CN110531015A - 一种检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用高效液相色谱串联质谱的方法检测血清中英夫利昔单抗的浓度及其应用。该方法的步骤具体包括：标准品的制备，酶切反应，高效液相色谱分离，串联质谱检测和血清中英夫利昔单抗的检测；本发明还公开了一种用高效液相色谱串联质谱的方法在检测血清中英夫利昔单抗浓度中的应用。本发明采用乙腈进行蛋白沉淀，提取后使用色谱串联三重四极杆质谱仪检测，前处理步骤简单，可以有效去除血清基质干扰，特异性好；另外，本发明用高效液相色谱串联质谱仪进行检测，同时定性并精准定量血清中英夫利昔单抗，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好，成本低廉。

Description

一种检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法及其应用
技术领域
本发明属于质谱分析检测技术领域，具体涉及一种检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法及其应用，更具体的，涉及一种用高效液相色谱质谱串联的检测方法检测血清中的英夫利昔单抗浓度及该检测方法的应用。
背景技术
炎症性疾病是人类健康的一个很大的威胁，而肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在一系列炎症性疾病中发挥了关键的作用，因此，TNF-α抑制剂如今成为了治疗多种炎症性疾病的主要治疗药物。英夫利昔单抗是FDA批准的首个抗TNF-α的人鼠嵌合单抗，自20世纪90年代中期开始应用于临床，并在多种疾病中起到很好的疗效。然而，英夫利昔单抗的治疗仍然存在一些问题。不同的病人接受英夫利昔单抗药治疗后表现出不同的临床反应，而且有证据表明许多患者经过这种抗TNF-α单抗治疗后病情没有很好的改善，这可能是因为血中药物水平不足或是抗抗体产生的缘故。由此可见，准确监测血清中英夫利昔单抗药及抗抗体的水平对于这类治疗具有重要的意义。首先，测定英夫利昔单抗的浓度有利于个体用药剂量的调节并有助于调整病人的治疗策略。其次，对接受英夫利昔单抗药治疗的患者进行血药浓度的监测将能提高对疾病的控制力。再次，这也符合治疗药物监测的发展(TDM)。TDM是通过利用各种现代化的测试手段，对生物样品(包括尿、血、唾液等)中的药物及代谢产物浓度进行定量分析，用各种药物动力学方法来计算最佳的给药剂量和给药间隔时间等，探索一个比较安全的血药浓度范围，从而实现个体化的给药方案，达到一个有效、安全和经济的用药目的。TDM利用血药浓度来调整给药剂量，在较大程度上能够降低用药(包括加药、减药、换药、停药等)的盲目性，使药物在病人中发挥最佳疗效，而不良反应最小。
在临床前及临床药代动力学研究中，免疫学方法是常用来定量分析生物基质中蛋白水平的技术，例如酶联免疫吸附方法(ELISA)和放射免疫法(RIA)。稳定同位素内标和抗肽段抗体捕获(SISCAPA)技术是另一种定量复杂基质中抗体的策略，它与ELISA有相似之处，结合稳定性同位素内标，通过抗肽段抗体来捕获目标抗体，再进行定量。除了以上几种方法，化学发光法(ELC)和同源迁移率变动分析方法(HMSA)也被用来测定血清中的抗体浓度。尽管这些技术都显示了较大的实用性，但仍然存在一些缺点包括方法之间的一致性较差以及存在干扰因素等。ELISA是血药浓度测定中最为常用的方法，这是由于此方法异常灵敏且能实现高通量。但是，这种基于抗体的定量方法存在几个不足，如动态范围不宽，会发生交叉反应，方法开发耗时长，高可变性等，因此，ELISA不能满足现代TDM和药代动力学的要求。由此看来，建立一种更为快速、准确的血药浓度测定方法，对临床上单抗类药物的药代动力学研究具有重大的意义。
LC-MS/MS技术，已经在制药行业被称为小分子药定量的“金标准”，如今在复杂生物基质中大分子定量方面的应用也越来越受关注，这是由于此方法相比传统的免疫学分析方法具有其独特的优点，如方法开发快，较高的特异性，准确度和精确度高，并且能检测到降解产物和翻译后修饰等。
现有技术中，LC-MS/MS方法在多种生物基质中的灵活的转移性，使得此方法在非临床转向临床应用时方法优化程度极小，如在文献Stable-isotope dilution LC-MS forquantitative biomarker analysis和Quantitation of a recombinant monoclonalantibody in monkey serum by liquid chromatography-mass spectrometry中，大部分用LC-MS/MS方法来对蛋白进行定量的例子都是先将蛋白进行酶切后选择一个或多个特征性肽段，再利用特征肽段和借助稳定性同位素内标来对蛋白进行定量。
