CN115201385B - 一种使氨基小分子携带两个电荷的电喷雾质谱检测用衍生化试剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使氨基小分子携带两个电荷的电喷雾质谱检测用衍生化试剂及其制备方法和应用，其为多肽衍生化物，所述多肽由六个非酸性氨基酸组成，其C端为赖氨酸，采用本发明提供的衍生化试剂，与待测物形成的衍生物既可以通过电荷(2+)提高选择性，也可以通过其特征性的二级图谱提高选择性，促进液质联用技术在具有氨基基团的化合物小分子方面的检测和应用，本发明方法还具有特异性强、线性范围宽、灵敏度高、操作简便、安全性好等优点，使得液质联用技术在检测氨基小分子化合物方面有了进一步的发展。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，尤其适用于含氨基小分子物质的液质检测技术领域，具体涉及一种电喷雾质谱检测用衍生化试剂及其制备方法和应用。
背景技术
质谱分析是一种测量离子质荷比(质量-电荷比，m/z)的分析方法。质谱分析的基本原理是，在离子源中试样中的各组分发生电离，形成不同质荷比的带电离子，在加速电场的作用下，形成离子束，进入质量分析器，根据质荷比不同，得到质谱图。
液质联用技术(LC-MS)又称为液相色谱-质谱联用技术，其中液相色谱部分作为分离系统，质谱部分作为检测系统。通过液相色谱部分的色谱柱，对待测样品进行分离，经过离子源离子化后，进入质谱部分，离子碎片按照m/z分离，经检测器得到质谱图。液质联用技术充分结合色谱与质谱的优势，即将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱的高选择性、高灵敏度以及能够提供相对分子量与结构信息的优势相结合，展现出卓越的分离分析能力，在药物分析、食品分析和环境分析等多领域得到了广泛的应用。如：分析中药的成分、控制中药的质量、筛选中药的有效成分、研究血液中的中药成分等，同时可建立数据库检索系统，对于深度挖掘液质数据，高效解析结构，表征中药作用的物质基础具有重要意义；LC-MS技术应用于农药残留检测、兽药残留检测、毒素检测和保健品功效成分的检测，与传统检测技术相比，提高了检测的效率和准确性，弥补了传统检测技术的不足。
在生命医学领域，机体内存在多种含有氨基的小分子化合物，例如神经递质、多肽、氨基酸等，这些化合物参与了人体生长、发育、免疫调节、神经调节和新陈代谢等生理活动，发挥着重要的生理功能，与多种疾病密切相关。在采用LC-MS技术对这些物质进行检测时，由于存在大量的内源性代谢产物，使得氨基小分子检测结果并不理想。并且这些内源性代谢产物在ESI离子源中通常仅能形成单电荷，若能使待测物形成多电荷，就可以利用高分辨质谱的电荷选择特性，极大地降低内源性待测物的干扰。
有鉴于此，亟需发明一种能够使待测物形成多电荷的衍生化试剂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存着的缺陷，提供一种电喷雾质谱检测用衍生化试剂，其可以使含有氨基的小分子化合物在ESI源中带有特征性的双电荷(2+)，从而提高液质检测技术对含氨基的生物小分子化合物的选择性，降低干扰。并同时提供其制备方法以及在质谱检测中的应用。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一方面提供了一种电喷雾质谱检测用衍生化试剂，其为多肽衍生化物，所述多肽由6个非酸性氨基酸组成，其中仅有一个碱性氨基酸，其C端为赖氨酸。
作为本发明的优选实施方案，所述多肽衍生化物包括但不限于LPFYFK、WTTFLK、LPPWLK。
作为本发明的优选实施方案，所述多肽衍生化物由所述多肽以及连接于所述多肽羧基端的琥珀酰亚胺基构成。
