CN112326816A - 一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法 - Google Patents

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CN112326816A CN202011114376.7A CN202011114376A CN112326816A CN 112326816 A CN112326816 A CN 112326816A CN 202011114376 A CN202011114376 A CN 202011114376A CN 112326816 A CN112326816 A CN 112326816A
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Abstract

本发明涉及一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法，属于抗体检测技术领域。本发明采用液质联用技术，对人血清中地舒单抗的浓度进行定量检测，解决了传统配体结合分析法检测范围较窄，制备特异性结合试剂费时费力且价格昂贵，选择性差，易受到内源性抗体干扰导致的检测结果不可靠等问题，也解决了已建立的LC‑MS/MS法灵敏度不足的问题。

Description

一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法
技术领域
本发明涉及抗体检测技术领域，具体涉及一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法。
背景技术
地舒单抗(Denosumab)是一种全人源化的、针对RANKL的单克隆抗体(IgG2)，能够特异性地阻断RANKL与RANK的结合，从而抑制破骨细胞的生成、分化及活化，减少骨质重吸收，达到治疗效果。地舒单抗注射液于2010年经美国FDA批准用于多发性骨髓瘤、实体瘤骨转移引起的骨相关事件的预防、不可切除的或手术切除会导致严重并发症的成人或骨成熟青少年骨巨细胞瘤的治疗和双磷酸盐耐药的高钙血症的治疗。2019年地舒单抗注射液(Denosumab Injection)获得国家药品监督管理局批准，用于治疗不可手术切除或者手术切除可能导致严重功能障碍的骨巨细胞瘤，包括成人和骨骼发育成熟(定义为至少1处成熟长骨且体重＞45kg)的青少年患者。临床资料显示地舒单抗比其他现有的抗骨吸收药物(如唑来膦酸)更有效地预防骨骼相关事件，但是，地舒单抗治疗的患者偶尔会观察到一些严重的不良反应，如低钙血症、颌骨骨坏死，其最严重的毒副反应是感染。到目前为止，疗效和不良反应与血清地舒单抗浓度的关系仍然不明确。目前，国内已有多家制药企业加入地舒单抗生物类似药开发，在进行临床前或临床I期研究中。
与其他大分子药物类似，一般使用配体结合分析(如ELISA)来检测血清中地舒单抗的浓度，虽然配体结合分析法具有简便、灵敏、高通量的优点，但同时存在检测范围较窄，制备特异性结合试剂费时费力且价格昂贵，选择性差，很容易受到内源性抗体干扰，导致检测结果不可靠等缺陷。
LC-MS/MS在线性范围、选择性、精密度和准确度等方面较配体结合分析法具有明显优势，且LC-MS/MS的前处理方法和色谱质谱检测方法确定后，通常类似抗体药物均能检测，可克服配体结合分析法的缺陷。目前已有日本科学家建立LC-MS/MS定量检测人血清中地舒单抗的方法，定量下限为2500ng/mL，检测线性为2500ng/mL～80000ng/mL，此灵敏度下仅能满足临床患者血药浓度较高时血清药物浓度检测(每4周给予120mg药物的癌症病人)，而对于地舒单抗治疗骨质疏松症(每6个月注射60mg)的病人血样因灵敏度不足无法检测，而对于新药临床一期和二期研究，通常给药剂量较低，因此急需建立更高灵敏度的LC-MS/MS定量检测人血清中地舒单抗的方法，以满足临床研究和临床血药浓度监测需要。
另外，在地舒单抗的临床前研究中，根据蛋白序列同源性、体外生物活性(亲和力、受体/配体结合率、药效学活性)、组织交叉反应体现猴是临床前研究最相关的种属，需选择食蟹猴或恒河猴进行临床前药效试验、药代动力学试验、毒理学试验研究，因此建立可靠的检测方法进行临床前药代动力学(PK)和毒代动力学(TK)样品试验猴血清中地舒单抗浓度检测为临床前研究所必须。
目前已有沈阳药科大学研究人员建立LC-MS/MS定量检测猴血清中地舒单抗的方法，定量下限为100ng/mL，检测线性为100g/mL～30000ng/mL。而ELISA法的定量为2ng/mL，因此已建立的LC-MS/MS方法与ELISA法灵敏度上有明显不足。另外，地舒单抗临床前的毒代动力学研究发现，因地舒单抗对食蟹猴多次给药后，免疫阳性发生率高达50～70％，免疫阳性可导致食蟹猴体内的药物浓度断崖式降低，这就要求建立的检测方法既能满足线性范围宽，且灵敏度需足够低，显然定量下限为100ng/mL的定量下限还不足于临床前PK和TK的样品检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法。本发明采用液质联用技术，分别对人和猴血清中地舒单抗的浓度进行定量检测，解决了传统配体结合分析法检测范围较窄，制备特异性结合试剂费时费力且价格昂贵，选择性差，易受到内源性抗体干扰检测结果不可靠等问题，也解决了已建立的LC-MS/MS法灵敏度不足的问题。
本发明提供了一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法，包括以下步骤：
1)使用NCBI BLAST、Sequence Alignment Tool和In-silico Digestion预测地舒单抗的候选特征性肽段，以待测血清对应的物种为目标种属，确定种属的序列同源性，舍弃受该种属内源性蛋白干扰的肽段；
2)使用ProteinWorks Kits对地舒单抗进行酶解，使用Waters UPLC I-ClassVion MS/MS Qtof对酶解后的样品进行检测，确认候选特征性肽段的带电荷状态和主要碎片离子，选择灵敏度较高的肽段作为定量分析的目标肽段，并根据选择的肽段合成类似肽段作为内标；
3)使用能与地舒单抗特异性结合的磁珠对血清样品中的地舒单抗进行免疫捕获，再使用ProteinWorks Auto-eXpress Low kit对免疫捕获的血清样品进行酶解，酶解后样品再经ProteinWorks μElution SPE Clean-up Kit纯化富集；
4)使用空白血清分别配制系列浓度的地舒单抗线性工作液和内标工作液；
5)得到定量分析的目标肽段和内标后，使用型号为Waters UPLC H-Class XEVOTQ-XS的液相色谱质谱联用仪对步骤3)纯化富集后的样品进行液相色谱和质谱定量检测；
所述步骤1)和3)没有时间先后顺序的限定，所述步骤3)和4)没有时间先后顺序的限定。
优选的是，步骤1)所述地舒单抗的候选特征性肽段包括氨基酸序列如SEQ IDNO.1～5所示的肽段。
优选的是，所述物种包括人和猴。
优选的是，当所述物种为人时，人定量分析的目标肽段的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，人同位素内标为C端用13C6标记的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的肽段；当所述物种为猴时，猴定量分析的目标肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，猴同位素内标为C端用13C6标记的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的肽段。
优选的是，步骤3)所述能与地舒单抗特异性结合的磁珠的制备方法包括以下步骤：
