CN117186185A - 一种蜈蚣特征肽段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜈蚣特征肽段及其应用，本发明通过大量实验筛选，获得序列为LPDGAELLLGPLK的蜈蚣特征肽，该蜈蚣特征肽具有很高的专属性，可用于鉴别含有蜈蚣药材的样品，特别是失去外观特点的标准汤剂、配方颗粒样品。本发明提供的蜈蚣特征肽的鉴别检测方法，通过对供试品溶液制备方式的考察和色谱条件的优化筛选出最佳检测条件，方法操作简单，对不同种类动物药及非药典基原蜈蚣具有明显区分能力，经过方法学验证，重现性、稳定性、耐用性均较好。应用上述特征肽鉴别蜈蚣，有利于蜈蚣药品的质量控制，对于蜈蚣药材、饮片、制剂成品的真伪鉴别以及质量保证具有重要的意义。

Description

一种蜈蚣特征肽段及其应用

技术领域

本发明涉及一种蜈蚣药材的鉴别方法，尤其涉及一种蜈蚣特征肽段及应用该特征肽段鉴别检测蜈蚣成分的方法。

背景技术

蜈蚣是蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)的干燥体，以全虫入药，是中医传统上一味较为常用的动物药材。

中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，相比于传统饮片汤剂具有方便携带，使用简单的特性。蜈蚣配方颗粒是蜈蚣、寻骨风等多种药材经过高温提取、浓缩、干燥、制粒而成，保留了蜈蚣的临床效果，同时兼顾了使用的便携性。

蜈蚣药材的鉴别方法已有部分报道。2020版《中国药典》仅收录了蜈蚣药材的性状鉴别，专属性不强，也不适用于蜈蚣成品制剂。也有文献报道(杨成俊,周伟庆.蜈蚣及其混淆品的鉴别研究[J].安徽农业科学,2011,39(25):2.)，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对蜈蚣药材及其混淆品进行区分鉴别，该方法操作复杂，检测效率较低；除此之外，COI序列的DNA条形码技术可用于鉴别蜈蚣药材混伪品(张红印,陈俊,贾静,等.中药材蜈蚣及其混伪品DNA条形码鉴别研究[J].中国中药杂志,2014,39(12):4.)，但是中药高温提取过程会影响DNA的完整性，进而影响DNA条形码鉴定的准确性。

相较于DNA分子，蛋白质、肽类成分的一级序列信息在高温提取条件下保存较好，可作为蜈蚣药材及其成品制剂的混伪品鉴别，尤其对于蜈蚣配方颗粒这种经过水提取的样品更加具有优势。李彦超等人筛选出三个特征肽用于蜈蚣药材混伪品的区分(李彦超,胡靓君,张琪,等.UFLC-MS/MS法分析蜈蚣中3种多肽成分以及在蜈蚣鉴别中的应用[J].南京中医药大学学报,2022,38(10):8.)，但是对于配方颗粒成品制剂并未进行区别研究，申请人采用该文献中的特征肽和方法对蜈蚣配方颗粒进行检测，结果表明3种特征肽在配方颗粒中均未检出，表明该文献中的特征肽和鉴别方法对于缺少外观性状的配方颗粒或成品制剂并不适用(见图1)。这主要是由于配方颗粒成品是由多种药材原料提取浓缩加工制成，因此配方颗粒成品中的多肽或其他组分种类繁多且浓度更高，对于蜈蚣混伪品的鉴别干扰较大，鉴别较为困难。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种蜈蚣特征肽段，解决现有特征肽段无法同时用于单一蜈蚣药材和成品制剂的混伪品鉴别的问题。本发明的另一目的在于提出一种蜈蚣特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，解决现有鉴别方法操作复杂、检测效率较低及准确性低的问题。

技术方案：本发明所述的一种蜈蚣特征肽段，其氨基酸序列包括：Leu-Pro-Asp-Gly-Ala-Glu-Leu-Leu-Leu-Gly-Pro-Leu-Lys。

本发明所述的一种上述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，包括如下步骤：

(1)将特征肽配成对照品参照溶液；

(2)将蜈蚣酶切后制备对照药材参照溶液；

(3)将待检样品酶切后制备待检样品酶解液；

(4)采用液相色谱-质谱联用方法分别检测待检样品酶解液、对照药材参照溶液和对照品参照溶液，比较待检样品酶解液、对照药材参照溶液和对照品参照溶液的离子对和离子保留时间，根据比较结果鉴别待检样品中的蜈蚣成分。

