CN113366309A - 乳和乳产品的β-酪蛋白分析 - Google Patents

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Abstract

一种测试乳和乳衍生的乳产品中A1型β‑酪蛋白变体和A2型β‑酪蛋白变体的存在和定量的方法，使用胰凝乳蛋白酶消化，接着通过LC‑MS分析来测定β‑酪蛋白消化肽的浓度，并使用该浓度来计算存在的A1型β‑酪蛋白变体和A2型β‑酪蛋白变体的含量。

Description

乳和乳产品的β-酪蛋白分析
技术领域
本发明涉及动物乳以及由动物乳制得的乳制品中的β-酪蛋白的分析。特别地，本发明涉及测试乳和乳衍生的乳制品中的A1型β-酪蛋白和A2型β-酪蛋白以及相关的β-酪蛋白变体的存在和定量。
发明背景
全世界人口消费的乳，主要是牛乳，是人类饮食中的主要蛋白质来源。牛乳通常每升包含约30至40克蛋白质。酪蛋白构成该蛋白的最大成分(80％)，而β-酪蛋白约占酪蛋白的37％。在过去的二十年中，越来越多的证据主体表明酪蛋白(尤其是β-酪蛋白)参与了许多生理或生物作用(有些与健康疾病有关)。
β-酪蛋白可分类为A1型β-酪蛋白和A2型β-酪蛋白。在大多数人群食用的牛乳中，A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白是主要的β-酪蛋白。基于β-酪蛋白的209个氨基酸序列的67位的氨基酸残基，许多β-酪蛋白变体可以分类为A1型或A2型。A1β-酪蛋白与A2β-酪蛋白只有一个氨基酸不同。组氨酸氨基酸位于67位，而脯氨酸位于A2β-酪蛋白的相同位置。但是，这种单个氨基酸差异对于肠道中β-酪蛋白的酶消化至关重要。67位组氨酸的存在允许通过酶消化产生包含七个氨基酸的蛋白质片段，称为β-酪啡肽(casomorphin)-7(BCM-7)。因此，BCM-7是A1β-酪蛋白的消化产物。在A2β-酪蛋白的情况下，67位被脯氨酸占据，脯氨酸阻碍了该位置的氨基酸键的裂解。因此，BCM-7不是A2β-酪蛋白的消化产物。
其他β-酪蛋白变体，如B、C、F、G和H1变体，在67位也具有组氨酸，而A3、D、E、H2和I变体在67位和A2变体一样具有脯氨酸。但这些变体在来自欧洲来源的乳牛的乳中只是以非常低的水平被发现，或根本没有发现。因此，在本发明的内容中，术语A1β-酪蛋白可以是指在67位具有组氨酸的任何β-酪蛋白，而术语A2β-酪蛋白可以是指67位具有脯氨酸的任何β-酪蛋白。
BCM-7是一种阿片样肽，且可以结合并激活全身的阿片样受体，并且已被证明可以限制谷胱甘肽/抗氧化剂的产生，从而导致细胞功能和基因表达的改变。1BCM-7具有穿越胃肠道壁并进入循环的能力，使其能够通过阿片样受体影响全身和细胞活动。申请人和其他人先前已经确定了在乳或乳产品中发现的A1β-酪蛋白的摄入与I型糖尿病，2冠心病，3神经系统疾病，4肠炎，5乳糖不耐症症状，6血糖水平的调节，7认知功能，8和肠道菌群9之间存在不良关联。
这些发现全都涉及BCM-7或消化时产生BCM-7的β-酪蛋白变体对患有临床上诊断的疾病或病症的个体的行为特征的影响。所述发现没有涉及健康个体。此外，众所周知基于细胞培养物实验的研究结果不能可靠地外推至体内或临床效果，因为关于BCM-7产生、转运和影响组织暴露的代谢以及因此关于生物反应存在许多变量。例如，已知阿片样物质的浓度及其对阿片样受体的亲和力对于细胞反应是重要的。
将β-酪蛋白变体与食用乳和乳产品的不良影响联系起来的科学证据体越来越多，这导致了重要的是能够可靠和准确地分析乳和乳产品中是否存在β-酪蛋白变体，特别是A1β-酪蛋白，及其在氨基酸序列的67位具有组氨酸的相关变体。