a)对小鼠大剂量皮下注射给予地舒单抗注射液，每周给药一次，连续给药5周，从小鼠腹水中提取抗地舒单抗抗体，并使用Protein A磁珠对抗地舒单抗抗体进行亲和纯化，得到纯化后的抗地舒单抗的抗体；
b)将活化生物素共价交联到纯化后的抗地舒单抗的抗体上得到生物素化抗地舒单抗抗体；
c)将生物素化抗地舒单抗抗体与链酶亲和素磁性微球混合，反应30～40min，制备成磁性微球，即得与地舒单抗特异性结合的磁珠。
优选的是，步骤3)所述免疫捕获包括以下步骤：
将清洗后的能与地舒单抗特异性结合的磁珠与血清样品混合，震荡后，置于磁力架上弃去上清，使用TBS清洗两次后，加入洗脱溶液进行洗脱，将洗脱液与中和试剂混合，得到免疫捕获后的血清地舒单抗样品。
优选的是，步骤5)所述液相色谱质谱联用仪使用的色谱柱包括ACQUITY
Figure BDA0002729755090000021
Peptide BEH系列的色谱柱。
优选的是，步骤5)所述色谱的定量检测条件包括：
色谱柱为ACQUITY
Figure BDA0002729755090000022
Peptide BEH系列色谱柱；
流动相A为乙酸水溶液，所述乙酸水溶液中乙酸在乙酸水溶液中的体积百分含量为0.3％；
流动相B为甲酸乙腈溶液，所述甲酸乙腈溶液中甲酸在甲酸乙腈溶液中的体积百分含量为0.2％；
样品室温度为8℃；
柱温为30～50℃；
进样量为2～7μL；
流速为0.25mL/min；
梯度洗脱条件为：0～1.5min，流动相A 80％，流动相B 20％；1.5～3min，流动相A80％→74％，流动相B 20％→26％；3～6.5min，流动相A 74％→5％，流动相B 26％→95％；6.5～8min，流动相A 5％，流动相B 95％；8～9min，流动相A 5％→80％，流动相B 95％→20％。
优选的是，步骤5)所述质谱的定量检测条件包括：
采用电喷雾电源(ESI)，正离子模式，多重反应检测，主要参数包括：Capillaryvoltage：1.00～2.00kV；Sample cone：20～30V；Source temperature：150℃；Desolvationtemperature：500～600℃；Desolvation gas flow：900～1000L/h；Cone gas flow：10L/h；
优选的是，当所述物种为人时，人定量分析的目标肽段的质谱条件包括：MRM离子对：745.36→696.82，锥孔电压：35V，碰撞能量16V；
人同位素内标的质谱条件包括：MRM离子对：768.17→513.26，锥孔电压：40V，碰撞能量26V；
当所述物种为猴时，猴定量分析的目标肽段的质谱条件包括：MRM离子对：765.17→696.99，锥孔电压：40V，碰撞能量14V；
猴同位素内标的质谱条件包括：MRM离子对：783.64→547.96，锥孔电压：38V，碰撞能量18V。
本发明提供了一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法。本发明采用液质联用技术，对人和猴血清中地舒单抗的浓度进行定量检测，解决了传统配体结合分析法检测范围较窄，制备特异性结合试剂费时费力且价格昂贵，选择性差，易受到内源性抗体干扰检测结果不可靠等问题，也解决了已建立的LC-MS/MS法灵敏度不足的问题。本发明的检测方法具有操作标准化、检测范围宽、选择性好、精密度和准确度高、重复性好等优点，可用于地舒单抗临床前和临床研究生物样品检测以及临床上治疗患者上的药物浓度监测。
本发明使用Waters UPLC I-Class Vion MS/MS Qtof对酶解后样品进行检测，确认候选肽段的带电荷状态和主要碎片离子，选择灵敏度较高的肽段作为定量分析的目标肽段。本发明使用能与地舒单抗特异性结合的磁珠对地舒单抗进行免疫捕获，可极大提高灵敏度。使用ProteinWorks Kits对地舒单抗进行标准流程的酶解，可提高灵敏度。酶解后样品再经ProteinWorks μElution SPE Clean-up Kit纯化富集，可提高灵敏度和选择性、精密度和准确度。使用型号为Waters UPLC H-Class XEVO TQ-XS的液相色谱质谱联用仪对样品进行检测，物种为人时，定量下限为10ng/mL，定量线性范围为10～5000ng/mL，物种为猴时，定量下限为2ng/mL，定量线性范围为2～2000ng/mL，灵敏度高，且能提高选择性、精密度和准确度。
附图说明
图1为本发明提供的UPLC-MS/MS检测人血清中地舒单抗浓度空白血清(Blank)代表色谱图；
图2为本发明提供的UPLC-MS/MS检测人血清中地舒单抗浓度LLOQ(10ng/mL)代表色谱图；
图3为本发明提供的UPCC-MS/MS检测人血清中地舒单抗浓度线性代表图(线性范围为10～5000ng/mL)；
图4为本发明提供的UPLC-MS/MS检测猴血清中地舒单抗浓度空白血清(Blank)代表色谱图；
图5为本发明提供的UPLC-MS/MS检测猴血清中地舒单抗浓度LLOQ(2ng/mL)代表色谱图；
图6为本发明提供的UPLC-MS/MS检测猴血清中地舒单抗浓度线性代表图(线性范围为2～2000ng/mL)；
图7为本发明提供的食蟹猴血清中地舒单抗浓度个体血药浓度-时间曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法，包括以下步骤：
1)使用NCBI BLAST、Sequence Alignment Tool和In-silico Digestion预测地舒单抗的候选特征性肽段，以待测血清对应的物种为目标种属，确定种属的序列同源性，舍弃受该种属内源性蛋白干扰的肽段；
2)使用ProteinWorks Kits对地舒单抗进行酶解，使用Waters UPLC 1-ClassVion MS/MS Qtof对酶解后的样品进行检测，确认候选特征性肽段的带电荷状态和主要碎片离子，选择灵敏度较高的肽段作为定量分析的目标肽段，并根据选择的肽段合成类似肽段作为内标；
3)使用能与地舒单抗特异性结合的磁珠对血清样品中的地舒单抗进行免疫捕获，再使用ProteinWorks Auto-eXpress Low kit对免疫捕获的血清样品进行酶解，酶解后样品再经ProteinWorks μElution SPE Clean-up Kit纯化富集；
4)使用空白血清分别配制系列浓度的地舒单抗线性工作液和内标工作液；
5)得到定量分析的目标肽段和内标后，使用型号为Waters UPLC H-Class XEVOTQ-XS的液相色谱质谱联用仪对步骤3)纯化富集后的样品进行液相色谱和质谱定量检测；
所述步骤1)和3)没有时间先后顺序的限定，所述步骤3)和4)没有时间先后顺序的限定。
本发明使用NCBI BLAST、Sequence Alignment Tool和In-silico Digestion预测地舒单抗的候选特征性肽段，以待测血清对应的物种为目标种属，确定种属的序列同源性，舍弃受该种属内源性蛋白干扰的肽段。地舒单抗的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示(EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC)。在本发明中，所述地舒单抗的候选特征性肽段包括氨基酸序列如SEQID NO.1～5所示的肽段。NCBI BLAST搜索得到血清中特异性肽段，重链中有2条特异性肽段，分别为EVQLLESGGGLVQPGGSLR(SEQ ID NO.1)和GLEWVSGITGSGGSTYYADSVK(SEQ IDNO.2)；轻链中有3条特异性肽段，分别为FSGSGSGTDFTLTISR(SEQ ID NO.3)、EIVLTQSPGTLSLSPGER(SEQ ID NO.4)和LEPEDFAVFYCQQYGSSPR(SEQ ID NO.5)。本发明所述物种包括人和猴。
