CN114137124B - 一种对蛋白进行快速肽图分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种对蛋白进行快速肽图分析的方法，所述方法采用DI‑MS/MS结合气态分段技术，可适用于所有蛋白类药物，通过计算机辅助所获得的理论酶解肽段和前体离子、碎片离子信息，与DI‑MS/MS结合气态分段技术所采集的肽图进行匹配，即可实现所有蛋白类药物的质量分析和控制。该方法单次分析仅需5min，与传统基于LC‑MS技术的多肽样品分析相比，极大的提高了分析通量，并且可以提供更为精确的m/z值信息，精确度可达小数点后四位甚至更多，保障了对蛋白的准确定性，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，更为具体的，本发明涉及一种利用DI-MS/MS结合气态分段技术对蛋白进行快速肽图分析的方法。
背景技术
近年来，单克隆抗体(mAb)、免疫球蛋白和干扰素等蛋白质类药物的应用愈发广泛，但其质量控制受限于缺乏合适的分析方法和平台。与小分子药物相比，蛋白类药物由于缺乏合适的分析方法，以及标准蛋白难以获得，其质量控制和分析仍然是一个巨大的挑战。MALDI-TOF-MS高分辨质谱能够在不进行蛋白酶解的情况下测量特定蛋白质的准确分子量，然而，这种技术无法提供所需的氨基酸序列信息。肽图(peptide map)分析策略以蛋白经特异性水解后产生的一系列肽段分子为研究对象，因肽段在质谱中的裂解途径与小分子化合物十分相似，因此可通过MSn信息实现肽段氨基酸序列的确认，可应用于蛋白类药物的分析中。理论上讲，肽图分析可以被视为一种自下而上的蛋白质组学方法。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术已应用于肽图分析中，LC负责将混合多肽化合物分离纯化为简单混合物或单一多肽，随后传输至MS获取各多肽的MS1和MS2信息。通过[M+2H]2+和[M+3H]3+等准分子离子及其解离后产生的a+、b+、c+、x+、y+和z+型碎片离子的精确质荷比(m/z)信息，解析多肽的氨基酸序列。但LC-MS/MS技术的分析通量受限于耗时的LC分离，无法满足大队列样品的快速分析。
直接注射(direct infusion，DI)具有分析通量高的优势，但与数据依赖性扫描模式(data-dependentacquisition，DDA)结合时，仅可采集Top10-20前体离子的碎片信息，与数据非依赖性扫描模式(data-independentacquisition，DIA)结合时，所有前体离子的碎片信息混合在1个MS2图谱中，碎片归属十分困难。因此，在全面采集碎片信息的前提下，获取数据复杂程度较低的MS2图谱是DI技术广泛应用的关键。气态离子分段(gas phase ionfractionation，GPF)技术在前体离子进入碰撞池前，将其分成一系列连续的m/z质量窗口，具备较强的选择性和分离能力。理论上，GPF中m/z质量窗口越窄，质谱的分离潜力越大，但MS2采集时间明显增加，将会导致分析物在相应洗脱时间内(即色谱峰峰宽)无法完成足够次数的扫描；更宽的GPF窗口能够减少采集时间，但限制了质谱的分离能力，并且导致碎片离子归属困难。为了平衡MS2扫描时间和峰宽之间的矛盾，目前广泛应用的SWATH方法通常将GPF窗口设定为25Da。将气态分段技术与DI结合时，各分析物的峰宽不受限制(等于样品注射时间)，GPF的质量窗口可以缩短至1Da，从而实现在每个表观质量窗口内采集MS2信息。目前，DI-MS/MS结合气态分段技术已应用于脂质组学研究和中药复杂基质中的小分子全面表征中。此外，刘阳等通过DI与MRM采集模式相结合的靶向分析策略实现了13个氨基酸的定量分析，然而该方法仅靶向采集个别感兴趣的氨基酸，无法实现样品信息的全面采集，并且使用的低分辨率的QQQ质谱分析仪，其分辨率仅为0.6-0.8Da，在定性分析中十分受限。目前尚无研究将DI-MS/MS结合气态分段技术应用于蛋白和多肽样品的分析的报道。
