CN108267534A

CN108267534A - 聚乙二醇修饰蛋白质药物的酶解肽图分析方法

Info

Publication number: CN108267534A
Application number: CN201611267294.XA
Authority: CN
Inventors: 马永; 颜莎; 王俊
Original assignee: CHANGZHOU GENSUN INSTITUTE OF BIOMEDICINE Co Ltd; ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Current assignee: ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Priority date: 2016-12-31
Filing date: 2016-12-31
Publication date: 2018-07-10

Abstract

本发明涉及聚乙二醇修饰蛋白肽图分析方法，该方法首先需要破坏蛋白的高级结构以充分暴露酶切位点，随后再进行蛋白酶解；其次本发明方法通过选择合适的色谱填料孔径，获得了针对PEG修饰蛋白的分析性能理想的肽图分析方法。本方法的有效使用，可以在肽图中有效检出PEG修饰肽段，克服传统方法中无法区分修饰蛋白与未修饰蛋白的技术难题。

Description

聚乙二醇修饰蛋白质药物的酶解肽图分析方法

技术领域

本发明涉及一种适用于聚乙二醇化蛋白质的肽图分析方法，尤其是适用于聚乙二醇化药用蛋白酶的肽图分析方法，更具体的是一种聚乙二醇化门冬酰胺酶、激肽原酶或精氨酸脱亚胺酶的肽图分析方法。

背景技术

药用蛋白和多肽普遍存在生物稳定性差、体内半衰期短和具有免疫原性等缺点，通常采用基因工程改造和化学修饰等手段对其进行改造修饰以克服上述缺点。聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG已经被广泛地应用于蛋白多肽类药物的修饰研究，蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性、改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一。

肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。肽图分析对蛋白质及多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义。

中国药典2015年版关于肽图分析规定在第四部通则3405·第一法，该方法系胰蛋白酶裂解蛋白质后，采用反相高效液相色谱法鉴定蛋白质一级结构。依据本方法的原理，采用该方法对PEG修饰前后蛋白进行肽图分析时，由于未修饰蛋白的所有肽段均不带PEG，而修饰蛋白的部分肽段连接有PEG，因此PEG修饰前后的蛋白在反向色谱图上应当是有区别的。然而发明人参考药典方法对聚乙二醇修饰蛋白进行肽图分析时，并未发现修饰蛋白与未修饰蛋白的区别，即PEG修饰肽段并未在肽图检测中出现，除检测方法不适用外，同时还存在PEG修饰蛋白酶解不彻底的问题。

发明内容

本发明要解决现有肽图分析方法应用于聚乙二醇修饰蛋白时酶解不彻底、PEG修饰肽段未出现的技术问题。

本发明提供的聚乙二醇修饰蛋白肽图分析方法，首先需要充分破坏蛋白的高级结构，以充分暴露酶切位点，酶解蛋白；其次选择色谱柱填料孔径进行反相色谱分析。

所述色谱柱是填料为烷基硅烷键合硅胶反相色谱柱。

常规的反向色谱柱孔径有等。作为优选，色谱柱填料孔径为大于的反相柱，如

作为优选，任何破坏蛋白的高级结构，以充分暴露酶切位点的方法均可用于本发明，如用DTT，TECP-HCl等还原剂进行处理、超声、样品加热处理后再用酶解。如100℃加热处理5-10min后，再向反应体系中加入蛋白酶。

作为优选，所用蛋白酶为胰蛋白酶。

作为优选，本方法中流动相A:0.1％TFA+水/乙腈(95:5，v/v)，流动相B:0.1％TFA+水/乙腈(35:65，v/v)。或者，流动相A:0.1％FA+水；流动相B:0.1％FA+乙腈。