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高效液相色谱串联质谱检测血清中英夫利昔单抗的方法，能够有效的提高检测的特异性和速度，避免了传统免疫方法可能出现的交叉反应和干扰问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法及其应用。
具体地，是一种用高效液相色谱串联质谱的方法检测血清中英夫利昔单抗的浓度及该检测方法的应用。
为了达到上述目的，首先，本发明提供一种检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)标准品的制备：将英夫利昔单抗标准品用乙腈稀释到若干个不同浓度备用，每个浓度的标准品中加入等量的含有已知浓度内标的乙腈溶液，高速离心后取上清液，上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板用于高效液相色谱串联质谱上样分析；
(2)酶切反应：加入内标肽段，再加入胰蛋白酶，涡旋混匀，50℃条件下反应10-90min，进行酶切；酶切完后加入甲酸水溶液终止胰酶切；
(3)高效液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在C18分析柱上对样品进行分析；
(4)串联质谱检测：色谱上分离后的样品进入到质谱进行检测，利用三重四极杆质谱中的反应监控模式特异性地检测英夫利昔单抗，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；
(5)血清中英夫利昔单抗的检测：取血清样本，加入含内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血清上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板上备用，用于高效液相色谱串联质谱上样分析；
高效液相色谱串联质谱上样分析步骤同步骤(3)、步骤(4)，液相色谱质谱检测得到英夫利昔单抗与同位素肽内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中英夫利昔单抗的含量；
进一步的，步骤(1)中所述英夫利昔单抗乙腈溶液的浓度范围为0.01nmol/L～100nmol/L；
进一步的，所述步骤(1)中两次离心条件为：低温离心机在17000g离心力4℃下离心5min；
进一步的，步骤(1)中所述内标为同位素肽段SKSINSA(A→A13C3 15N)THYAESVK，浓度为100nmol/L-500nmol/L；
进一步的，所述步骤(2)中高效液相色谱分离条件为：：Waters ACQUITY UPLCC18Column:pore size particle size 1.7μm，2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：60℃；进样量：10μL；流速：0.3mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈溶液；
进一步的，所述步骤(2)中取一定含量标准品的含量根据离心管容积V1可调，具体值V2区间为0.01V1-0.1V1；
进一步的，所述步骤(2)中加入内标肽段的含量V3取值区间为0.5V2-1.5V2；
进一步的，所述步骤(2)中加入胰蛋白酶的质量为英夫利昔单抗标准品质量的5-10倍，对应体积为V4，最小值取0.5μL；
进一步的，所述步骤(2)中加入终止胰酶切的甲酸水溶液含量为体系总含量V(V＝V2+V3+V4)的10％-40％；
进一步的，所述步骤(2)中加入含有乙腈的水溶液后离心，加入的量为V2；
进一步的，所述高效液相色谱串联质谱检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法，其特征在于，所述步骤(4)中质谱检测条件中，英夫利昔单抗的质谱检测参数先用标准品优化，然后利用三重四极杆质谱中的多重反应监控模式以及优化好的特定质谱参数特异性地检测英夫利昔单抗，所述质谱检测参数为：为电喷雾针电压：2.5kV，去溶剂气流速：800L/H，去溶剂气温度：500℃，锥孔气流速：100L/H，检测为负离子模式，反应监控模式(MRM)；
进一步的，所述步骤(5)中血清与含内标乙腈溶液的体积比为1:3；
进一步的，所述步骤(5)中加入一定含量的含有乙腈的水溶液配置方式为水：乙腈：甲酸的体积比为9:1:0.05，体积为V2；