发明内容
为填补现有技术的空白，本发明提供一种应用DI-MS/MS结合气态分段技术实现对蛋白样品快速定性分析的方法。具体的，本发明提供如下的技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种DI-MS/MS结合气态分段技术在蛋白多肽指纹图谱分析中的应用。
本发明的第二个方面，提供一种对蛋白进行快速肽图分析的方法，其中，所述方法包括如下步骤：
将蛋白样品进行FASP消化获得多肽，将多肽直接引入质谱仪配备的ESI离子源中，通过MS前端的LC系统实现样品的自动化进样，在0～0.5min通过大流速的流动相将样品迅速传输至离子源内；第0.5～4.5min，降低流动相流速，样品缓慢通过离子源后，采集样品的MS1和MS2信息；第4.5～5min，转变为大流速将残留的样品冲洗干净。
在一种实施方式中，其中，进样量为50μL，柱温箱中使用两通连接。
在一种实施方式中，其中，离子源的参数设置如下：正离子模式下采集；喷雾电压：5500V；气帘气(curtain gas)范围25-35MPa；GS1和GS2为15-55MPa；离子源温度：400-550℃，其中，气帘气、GS1、GS2和离子源温度可根据流速大小调整。
在一种实施方式中，其中，MS1和MS2扫描范围：m/z 50-2000；MS1累积时间1-20s；MS2累积时间：50-100ms；碰撞能(CE)值30-40eV，碰撞能量扩展值(CES)10-20eV。
本发明的第三个方面，提供上述方法在含有蛋白或多肽的制剂分析中的应用。
在一种实施方式中，所述制剂包括生物试剂、药品和食品。
本发明相对于现有技术可获得如下有益的效果：
1、本发明中所提供的DI-MS/MS结合气态分段技术可适用于所有蛋白类药物，针对拥有不同氨基酸序列的蛋白类药物，气帘气、GS1、GS2和离子源温度等离子源参数根据样品进样流速进行调整，MS1和MS2扫描范围、CE和CES值可根据多肽样品的分子量范围进行调整。通过计算机辅助所获得的理论酶解肽段和前体离子、碎片离子信息，与DI-MS/MS结合气态分段技术所采集的肽图进行匹配，即可实现所有蛋白类药物的质量分析和控制。
2、本发明中所提供的DI-MS/MS结合气态分段技术单次分析仅需5min，与传统基于LC-MS技术的多肽样品分析相比，极大的提高了分析通量。
3、本发明所提供的DI-MS/MS结合气态分段技术中使用的为高分辨质谱，可以提供更为精确的m/z值信息，精确度可达小数点后四位甚至更多，保障了对蛋白的准确定性。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为通过DI-MS/MS结合气态分段技术获取的HSA胰蛋白酶多肽的MS1指纹图谱(A)和碎片离子散点图(B)；
图2为m/z467-468窗口内前体离子的MS2图谱；
图3为DI-MS/MS结合气态分段技术和LC-MS/MS多肽覆盖率(黑色、黑色加粗和灰色字符分别表示DI-MS/MS结合气态分段技术和LC-MS/MS均可检出、仅LC-MS/MS检出、DI-MS/MS结合气态分段技术和LC-MS/MS均未检出)；
图4为LC-MS/MS获得的HSA胰蛋白酶多肽的提取离子流色谱图；
图5为DI-MS/MS结合气态分段技术(上)和LC-MS/MS(下)的MS1指纹图谱比较；B为DI-MS/MS结合气态分段技术和LC-MS/MS前体离子带电荷数情况；
图6为肽段LC*TVATLR的MS2图谱(上半部分为DI-MS/MS结合气态分段技术中m/z467-468窗口内的MS2图谱，下半部分为LC-MS/MS中前体离子m/z 467.2633的MS2图谱)；
图7为DI-MS/MS结合气态分段技术和LC-MS/MS方法系统比较雷达图；