得到地舒单抗的候选特征性肽段后，本发明使用ProteinWorks Kits对地舒单抗进行酶解，使用Waters UPLC I-Class Vion MS/MS Qtof对酶解后的样品进行检测，确认候选特征性肽段的带电荷状态和主要碎片离子，选择灵敏度较高的肽段作为定量分析的目标肽段，并根据选择的肽段合成类似肽段作为内标。在本发明中，当所述物种为人时，人定量分析的目标肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，人同位素内标为C端用13C6标记的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的肽段；当所述物种为猴时，猴定量分析的目标肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，猴同位素内标为C端用13C6标记的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的肽段。本发明使用Waters UPLC I-Class Vion MS/MS Qtof对酶解后样品进行检测，确认候选肽段的带电荷状态和主要碎片离子，选择灵敏度较高的肽段作为定量分析的目标肽段。
本发明使用能与地舒单抗特异性结合的磁珠对血清样品中的地舒单抗进行免疫捕获，再使用ProteinWorks Auto-eXpress Low kit对免疫捕获的血清样品进行酶解，酶解后样品再经ProteinWorksμElution SPE Clean-up Kit纯化富集。本发明使用磁珠对地舒单抗进行免疫捕获，可提高灵敏度。在本发明中，所述能与地舒单抗特异性结合的磁珠的制备方法优选包括以下步骤：
a)对小鼠大剂量皮下注射给予地舒单抗注射液，每周给药一次，连续给药5周，从小鼠腹水中提取抗地舒单抗抗体，并使用Protein A磁珠对抗地舒单抗抗体进行亲和纯化，得到纯化后的抗地舒单抗的抗体；
b)将活化生物素共价交联到纯化后的抗地舒单抗的抗体上得到生物素化抗地舒单抗抗体；
c)将生物素化抗地舒单抗抗体与链酶亲和素磁性微球混合，反应30～40min，制备成磁性微球，即得与地舒单抗特异性结合的磁珠。
本发明对小鼠大剂量皮下注射给予地舒单抗注射液，每周给药一次，连续给药5周，从小鼠腹水中提取抗地舒单抗抗体，并使用Protein A磁珠对抗地舒单抗抗体进行亲和纯化，得到纯化后的抗地舒单抗的抗体。在本发明中，所述注射的浓度优选为156mg/kg。在本发明中，纯化后的抗地舒单抗的抗体的纯度优选大于等于98.2％。
得到纯化后的抗地舒单抗的抗体后，本发明将活化生物素共价交联到纯化后的抗地舒单抗的抗体上得到生物素化抗地舒单抗抗体。在本发明中，所述生物素优选使用进口的生物素产品。
得到生物素化抗地舒单抗抗体后，本发明将生物素化抗地舒单抗抗体与链酶亲和素磁性微球混合，反应30～40min，制备成磁性微球，即得与地舒单抗特异性结合的磁珠。在本发明中，所述反应优选在室温下进行，更优选为35℃。
在本发明中，所述免疫捕获优选包括以下步骤：
将清洗后的能与地舒单抗特异性结合的磁珠与血清样品混合，震荡后，置于磁力架上弃去上清，使用TBS清洗两次后，加入洗脱溶液进行洗脱，将洗脱液与中和试剂混合，得到免疫捕获后的血清地舒单抗样品。本发明在将清洗后的能与地舒单抗特异性结合的磁珠与血清样品混合，优选使用TBS溶液将清洗后的能与地舒单抗特异性结合的磁珠和血清样品分别溶解。在本发明中，所述TBS优选为Tris Buffered Saline，含25mM Tris，150mMNaCl，pH 7.2。本发明优选使用TBS对磁珠进行清洗。本发明对所述洗脱溶液的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售洗脱溶液即可，如购自Sigma公司。在本发明中，所述中和试剂包括500mM碳酸氢铵，pH 8.0。
在本发明中，所述酶解的步骤包括变性、还原、烷基化、酶解和中止。本发明对所述酶解和纯化富集的操作方法没有特殊限定，采用各自的试剂盒的常规要求进行操作即可。本发明使用ProteinWorks Kits对地舒单抗进行标准流程的酶解，可提高灵敏度。本发明在酶解后样品再经ProteinWorksμElution SPE Clean-up Kit纯化富集，可提高灵敏度和选择性、精密度和准确度。
本发明分别使用人和猴空白血清分别配制系列浓度的地舒单抗线性工作液和内标工作液。在本发明中，所述人血清基质地舒单抗线性工作液的线性浓度范围为10～5000ng/mL，所述内标工作液中内标肽段的质量浓度为10μg/mL；猴血清基质地舒单抗线性工作液的线性浓度范围为2～2000ng/mL，所述内标工作液中内标肽段的质量浓度为500ng/mL。
得到定量分析的目标肽段和内标后，本发明使用型号为Waters UPLC H-ClassXEVO TQ-XS的液相色谱质谱联用仪对上述纯化富集后的样品进行液相色谱和质谱定量检测。本发明使用液相色谱质谱联用仪型号为Waters UPLC H-Class XEVO TQ-XS对样品进行检测，物种为人时，定量下限为10ng/mL，定量线性范围为10～5000ng/mL，物种为猴时，定量下限为2ng/mL，定量线性范围为2～2000ng/mL，灵敏度高，且能提高选择性、精密度和准确度。在本发明中，所述液相色谱质谱联用仪使用的色谱柱包括ACQUITY
Figure BDA0002729755090000053
Peptide BEH系列的色谱柱。在本发明中，所述色谱的定量检测条件包括：
色谱柱为ACQUITY
Figure BDA0002729755090000054
Peptide BEH系列色谱柱，如ACQUITY
Figure BDA0002729755090000055
PeptideBEH
Figure BDA0002729755090000056
C182.1×50mm 1.7μm；
流动相A为乙酸水溶液，所述乙酸水溶液中乙酸在乙酸水溶液中的体积百分含量为0.3％；
流动相B为甲酸乙腈溶液，所述甲酸乙腈溶液中甲酸在甲酸乙腈溶液中的体积百分含量为0.2％；
样品室温度为8℃；
柱温为30～50℃；
进样量为2～7μL；
流速为0.25mL/min；
梯度洗脱条件为(如表1所示)：0～1.5min，流动相A 80％，流动相B 20％；1.5～3min，流动相A 80％→74％，流动相B 20％→26％；3～6.5min，流动相A 74％→5％，流动相B 26％→95％；6.5～8min，流动相A 5％，流动相B 95％；8～9min，流动相A 5％→80％，流动相B95％→20％。在此色谱条件下，目标肽段和内标均得到较好的分离，分离度良好。
表1色谱梯度洗脱条件
Figure BDA0002729755090000051
在本发明中，步骤5)所述质谱的定量检测条件优选包括：
采用电喷雾电源(ESI)，正离子模式，多重反应检测，主要参数包括：Capillaryvoltage：1.00～2.00kV；Sample cone：20～30V；Source temperature：150℃；Desolvationtemperature：500～600℃；Desolvation gas flow：900～1000L/h；Cone gas flow：10L/h；
在本发明中，当所述物种为人时，人定量分析的目标肽段的质谱条件(如表2所示)优选包括：MRM离子对：745.36→696.82，锥孔电压：35V，碰撞能量16V；
人同位素内标的质谱条件包括：MRM离子对：768.17→513.26，锥孔电压：40V，碰撞能量26V；在此质谱条件下，目标肽段和内标的响应最优。
表2人定量分析的目标肽段的质谱条件
Figure BDA0002729755090000052
当所述物种为猴时，猴定量分析的目标肽段的质谱条件(如表3所示)优选包括：MRM离子对：765.17→696.99，锥孔电压：40V，碰撞能量14V；
猴同位素内标的质谱条件包括：MRM离子对：783.64→547.96，锥孔电压：38V，碰撞能量18V。在此质谱条件下，目标肽段和内标的响应最优。
表3猴定量分析的目标肽段的质谱条件