本发明第二方面提供了上述电喷雾质谱检测用衍生化试剂的制备方法，其包括：将所述多肽衍生化物加入到pH为5.5-6.5的2-吗啉乙磺酸-氯化钠缓冲溶液中配制成多肽溶液，再加入肽偶联EDC，之后加入N-羟基琥珀亚酰胺，15～35℃下反应10～30min，而后加入2-巯基乙醇终止反应，最后采用脱盐柱分离纯化，即得。
作为本发明的一些优选实施方案，所述多肽衍生化物与所述N-羟基琥珀酰亚胺和肽偶联剂的质量摩尔比为10mg:4.5～6.0mM:1.8～2.2mM。
本发明第三方面提供了一种上述电喷雾质谱检测用衍生化试剂在含氨基的生物小分子化合物液质检测中的应用。
本发明第四方面提供了一种上述电喷雾质谱检测用衍生化试剂使含氨基的生物小分子化合物带双电荷的应用。
本发明第五方面提供了一种含氨基的小分子化合物的液质检测方法，其具体包括如下步骤：
S1：称取待测样品，去除样品中的蛋白质等干扰物质；
S2：向处理好的待测样品中，加入溶剂和如权利要求1或2中所述的衍生化试剂，进行衍生化处理；
S3：在低温条件下，采用氮气蒸发溶剂；
S4：采用流动相复溶样品，涡旋3min，离心10min，取上清，进入LC-MS系统，在正离子模式下，采集质谱数据进行分析。
作为本发明的一些优选实施方案，所述步骤S2中的溶剂为THF，所述步骤S2中衍生化试剂的加入量为样品的8～12倍。
作为本发明的一些优选实施方案，所述步骤S2衍生化处理条件为55～65℃，0.5～1.5h。
作为本发明的一些优选实施方案，所述步骤S3低温为2～5℃。
作为本发明的一些优选实施方案，所述步骤S4中分析包括分析基准分子离子峰[M+2H]2+和/或二级图谱。
在本发明中，衍生化试剂生成反应和待测物衍生化反应的反应式如下(以LPFYFK为例)：
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明所提供的衍生化试剂，可以与含有伯胺或仲胺的生物小分子化合物发生反应，生成衍生化合物。衍生化合物进入到质谱的ESI电离源中，在电离作用下，将携带两个电荷，高分辨质谱可以通过选择检测电荷量为+2的离子的方式，提高质谱对化合物的选择性，另外，所生成的二级质谱谱图，存在明显的特征性碎片离子(m/z217.1433、m/z 245.1293、m/z408.1947)。
本发明提供的衍生化试剂含有多肽段，其对含有伯胺或仲胺的生物小分子化合物具有高亲和力和高选择性；同时该衍生物的肽段部分具有分子量小、稳定性好、特异性强、成本较低等优点。
采用本发明提供的检测方法，具有特异性强、线性范围宽、灵敏度高、操作简便、安全性好等优点，通过对实际样品的检测证明该方法适用于对含有氨基的化合物的检测，在小分子化合物的检测等诸多领域开辟出一条有前景的检测方法，使得液质联用技术在检测氨基小分子化合物方面有了进一步的发展。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为衍生化试剂的质谱图；
图2为酪氨酸衍生化后的质谱图；
图3为酪氨酸未经衍生化的质谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或者按照仪器制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明的衍生化试剂为多肽衍生化物，所选肽段由6个氨基酸组成，其C端均为赖氨酸(K)，肽段残基均带一个正电荷，且序列中无酸性氨基酸，仅有一个碱性氨基酸，理论PI值在8.5-8.8之间，在一些具体实施例中以多肽LPFYFK为例。
实施例1衍生化试剂的制备
采用缓冲溶液将多肽LPFYFK制成10mg/ml溶液，缓冲溶液中包括0.1M 2-吗啉乙磺酸，0.5M NaCl并且溶液的pH＝6。取多肽溶液1ml，加入肽偶联剂EDC至终浓度为2mM，之后加入N-羟基琥珀酰亚胺至终浓度为5mM，在室温25℃下反应15min，之后加入2-巯基乙醇至终浓度为20mM，终止反应。采用脱盐柱，对化合物进行分离，将衍生化试剂分离出来，进行质谱检测，见图1。