图8为从PDB获得的HBA和HBB(PDB codes：1A00)的规范序列，以及DI-MS/MS和LC-MS/MS分别捕获的肽；
图9为DI-MS/MS结合气态分段技术和LC-MS/MS前体离子带电荷数情况。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1实验材料和样品的准备
1.1实验材料
标准蛋白人血清白蛋白(human serum albumin，HSA，上海源叶生物科技有限公司)；三氯乙基磷酸酯(TCEP，北京博奥拓达科技有限公司)；碘代乙酰胺(IAA，美国Sigma公司)；尿素(北京化工厂)；碳酸氢铵(NH4HCO3，北京化工厂)；胰蛋白酶(美国普洛麦格公司)。质谱级乙腈(ACN)和甲酸(FA)均购自美国Thermo Fisher公司，去离子水为实验室自制Milli-Q超纯水(18.2MΩ·cm)。
METTLER XS105型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；10kDa超滤管(赛多利斯公司)；MQD-S2P恒温双层摇床摇床(上海旻泉仪器有限公司)。
1.2样品制备
样品制备策略在现有技术[JR,Zougman A,Nagaraj N,MannM.Universal sample preparation method for proteome analysis.NatMethods,2009,6(5):359-62.]的基础上稍作修改，由于该方法的关键是借助过滤装置中纯化蛋白，因此该方法被称为FASP(filter aided sample prep)。将所配置的HSA水溶液于95℃下加热5min，使蛋白变性；随后，加入适量的TCEP溶液(终浓度为10mM)，于67℃下加热反应10min。恢复至室温后，将样品转移至10kDa超滤管中，于13000rpm下离心30min，弃去超滤液。向各超滤管中加入100μL IAA溶液(100mM)，避光反应30min后，13000rpm离心15min，弃去超滤液。先后加入100μL 8M的尿素溶液和200μL 50mM的NH4HCO3溶液，各重复两次，弃去超滤液。更换底部离心管，向超滤管中加入胰蛋白酶溶液(胰酶：蛋白＝1：50)，于200r/min的摇床上酶解16h(37℃)。酶解完成后，于13000rpm离心20min，收集超滤液，即为混合多肽样品。
1.3实验方法：
目前肽图分析的首选方法为LC-MS/MS结合DDA扫描的方法，该方法首先将多肽混合物分离成简单混合物，甚至单一多肽，并通过DDA模式采集MS2信息，无需额外的数据解卷积处理即可实现碎片离子的归属。
为了确认本发明所述方法的有效性及进步性，将1.2获得的混合多肽样品分别使用DI-MS/MS结合气态分段技术法和常规的LC-MS/MS法(对照组)进行分析。
实施例2 DI-MS/MS结合气态分段技术和LC-MS/MS(对照组)测定
2.1 DI-MS/MS结合气态分段技术测定
多肽样品不经色谱柱分离，直接引入SCIEX TripleTOF 6600+质谱仪配备的ESI离子源中。通过MS前端的LC系统实现样品的自动化进样，具体操作如下：流动相泵按照50:50(v/v)的比例传输含0.1％FA的水溶液(A)和含0.1％FA的乙腈溶液(B)，流速梯度为：0～0.5min，50μL/min；0.5～0.51min，50～7μL/min；0.51～4.5min,7μL/min；4.5～4.51min，7～50μL/min；4.51～5min，50μL/min。第一阶段(0～0.5min)通过大流速的流动相将样品迅速传输至离子源内；第二阶段(0.5～4.5min)，降低流动相流速，样品缓慢通过离子源后，采集样品的MS1和MS2信息；第三阶段(4.5～5min)，转变为大流速将残留的样品冲洗干净。进样量为50μL，柱温箱中使用两通连接。离子源参数设置如下：正离子模式下采集；气帘气：25MPa；GS1和GS2：25和15MPa；喷雾电压(spray voltage)：5500V；离子源温度：400℃。MS1和MS2扫描范围均为m/z 100-2000；MS1累计时间：10s；单位质量窗口MS2累计时间：100ms；碰撞能(CE)：35eV；碰撞能量扩展值(CES)：15eV。