其次，本发明提供一种用高效液相色谱串联质谱的方法在检测血清中英夫利昔单抗浓度的应用。
本发明的有益效果
(1)采用乙腈进行蛋白沉淀，提取后使用色谱串联三重四极杆质谱仪检测，前处理步骤简单，可以有效去除血清基质干扰，特异性好；
(2)高效液相色谱串联质谱仪进行检测，同时定性并精准定量血清中英夫利昔单抗，检测时间短，通量高，检测灵敏度高，特异性好，成本低廉。
附图说明
图1是本发明的检测方法的流程示意图。
图2是实施例3中的英夫利昔单抗及内标的色谱洗脱出峰的绝对保留时间图。
图3是实施例3中的英夫利昔单抗标准曲线。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
英夫利昔单抗标准品、内标同位素肽段【SKSINSA(A→A13C3 15N)THYAESVK】胰蛋白酶(30mg/mL)均采购于Sigma Aldrich公司；
标准品和内标首先用乙腈进行溶解，然后保存在-80℃环境，需要进行实际样品检测时，再利用乙腈将内标同位素肽段稀释浓度为270nmol/L，作为工作液。
实施例1标准品制备
分别取0.1mL 8个不同浓度(0.1nmol/L、1nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L、60nmol/L、100nmol/L)的英夫利昔单抗乙腈溶液到1.5mL EP管中，再分别加入0.3mL低温保存的上述同位素肽段内标乙腈溶液(270nmol/L)和30mg/mL的胰蛋白酶0.5μL，用旋涡混合器充分混合后，用1mL的移液枪转移0.3mL含同位素肽段内标乙腈溶液到另外一个1.5mL EP管，然后用离心浓缩冷冻系统冻干；
冻干后加入25μL的水：乙腈：甲酸体积比为9:1:0.05溶液。混合组分使用低温离心机在17000g离心力4℃下离心5min，取上清液于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析。
实施例2高效液相色谱分离
利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在C18分析柱上对实施例1制得的样品上清液进行色谱洗脱分离，通过控制洗脱条件，分离出所需检测的英夫利昔单抗；
高效液相色谱分离条件为：Waters ACQUITY UPLC C18Column:pore sizeparticle size 1.7μm，2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：60℃；进样量：10μL；流速：0.3mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈溶液；
洗脱梯度如下表1所示：
表1
序号 时间(min) 流速(mL/min) A％ B％ 曲线值
1 0.00 0.30 99.00 1.00 -
2 2.00 0.30 99.00 1.00 6
3 4.00 0.30 80.00 20.00 6
4 8.00 0.30 10.00 90.00 6
5 10.00 0.30 99.00 1.00 1
实施例3质谱检测并制标准曲线
液相色谱上将英夫利昔单抗和基质分离进入到三重四极杆质谱进行检测，利用三重四极杆质谱中的反应监控模式特异性地检测英夫利昔单抗的含量，并绘制标准曲线图；
根据不同的色谱洗脱时间，设置不同的检测窗口以及参数，检测参数先用标准品优化，然后利用三重四极杆质谱中的多重反应监控模式以及优化好的特定质谱参数特异性地检测英夫利昔单抗和同位素肽内标。
质谱为Waters Xevo TQD IVD(Waters,Milford,MA)；质谱检测条件如下：电喷雾针电压：2.5kV，去溶剂气流速：800L/h，去溶剂气温度：500℃，锥孔气流速：100L/h，检测为正离子模式，反应监控模式(MRM)，每个待测物的特定反应离子对、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等如下表2所示：
表2
反应监控模式(MRM)通过两次筛选，即第一个四极杆进行特定母离子筛选，第二个四极杆进行母离子碎裂产生子离子，第三个四极杆进行特定子离子筛选，具有非常好的特异性，通过选择反应监控检测到的离子流，以及对应的保留时间，来确定英夫利昔单抗的检测，再利用添加已知量的同位素肽段内标进行定量。
如图2所示，样品通过超高压液相色谱分离后，选择性检测英夫利昔单抗的洗脱出峰时间，并且被质谱选择反应监控模式检测到，其中，英夫利昔单抗保留时间为4.48min，同位素肽段内标保留时间为4.43min。
标准曲线图如图3所示，检测限定义为信噪比>3，定量限定义为信噪比>10，保留时间为色谱洗脱出峰的绝对保留时间，检测物质的相关系数r2均>0.99.