牛乳中β-酪蛋白的总水平的测定是相对不重要的。最常见的方法涉及通过液相色谱(LC)分离完整蛋白质，接着使用紫外线检测仪(UV)或通过质谱(MS)来检测。这种方法最近由Vincent等10用于研究澳大利亚的乳，以及由Givens等11用于研究英国的乳。在两种情况中，分开检测主要的β-酪蛋白变体，但因为纯化的β-酪蛋白变体不可商购作为分析标品，因此它们不能单独定量。此外，两种方法都需要使用高分辨率质谱仪，并且在存在过量的A2β-酪蛋白变体的情况下也不够灵敏来区分微量的A1β-酪蛋白变体。
可替换的方法涉及消化乳蛋白并定量所得到的肽。这种方法由Lutter等采用12，他们使用胰蛋白酶来消化各种食物，以确定主要乳蛋白的浓度。使用内部校准通过LC-MS/MS来分析样品。尽管这种方法比完整蛋白质方法更灵敏且更特异性，但其缺乏区分β-酪蛋白变体的关键能力。
尽管以上公开的方法可能适用于鲜乳的分析，但没有方法满足现代单变体乳产品所有必需的分析要求。这对于如UHT乳或婴儿配方乳粉这样的产品尤为真实，这些产品在加工过程中可以产生蛋白质的显著改变。在分析过程中，这些基质中的酪蛋白的行为方式可能不同于来自鲜乳的“野生型”酪蛋白，并且因此分析程序必须根据基质进行适应性改变。例如，使用LC-UV分析来自生乳样品的完整β-酪蛋白针对每个β-酪蛋白变体产生了单独的峰，这对于定性和定量分析都适用，因为它们可以容易地鉴定和整合。相反，应用于婴儿配方乳粉的相同程序产生了宽峰，其不能彼此分辩并且不适用于定性或定量分析。
使用用蛋白水解酶消化的分析方法也可能遇到阻止其在β-酪蛋白分析中的应用的问题。最广泛应用的蛋白酶是胰蛋白酶，其接触β-酪蛋白时，产生含有48个残基的长肽。这种肽的相当长的长度意味着它容易发生多种修饰，这导致质量的变化，这反过来使使用质谱的检测实质性地复杂化。另外，其长度使得这种肽难以合成用作分析标品，且因此，意味着基于胰蛋白酶的消化方法不适用于某些乳产品中β-酪蛋白的定量分析。因此，对于β-酪蛋白分析，使用替代酶是必需的。
申请人现在已经研发了一种用于乳和乳产品中商业相关水平的A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白变体的绝对测定方法。
因此本发明的目的是提供一种用于分析动物乳和源自动物乳的产品中β-酪蛋白变体的方法，或至少提供一种现有方法的有用替换方法。
发明概述
在本发明的第一方面中，提供了一种以高于80％的准确性测定组合物中A1型β-酪蛋白变体或A2型β-酪蛋白变体含量的方法，其中A1型β-酪蛋白变体是在β-酪蛋白氨基酸序列的67位具有组氨酸的β-酪蛋白变体，而A2型β-酪蛋白变体是在β-酪蛋白氨基酸序列的67位具有脯氨酸的β-酪蛋白变体，并且其中组合物是乳或从乳制得的产品，其包括步骤：
(i)在能够通过胰凝乳蛋白酶消化组合物中的β-酪蛋白的条件下将组合物接触胰凝乳蛋白酶；
(ii)获得β-酪蛋白消化肽的水溶液；
(iii)通过使用液相色谱-质谱分析混合物测定以下的浓度：
a)溶液中存在的两种或更多种β-酪蛋白消化肽，其中每种肽包含8至20个氨基酸残基，并且在对应于β-酪蛋白氨基酸序列的67位的位置具有组氨酸；和
b)溶液中存在的两种或更多种β-酪蛋白消化肽，其中每种肽包含8至20个氨基酸残基，并且在对应于β-酪蛋白氨基酸序列的67位的位置具有脯氨酸；和
(iv)使用步骤(iii)中测定的β-酪蛋白消化肽的浓度计算组合物中A1型β-酪蛋白变体的浓度或组合物中A2型β-酪蛋白变体的浓度。
在本发明的某些实施方案中，A1型β-酪蛋白变体包括A1β-酪蛋白、Bβ-酪蛋白、Cβ-酪蛋白、Fβ-酪蛋白、Gβ-酪蛋白和H1β-酪蛋白中的任何一种或多种。例如，A1型β-酪蛋白变体可以仅包括A1β-酪蛋白。