Figure BDA0002729755090000061
本发明优选还针对本发明所述方法进行方法字验证，优选按照2015年版《中国药典》9012生物样品定量分析方法验证指导原则进行完全的方法学验证，验证项目包括选择性、残留、定量下限、标准曲线、3批精密度和准确度、基质效应、提取回收率、稀释可靠性、进样器温度下放置24h稳定性等。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
UPLC-MS/MS定量测定人血清中地舒单抗的浓度的方法学验证
1特征性肽段选择
通过NCBI BLAST搜索得到人血清中特异性肽段，重链中有2条特异性肽段，分别为EVQLLESGGGLVQPGGSLR(SEQ ID NO.1)和GLEWVSGITGSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO.2)；轻链中有3条特异性肽段，分别为FSGSGSGTDFTLTISR(SEQ ID NO.3)、EIVLTQSPGTLSLSPGER(SEQ IDNO.4)、LEPEDFAVFYCQQYGSSPR(SEQ ID NO.5)。使用ProteinWorks Kits对地舒单抗进行标准流程的酶解，使用Waters UPLCI-Class Vion MS/MS Qtof对酶解后样品进行检测，确认候选肽段的带电荷状态和主要碎片离子。检测发现EVQLLESGGGLVQPGGSLR(SEQ ID NO.1)肽段存在干扰，对最终确定的4条肽段进行比较，发现GLEWVSGITGSGGSTYYADSVK(SEQ IDNO.2)的响应最高，因此最终选择GLEWVSGITGSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO.2)为定量的特征性肽段。
2样品前处理
2.1特异性磁珠对地舒单抗免疫捕获
能与地舒单抗特异性结合的磁珠制备步骤如下：
1)抗地舒单抗抗体制备：对小鼠大剂量皮下注射给予地舒单抗注射液(156mg/kg)，每周给药一次，连续给药5周，从小鼠腹水中提取抗地舒单抗抗体，并使用Protein A磁珠对抗地舒单抗抗体进行亲和纯化，得到纯度达98.2％的抗体。
2)生物素化抗体：将进口的活化生物素共价交联到抗地舒单抗的抗体上得到生物素化抗地舒单抗抗体。
3)磁珠准备：在室温条件下，将生物素化抗地舒单抗抗体与链酶亲和素磁性微球混合，反应时间30～40min，制备成磁性微球，即得能与地舒单抗特异性结合的磁珠。
免疫捕获：将磁珠混匀，取25μL Protein磁珠与200μL Tris Buffered Saline(TBS)(25mM Tris，150mM NaCl，pH 7.2)混匀30s，置于磁力架上2min，将上清小心的弃去；将磁珠清洗2遍，上清弃去。每次加入250μL TBS，混匀30s，置于磁力架2min，弃去上清；将50μL血浆加入到200μL TBS，混匀后加入磁珠中。室温震荡混匀样品60min(1300rpm)，然后置于磁力架2min，将上清弃去；加入200μL TBS，混匀5min(1000rpm)，上清弃去，重复该步骤一次；加入80μL Elution溶液，室温混匀5min(1300rpm)。将上清转移到另一套管中，加入8μL中和试剂(500mM碳酸氢铵，pH 8.0)；混匀后(总体积大约为88μL)。
2.2酶解样品
使用ProteinWorks Auto-eXpress Low kit对血清样品进行酶解，酶解步骤包括变性、还原、烷基化、酶解、中止处理样品。变性：中和免疫捕获上清液(pH 7.9～8.2)80μL，加入16μLRapigest，混匀，涡流，80℃加热10min；冷却至室温。还原：上述样品中加入16μL还原剂，加盖后涡旋；60℃加热2min。烷基化：样品冷却至室温后，加入24μL烷基化试剂，加盖后涡旋。避光下，室温放置30min。酶解：每个样品中加入24μL胰蛋白酶溶液(酶溶液为0.228mg/mL)，涡旋；样品45℃继续加热15min。
2.3纯化富集
酶解后样品再经ProteinWorks μElution SPE Clean-up Kit纯化富集。活化平衡SPE填料，取80μL酶解后样品上样，按照ProteinWorks μElution SPE的标准操作规程将样品进行纯化富集。
3标准曲线和质控样品工作液配制
3.1标准曲线配制：地舒单抗标准品储备液浓度为6400ng/mL，精密移取一定量的地舒单抗标准品储备液，使用人血清稀释配制为10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000ng/mL的线性工作液，根据需要量合理配制。
3.2质控样品配制：精密移取一定量的地舒单抗标准品储备液，使用人血清稀释配制为15、600、4000ng/mL的线性工作液，根据需要量合理配制。
3.3内标工作液配制：内标为合成的同位素内标相似肽段SRGLEWVSGITGSGGSTYYADSV13C6(氨基酸序列为SEQ ID NO.6)，内标储备液液浓度为10μg/mL，精密移取一定量的内标储备液，使用人血清配制为1000ng/mL的内标工作液，根据需要量合理配制。
4色谱和质谱检测条件
4.1色谱条件
超高效液相色谱仪的型号为ACQUITY UPLCTMH-Class色谱条件如下：
色谱柱：ACQUITY
Figure BDA0002729755090000071
Peptide BEH
Figure BDA0002729755090000072
C182.1×50mm 1.7μm
流动相A：0.3％乙酸水溶液
流动相B：0.2％甲酸乙腈
样品室温度：8℃
柱温：50℃
进样量：7μL
流动相比例如表1所示。
4.2质谱条件
采用电喷雾电源(ESI)，正离子模式，多重反应检测，主要参数包括：Capillaryvoltage：1.00kV；Sample cone：20V；Source temperature：150℃；Desolvationtemperature：500℃；Desolvation gas flow：1000L/h；Cone gas flow：10L/h。
定量肽段GLEWVSGITGSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO.2)及其同位素内标SRGLEWVSGITGSGGSTYYADSV13C6(氨基酸序列为SEQ ID NO.6)的质谱条件如表2所示。
5方法学验证方案
5.1选择性
选取6份不同来源的空白血清样品各50μL，除不加内标外，按照“2样品前处理”项下操作处理后，获得空白血清样品色谱图；将最低定量浓度(LLOQ)和内标溶液加入空白血清，依同法操作，获得相应色谱图；要求目标化合物在空白样品中的峰面积不得超过LLOQ样品峰面积的20％，并低于内标响应的5％，即可以接受。
5.2标准曲线
配制标准曲线工作液(10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000ng/mL)按照“2样品前处理”项下操作处理后，得到工作曲线样品进样分析。以样品浓度X(ng/mL)为横坐标，特征肽段与内标物峰面积比值Y为纵坐标，做线性回归。用加权最小二乘法计算各回归方程，要求相关系数R2＞0.98。待测样品中的地舒单抗的浓度由该批次的标准曲线通过内标法计算获得。校正标样回算的浓度一般应该在标示值的±15％以内，定量下限处应该在±20％。至少75％校正标样，含最少6个有效浓度，应满足上述标准。
5.3定量下限(LLOQ)
标准曲线上的最低浓度点为LLOQ。LLOQ需进行精密度和准确度验证，要求准确度(相对误差：RE％)不超过±20％，精密度(变异系数：CV％)≤20％。
5.4残留
在定量上限(5000ng/mL)进样后，设置2个空白样品来考察残留。定量上限后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20％，并不超过内标响应的5％。