优选地，所述离子对中母离子为m/z 668.4和m/z 861.7，母离子带双电荷，子离子为m/z611.9和m/z414.4。该特征离子均能在不同批次的蜈蚣质谱图中检测，且响应较高，故选作蜈蚣特征肽的特征离子。

优选地，所述步骤(4)中根据比较结果鉴别待检样品中的蜈蚣成分的具体方法为：如果待检样品酶解液中检测出所述离子对，且离子的保留时间与对照药材参照溶液和对照品参照溶液一致，待检样品酶解液的子离子与对照药材参照溶液和对照品参照溶液的子离子一致，则所述待检样品中含有蜈蚣成分。

优选地，所述待检样品为蜈蚣干品或制剂成品。本发明中的鉴别方法不仅可以鉴别单一蜈蚣药材的真伪，还可以鉴定蜈蚣制剂成品中是否含有蜈蚣成分。

优选地，所述步骤(2)和步骤(3)中酶切的方法为：将蜈蚣或待检样品加入缓冲液中进行提取操作，提取液中加入蛋白酶，恒温酶解即得。本发明中蛋白酶可选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等，通过蛋白酶将蛋白质水解为多肽段，用于后续步骤的检测。

优选地，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，按料液比0.2-1g/50mL将蜈蚣或待检样品加入Tris-HCl缓冲液；所述提取方法为：将混合有蜈蚣或待检样品的Tris-HCl缓冲液超声或回流提取15-60min。

优选地，所述蛋白酶恒温酶解的方法为：将所述提取液过滤后加入胰蛋白酶溶液，恒温水浴酶解，加入三氟乙酸终止反应，脱盐，挥干，加水复溶后离心取上清即得。

优选地，所述液相色谱-质谱联用方法的液相色谱条件为：以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱：0-2min，10→25％A，2-4min，25→80％A，4-5min，80％A，5-6min，80→10％A。

优选地，所述液相色谱-质谱联用方法的质谱参数为：电喷雾离子化为正离子模式，喷雾电压为2.5kV，离子传输毛细管温度为200℃；MRM模式的离子对为：m/z 668.4双电荷→611.9，DP＝94，CE＝35、m/z688.4双电荷→414.4，DP＝96，CE＝44。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明的特征肽专属性强，可同时用于单一蜈蚣药材和成品制剂的混伪品鉴别；本发明应用该特征肽构建的蜈蚣成分鉴别方法操作简单，经过方法学验证，重现性、稳定性、耐用性均较好，检测效率高，有利于蜈蚣药品的质量控制，对保证蜈蚣药品的质量具有重要意义。

附图说明

图1为蜈蚣药材、蜈蚣配方颗粒3种特征肽质谱图；

图2为蜈蚣配方颗粒、蜈蚣对照药材、特征肽对照品与辅料的质谱图；

图3为688.1→862.8特征离子对检测结果图；

图4为蜈蚣配方颗粒与不同动物药及伪品蜈蚣的质谱图；

图5为蜈蚣特征离子筛选质谱图；其中，上图为特征肽的一级质谱图；下图为特征肽的二级质谱图；

图6为不同色谱柱耐用性考察质谱图；

图7为不同柱温耐用性考察质谱图；

图8为不同流速耐用性考察质谱图；

图9为不同液质联用仪耐用性考察质谱图；

图10为本发明中特征肽的总离子流图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1：蜈蚣配方颗粒与不同动物药及伪品蜈蚣特征肽段检测

本实施例提供了一种蜈蚣样品的特征肽段的检测方法，其中蜈蚣样品可为蜈蚣药材及其制剂成品，本实施例中采用的特征肽段序列为：Leu-Pro-Asp-Gly-Ala-Glu-Leu-Leu-Leu-Gly-Pro-Leu-Lys。下面以蜈蚣配方颗粒为例，其特征肽段检测方法包括以下步骤：

1、参照物溶液的制备：

取蜈蚣对照药材(批号：400015-202108，上海鸿永)1g，至具塞锥形瓶中，加水10mL，浸泡30分钟，加热回流30分钟，用微孔滤膜滤过，取续滤液0.2mL，置离心管中，加入50mmol/L Tris-HCl缓冲液1.0mL，加胰蛋白酶溶液100μL(取测序级胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含0.1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，加入10％三氟乙酸50μL，脱盐，挥干，加水100μL复溶，离心(每分钟12000转)10分钟，取上清液，作为对照药材参照溶液。取蜈蚣特征肽对照品加水配成200ng/mL的溶液，作为对照品参照溶液。