在本发明的某些实施方案中，A2型β-酪蛋白变体包括A2β-酪蛋白、A3β-酪蛋白、Dβ-酪蛋白、Eβ-酪蛋白、H2β-酪蛋白和Iβ-酪蛋白中的任何一种或多种。例如，A2型β-酪蛋白变体可以仅包括A2β-酪蛋白。
在一些实施方案中，A1型β-酪蛋白变体仅包括A1β-酪蛋白，而A2型β-酪蛋白变体仅包括A2β-酪蛋白。
在本发明的一些实施方案中，测定了在对应于β-酪蛋白氨基酸序列的67位的位置具有组氨酸的三种或四种β-酪蛋白消化肽的浓度。在一些实施方案中，在乳是牛乳的情况中，β-酪蛋白消化肽选自VYPFPGPIHN、SLVYPFPGPIHN、VYPFPGPIHNSLPQ和SLVYPFPGPIHNSLPQ
在本发明的一些实施方案中，测定了在对应于β-酪蛋白氨基酸序列的67位的位置具有脯氨酸的三种或四种β-酪蛋白消化肽的浓度。在一些实施方案中，在乳是牛乳的情况中，β-酪蛋白消化肽选自VYPFPGPIPN、SLVYPFPGPIPN、VYPFPGPIPNSLPQ和SLVYPFPGPIPNSLPQ。
在本发明的某些实施方案中，使用液相色谱-质谱分析的混合物含有对应于a)和b)的每种肽的同位素标记的肽。可以在步骤(i)中用胰凝乳蛋白酶处理前或在步骤(i)中用胰凝乳蛋白酶处理后，将同位素标记的肽加入组合物中。
在本发明的一些实施方案中，在乳是牛乳的情况中，同位素标记的肽可以对应于如下的消化肽：
Figure BDA0003132788680000041
Figure BDA0003132788680000051
在本发明的一些实施方案中，在乳是牛乳的情况中，同位素标记的肽可以对应于如下的消化肽：
消化肽 同位素标记的肽
VYPFPGPIPN (*V)YPFPGPIPN
SLVYPFPGPIPN SL(*V)YPFPGPIPN
VYPFPGPIPNSLPQ VYPFPGPIPNS(*L)PQ
SLVYPFPGPIPNSLPQ SL(*V)YPFPGPIPNSLPQ
在本发明的一些实施方案中，在乳是牛乳的情况中，在步骤(iii)中测定以下肽的浓度：VYPFPGPIHN、SLVYPFPGPIHN、VYPFPGPIHNSLPQ、SLVYPFPGPIHNSLPQ、VYPFPGPIPN、SLVYPFPGPIPN、VYPFPGPIPNSLPQ和SLVYPFPGPIPNSLPQ。
在本发明的一些实施方案中，以高于90％的准确性，高于95％的准确性或高于99％的准确性测定组合物中A1型β-酪蛋白变体和A2型β-酪蛋白变体的含量。
在本发明的一些实施方案中，组合物是牛乳或从牛乳制得的乳产品。
在本发明的一些实施方案中，乳是鲜乳、生乳、乳粉、从乳粉重建的液体乳、脱脂乳、均质乳、浓缩乳、淡炼乳(evaporated milk)、调味乳、UHT乳、巴氏杀菌乳或未巴氏杀菌的乳。在本发明的一些实施方案中，乳产品是婴儿配方乳、奶油、酸奶、夸克(quark)、干酪(cheese)、黄油(butter)或冰淇淋。
附图简述
图1显示了使用本发明的方法以及完整的HPLC分析分析的系列相关乳标品中的A1型β-酪蛋白的比例。
图2显示了与自样品的蛋白质含量所确定的理论β-酪蛋白水平相比，通过本发明的方法测量的系列乳样品和乳产品中的β-酪蛋白的含量。
详述
定义
术语“β-酪啡肽-7”或“BCM-7”是指蛋白质片段Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile，在氨基酸序列67位具有组氨酸而不是脯氨酸的牛β-酪蛋白变体在酶消化时产生的七肽。
术语“A1型β-酪蛋白变体”表示在其氨基酸序列的67位具有组氨酸残基的任何β-酪蛋白变体，并且包括A1β-酪蛋白、Bβ-酪蛋白、Cβ-酪蛋白、Fβ-酪蛋白和Gβ-酪蛋白中的任何一种或多种。