5.5精密度和准确度
低、中、高三个浓度(30、600、4000ng/mL)三个浓度的质控样品(QC)，每个批次每个浓度6个样品，获得批内精密度和准确度，由三个分析批的数据获得批间精密度和准确度。QC样品的浓度由该批次的标准曲线确定。批内和批间精密度以变异系数(CV％)表示，CV％＝(标准偏差SD/测得浓度平均值)×100％；准确度以相对误差(RE％)表示，RE％＝(测得浓度平均值-标示浓度)/标示浓度×100％。批内和批间变异系数(CV％)不得超过15％；批内和批间RE％应在样品标示值的±15％之内。
5.6基质效应
分别取6个不同来源的空白血清45μL，其余按“2样品前处理”项下操作，向获得的全部上清液加入低、高浓度质控工作液5μL和内标溶液5μL，涡旋混匀后，进样分析；同时用稀释液代替空白血清，同法操作后进样分析。比较两种处理方式下目标化合物和内标峰面积比值，计算地舒单抗和内标的基质因子。进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。计算值的总体变异系数不得大于15％。
5.7提取回收率
按照“2样品前处理”项下方法分别配制地舒单抗人血清的低、高浓度(30、4000ng/mL)质控样品(QC)，每个浓度6个样品。同时另取空白血清45μL，按“2样品前处理”项下操作，向获得的全部上清液加入低、高浓度质控工作液5μL和内标溶液5μL，涡旋混匀后，进样分析。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算回收率。
5.8稀释可靠性
分别配制地舒单抗人血清的20000ng/mL和10000ng/mL的工作液，200000ng/mL的工作液采用空白人血清稀释40倍，地舒单抗检测标示浓度为500ng/mL；10000ng/mL的工作液采用空白人血清稀释5倍，地舒单抗检测标示浓度为2000ng/mL；每个平行配制6份样品。将测得浓度与标示浓度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差(RE％)应在±15％范围内。
5.9自动进样器温度下放置24h稳定性
按“2样品前处理”项下方法分别配制地舒单抗血浆的低、高浓度(30、4000ng/mL)的质控样品(QC)，每个浓度配制6个样品，置自动进样器温度下放置24h后，测定样品浓度，由测定样品浓度与标示浓度的相对误差(RE％)评价样品置自动进样器温度下放置稳定性。将测得浓度与标示浓度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15％范围内。
6方法学验证结果
6.1选择性结果
由图1空白血清代表色谱图(UPLC-MS/MS检测人血清中地舒单抗浓度空白血清(Blank)代表色谱图)和图2LLOQ代表色谱图(UPLC-MS/MS检测人血清中地舒单抗浓度LLOQ(10ng/mL)代表色谱图)可知，目标肽段GLEWVSGITGSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO.2)和同位素内标SRGLEWVSGITGSGGSTYYADSV13C6(氨基酸序列为SEQ ID NO.6)肽段的分离度良好，在相应的保留时间范围内未出现明显的内源性干扰。
6.2标准曲线
由图3标准曲线代表性色谱图(UPCC-MS/MS检测人血清中地舒单抗浓度线性代表图(线性范围为10～5000ng/mL))可知，目标肽段GLEWVSGITGSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO.2)的线性范围均为10-5000ng/mL，线性r大于0.99，线性良好。
6.3精密度和准确度
精密度和准确度的方法学验证结果见表4，低、中、高浓度QC样品批间精密度CV％分别为4.58％、3.245％、5.45％；批间准确度RE％分别2.08％、5.41％、8.48％，均符合接受标准。
6.4定量下限(LLOQ)
定量下限的精密度和准确度方法学验证结果见表5，定量下限的批间CV％为10.25％，批间RE％为-3.28％。
6.5残留
残留考察结果见表6，定量上限后的空白样品中的残留不超过定量下限的20％，内标不超过S1内标响应的5％，残留符合接受标准。
6.6基质效应
基质效应的验证结果见表7，低浓度(30ng/mL)、高浓度(4000ng/mL)下的目标肽段峰面积比值平均值分别为77.78％、80.13％，内标的峰面积比值平均值分别为80.29％、79.93％，内标归一化的基质因子平均值分别为0.97和1.00，总体变异系数分别为0.10％和0.06％，符合接受。
6.7提取回收率
提取回收率的验证结果见表8和表9，UPLC-MS/MS测定人血清中地舒单抗在低、高浓度下平均回收率分别为55.45％、55.22％；内标在低、高浓度下平均回收率分别为63.01％、62.54％。
6.8稀释可靠性
稀释可靠性考察验证结果见表10，20000ng/mL的工作液采用空白人血清稀释40倍，检测标示浓度为500ng/mL测得浓度与标示浓度相对误差(RE％)为-14.40％，CV％为5.75％；10000ng/mL的工作液采用空白人血清稀释5倍，检测标示浓度为2000ng/mL测得浓度与标示浓度相对误差(RE％)为11.09％，CV％为4.91％；稀释40倍和5倍的可靠性符合要求。
6.9自动进样器温度下放置24h稳定性
进样器温度下放置24h稳定性结果见表11，低浓度(30ng/mL)、高浓度(4000ng/mL)下检测浓度与标示浓度的相对误差(RE％)分别为0.49％、3.56％，CV％分别为4.87％、2.49％，自动进样器温度下放置26.4h的稳定性符合要求。
方法学验证结果表明该方法符合人血清中地舒单抗方法的定量检测分析。
表4 UPLC-MS/MS测定人血清中地舒单抗的精密度和准确度验证结果表
Figure BDA0002729755090000091
表5 UPLC-MS/MS测定人血清中地舒单抗浓度LLOQ的精密度和准确度验证结果表
Figure BDA0002729755090000092
表6残留检测结果
Figure BDA0002729755090000093
Figure BDA0002729755090000101
表7 UPLC-MS/MS测定人血清中地舒单抗浓度基质效应验证结果表
Figure BDA0002729755090000102
表8人血清中地舒单抗浓度提取回收率验证结果表
Figure BDA0002729755090000103
表9内标提取回收率验证结果表
Figure BDA0002729755090000104
Figure BDA0002729755090000111
表10人血清中地舒单抗浓度稀释可靠性考察验证结果表
Figure BDA0002729755090000112
表11人血清中地舒单抗浓度进样器温度下放置24h稳定性验证结果表
Figure BDA0002729755090000113
根据实施例1可知：
1.本发明采用液质联用技术，对人血清中地舒单抗的浓度进行定量检测，对检测方法进行完全方法学验证，方法学验证结果表明检测方法选择性好，精密度和准确度高，可应用于人生物样品分析，解决了传统配体结合分析法检测范围较窄，制备特异性结合试剂费时费力且价格昂贵，选择性差，易受到内源性抗体干扰检测结果不可靠等问题。
2.本发明的灵敏度高，已发表文献的定量下限的灵敏度为2500ug/mL，而本发明的定量下限为10ng/mL，灵敏度提高250倍；
3.本发明制备了能与地舒单抗特异性结合的磁珠，能特异性的对地舒单抗进行免疫捕获，极大的提高了灵敏度；
4.本发明前处理过程的酶解、过SPE柱纯化富集使用的均为商品化处理包，前处理流程标准化，重现性好，可实现大批量检测，检测精密度和准确度较高；
5.本发明的检测方法线性范围宽，可应用于临床研究生物样品检测和临床药物浓度监测。
实施例2