2.2 LC-MS/MS测定
相同的多肽样品引入LC-Triple TOF 6600+质谱仪中。色谱柱：Acquity UPLC HSST3色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm，美国Waters公司)；流动相：0.1％(v/v)甲酸水(A)和0.1％(v/v)甲酸乙腈(B)；洗脱程序：0～3min，10％B～15％B；3～13min，15％B～20％B；13～19min，20％B～30％B；19～23min，30％B～95％B；23～25min，95％B；25～25.1min，95％B～10％B；25.1～30min，10％B；流速：0.20mL/min；柱温箱：40℃；进样量：2μL。离子源参数设置如下：正离子模式下采集；气帘气：35MPa；GS1和GS2：55和55MPa；喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃。MS1和MS2扫描范围及碰撞能参数与DI-MS/MS结合气态分段技术一致；MS1累计时间：150ms；MS2累计时间：50ms；以DDA模式采集MS1和MS2信息。
2.3软件辅助的多肽序列鉴定
从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中获取HSA(PDB codes:1BM0)的序列信息，并下载包含蛋白ID和序列等信息的“FASTA”文件。将该文件导入Skyline软件中，派生出HSA经胰蛋白酶特异性水解后所产生的理论肽段，以及对应的前体离子和碎片离子列表。Skyline中肽段设置中酶：胰蛋白酶[KR|P]；最大遗漏的酶解位点数：0；序列长度：6～40个氨基酸；结构修饰：Carbamidomethyl(C)；离子对设置中前体离子电荷数：1～4个；碎片离子类型：A+、X+、B+、Y+、C+和Z+。
DI-MS/MS结合气态分段技术和LC-MS/MS所获取的MS1和MS2谱图信息与Skyline软件所提供的准确m/z值匹配时，将质量偏差设定为±10ppm。
实施例3实验结果
3.1DI-MS/MS结合气态分段技术的多肽表征
DI-MS/MS结合气态分段技术的测定包含MS1全扫描和单位质量窗口内的MS2图谱。为了提高MS1数据质量，MS1光谱采集时间设置为10s。MS1图谱中主要信号出现在m/z467.2622、480.7839、507.3021、569.7515、673.3769、772.4380、789.4710和1013.5991，如图1A所示。进一步我们分析了每个MS1信号的带电荷数，这对于分子式预测和氨基酸序列鉴定具有重要意义。使用天然丰度为1.01％的13C-同位素信号来确认带电状态，具体表现为相关信号与其13C-同位素信号之间的距离为1.000Da，则该离子为单电荷离子；距离为0.500Da对应于双电荷离子，以此类推。以m/z 1013.5991为例，在m/z 1014.6024处观察到同位素信号，表明它应该是单电荷离子，从而计算出分子式为C45H80O14N12。由于m/z481.2850处出现了同位素信号，m/z480.7839被定义为双电荷离子，从而确定元素组成为C44H73O11N13。统计MS1中所有前体离子的带电荷数分布，结果显示共有25个单电荷离子、33个双电荷离子，三电荷离子和四电荷离子较少检出。此外，我们发现同一个多肽可能同时产生不同电荷的前体离子，例如m/z 1000.6041和500.8039对应分子式为C45H81O14N11的多肽的单电荷和双电荷分子离子。所有可检出的MS1信息见表1。