2、供试品溶液的制备：

供试品：蜈蚣配方颗粒(江阴天江药业有限公司生产提供，批号21090409，21090419，21090429)及其他样品，如辅料(麦芽糊精、二氧化硅)，哈氏蜈蚣，九香虫，全蝎，桑螵蛸，壁虎，水牛角，鹿角。

分别取供试品约0.2g，至具塞锥形瓶中，加入50mmol/L Tris-HCl缓冲液50mL，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，用微孔滤膜滤过，取续滤液1mL置离心管中，加胰蛋白酶溶液100μL(取测序级胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含0.1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，加入10％三氟乙酸50μL，脱盐，挥干，加水100μL复溶，离心(每分钟12000转)10分钟，取上清液，即得待检样品酶解液，作为供试品溶液。

将上述制备的供试品溶液以及参照物溶液各10μL，分别注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。

其中，液相条件参数：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表中规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温为35℃。

表1液相条件参数

采用三重四极杆质谱，质谱参数为：电喷雾离子化(ESI)正离子模式，喷雾电压为2.5kV，离子传输毛细管温度为200℃；MRM模式的离子对为：m/z 668.4双电荷→611.9，DP＝94，CE＝35、m/z 688.4双电荷→414.4，DP＝96，CE＝44。结果见图2和图3。

由图2、图3可见，蜈蚣样品中可检测出与蜈蚣对照药材参照溶液和蜈蚣特征肽对照品参照溶液一致的离子峰，其他样品，如辅料，哈氏蜈蚣，九香虫，全蝎，桑螵蛸，壁虎，水牛角，鹿角均未检出该特征肽的离子峰。表明该特征肽段具有较好的专属性，能显著区分不同动物药和伪品蜈蚣。

实施例2：蜈蚣配方颗粒特征肽段检测方法的建立及其方法学研究

本实施例用于确认蜈蚣样品的特征肽段检测方法的最优方案，具体包括特征肽段离子的筛选，供试品溶液制备的方案对比，选出最优特征肽离子和供试品制备方案；并对最优方案分别进行专属性、精密性、稳定性、重复性、耐用性的考察。

1.仪器与试剂

仪器：AB SCIEX Triple Quad^TM5500plus三重四极杆液质联用仪(AB SCIEX公司)，Waters UPLC-Xevo TQ-S micro三重四极杆液质联用仪(沃特世公司)，Waters ACQUITYBEH C18色谱柱(2.1mm×150mm，1.7μm)，Waters ACQUITY HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm)，Agilent ZORBAXSB C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm)，电热恒温水浴锅(HWS-28型，上海一恒科学仪器有限公司)；数控超声波清洗器(KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司)；药品稳定性验箱(SHH-250SD，重庆市永生实验仪器厂)；万分之一天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)；百万分之一天平(XP26，梅特勒-托利多公司)；超纯水系统(Milli-QDirect，默克股份有限公司)。

试剂：胰蛋白酶(批号：0000531898，Promega公司，测序级)；乙腈(批号：SY21908005，默克公司，色谱级)；碳酸氢铵(批号：79060010，CNW，色谱级)；Tris-HCl(批号：YT1010-500，翼飞雪生物科技有限公司)；甲酸(批号：82940090，CNW，色谱级)；水为超纯水(实验室自制)。

蜈蚣对照药材(批号：400015-202108，上海鸿永)；

蜈蚣配方颗粒由江阴天江药业有限公司提供。

2.特征肽离子的筛选

使用Thermo Q-Exactive Plus高分辨液质联用仪采集经胰蛋白酶酶解后溶液的一级和二级质谱数据。色谱条件与质谱条件如下。将所采集的质谱数据在Thermo Xcalibur质谱软件上进行筛选对比，提取蜈蚣质谱图中存在的特征多肽。

色谱条件：戴安U3000 NanoRSLC纳升液相系统，色谱柱为5μm Reprosil C18AQ(75μm×150mm)，LC-MS/MS质谱系统分析样品。用初始流动相复溶蜈蚣对照药材溶液，调整多肽浓度为1μg/μL，上样2μL，流速400nL/min，流动相A(乙腈/甲酸/水＝2/0.2/98，v/v/v)，流动相B(乙腈/甲酸/水＝80/0.2/20，v/v/v)，2～30％B线性梯度洗脱90min。