术语“A2型β-酪蛋白变体”表示在其氨基酸序列的67位具有脯氨酸残基的任何β-酪蛋白变体，并且包括A2β-酪蛋白、A3β-酪蛋白、Dβ-酪蛋白、Eβ-酪蛋白、H1β-酪蛋白、H2β-酪蛋白和Iβ-酪蛋白。
术语β-酪蛋白氨基酸序列的“67位”表示从β-酪蛋白(除去信号肽后)的N末端计数序列的氨基酸残基编号为67的位置。
术语“AQ”，有时候称为“AQUA”，表示“绝对定量”并且表示本发明的方法可以用于测量作为样品分数(例如，质量分数)的β-酪蛋白的绝对浓度，与没有测量绝对浓度但测量相对于样品中另一组分的β-酪蛋白的比例，或一种β-酪蛋白变体相对于另一种的比例的其他方法相对。
在整个说明书中，除非特异性另外指出或内容另外需要，提及单个步骤、物质组成、步骤的组或物质组成的组应当考虑包括一个或数个(即，一个或多个)那些步骤、物质组成、步骤的组或物质组成的组。
任何提及本说明书中所述的数字范围(例如，1至10)还旨在包括提及该范围内所有相关的数字(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内任何合理的数字范围(例如，2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)，并且因此包括明确公开本说明书中描述的所有范围的所有子范围。这些仅是特定目的的示例，并且所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合应被认为在本说明书中以类似的方式明确地陈述。
在整个说明书中，词语“包括(comprise)”，或变化，如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，将理解为表示包括所述的元素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组。
本领域技术人员将认识到本说明书中描述的本发明除具体描述的那些外还可以进行改变和修改。应该理解，本发明包括所有这样的改变和修改。本发明还单独地或共同地包括在本说明书中提及或指示的所有步骤或特征，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个。
本发明的范围不受本说明书中描述的具体实施例的限制，这些具体实施例仅是为了举例说明的目的。功能等效的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。
本说明书中对现有技术文件的任何引用均不应被认为是承认该现有技术是本领域公知的或形成本领域公知常识的一部分。
测试方法
本发明提供了一种用于测定组合物中A1型β-酪蛋白变体和A2型β-酪蛋白变体的含量的方法。重要地，所述方法能够以高于80％的准确性，且甚至高达100％的准确性，测定两种类型的β-酪蛋白变体的含量。因为在过去十年对不含A1β-酪蛋白(和相关变体)的乳和乳产品的需求显著增加，因此准确性的程度变得重要。消费者以及制造商和供应商需要知道产品是否基本上不含A1型β-酪蛋白变体。
所述方法涉及用丝氨酸蛋白酶胰凝乳蛋白酶消化组合物中的β-酪蛋白蛋白质。申请人已经确定了消化过程产生特定的可鉴别的肽。可以测定从组合物产生的每种肽的存在和含量并且随后将含量用于计算组合物中A1型β-酪蛋白变体和A2型β-酪蛋白变体的百分比含量。分析的肽的数量(例如，2、3、4或更多种)决定了准确性程度。例如，仅有两种肽的分析可以产生组合物中两种类型的β-酪蛋白变体的百分比含量的最终测定为仅有80％的准确性水平。三种肽的分析可以产生约90％的准确性水平，并且分析四种肽可以产生约95％的准确性水平。