作为优选，本方法中流速为：0.1-1mL/min，柱温为：30-65℃，检测波长为：214nm。

本发明的技术效果：通过对聚乙二醇修饰蛋白加热处理，使其酶解充分；通过选择合适孔径的色谱柱，可以在肽图中有效检出PEG修饰肽段。

附图说明

图1比较例1肽图分析色谱图

图2比较例2肽图分析色谱图

图3比较例3肽图分析色谱图

图4比较例4RP18柱对未酶解样品的肽图分析色谱图

图5比较例4C4柱对未酶解样品的肽图分析色谱图

图6比较例4C4柱对酶解样品的肽图分析色谱图(214nm)

图7比较例4C4柱对酶解样品的肽图分析色谱图(ELSD)

图8实施例1肽图分析色谱图(专属性验证)

图9实施例1重复性验证色谱图

图10本发明方法应用于聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶的肽图分析色谱图(C4柱)

图11本发明方法应用于聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶的肽图分析色谱图(C18柱)

图12本发明方法应用于聚乙二醇修饰KLK1的肽图分析色谱图

具体实施方式

以下实施例所用聚乙二醇定点修饰的门冬酰胺酶(PEG-ASP)，其相关制备信息可参见中国专利CN105802948，所用PEG修饰剂为分子量为40KD的Y-PALD-40K,以下简称“PEG-ASP”。ASP是具有4个亚基的同源四聚体，本申请中PEG-ASP的两个亚基各自偶联一个PEG，另两个亚基未偶联PEG。

以下实施例所用PEG修饰精氨酸脱亚胺酶(PEG-ADI)，具体由以下方法制备得到：

1、修饰反应

按照ADI:PEG：还原剂摩尔比1:4：600称取Y-PALD-40K PEG(购自北京键凯)，还原剂氰基硼氢化钠。修饰反应在4℃下进行，反应时间12-20小时。

2、修饰样品纯化

色谱法条件：流动相A为20mM PB(pH7.2)，流动相B为20mM PB含1M NaCl(pH7.2)。

色谱柱：阴离子交换柱(购自GE公司，Q sepharose HP)

0-25％B液洗脱，洗脱体积为20个柱体积，分步收集样品。即得所需PEG-ADI。

以下实施例所用PEG修饰激肽释放酶(KLK1)，具体由以下方法制备得到：

1、修饰反应

按KLK1:PEG修饰剂(M-SPA-10K)为1:100的摩尔比进行反应，在4℃下反应12h。

2、修饰样品纯化

色谱法条件：平衡缓冲液A液：20mM的Tris-HCl(pH9.0)，洗脱缓冲液B液：含0.1MNaCl的20mM的磷酸缓冲液(pH8.0)。

色谱柱：Q离子交换柱(购自GE公司，HiTrap Q HP 5mL)

流动相配比为0-50％B液，洗脱体积为10个柱体积，洗脱时间为20分钟。

比较例1

参考中国药典方法对门冬酰胺酶(以下简称“ASP”)、聚乙二醇定点修饰的门冬酰胺酶进行肽图分析，取1mg/mL的ASP溶液及PEG-ASP溶液，分别用1％碳酸氢铵溶液充分透析，按1:50(mg/mg)加人胰蛋白酶溶液(取序列分析纯胰蛋白酶适量，加1％碳酸氢铵溶液溶解，制成0.lmg/ml的溶液)到溶液中，于37℃保温24小时后，按1:10加入50％醋酸溶液，以10000转/min离心5分钟，精密量取上清液100μL，分别注入液相色谱仪。色谱条件如下:

色谱柱：XBridge shield RP18色谱柱(规格：4.6*250mm,孔径

流动相A:0.1％TFA+水，流动相B:0.1％TFA+乙腈；

样品池温度为2-8℃,样品由自动进样器上样100μL，再经色谱柱分离，流速为1.0ml/min，检测波长214nm，柱温30℃。相关液相梯度如下：

表1

色谱图如图1所示。结果显示，采用上述方法进行肽图分析存在如下两个方面的问题：1、ASP及PEG-ASP均酶解不完全，酶解处理过程不适用；2、PEG-ASP的部分亚基结合有PEG，在反相色谱上PEG-ASP应与ASP色谱有差别，而图1中并未体现。

