饰；
d.将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10ml/g的比例)的切割液(组成是95％TFA，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水)，震荡，滤掉树脂；
e.得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物；
②多肽纯化：用高效液相色谱将粗品提纯；
③多肽冻干：纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末，即得目标肽段3标准品。
目标肽段3标准品由上海强耀生物科技有限公司制备。
(2)标准溶液的配制：分别取步骤(1)中制备的5mg目标肽段3的标准品，溶解于1mL蒸馏水中，逐级稀释，得到10μg mL-1、100μg mL-1的目标肽段3的标准溶液，经由上述液相色谱串联质谱分析检测分别绘制目标肽段3的标准曲线。得到的标准品目标肽段3的标准曲线如图7所示，y＝13183.7704x-502.7037。
(4)样品制备：称取食品样品5-10g，溶解于30mL去离子水中，加入10mL正己烷振荡去除脂肪，静置直至分层，去除有机相，重复萃取3次，最终得到的水相预冷后放入冻干机中冻干待测。
(5)样品缓冲液的配制：50mmol L-1pH 7.5Tris-HCl，10mmol L-1CaCl2缓冲液的配制：称取6.06g Tris和1.11g CaCl2溶于900mL纯净水中，滴加浓HCl不断搅拌调节pH至7.5，加水定容至1000mL。
(6)蛋白酶K酶解：取100mg冻干后的样品，溶于5mL样品缓冲液中，加入蛋白酶K储备液25μL，58℃酶解8h。酶解结束后95℃灭酶10min，4310g离心10min，保留上清液，300Da透析袋透析2d，保留透析内液，4℃保存待测。
(7)待检测样品的酶解液经0.22μm的水相滤膜过滤后利用HPLC-ESI-QqQ MS检测(同实施例3中的HPLC-ESI-Q-TOF MS检测方法)，获得待测样品多肽的离子流色谱图和质谱图，对其进行定量测定，具体方法为：将待检样品的肽段SEQ ID No.3离子流色谱图的峰面积带入步骤(3)所得的标准曲线分析计算，并经过换算公式换算，从而获得样品中酪蛋白糖巨肽的含量。
实施例5牛乳乳粉酶解样品中酪蛋白糖巨肽的定量实验
参照实施例4所述的方法，对牛乳样品中酪蛋白糖巨肽进行定量实验。
本实施例中的牛乳样品的来源为：新农天上天山全脂奶粉。
待测牛乳样品多肽的离子流色谱图和质谱图如图8所示，将待检样品的目标肽段3离子流色谱图的峰面积值(由图8得出为876)带入图7所示的标准曲线分析计算，并经过换算公式换算，从而获得样品中酪蛋白糖巨肽的含量为0.1046μg/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种用于检测酪蛋白糖巨肽的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3任一所示。
2.一种检测酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，所述方法为利用质谱技术检测权利要求1所述多肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法为以权利要求1所述多肽的671.0/455.1(5‰)离子对应的MRM质谱峰用于检测酪蛋白糖巨肽。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述质谱的流动相条件为：初始流动相A所占比例100％，40～45 min流动相A所占比例70％，流动相B所占比例30％；45～50 min流动相A所占比例20％，流动相B所占比例80％；50～55 min流动相B所占比例100％，55 min流动相A所占比例100％；
流动相A为100％0.1甲酸，流动相B为乙腈。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相流速设置为0.1～0.5 mLmin-1，所述质谱的检测条件为：正离子模式，扫描模式：MRM，去簇电压：30～40 V，入口电压：8～15V，离子源电压：4000～5000 V，离子源温度：550℃，碰撞能：20～50 V。
6.一种定量检测酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
(1)前处理：使用低极性有机溶剂处理待检测样品，收集水相，使用蛋白酶酶解后终止反应，经滤膜过滤后，得到样品前处理液；
(2)检测酪蛋白糖巨肽：利用权利要求2～5任一所述的方法检测样品前处理液，获得待检测样品中多肽的离子流色谱图和质谱图；
(3)含量计算：将步骤(2)中多肽的离子流色谱图的峰面积带入标准曲线分析计算，从而获得待检测样品中酪蛋白糖巨肽的含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的构建方法为：利用权利要求2～5任一所述方法测定一系列浓度的酪蛋白糖巨肽标准溶液，获得峰面积值，将峰面积值与相应酪蛋白糖巨肽标准溶液的浓度构建标准曲线。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述低极性有机溶剂选自C5～C12的烷烃或环烷烃、C1～C8的卤代烷烃或其混合物。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述蛋白酶为蛋白酶K。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶的工作浓度不低于0.05mgmL-1，所述酶解的条件为55～65℃酶解8 h。
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