表1
随后，分析DI-MS/MS结合气态分段技术所采集的MS2谱图信息，碎片离子三维散点图见图1B所示。图中显示，大多数碎片离子分布在线性方程y＝0和y＝x之间，y＝x上方的散点表示其是由多电荷前体离子产生的单电荷碎片离子。各MS1前体离子的MS2图谱可通过x＝b线性方程获取，其中b表示所选择的MS1信号的m/z值。该规则实现碎片离子与前体离子的关联，随后将每个MS1-MS2数据与Skyline软件导出的信息对比，进行多肽的结构注释。以m/z467.2622为例，该前体离子产生的所有碎片离子信息均分布在线性方程x＝467.2622上，提取的MS2光谱如图2所示。前体离子及所采集的MS2信号信息与Skyline软件对比，归属各信号的离子类型，最终确定该多肽序列为LC*TVATLR。按照离子命名规则，主要的MS2信号归属为y7 +、y6 +、y5 +、y4 +、z4 +、y3 +、b2 +、y1 +和c1 +(图2)。碎片离子以y+型离子为主，x+型离子在MS2图谱中未检出。
3.2DI-MS/MS结合气态分段技术与LC-MS/MS对比分析
本发明的技术方案通过气态分段技术实现前体离子流的分离，随后具有相同表观分子量的离子进入碰撞池，产生高质量的MS2图谱。尽管DI-MS/MS结合气态分段技术本质上是DIA模式，但由于胰蛋白酶肽来源于单一蛋白质，单位质量窗口内通常仅包含单一多肽的准分子离子峰，因此，可以实现碎片离子与前体离子间的对应关系。
通过Skyline软件导出来源于HSA经胰蛋白酶酶解产生的41个理论多肽(图3)，通过DI-MS/MS结合气态分段技术中所采集的MS1-MS2信息(表1)和Skyline软件计算的信息匹配分析，共计检出35个多肽(ALVLIAFAQYLQQC*PFEDHV，HPYFYAPELLFFAK，VHTEC*C*HGDLLEC*ADDR，SHC*IAEVENDEMPADLPSLAADFVESK，EFNAETFTFHADIC*TLSEK和ETC*FAEEGK未检出)，而使用LC-MS/MS分析方法获取HSA的胰蛋白酶水解后的多肽混合样品(图4)，将每个MS1-MS2信息与Skyline软件导出信息对比后，共检出了38个胰蛋白酶肽段，与DI-MS/MS结合气态分段技术所取得的结果对比，多肽HPYFYAPELLFFAK、VHTEC*C*HGDLLEC*ADDR和ETC*FAEEGK片段被额外检出。
两种分析方法所得到的MS1图谱对比见图5。其中LC-MS/MS中的MS1图谱对应于整个洗脱时间(0-25min)的平均图谱。图中显示，具有较大m/z值的信号在DI-MS/MS结合气态分段技术中响应较优。DI-MS/MS结合气态分段技术中检出25个单电荷离子和33个双电荷离子，LC-MS/MS中检出31个单电荷离子和38个双电荷离子，结果基本一致。LC-MS中分别检出21个三电荷离子和5个四电荷离子信号，而DI-MS/MS结合气态分段技术中仅检出3个三电荷离子，无四电荷离子检出。DI-MS/MS结合气态分段技术与LC-MS/MS间不同的电荷数目可能是由于样品未经色谱分离，直接注入ESI离子源中，离子化竞争和与基质效应相关的离子化抑制作用更为明显。
DI-MS/MS结合气态分段技术与LC-MS/MS中MS2图谱基本一致。以LC*TVATLR为例(图6)，大多数碎片离子离子，如DI-MS/MS结合气态分段技术中m/z 820.4347、660.4043、559.3561、460.2875、389.2515、274.1227、175.1190和131.1182在LC-MS/MS中均有检出。由于这些MS2信号对多肽序列的鉴定具有决定性作用，因此DI-MS/MS结合气态分段技术与LC-MS/MS策略在多肽结构鉴定方面具有可比性。综合MS1和MS2图谱来看，这两种方法在肽段覆盖率方面具有可比性。