推测可能的原因如下：第一，ASP及PEG-ASP因具有复杂的高级结构，若前期不对蛋白进行适当处理，则影响酶切位点的暴露而导致酶解不完全，因此后续尝试加热或添加还原剂来打开蛋白的高级结构；第二，修饰前后ASP反相图谱结果一致，可能与现有的色谱梯度无法将二者在极性上的差异体现出来有关。

比较例2

在比较例1基础上改变酶解条件(酶解前100℃处理样品)并调整流动相梯度，对ASP、PEG-ASP进行肽图分析，具体方法如下：

1、将待检样品进行脱盐处理，置换到1％NH₄HCO₃缓冲液(pH约7.8)中。

2、将样品稀释至1.0mg/ml，取100微升，100℃加热5min。

3、每100ug加热过的样品溶液中加入1ug胰蛋白酶，37℃，酶切16-24h。

4、终止反应：向反应体系中1:10(v/v)加入10μL的50％的乙酸溶液终止反应。

5、RP-HPLC检测,色谱条件:

XBridge shield RP18色谱柱(4.6*250mm，孔径

流动相A:0.1％TFA+水，流动相B:0.1％TFA+乙腈；

表2

色谱图如图2所示。结果显示:(1)与图1相比，图2结果显示分离出了更多的肽段，表明酶解前用100℃处理样品能较好地促进样品酶解；(2)方法色谱梯度导致基线波动较大,重复性较差；(3)修饰前后蛋白肽图无明显差别，未见PEG修饰肽段，说明采用该比较例的流动相梯度的改变对于修饰前后蛋白的检出无明显影响。

比较例3

在比较例2的基础上调整色谱流动相比例及梯度(其余步骤同比较例2)，分别对ASP酶解后、PEG-ASP酶解后、ASP酶解前、PEG-ASP酶解前样品进行肽图分析，其中酶解前样品置换入1％NH₄HCO₃缓冲液(pH约7.8)中，再定容至1.0mg/mL，取100μL进样。

流动相A:0.1％TFA+水/乙腈(95:5，v/v)，流动相B:0.1％TFA+水/乙腈(35:65，v/v)；

流动相梯度如下：

表3

色谱图如图3所示。实验结果显示：(1)经流动相梯度及流动相比例的改变，色谱图重现性及基线波动情况有了较大的改善。(2)ASP、PEG-ASP均只出现一个峰。PEG修饰的肽段仍未能有效检出。

比较例4

色谱条件同比较例3，在UV检测器后串联ELSD检测器，分别进样Y-PALD-40K(PEG-ASP所用PEG修饰剂)及PEG-ASP样品(未酶解)，结果如图4所示。LSU为ELSD的信号，AU为214nm信号。

在比较例3条件基础上，将RP18柱更改为XBridge Protein BEH C4色谱柱(4.6×250mm,孔径分别进样Y-PALD-40K、PEG-ASP，结果如图5所示。

图4、5结果表明带PEG的肽段或者Y-PALD-40K在反相C18柱上不能出峰。而在C4柱上可以出峰。

以C4柱进行分析PEG-ASP酶解后、ASP酶解后样品，采集214nm及ELSD色谱图，见图6、7。结果：(1)同时比较214nm条件下PEG-ASP及ASP图谱(图6)，结果在55.313min出现信号强烈的色谱峰，推测极可能为带有PEG的肽段。(2)同时比较ELSD条件下PEG-ASP及ASP图谱(图7)，结果与反相图谱一致。