质谱的检测条件为：离子源：电喷雾电离源正离子模式；喷雾电压3.5kV，离子传输管温度300℃，碎裂模式为高能碎裂。
实施例2衍生化试剂用于测定小鼠脑组织中4-氨基丁酸(GABA)含量
1.标准曲线的制作
1.1准确称取GABA 1mg于干燥的烧杯中，加入80％乙腈溶液10mL配制成浓度为1mmol/L的储备溶液，密封后置于冰箱中储存备用；
1.2取10个干燥的离心管，向离心管中加入储备液，分别加入80％乙腈溶液，配制成浓度为1μmol/L、0.5μmol/L、0.1μmol/L、50nmol/L、20nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、1nmol/L、0.8nmol/L、0.5nmol/L的系列GABA标准溶液；
1.3在室温下，取100μL标准溶液于试管中，加入500μl THF和相当于GABA摩尔量10倍的实施例1制备的衍生化试剂，并混合，在60℃下反应1h，制备衍生化物，反应如下：
1.4反应结束后，在低温条件下，采用氮气蒸发溶剂，去除未反应的试剂和副产物。
1.5采用乙腈100μL复溶样品，之后进行LC-MS检测，得到GABA衍生化物的提取离子质谱图，LC-MS检测条件如下：
高效液相色谱的检测条件为：C18色谱柱(2.1×50mm、2.7μm)；流动相A为0.1％甲酸(v/v)，流动相B为100％乙腈(v/v)(含0.1％甲酸(v/v))。进样量5μL，流速为0.3mL/min，洗脱梯度：0～10min为5～100％B；10～13min为100％B；13～13.1min为100～5％B；13.1～16min为5％B。
质谱的检测条件为：离子源：电喷雾电离源正离子模式；喷雾电压3.5kV，离子传输管温度300℃，碎裂模式为高能碎裂。
1.6以GABA浓度为横坐标X，衍生化产物所对应的峰面积为纵坐标Y，得到GABA的衍生化产物的标准曲线，在GABA浓度0.5～1000ng/L范围内，标准曲线方程为：Y＝4684.4613X+277.9387，r＝0.9947。
2.测定小鼠脑提取物中GABA含量
2.1对小鼠脑进行处理，得到小鼠脑提取液。
2.2在室温下，100μL小鼠脑提取液于试管中，加入500μL THF和相当于GABA摩尔量10倍的实施例1得到的衍生化试剂，并混合，在60℃下反应1h，制备衍生化物。
2.3反应结束后，在低温条件下，采用氮气蒸发溶剂，去除未反应的试剂和副产物。
2.4采用乙腈复溶样品，之后进行LC-MS检测，检测条件同1.5。
2.5从质谱结果中提取对应的衍生化产物的质谱图，通过检测产物所对应的峰面积，由标准曲线得到检测样品中GABA的含量，计算得到小鼠脑提取物中GABA为9.1μg/g。
实施例3衍生化试剂用于酪氨酸的检测
1.酪氨酸衍生化物检测
1.1将酪氨酸标准品溶于80％乙腈溶液使得最终浓度为1mg/ml，超声5min使其溶解完全；
1.2在室温下，取100μl酪氨酸标准品于试管中，加入500μl THF和相当于酪氨酸摩尔量10倍的实施例1得到的衍生化试剂，并混合，在60℃下反应1h，制备衍生化物。
1.3反应结束后，在低温条件下，采用氮气蒸发溶剂，去除未反应的试剂和副产物。
1.4采用乙腈复溶样品，之后进行LC-MS检测，检测条件如下：
高效液相色谱的检测条件为：C18色谱柱(2.1×50mm、2.7μm)；流动相A为0.1％甲酸(v/v)，流动相B为100％乙腈(v/v)(含0.1％甲酸(v/v))。进样量5μL，流速为0.3mL/min，洗脱梯度：0～10min为5～100％B；10～13min为100％B；13～13.1min为100～5％B；13.1～16min为5％B。