待分析的组合物可以为来自任何动物的乳或从动物乳制得的产品。组合物还可以是含有已经从乳获得的β-酪蛋白的非乳产品。
乳可以是鲜乳、生乳、乳粉、从乳粉重建的液体乳、脱脂乳、均质乳、浓缩乳、淡炼乳(evaporated milk)、调味乳、UHT乳、巴氏杀菌乳或未巴氏杀菌的乳，或任何其他形式的乳。
本发明的方法最适合于分析牛乳和牛乳产品，但也可以容易地适用于来自多种动物的乳和乳产品，所述动物包括人、绵羊、山羊、马、猪、水牛、鹿和任何其他在其乳中产生酪蛋白的哺乳动物。
组合物也可以是任何乳衍生的产品，如婴儿配方乳、奶油、酸奶、夸克(quark)、干酪(cheese)、黄油(butter)或冰淇淋。
在待分析的组合物是乳的情况中，需要最小的样品准备。优选将乳样品中含有的蛋白质变性，例如，通过用变性剂(如盐酸胍或尿素)处理。
在乳产品是固体或半固体的情况中，样品准备通常涉及将均一含量的产品称重至分开的容器中并将酪蛋白蛋白质提取至已知体积的溶液中。
使用胰凝乳蛋白酶消化样品中的β-酪蛋白可以在适于能够进行有效消化的条件下进行。通常将样品在约37℃下孵育几小时，接着用试剂(如甲酸)淬灭，以将胰凝乳蛋白酶灭活。
一旦样品已经经受胰凝乳蛋白酶消化和任何消化后样品准备，将某些同位素标记的肽加入样品中，接着进行LC-MS(液相色谱-质谱)分析。基于申请人先前确定的胰凝乳蛋白酶分解A1型β-酪蛋白变体产生消化肽VYPFPGPIHN、SLVYPFPGPIHN、VYPFPGPIHNSLPQ和SLVYPFPGPIHNSLPQ以及分解A2型β-酪蛋白变体产生消化肽VYPFPGPIPN、SLVYPFPGPIPN、VYPFPGPIPNSLPQ和SLVYPFPGPIPNSLPQ来选择同位素标记的肽。
同位素标记的肽可以来自以下的组：(*V)YPFPGPIHN、SL(*V)YPFPGPIHN、VYPFPGPIHNS(*L)PQ、SL(*V)YPFPGPIHNSLPQ、(*V)YPFPGPIPN、SL(*V)YPFPGPIPN、VYPFPGPIPNS(*L)PQ和SL(*V)YPFPGPIPNSLPQ，其中*V表示同位素标记的缬氨酸残基和*L表示同位素标记的亮氨酸残基。应当认识到，肽的任一个或多个氨基酸残基可以被同位素标记。然而，通常优选同位素标记的缬氨酸或亮氨酸。
在本发明的一些实施方案中，所用的同位素标记的肽对应于根据表1的消化肽。
表1：消化肽及其同位素标记的等价体
Figure BDA0003132788680000081
Figure BDA0003132788680000091
本发明的方法需要将至少两种上述同位素标记的肽加入样品中。然而，为了更高的准确性，将三种、四种或可能更多种同位素标记的肽加入样品中。
LC-MS/MS能够基于肽的滞留时间以及MS/MS模式分析时产生的片段的离子比例容易地鉴定出任一种消化肽的存在。这可替换地称为多重反应监测(MCM)模式，或选择反应监测(SRM)模式。每种肽对混合物中存在的同位素标记的内标肽的反应和同时运行的标准曲线的比较使得可以测定每种肽的浓度，从其可以计算组合物中的A1型β-酪蛋白变体和组合物中的A2型β-酪蛋白变体的浓度。
实施例的讨论
以下提供了实验步骤的实例。实施例1显示了怎样准备样品用于分析。这通常包括将β-酪蛋白提取成含水状态，其中它们可以通过离液变性剂(如尿素)的作用解折叠，使得之后胰凝乳蛋白酶对样品的作用更有效。在液体样品(如全乳或UHT乳)的情况中，这就简单涉及将等份的样品转移至容器中并添加变性剂。对于固体或半固体样品，这涉及溶解于提取缓冲液(通常是含水缓冲液)中的固体的精确限定溶液的制备。随后，以用于液体样品的相同方式来处理样品。