质谱条件：Thermo Q-Exactive Plus质谱仪用于进行肽段分析，喷雾电压为2.5kV，离子传输毛细管温度为200℃；质谱一级全扫描范围为m/z 300～2000，分离宽度为3；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离(CID)二级串联质谱，每个样品重复进样1次。采用Xcalibur(3.0.63)软件进行数据采集。

数据分析：串联质谱数据用PEAKS 8.5软件进行搜库分析，选择节肢动物门蛋白质数据库，检索参数设置为：前体离子误差10；子离子误差1；翻译后修饰(PTM)的设置参数为：固定PTM为：半胱氨酸的氨甲酰甲基化(+57.02)；可变PTM为：甲硫氨酸的氧化(+15.99)；脯氨酸的羟基化(+15.99)；天门冬酰胺与谷氨酰胺的脱酰胺(+0.98)；允许2个位点误切，假阳性率(FDR)≤1％；选择胰蛋白酶酶切(Trypsin)；De novo sequence(从头测序)测定的肽段选择ALC(Average Local Confidence)得分≥90％；其他为默认参数，在上述检索条件下所得分值有显著性意义(P<0.05)被认定为有效的鉴定结果。

前期筛选出的特征肽688.1→862.8，能够区分与蜈蚣不同种属的动物药，例如水牛角，但是对于蜈蚣近似品，无法进行有效区分(见图4)，后续通过对特征肽响应的优化和进一步的筛选，筛选出(m/z)668.4(双电荷)→611.9，(m/z)861.7(双电荷)→414.4特征离子均能在不同批次的蜈蚣质谱图中检测，且响应较高，不仅能够区分不同种属动物药，同时能够对蜈蚣近似品进行区分，故选作蜈蚣特征肽的特征离子(见图5和图10)。

3.检测条件

使用三重四级杆液质联用仪对其二级离子的质谱条件进行优化和选择，筛选出响应较高的二级离子，分别为蜈蚣多肽(m/z)668.4(双电荷)→611.9，(m/z)668.4(双电荷)→414.4。最终采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(ESI⁺)，进行多反应监控扫描(MRM)，以建立蜈蚣配方颗粒的色谱与质谱条件。

色谱条件：采用Waters ACQUITY BEH C18(100mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按表1中规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.3mL；柱温为35℃；进样量为10μL。

质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)，进行多反应监测(MRM)，以质荷比(m/z)668.4(双电荷)→611.9，(m/z)668.4(双电荷)→414.4作为检测离子对进行检测。按上述检测离子对测定的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1。

表2梯度洗脱表

4.供试品溶液的制备

4.1不同提取溶剂的考察

取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，平行两组，每组两份，加入50mmol/LTris-HCl缓冲液50mL，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)、加热回流30分钟，放冷，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，移取1mL置进样瓶中，加胰蛋白酶溶液100μL(取测序级胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含0.1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，加入10％三氟乙酸50μL，使用Seppak脱盐，挥干，加入100μL纯水复溶，离心(每分钟12000转)10分钟，取上清液，即得。进样分析，记录峰面积，并计算“峰面积/称样量”，实验结果见表3。

表3不同提取方式质谱鉴别测定结果

结果显示，超声提取与加热回流提取离子对的“峰面积/称样量”比值差异不大，为了实验操作方便，故选择超声提取方式。

4.2不同提取时间的考察

取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，平行三组，每组两份，置具塞锥形瓶中，加入50mmol/L Tris-HCl缓冲液50mL，超声处理(功率250W，频率50kHz)15分钟、30分钟、60分钟，放冷，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，精密移取续滤液1mL，加入胰蛋白酶溶液100μL(取测序级胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含0.1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，加入10％三氟乙酸50μL，使用Seppak脱盐，挥干，加入100μL纯水复溶，离心(每分钟12000转)10分钟，取上清液，即得。进样分析，记录峰面积，并计算“峰面积/称样量”，实验结果见表4。