从分析耗时来看，DI-MS/MS结合气态分段技术和LC-MS/MS的数据处理工作量(主要是将MS2信息与前体离子关联起来)将分别花费4h和10h。除此之外，对比了两种分析方法的样品单次分析时间、溶剂消耗量和进样量。DI-MS/MS结合气态分段技术单次采集仅需5min，并且只消耗了50μL溶剂用于清洗管路，而LC-MS/MS单次分析需30min，共消耗了6000μL流动相，表明DI-MS/MS结合气态分段技术是一种高通量且更为经济的分析方法。另一方面，LC-MS/MS仅需2μL样品，而DI-MS/MS结合气态分段技术单次进样量为50μL。图7为两种分析方法的系统比较示意图。以上结果显示，DI-MS/MS结合气态分段技术策略可实现与LC-MS相似的多肽结构鉴定功能，并且显著缩短实验时间和成本，以及仅需更少的样本量即可实现多肽结构的分析，相对于LC-MS技术来说是一种更为优选的多肽结构分析工具。
实施例4普适性验证
上文以HSA为例，对比DI-MS/MS和LC-MS采集策略下的多肽序列覆盖率、MS1和MS2图谱，探究DI-MS/MS结合气态分段技术是否可作为LC-MS的替代分析方法，应用于多肽指纹图谱研究中。研究结果显示DI-MS/MS结合气态分段技术可以实现蛋白样品的定性分析。为了进一步说明本发明所述方法的普适性，采用上述分析方法进一步采集分析人血红蛋白的肽谱。
结果如下表2以及图8所示，其中，图8展示的为从PDB数据库获得的HBA和HBB序列(PDB codes：1A00)的规范序列，以及DI-MS/MS和LC-MS/MS捕获的肽，结果显示，Skyline中得到的14个理论肽段中，DI-MS/MS气态分段技术可实现13个肽段(浅灰下划线字符)的检出(仅LLGNVLVC*VLAHHFGK未检出)，满足分析所用的肽段覆盖率的要求；图9显示，DI-MS/MS气态分段技术和LC-MS中[M+H]+、[M+2H]2+、[M+3H]3+及[M+4H]4+型前体离子数目分别为4、11、7、3和8、13、13、8；两者二级碎片较为一致，以Y+型碎片离子为主。该结果与HSA一致，提示DI-MS/MS气态分段技术可广泛应用于蛋白类药物的快速肽谱分析。
表2
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (1)
1.一种对蛋白进行快速肽图分析的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
多肽样品不经色谱柱分离，直接引入SCIEX TripleTOF 6600+质谱仪配备的ESI离子源中，通过MS前端的LC系统实现样品的自动化进样，具体操作如下：流动相泵按照体积比50 :50的比例传输含0.1% FA的水溶液和含0.1% FA的乙腈溶液，流速梯度为：
第一阶段：0~0.5 min，50 μL/min；
第二阶段：0.5~0.51 min，50~7 μL/min；0.51~4.5 min, 7 μL/min；
第三阶段：4.5~4.51 min，7~50 μL/min；4.51~5 min，50 μL/min，
其中，第一阶段通过大流速的流动相将样品迅速传输至离子源内；第二阶段降低流动相流速，样品缓慢通过离子源后，采集样品的MS1和MS2信息；第三阶段转变为大流速将残留的样品冲洗干净；
进样量为50 μL，柱温箱中使用两通连接；
离子源参数设置如下：正离子模式下采集；气帘气：25 MPa；GS1和GS2：25和15 MPa；喷雾电压：5500 V；离子源温度：400 ℃，MS1和MS2扫描范围均为m/z 100-2 000；MS1累计时间：10 s；单位质量窗口MS2累计时间：100 ms；碰撞能：35 eV；碰撞能量扩展值：15 eV。
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