配置低、中、高三个浓度的标准样品各5份，同一天按实验方法预处理后测试，计算批内精度，结果见下表3；连续三天，配置低、中、高三个浓度的标准样品各5份，按实验方法预处理后测试，综合三天的数据，取各批次的平均值，计算批间精度，结果见下表4。批内批间精密度RSD均小于10％，表明检测结果准确，可重复。
英夫利昔单抗批内和批间精密度数据如下表3和表4所示：
表3：批内精密度(n＝5)
表3：批间精密度(n＝3)
浓度(nmol/L) 5 20 80
批次1 4.865±0.211 21.935±1.089 81.443±2.214
批次2 4.798±0.308 19.812±0.986 79.89±2.091
批次3 5.125±0.198 20.687±0.72 82.243±1.859
RSD％ 4.85 4.48 2.53
实施例4血清中英夫利昔单抗的检测
取0.1mL血清样品到1.5mL EP管中，再加入0.3mL低温保存的同位素肽段内标乙腈溶液，用旋涡混合器充分混合后，用1mL的移液枪转移0.3mL同位素肽段内标乙腈溶液到另外一个1.5mL EP管，然后用真空冷冻干燥器冻干；
冻干后加入25μL的水：乙腈：甲酸体积比为9:1:0.05溶液，混合组分使用低温离心机在17000g离心力4℃下离心5min，取上清液于96孔板用于液相色谱串联质谱上样分析；
液相色谱串联质谱分析同实施例2和实施例3，质谱检测得到英夫利昔单抗与同位素肽内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中英夫利昔单抗的含量。

Claims (7)

1.一种检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法，其特征在于，该方法利用高效液相色谱串联质谱的方式检测血清中英夫利昔单抗的浓度。
2.如权利要求1所述的一种检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法，具体包括如下步骤：
(1)标准品的制备：将英夫利昔单抗标准品用乙腈稀释到不同浓度备用，每个浓度的标准品中加入等量的含有已知浓度内标的乙腈溶液，制得标准品；
(2)酶切反应：取步骤(1)中的标准品，加入内标肽段，再加入胰蛋白酶，涡旋混匀，50℃条件下反应10-90min，进行酶切；酶切完后加入甲酸水溶液终止胰酶切；高速离心后取上清液，上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板用于高效液相色谱串联质谱上样分析；
(3)高效液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在C18分析柱上对样品进行分析；
(4)串联质谱检测：色谱上分离后的样品进入到质谱进行检测，利用三重四极杆质谱中的反应监控模式特异性地检测英夫利昔单抗，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；
(5)血清中英夫利昔单抗的检测：取血清样本，加入含内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血清上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板上备用，用于高效液相色谱串联质谱上样分析；
高效液相色谱串联质谱上样分析步骤同步骤(3)、步骤(4)，液相色谱质谱检测得到英夫利昔单抗与同位素肽内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中英夫利昔单抗的含量。
3.如权利要求2所述的一种检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述英夫利昔单抗乙腈溶液的浓度范围为0.01nmol/L～100nmol/L；
步骤(1)中所述内标为同位素肽段SKSINSA(A→A13C3 15N)THYAESVK，浓度为100nmol/L-500nmol/L；
所述步骤(2)中两次离心条件为：低温离心机在17000g离心力4℃下离心5min；
所述步骤(2)中高效液相色谱分离条件为：：Waters ACQUITY UPLC C18Column:poresize particle size 1.7μm，2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：60℃；进样量：10μL；流速：0.3mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸乙腈溶液；
所述步骤(2)中取一定含量标准品的含量根据离心管容积V1可调，具体值V2区间为0.01V1-0.1V1；
所述步骤(2)中加入内标肽段的含量V3取值区间为0.5V2-1.5V2；
所述步骤(2)中加入胰蛋白酶的质量为英夫利昔单抗标准品质量的5-10倍，对应体积为V4，最小值取0.5μL；
所述步骤(2)中加入终止胰酶切的甲酸水溶液含量为体系总含量V(V＝V2+V3+V4)的10％-40％；
所述步骤(2)中加入含有乙腈的水溶液后离心，加入的量为V2。
4.如权利要求2所述的一种检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法，其特征在于：
所述步骤(4)中质谱检测条件中，英夫利昔单抗的质谱检测参数先用标准品优化，然后利用三重四极杆质谱中的多重反应监控模式以及优化好的特定质谱参数特异性地检测英夫利昔单抗。
5.如权利要求4所述的一种检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法，其中，所述质谱检测参数如下，电喷雾针电压：2.5kV，去溶剂气流速：800L/H，去溶剂气温度：500℃，锥孔气流速：100L/H，检测为负离子模式，反应监控模式(MRM)。
6.如权利要求2所述的一种检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法，所述步骤(5)中血清与含内标乙腈溶液的体积比为1:3；所述步骤(5)中加入一定含量的含有乙腈的水溶液配置方式为水：乙腈：甲酸的体积比为9:1:0.05，体积为V2。
7.一种用高效液相色谱串联质谱的方法在检测血清中英夫利昔单抗浓度中的应用。
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