实施例2描述了胰凝乳蛋白酶消化步骤。将变性的样品在小心控制的条件下暴露于胰凝乳蛋白酶溶液。这些条件通常包括控制溶液pH的缓冲剂，因为蛋白水解酶仅在狭窄的pH范围内是有活性的。条件通常还包括消化的机械搅拌，以降低或消除物质转移限制，并加热使反应加速。这导致了β-酪蛋白和基质内的其他蛋白质的受控分解，以产生一组可以被独特地鉴定为源自特定蛋白质的肽。预定的时间段后，通过在有机溶剂中添加浓酸溶液来停止反应(“淬灭”)，这立即停止了消化。然后通过添加同位素标记的内标肽来强化样品，随后将其用于计算β-酪蛋白的浓度。
实施例3描述了使用三重四极杆质谱检测，使用液相色谱分析样品。这导致了肽在空间上和时间上的相互分离，这可以通过将洗脱液通过以多重反应监测模式操作的质谱仪或等效的特异性检测程序(如高分辨率选择的离子监测)进行单独定量。通过整合以及同位素标记的内标确定靶标肽的峰面积。然后通过与标准曲线比较，将峰面积比用于确定靶标肽的浓度。为了确保肽得到正确鉴定，在程序中采用了质量控制标准，如滞留时间匹配和离子比例匹配。
在实施例4中，将肽的浓度用于计算亲本β-酪蛋白的浓度。通常，基于肽质量与亲本蛋白质质量的比例来推算转换系数，并用于从肽浓度转换成蛋白质浓度。因为靶标肽具有重叠序列，随后可以对浓度求和，以发现总的A1型β-酪蛋白含量，和总的A2型β-酪蛋白含量，以及从这些值衍生的图，如样品中A1型β-酪蛋白相对于总β-酪蛋白的比例。
实施例5显示了该方法在各种乳产品范围分析中的应用。将结果与现有测定乳或乳产品样品中的A1型β-酪蛋白百分比方法的结果进行比较和对比。对于一定范围的基质类型，显示出样品中β-酪蛋白的浓度与基于标记的蛋白质含量的预期值一致，并且因此样品中A1型β-酪蛋白的比例是正确的。此外，A1型β-酪蛋白的比例与以前的简单基质(如乳或乳粉)的方法一致，但可为诸如婴儿配方乳等严重改变的产品提供更准确的估算。结果显示于表6中。
表6的第1列指出了所分析产品的身份。第2栏显示了通过凯氏定氮分析测定的每个样品的总蛋白质含量。可以将这与第3列进行比较，其显示了产品标签上指定的蛋白质含量。通常，这两种测量之间有很好的一致性，表明标记的蛋白质含量是准确的。第4列显示了每个样品的理论β-酪蛋白含量，该值是通过将标记的蛋白质值乘以0.32来确定的，0.32是公认的转换系数，代表乳产品中β-酪蛋白相对于总蛋白质含量的质量分数。
第9列显示了总β-酪蛋白含量，以g/100g来表示，作为A1型β-酪蛋白和A2型β-酪蛋白的总和，如通过本发明的方法测定的。这些通常与第4列中的值显示出很好的一致性，表明该方法是准确的并且适合于目的。
第10列显示了总β-酪蛋白含量的A1型β-酪蛋白的百分比，以A1型β-酪蛋白与A2型β-酪蛋白的总和计算。可将这些结果与第5列中的结果进行比较，其呈现了A1％，其是使用高效液相色谱和紫外线检测通过完整蛋白质分析确定的。对于未经过显著改变的乳和乳产品，这两个数字之间存在很好的一致性。但是，在婴儿配方乳样品的情况中，存在显著差异，由于其制造的性质，它们不适合完整分析并产生错误的结果。将第10列与第6列进行比较时，会看到类似的趋势，其显示了使用原始酶法利用样品的胰蛋白酶消化以及随后相对体积稀释的相对乳标品进行校准而确定的A1型β-酪蛋白的百分比。
图1显示了使用本发明的方法分析的一系列相对乳标品中的A1型β-酪蛋白的比例，以及完整的HPLC分析。样品是通过对两只单独的动物的乳进行体积稀释而制成的，其中一只被证实为A1/A1基因型，并且因此产生含有纯A1型β-酪蛋白的乳，另一只为A2/A2基因型，因此产生含有纯A2型β-酪蛋白的乳。如通过相关系数(R2＝0.9996)所示的，围绕最佳拟合线的数据点的紧密聚类表明当前方法是精确的。解释线的斜率(0.9861)表示当前方法也是准确的。