质谱的检测条件为：离子源：电喷雾电离源正离子模式；喷雾电压3.5kV，离子传输管温度300℃，碎裂模式为高能碎裂。
1.5通过液质检测，得到酪氨酸标准品衍生化后的质谱图2。
2.酪氨酸标准品检测
2.1将酪氨酸标准品溶于80％乙腈溶液使得最终浓度为1mg/ml，超声5min使其溶解完全；
2.2进行LC-MS检测，检测条件如下：
高效液相色谱的检测条件为：C18色谱柱(2.1×50mm、2.7μm)；流动相A为0.1％甲酸(v/v)，流动相B为100％乙腈(v/v)(含0.1％甲酸(v/v))。进样量5μL，流速为0.3mL/min，洗脱梯度：0～10min为5～100％B；10～13min为100％B；13～13.1min为100～5％B；13.1～16min为5％B。
质谱的检测条件为：离子源：电喷雾电离源正离子模式；喷雾电压3.5kV，离子传输管温度300℃，碎裂模式为高能碎裂。
2.3通过液质检测，得到酪氨酸标准品衍生化后的质谱图3。
通过对实施例3得到的酪氨酸质谱图和酪氨酸衍生化进行分析，质谱对衍生化后的多肽标准品峰面积进行积分，得到信号强度，与衍生化前相比，多肽标准品信号强度明显增强，表明衍生化对多肽检测具有明显提升能力。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种电喷雾质谱检测用衍生化试剂，其特征在于，其为多肽衍生化物，所述多肽衍生化物由所述多肽以及连接于所述多肽羧基端的琥珀酰亚胺基构成，所述多肽由6个非酸性氨基酸组成，其中仅有一个碱性氨基酸，其C端为赖氨酸，所述多肽衍生化物包括LPFYFK、WTTFLK、LPPWLK。
2.根据权利要求1所述的电喷雾质谱检测用衍生化试剂的制备方法，其特征在于，将所述多肽衍生化物加入到pH为5.5-6.5的2-吗啉乙磺酸-氯化钠缓冲溶液中配制成多肽溶液，再加入肽偶联剂1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳酰二亚胺(EDC)，之后加入N-羟基琥珀酰亚胺，15～35℃下反应10～30min，而后加入2-巯基乙醇终止反应，最后采用脱盐柱分离纯化，即得。
3.根据权利要求2所述的电喷雾质谱检测用衍生化试剂的制备方法，其特征在于，所述多肽衍生化物与所述N-羟基琥珀酰亚胺和肽偶联剂的质量摩尔比为10mg:4.5～6.0mM:1.8～2.2mM。
4.一种如权利要求1所述的电喷雾质谱检测用衍生化试剂在含氨基的生物小分子化合物液质检测中或使含氨基的生物小分子化合物带双电荷的应用。
5.一种含氨基的生物小分子化合物的液质检测方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：S1：称取待测样品，去除样品中的蛋白质干扰物质；S2：向处理好的待测样品中，加入溶剂和如权利要求1中所述的衍生化试剂，进行衍生化处理；S3：在低温条件下，采用氮气蒸发溶剂；S4：采用流动相复溶样品，涡旋3min，离心10min，取上清，进入LC-MS系统，在正离子模式下，采集质谱数据进行分析。
6.根据权利要求5所述的一种含氨基的生物小分子化合物的液质检测方法，其特征在于，所述步骤S2中的溶剂为四氢呋喃(THF)，所述步骤S2中衍生化试剂的加入量为样品的8～12倍。
7.根据权利要求5所述的一种含氨基的生物小分子化合物的液质检测方法，其特征在于，所述步骤S2衍生化处理条件为55～65℃，0.5～1.5h；所述步骤S3低温为2～5℃。
8.根据权利要求5所述的一种含氨基的生物小分子化合物的液质检测方法，其特征在于，所述步骤S4中分析包括分析基准分子离子峰[M+2H]2+和/或二级图谱。
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