表4不同提取时间质谱鉴别测定结果

结果显示：不同的提取时间对监测离子的“峰面积/称样量”比值差异不明显，为了充分提取，故选择超声提取时间为30分钟。

4.3不同胰蛋白酶用量的考察

取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，平行四组，每组两份，置具塞锥形瓶中，加入50mmol/L Tris-HCl缓冲液50mL，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，放冷，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，精密移取续滤液1mL，共四组，每组分别加入胰蛋白酶溶液50μL，100μL，200μL，500μL(取测序级胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含0.1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，加入10％三氟乙酸50μL，使用Seppak脱盐，挥干，加入100μL纯水复溶，离心(每分钟12000转)10分钟，取上清液，即得。进样分析，记录峰面积，并计算“峰面积/称样量×稀释倍数”，实验结果见表5。

表5不同胰蛋白酶加入量的质谱鉴别测定结果

结果显示，50、100、200μL的胰蛋白酶加入量对应的“峰面积/称样量×稀释倍数”值差异不大，500μL加酶量显示出降低的趋势，故选择100μL作为胰蛋白酶的加入量。4.4供试品溶液制备方法的确定

取本品适量，研细，取约0.2g，至具塞锥形瓶中，加入50mmol/L Tris-HCl缓冲液50mL，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，用微孔滤膜滤过，取续滤液1mL置离心管中，加胰蛋白酶溶液100μL(取测序级胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含0.1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，加入10％三氟乙酸50μL，脱盐，挥干，加水100μL复溶，离心(每分钟12000转)10分钟，取上清液，作为供试品溶液。

5.方法学研究

5.1专属性考察

供试品溶液的制备：称取蜈蚣配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，按正文确定的供试品溶液制备方法制备成蜈蚣配方颗粒供试品溶液；取阴性溶液，同法制成缺蜈蚣配方颗粒的阴性溶液和不同物种的供试品溶液。

精密吸取上述溶液各10μL，注入液质联用仪，按照正文色谱条件与质谱条件测定，结果见图2、图3。

结果显示：缺蜈蚣的阴性样品、不同物种的阴性样品在供试品溶液图谱与对照药材参照物色谱相应的保留时间处未检出特征离子峰，表明阴性样品对方法中特征离子对的检出无干扰，方法具有专属性。

5.2精密度考察

取同一批号样品，按供试品溶液制备方法制备成供试液，连续进样6次，记录峰面积，计算峰面积RSD值，结果见表6。

表6蜈蚣配方颗粒特征图谱精密度结果表(峰面积)

结果显示，同一份供试品溶液连续进样6次，特征离子对的峰面积RSD值均小于3.0％，表明仪器精密度良好。

5.3稳定性考察

取蜈蚣配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，按正文供试品溶液制备方法制备蜈蚣供试品溶液，分别在0，2，4，8，10，12小时精密吸取，10μL注入液质联用仪，以离子对的峰面积对溶液稳定性进行评价，结果见表7。

表7蜈蚣配方颗粒稳定性考察结果

结果显示，供试品溶液在常温下放置12小时，蜈蚣多肽的特征离子的峰面积均能明显检出，且12小时内稳定。结果表明供试品溶液在常温下放置12小时内，不影响特征离子的鉴别。

5.4重复性考察

取蜈蚣配方颗粒适量，研细，称取约0.2g，精密称定，平行称定6份，按正文确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液6份。按正文条件测定，计算“峰面积/称样量”比值的RSD值，测定结果见表8。

表8重复性考察结果

结果显示，同一批样品重复测定6次，“峰面积/称样量”比值的RSD值均小于4.0％，表明该方法重复性良好。

5.5耐用性考察

(1)色谱柱考察

比较了Waters BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)，Agilent ZORBAX SB C18(2.1mm×100mm，1.8μm)，WatersACQUITY HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)3种不同品牌和类型的色谱柱对蜈蚣配方颗粒特征离子峰的检出影响。

取蜈蚣配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，按正文项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取10μL注入液质联用仪，按正文条件进行测定，实验结果见表9、图6。

表9蜈蚣配方颗粒不同色谱柱耐用性考察峰面积结果

结果显示：不同品牌的色谱柱均能明显检出规定的特征离子对，表明不同牌子和型号的色谱柱对蜈蚣的特征离子的检出鉴别无影响。

(2)柱温考察

比较30℃、35℃、40℃不同柱温对蜈蚣配方颗粒特征离子峰的检出影响。

取蜈蚣配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，按正文确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取10μL注入液质联用仪，除柱温分别为30℃、35℃、40℃外，其余条件均按正文条件进行测定，实验结果见表10、图7。