以C4柱进行分析时，结果与C18柱类似，即带PEG的肽段或者Y-PALD-40K在C4柱上也不能出峰。

以C18柱进行分析时，结果与C4柱类似，可用于PEG-ASP的肽图分析。

分析：Y-PALD-40K及其修饰的肽段在C18或C4色谱柱上未能出峰，在C4柱或C18上可以出峰；Y-PALD-40K及其修饰的肽段未能在C18或C4色谱柱出峰的原因很可能是填料孔径太小,为限制了大分子PEG及其修饰肽段的检出。由此可知，在进行PEG修饰蛋白肽图分析时，色谱填料孔径对分析性能影响很大。本领域技术人员可以合理推测，填料孔径更大的反相色谱柱也能用于PEG-ASP的肽图分析。

实施例1本发明的肽图分析方法应用于ASP及PEG-ASP

1、检测方法

(1)、酶解：

将待检样品进行脱盐处理，置换到1％NH₄HCO₃缓冲液(PH7.8)中；

将样品稀释至1.0mg/mL，取100μL，100℃加热5min；

每100ug加热过的样品溶液中2ug胰蛋白酶(1mg/ml,加入2μl)，37℃酶切16-24h；

终止反应：向反应体系中1:10(v/v)加入10μl的50％的乙酸溶液终止反应；

同法制得PEG-ASP酶解空白及ASP酶解空白(即未酶解的PEG-ASP、ASP样品，以2μL1％NH₄HCO₃缓冲液(pH约为7.8)代替2μL酶)。

(2)、RP-HPLC检测

色谱柱：XBridge Protein BEH C4色谱柱(4.6×250mm，

流动相：A:0.1％TFA+水/乙腈(95:5，v/v)；B:0.1％TFA+水/乙腈(35:65，v/v)

样品池温度为2-8℃,样品由自动进样器上样50μL，再经色谱柱分离，流速为1.0ml/min，检测波长214nm，柱温30℃。

色谱梯度：

表4

2、方法验证

2.1专属性

分别进针PEG-ASP酶解样品溶液(按照实施例1的“1、酶解”方法配置)、ASP酶解样品溶液(按照实施例1的“1、酶解”方法配置)、PEG-ASP酶解空白(即PEG-ASP未酶解样品，按照实施例1的“1、酶解”方法配置，但以2μL1％NH₄HCO₃代替2μL酶)、ASP酶解空白(即ASP未酶解样品，按照实施例1的“1、酶解”方法配置，但以2μl 1％NH₄HCO₃代替2μL酶)、空白溶液(置换缓冲液1％NH₄HCO₃)。

采集色谱图，分别进行比较，结果见图9。

由图9可知，45min色谱峰在PEG-ASP酶解空白、ASP酶解空白中均有出现，推测其为未修饰的ASP亚基；49min色谱峰在PEG-ASP酶解空白中出现，在ASP酶解空白中未出现，推测为PEG修饰的ASP亚基；PEG-ASP酶解样品与ASP酶解样品色谱图相比，前者在51min处有明显的色谱峰，其余谱峰个数及比例无明显区别，推测51min处为PEG修饰的N端肽段。空白溶液无谱峰干扰；样品溶液与标准溶液的肽图一致。

2.2重复性

补充中试三批样品肽图检测，具体实验结果如图9所示。根据图9显示，说明方法的重复性良好。图9中，51min左右为PEG修饰的N端，34min为未修饰N端。

实施例2本发明的肽图分析方法应用于聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶(PEG-ADI)

1.酶解：

500μL的PEG-ADI样品中，加入20μL 0.5mM DTT和20μL2M脲，室温变性反应30min。脱盐置换于1％NH₄HCO₃溶液中，取100μL，100℃加热5min。冷却后加入2μg胰酶，37℃酶解16～24h。向体系中1:10(V/V)加入10μL的50％乙酸终止反应。处理好的样品离心备用。

2.RP-HPLC检测：

色谱条件：

色谱柱：XBridge Protein BEH C4色谱柱(4.6×250mm,

梯度如表5所示：

表5

Time(min)	流速(mL/min)	％A	％B
				0	0.1	99	1
2	0.1	99	1
				30	0.1	1	99
30.1	0.1	99	1
				35	0.1	99	1