LC-MS/MS定量测定猴血清中地舒单抗的浓度的方法学验证
1特征性肽段选择
通过NCBI BLAST搜索得到猴血清中特异性肽段，重链中有2条特异性肽段，分别为EVQLLESGGGLVQPGGSLR(SEQ ID NO.1)和GLEWVSGITGSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO.2)；轻链中有3条特异性肽段，分别为FSGSGSGTDFTLTISR(SEQ ID NO.3)、EIVLTQSPGTLSLSPGER(SEQ IDNO.4)、LEPEDFAVFYCQQYGSSPR(SEQ ID NO.5)。使用ProteinWorks Kits对地舒单抗进行标准流程的酶解，使用Waters UPLC I-Class Vion MS/MS Qtof对酶解后样品进行检测，确认候选肽段的带电荷状态和主要碎片离子。检测发现EVQLLESGGGLVQPGGSLR(SEQ ID NO.1)肽段存在干扰，对最终确定的4条肽段进行比较，发现LEPEDFAVFYCQQYGSSPR(SEQ ID NO.5)的响应最高，因此最终选择LEPEDFAVFYCQQYGSSPR(SEQ ID NO.5)为定量的特征性肽段。
2样品前处理
2.1特异性磁珠对地舒单抗免疫捕获
能与地舒单抗特异性结合的磁珠制备步骤如下：
1)抗地舒单抗抗体制备：对小鼠大剂量皮下注射给予地舒单抗注射液(156mg/kg)，每周给药一次，连续给药5周，从小鼠腹水中提取抗地舒单抗抗体，并使用Protein A磁珠对抗地舒单抗抗体进行亲和纯化，得到纯度达98.2％的抗体。
2)生物素化抗体：将进口的活化生物素共价交联到抗地舒单抗的抗体上得到生物素化抗地舒单抗抗体。
3)磁珠准备：在室温条件下，将生物素化抗地舒单抗抗体与链酶亲和素磁性微球混合，反应时间30～40min，制备成磁性微球，即得能与地舒单抗特异性结合的磁珠。
免疫捕获：将磁珠混匀，取25μL Protein磁珠与200μL Tris Buffered Saline(TBS)(25mM Tris，150mM NaCl，pH 7.2)混匀30s，置于磁力架上2min，将上清小心的弃去；将磁珠清洗2遍，上清弃去。每次加入250μL TBS，混匀30s，置于磁力架2min，弃去上清；将50μL血浆加入到200μL TBS，混匀后加入磁珠中。室温震荡混匀样品60min(1300rpm)，然后置于磁力架2min，将上清弃去；加入200μL TBS，混匀5min(1000rpm)，上清弃去，重复该步骤一次；加入80μL Elution溶液，室温混匀5min(1300rpm)。将上清转移到另一套管中，加入8μL中和试剂(500mM碳酸氢铵，pH 8.0)；混匀后(总体积大约为88μL)。
2.2酶解样品
使用ProteinWorks Auto-eXpress Low kit对血清样品进行酶解，酶解步骤包括变性、还原、烷基化、酶解、中止处理样品。变性：中和免疫捕获上清液(pH7.9～8.2)80μL，加入16μLRapigest，混匀，涡流，80℃加热10min；冷却至室温。还原：上述样品中加入16μL还原剂，加盖后涡旋；60℃加热2min。烷基化：样品冷却至室温后，加入24μL烷基化试剂，加盖后涡旋。避光下，室温放置30min。酶解：每个样品中加入24μL胰蛋白酶溶液(酶溶液为0.228mg/mL)，涡旋；样品45℃继续加热15min。
2.3纯化富集
酶解后样品再经ProteinWorks μElution SPE Clean-up Kit纯化富集。活化平衡SPE填料，取80μL酶解后样品上样，按照ProteinWorks μElution SPE的标准操作规程将样品进行纯化富集。
3标准曲线和质控样品工作液配制
3.1标准曲线配制：地舒单抗标准品储备液浓度为6400ng/mL，精密移取一定量的地舒单抗标准品储备液，使用猴血清稀释配制为2、5、10、50、100、200、500、1000、2000ng/mL的线性工作液，根据需要量合理配制。
3.2质控样品配制：精密移取一定量的地舒单抗标准品储备液，使用猴血清稀释配制为6、300、1600ng/mL的线性工作液，根据需要量合理配制。
3.3内标工作液配制：内标为LEPEDFAVFYCQQYGSSPR(SEQ ID NO.5)，内标储备液液浓度为5μg/mL，精密移取一定量的内标储备液，使用猴血清配制为500ng/mL的内标工作液，根据需要量合理配制。
4色谱和质谱检测条件
4.1色谱条件
超高效液相色谱仪的型号为ACQUITY UPLCTMH-Class色谱条件如下：
色谱柱：ACQUITY
Figure BDA0002729755090000121
Peptide BEH
Figure BDA0002729755090000122
C182.1×50mm 1.7μm
流动相A：0.3％乙酸水溶液
流动相B：0.2％甲酸乙腈
样品室温度：8℃
柱温：50℃
进样量：7μL
流动相比例如表1所示。
4.2质谱条件
采用电喷雾电源(ESI)，正离子模式，多重反应检测，主要参数包括：Capillaryvoltage：2.00kV；Sample cone：30V；Source temperature：150℃；Desolvationtemperature：600℃；Desolvation gas flow：900L/h；Cone gas flow：10L/h。
定量肽段LEPEDFAVFYCQQYGSSPR(SEQ ID NO.5)及其内标SRLEPEDFAVFYCQQYGSSPR13C6(氨基酸序列为SEQ ID NO.7)的质谱条件如表3所示。
5方法学验证方案
5.1选择性
选取6份不同来源的空白血清样品各50μL，除不加内标外，按照“2样品前处理”项下操作处理后，获得空白血清样品色谱图；将最低定量浓度(LLOQ)和内标溶液加入空白血清，依同法操作，获得相应色谱图；要求目标化合物在空白样品中的峰面积不得超过LLOQ样品峰面积的20％，并低于内标响应的5％，即可以接受。
5.2标准曲线
配制标准曲线工作液(2、5、10、50、100、200、500、1000、2000ng/mL)按照“2样品前处理”项下操作处理后，得到工作曲线样品进样分析。以样品浓度X(ng/mL)为横坐标，特征肽段与内标物峰面积比值Y为纵坐标，做线性回归。用加权最小二乘法计算各回归方程，要求相关系数R2＞0.98。待测样品中的地舒单抗的浓度由该批次的标准曲线通过内标法计算获得。校正标样回算的浓度一般应该在标示值的±15％以内，定量下限处应该在±20％。至少75％校正标样，含最少6个有效浓度，应满足上述标准。
5.3定量下限(LLOQ)
标准曲线上的最低浓度点为LLOQ。LLOQ需进行精密度和准确度验证，要求准确度(相对误差：RE％)不超过±20％，精密度(变异系数：CV％)≤20％。
5.4残留
在定量上限(2000ng/mL)进样后，设置2个空白样品来考察残留。定量上限后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20％，并不超过内标响应的5％。
5.5精密度和准确度
低、中、高三个浓度(6、300、1600ng/mL)三个浓度的质控样品(QC)，每个批次每个浓度6个样品，获得批内精密度和准确度，由三个分析批的数据获得批间精密度和准确度。QC样品的浓度由该批次的标准曲线确定。批内和批间精密度以变异系数(CV％)表示，CV％＝(标准偏差SD/测得浓度平均值)×100％；准确度以相对误差(RE％)表示，RE％＝(测得浓度平均值-标示浓度)/标示浓度×100％。批内和批间变异系数(CV％)不得超过15％；批内和批间RE％应在样品标示值的±15％之内。
5.6基质效应
分别取6个不同来源的空白血清45μL，其余按“2样品前处理”项下操作，向获得的全部上清液加入低、高浓度质控工作液5μL和内标溶液5μL，涡旋混匀后，进样分析；同时用稀释液代替空白血清，同法操作后进样分析。比较两种处理方式下目标化合物和内标峰面积比值，计算地舒单抗和内标的基质因子。进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。计算值的总体变异系数不得大于15％。