表10蜈蚣配方颗粒不同柱温耐用性考察峰面积结果

结果显示：柱温在±5℃变化范围内均能明显检出规定的特征离子对，表明柱温的小范围调整对蜈蚣的特征离子的检出鉴别无影响。

(3)流速考察

比较0.25mL/min、0.30mL/min、0.35mL/min不同流速对蜈蚣配方颗粒特征离子峰的检出影响。

取蜈蚣配方颗粒适量，研细，取约0.2g，精密称定，按正文确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取10μL注入液质联用仪，除流速分别为0.25mL/min、0.30mL/min、0.35mL/min外，其余条件均按正文条件进行测定，实验结果见表11、图8。

表11蜈蚣配方颗粒不同流速耐用性考察峰面积结果

结果显示，不同的流速条件下，均能明显检出蜈蚣配方颗粒规定的特征离子对，表明流速的小范围调整对蜈蚣的特征离子的检出鉴别无影响。

(4)不同液质联用仪考察

考察使用不同牌子的液质联用仪(Waters UPLC-Xevo TQ-S micro三重四极杆液质联用仪与AB SCIEX Triple Quad^TM5500plus三重四极杆液质联用仪)对蜈蚣配方颗粒特征离子峰的检出影响。

取蜈蚣配方颗粒适量，研细，称取约0.2g，精密称定，按正文项下确定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取10μL注入液质联用仪，按正文条件进行测定，实验结果见表12、图9。

表12蜈蚣配方颗粒不同仪器耐用性考察峰面积结果

结果显示：使用两种不同品牌的三重四级杆液质联用仪，蜈蚣配方颗粒的特征离子对能明显检出。

Claims (10)

1.一种蜈蚣特征肽段，其特征在于，特征肽的氨基酸序列包括：Leu-Pro-Asp-Gly-Ala-Glu-Leu-Leu-Leu-Gly-Pro-Leu-Lys。

2.一种如权利要求1所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用。

3.根据权利要求2所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将特征肽配成对照品参照溶液；

(2)将蜈蚣酶切后制备对照药材参照溶液；

(3)将待检样品酶切后制备待检样品酶解液；

(4)采用液相色谱-质谱联用方法分别检测待检样品酶解液、对照药材参照溶液和对照品参照溶液，比较待检样品酶解液、对照药材参照溶液和对照品参照溶液的离子对和离子保留时间，根据比较结果鉴别待检样品中的蜈蚣成分。

4.根据权利要求3所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，所述离子对中母离子为m/z 668.4和m/z 861.7，母离子带双电荷，子离子为m/z611.9和m/z414.4。

5.根据权利要求3所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，所述步骤(4)中根据比较结果鉴别待检样品中的蜈蚣成分的具体方法为：如果待检样品酶解液中检测出所述离子对，且离子的保留时间与对照药材参照溶液和对照品参照溶液一致，待检样品酶解液的子离子与对照药材参照溶液和对照品参照溶液的子离子一致，则所述待检样品中含有蜈蚣成分。

6.根据权利要求3所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，所述待检样品为蜈蚣干品或制剂成品。

7.根据权利要求3所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中酶切的方法为：将蜈蚣或待检样品加入缓冲液中进行提取操作，提取液中加入蛋白酶，恒温酶解即得。

8.根据权利要求7所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，按料液比0.2-1g/50mL将蜈蚣或待检样品加入Tris-HCl缓冲液；所述提取方法为：将混合有蜈蚣或待检样品的Tris-HCl缓冲液超声或回流提取15-60min。

9.根据权利要求7所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，所述蛋白酶恒温酶解的方法为：将所述提取液过滤后加入胰蛋白酶溶液，恒温水浴酶解，加入三氟乙酸终止反应，脱盐，挥干，加水复溶后离心取上清即得。

10.根据权利要求3所述特征肽段在鉴别蜈蚣中的应用，其特征在于，步骤(4)中所述液相色谱-质谱联用方法的液相色谱条件为：以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱：0-2min，10→25％A，2-4min，25→80％A，4-5min，80％A，5-6min，80→10％A；所述液相色谱-质谱联用方法的质谱参数为：电喷雾离子化为正离子模式，喷雾电压为2.5kV，离子传输毛细管温度为200℃；MRM模式的离子对为：m/z 668.4双电荷→611.9，DP＝94，CE＝35、m/z688.4双电荷→414.4，DP＝96，CE＝44。