柱温：30℃

检测波长：214nm

上样量：20μl

实验结果如图10所示。

同样实验条件下，用的反相C4柱替换的反相C4柱实验结果如图11所示，分析结果可见：的反相柱相比于的反相柱在出峰数目上有明显的优势。而用的反相C18柱是效果与的反相C4柱基本相同。

实施例3本发明的肽图分析方法应用于聚乙二醇修饰的KLK1(PEG-KLK1)

1.酶解

1)将含有PEG-KLK1样品的酶溶液进行离心超滤进行浓缩，4000rpm离心30min，取0.3M Tris-HCl(pH7.8，含1M TCEP HCl和10mM EDTA)溶液重悬蛋白，进行溶解，将样品浓度定容至约1.0mg/mL。

2)向反应体系中加入1:25(v/v)μL 0.5M碘乙酸，室温避光反应30min。

3)向反应体系中加入1:50(v/v)μL 0.5M DTT，混匀。

4)取上述混合液过G25Desalting柱子进行脱盐，置换于含2M尿素的Tris-HCl(pH7.8)缓冲液中。

5)取脱盐后的混合液100μL，以1:50(v/v)比例加入2μg胰酶(使用前用Resuspension Buffer溶解至1mg/ml,加入2μL)，37℃酶切18-24h。

6)终止反应：向反应体系中1:50(v/v)加入2μL的TFA溶液终止反应。

7)同法制得PEG-KLK1对照品及酶解空白(以等体积0.3M Tris-HCl缓冲液代替胰酶)。

8)样品离心：将上述酶解及酶解空白样品于12000rmp离心5min后取上清备用。

2.对酶解处理后的样品进行分析，UPLC检测,采集色谱图，比较酶切前后样品色谱图的变化情况。

色谱柱：ACQUITY UPLC Peptide BEH C18，1.7um，2.1*150mm,41#

流动相：A:0.1％FA水；B:0.1％FA乙腈，梯度如表6所示：

表6

Time(min)	流速(ml/min)	％A	％B
				0	0.2	95	5
40	0.2	30	70
				40.01	0.2	95	5
48	0.2	95	5

样品池温度为10℃,样品由自动进样器上样50μL，再经色谱柱分离，流速为0.2ml/min，检测波长214nm，柱温65℃。

图12表明相比的C18色谱柱，C18色谱柱的色谱峰的检出率更高，更适合用于PEG修饰蛋白的肽图分析。

Claims

1.聚乙二醇修饰蛋白肽图分析方法，首先破坏蛋白的高级结构以充分暴露酶切位点，随后进行蛋白酶解；其次选择孔径不小于的色谱柱填料进行反相色谱分析。

2.权利要求1所述聚乙二醇修饰蛋白肽图分析方法，其特征是色谱柱是填料为烷基硅烷键合硅胶的反相色谱柱。

3.权利要求2所述聚乙二醇修饰蛋白肽图分析方法，其特征是所述色谱柱填料孔径为或

4.权利要求1所述聚乙二醇修饰蛋白肽图分析方法，其特征是充分破坏蛋白的高级结构以充分暴露酶切位点的方法选自用对样品进行DTT，TECP-HCl等还原剂处理、超声处理或加热处理。

5.权利要求1所述聚乙二醇修饰蛋白肽图分析方法，其特征是蛋白酶解所用蛋白酶为胰蛋白酶。

6.权利要求1所述聚乙二醇修饰蛋白肽图分析方法，其特征是：流动相A:0.1％TFA+水/乙腈(95:5，v/v)，流动相B:0.1％TFA+水/乙腈(35:65，v/v)。

7.权利要求1所述聚乙二醇修饰蛋白肽图分析方法，其特征是：流动相A:0.1％FA+水；流动相B:0.1％FA+乙腈。

8.权利要求1所述聚乙二醇修饰蛋白肽图分析方法，其特征是：流速为：0.1-1ml/min，柱温为：30-65℃，检测波长为：214nm。