5.7提取回收率
按照“2样品前处理”项下方法分别配制地舒单抗猴血清的低、高浓度(30、4000ng/mL)质控样品(QC)，每个浓度6个样品。同时另取空白血清45μL，按“2样品前处理”项下操作，向获得的全部上清液加入低、高浓度质控工作液5μL和内标溶液5μL，涡旋混匀后，进样分析。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算回收率。
5.8稀释可靠性
分别配制地舒单抗猴血清的20000ng/mL和8000ng/mL的工作液，200000ng/mL的工作液采用空白猴血清稀释40倍，地舒单抗检测标示浓度为500ng/mL；10000ng/mL的工作液采用空白猴血清稀释5倍，地舒单抗检测标示浓度为1600ng/mL；每个平行配制6份样品。将测得浓度与标示浓度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差(RE％)应在±15％范围内。
5.9自动进样器温度下放置24h稳定性
按“2样品前处理”项下方法分别配制地舒单抗血浆的低、高浓度(6、1600ng/mL)的质控样品(QC)，每个浓度配制6个样品，置自动进样器温度下放置24h后，测定样品浓度，由测定样品浓度与标示浓度的相对误差(RE％)评价样品置自动进样器温度下放置稳定性。将测得浓度与标示浓度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15％范围内。
6方法学验证结果
6.1选择性结果
由图4空白血清代表色谱图(UPLC-MS/MS检测猴血清中地舒单抗浓度空白血清(Blank)代表色谱图)和图5LLOQ代表色谱图(UPLC-MS/MS检测猴血清中地舒单抗浓度LLOQ(2ng/mL)代表色谱图)可知，目标肽段LEPEDFAVFYCQQYGSSPR(SEQ ID NO.5)和内标SRLEPEDFAVFYCQQYGSSPR13C6(氨基酸序列为SEQ ID NO.7)肽段的分离度良好，在相应的保留时间范围内未出现明显的内源性干扰。
6.2标准曲线
由图6标准曲线代表性色谱图(UPLC-MS/MS检测猴血清中地舒单抗浓度线性代表图(线性范围为2～2000ng/mL))可知，目标肽段LEPEDFAVFYCQQYGSSPR(SEQ ID NO.5)的线性范围均为2-2000ng/mL，线性r大于0.99，线性良好。
6.3精密度和准确度
精密度和准确度的方法学验证结果见表12，低、中、高浓度QC样品批间精密度CV％分别为8.80％、3.55％、5.49％；批间准确度RE％分别2.21％、5.42％、0.25％，均符合接受标准。
6.4定量下限(LLOQ)
定量下限的精密度和准确度方法学验证结果见表13，定量下限的批间CV％为7.06％，批间RE％为-4.69％。
6.5残留
残留考察结果见表14，定量上限后的空白样品中的残留不超过定量下限的20％，内标不超过S1内标响应的5％，残留符合接受标准。
6.6基质效应
基质效应的验证结果见表15，低浓度(6ng/mL)、高浓度(1600ng/mL)下的目标肽段峰面积比值平均值分别为59.97％、62.05％，内标的峰面积比值平均值分别为58.36％、62.61％，内标归一化的基质因子平均值分别为1.03和0.99，总体变异系数分别为0.09％和0.06％，符合接受标准。
6.7提取回收率
提取回收率的验证结果见表16和表17，UPLC-MS/MS测定猴血清中地舒单抗在低、高浓度下平均回收率分别为63.78％、67.52％；内标在低、高浓度下平均回收率分别为67.44％、72.61％。
6.8稀释可靠性
稀释可靠性考察验证结果见表18，20000ng/mL的工作液采用空白猴血清稀释40倍，检测标示浓度为500ng/mL，测得浓度与标示浓度相对误差(RE％)为6.14％，CV％为3.77％；8000ng/mL的工作液采用空白猴血清稀释5倍，检测标示浓度为1600ng/mL测得浓度与标示浓度相对误差(RE％)为5.27％，CV％为5.18％；稀释40倍和5倍的可靠性符合要求。
6.9自动进样器温度下放置24h稳定性
进样器温度下放置24h稳定性结果见表19，低浓度(6ng/mL)、高浓度(1600ng/mL)下检测浓度与标示浓度的相对误差(RE％)分别为-1.10％、-0.33％，CV％分别为4.04％、7.52％，自动进样器温度下放置24h的稳定性符合要求。
方法学验证结果表明该方法符合猴血清中地舒单抗浓度的定量检测分析。
7地舒单抗对食蟹猴连续1个月皮下重复给药毒性试验伴随毒代动力学试验样品检测
7.1试验设计
8只食蟹猴，雌雄各半，采用皮下给药方式，给药剂量为9.9mg/kg，每周给药1次，共给药5次。第1次给药，采血点为给药前(0h)、给药后0.5、1、4、8、12、24、72、120、168h。第2～4次给药，采血点为给药前(0h)、给药后2h，即分别对应的时间点为168、170、336、338、504、506h。第5次给药的2、4、7、9号动物进行毒代动力学血样采集，采血时间点为给药前(0h)、给药后0.5、1、4、8、12、24、72、120、168h，15天(336h)、29天(672h)、43天(1008h)、57天(1344h)、71天(1680h)、84天(1992h)。每次采血容积约1.5ml，血液在室温存放30分钟至2小时后，将采血管用2000g相对离心力，20℃离心15分钟后取上层血清。血清样本放于-80℃或以下的冰箱中保存，采用方法学验证合格的UPLC-MS/MS检测方法检测猴血清中地舒单抗的浓度。
7.2检测结果
猴血清中地舒单抗个体血药浓度-时间曲线图见图7(食蟹猴血清中地舒单抗浓度个体血药浓度-时间曲线图)。对食蟹猴皮下注射给药地舒单抗注射液，每周给药一次，连续给药5次，第5次给药后，8例动物中有4例动物(B4、B7、B8、B9)出现血药浓度快速下将的情况，与ADA出现阳性有关。
表12 UPLC-MS/MS测定猴血清中地舒单抗的精密度和准确度验证结果表
Figure BDA0002729755090000151
表13 UPLC-MS/MS测定猴血清中地舒单抗浓度LLOO的精密度和准确度验证结果表
Figure BDA0002729755090000152
表14残留检测结果
Figure BDA0002729755090000153
Figure BDA0002729755090000161
表15 UPLC-MS/MS测定猴血清中地舒单抗浓度基质效应验证结果表
Figure BDA0002729755090000162
表16猴血清中地舒单抗浓度提取回收率验证结果表
Figure BDA0002729755090000163
表17内标提取回收率验证结果表
Figure BDA0002729755090000164
Figure BDA0002729755090000171
表18猴血清中地舒单抗浓度稀释可靠性考察验证结果表
Figure BDA0002729755090000172
表19猴血清中地舒单抗浓度进样器温度下放置24h稳定性验证结果表
Figure BDA0002729755090000173
根据实施例2可知：
本发明采用液质联用技术，对猴血清中地舒单抗的浓度进行定量检测，对检测方法进行完全方法学验证，方法学验证结果表明检测方法选择性好，精密度和准确度高，可应用于猴生物样品分析，解决了传统配体结合分析法检测范围较窄，制备特异性结合试剂费时费力且价格昂贵，选择性差，易受到内源性抗体干扰检测结果不可靠等问题。
本发明的灵敏度高，已发表文献的定量下限的灵敏度为100ng/mL，而本发明的定量下限为2ng/mL，灵敏度提高50倍；
本发明制备了能与地舒单抗特异性结合的磁珠，能特异性的对地舒单抗进行免疫捕获，极大的提高了灵敏度；
本发明样品处理过程包括酶解、过SPE柱纯化富集使用的均为商品化处理包，前处理流程标准化，重现性好，可实现大批量检测，检测精密度和准确度较高；
本发明的检测方法线性范围宽，可应用于临床研究和临床药物浓度检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东莱恩医药研究院有限公司
广州中科莱恩药物研究有限公司
<120> 一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
1 5 10 15
Tyr Ala Asp Ser Val Lys
20
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
1 5 10 15
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Ser Pro Arg
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Arg Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
20
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr
1 5 10 15
Gly Ser Ser Pro Arg
20
<210> 8
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 9
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (10)

1.一种定量检测血清中地舒单抗的液质联用方法，包括以下步骤：
1)使用NCBI BLAST、Sequence Alignment Tool和In-silico Digestion预测地舒单抗的候选特征性肽段，以待测血清对应的物种为目标种属，确定种属的序列同源性，舍弃受该种属内源性蛋白干扰的肽段；
2)使用ProteinWorks Kits对地舒单抗进行酶解，使用Waters UPLC I-Class VionMS/MS Qtof对酶解后的样品进行检测，确认候选特征性肽段的带电荷状态和主要碎片离子，选择灵敏度较高的肽段作为定量分析的目标肽段，并根据选择的肽段合成类似肽段作为内标；
3)使用能与地舒单抗特异性结合的磁珠对血清样品中的地舒单抗进行免疫捕获，再使用ProteinWorks Auto-eXpress Low kit对免疫捕获的血清样品进行酶解，酶解后样品再经ProteinWorks μElution SPE Clean-up Kit纯化富集；
4)使用空白血清分别配制系列浓度的地舒单抗线性工作液和内标工作液；
5)得到定量分析的目标肽段和内标后，使用型号为Waters UPLC H-Class XEVO TQ-XS的液相色谱质谱联用仪对步骤3)纯化富集后的样品进行液相色谱和质谱定量检测；
所述步骤1)和3)没有时间先后顺序的限定，所述步骤3)和4)没有时间先后顺序的限定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述地舒单抗的候选特征性肽段包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的肽段。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述物种包括人和猴。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，当所述物种为人时，人定量分析的目标肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，人同位素内标为C端用13C6标记的氨基酸序列如SEQID NO.6所示的肽段；当所述物种为猴时，猴定量分析的目标肽段的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，猴同位素内标为C端用13C6标记的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的肽段。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述能与地舒单抗特异性结合的磁珠的制备方法包括以下步骤：
a)对小鼠大剂量皮下注射给予地舒单抗注射液，每周给药一次，连续给药5周，从小鼠腹水中提取抗地舒单抗抗体，并使用ProteinA磁珠对抗地舒单抗抗体进行亲和纯化，得到纯化后的抗地舒单抗的抗体；
b)将活化生物素共价交联到纯化后的抗地舒单抗的抗体上得到生物素化抗地舒单抗抗体；
c)将生物素化抗地舒单抗抗体与链酶亲和素磁性微球混合，反应30～40min，制备成磁性微球，即得与地舒单抗特异性结合的磁珠。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述免疫捕获包括以下步骤：
将清洗后的能与地舒单抗特异性结合的磁珠与血清样品混合，震荡后，置于磁力架上弃去上清，使用TBS清洗两次后，加入洗脱溶液进行洗脱，将洗脱液与中和试剂混合，得到免疫捕获后的血清地舒单抗样品。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述液相色谱质谱联用仪使用的色谱柱包括ACQUITY
Figure RE-FDA0002847672320000021
Peptide BEH系列的色谱柱。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述色谱的定量检测条件包括：
色谱柱为ACQUITY
Figure RE-FDA0002847672320000022
Peptide BEH系列色谱柱；
流动相A为乙酸水溶液，所述乙酸水溶液中乙酸在乙酸水溶液中的体积百分含量为0.3％；
流动相B为甲酸乙腈溶液，所述甲酸乙腈溶液中甲酸在甲酸乙腈溶液中的体积百分含量为0.2％；
样品室温度为8℃；
柱温为30～50℃；
进样量为2～7μL；
流速为0.25mL/min；
梯度洗脱条件为：0～1.5min，流动相A 80％，流动相B 20％；1.5～3min，流动相A 80％→74％，流动相B 20％→26％；3～6.5min，流动相A 74％→5％，流动相B 26％→95％；6.5～8min，流动相A 5％，流动相B 95％；8～9min，流动相A 5％→80％，流动相B 95％→20％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述质谱的定量检测条件包括：
采用电喷雾电源(ESI)，正离子模式，多重反应检测，主要参数包括：Capillaryvoltage：1.00～2.00kV；Sample cone：20～30V；Source temperature：150℃；Desolvationtemperature：500～600℃；Desolvation gas flow：900～1000L/h；Cone gas flow：10L/h。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于，当所述物种为人时，人定量分析的目标肽段的质谱条件包括：MRM离子对：745.36→696.82，锥孔电压：35V，碰撞能量16V；
人同位素内标的质谱条件包括：MRM离子对：768.17→513.26，锥孔电压：40V，碰撞能量26V；
当所述物种为猴时，猴定量分析的目标肽段的质谱条件包括：MRM离子对：765.17→696.99，锥孔电压：40V，碰撞能量14V；
猴同位素内标的质谱条件包括：MRM离子对：783.64→547.96，锥孔电压：38V，碰撞能量18V。
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