图2显示了与从样品的蛋白质含量确定的理论β-酪蛋白水平相比，通过本发明的方法测量的一系列乳样品和乳产品中的β-酪蛋白含量。关于最佳拟合线的数据点的良好聚类表明该方法是精确的，相关系数(R2＝0.9075)也表示了这一点。线的斜率(0.9075)也表明该方法是准确的。
参考以下实施例进一步描述本发明。将认识到所要求保护的本发明不是旨在以任何方式受到实施例的限制。
实施例
实施例1：样品准备
液体样品-对于非粘性液体样品，例如，乳，将液体(40μL)转移至2mL离心管中。加入尿素溶液(120μL，500g/L)，使蛋白质变性，并且随后将混合物在2000RPM下混合5min。
固体样品-对于固体样品或粘性液体样品，将样品(5.00±0.01g)称重至falcon管(50ml)中。加入碳酸氢铵溶液(46.6ml，4g/L)，振荡混合物以润湿所有粉末。在50℃下孵育15min后，将混合物振荡至均匀。在婴儿配方乳粉的情况中，将样品(100μL)转移至2mL离心管中，加入酪蛋白沉淀剂(150g/L乙酸铵pH4.2，1000μL)，并将混合物在2000RPM下混合5min，然后在5000RCF下离心5min。倾析上清液后，将酪蛋白沉淀剂(1000μL)添加到固体沉淀物中，并将混合物在2000RPM下混合5min，然后在倾析上清液之前在5000RCF下离心5min。将水(1000μL)加入固体沉淀物中，重复混合和离心步骤，并倾析出上清液。加入尿素溶液(120μL，500g/L)，使蛋白质变性，然后将混合物在2000下混合5min。
实施例2：胰凝乳蛋白酶消化
将胰凝乳蛋白酶溶液(1000μL)加入根据实施例1制备的样品中。将混合物在37℃下孵育8小时，同时在200RPM下振荡。加入淬灭溶液(120μL，500g/L甲酸溶液)，并将混合物在2000RPM下混合5min，并在10,000RCF下离心10min。将样品(980μL)转移到LC小瓶中，添加同位素标记的肽标品溶液(20μL)，并将混合物涡旋10sec。通过将表1中的每种肽(2.00±0.10mg)称重到2mL聚乙烯离心管中，制备了标记的肽标品溶液(Biomatik，定制，≥95.0％)。通过加入含有0.1％甲酸的20％乙腈来溶解肽。调节体积以获得1,000.0mg/L的浓度。例如，如果仅称重1.90mg，则加入1.90mL溶液。表2的标记的肽标品与表3的靶标肽相对应。
表2：同位素标记的肽标品
Figure BDA0003132788680000121
表3：靶标肽
Figure BDA0003132788680000122
Figure BDA0003132788680000131
实施例3：LC-MS/MS分析
使用Thermo Vanquish LC系统将样品(1μL)注入连接有Phenomenex KrudCatcher的Waters Xselect HSS T3 C18柱(2.5um×2.1mm×50mm)上。分离参数总结在表4中。简而言之，从20％乙腈直至40％乙腈运行梯度以分离靶标肽，在此期间，洗脱液通过至质谱仪进行检测。然后，在开始下一次注入前，先以升高的流速洗涤柱子。在此洗涤期间，样品中不需要的成分被转移到废物中，并且关闭了采集。
表4：梯度和选定的采集参数
时间 ％A ％B 流速 转移 MS采集
0.0 80 20 0.5 1-6 关
0.5 80 20 0.5 1-2 开
4.0 60 40 0.5 1-2 关
4.5 0 100 0.8 1-6 关
6.0 0 100 0.8 1-6 关
6.5 80 20 0.8 1-6 关
7.5 80 20 0.5 1-6 关
8.0 80 20 0.5 1-6 关
使用Thermo TSQ Altis质谱仪进行了质谱采集，以位置离子MRM模式操作。每个肽都具有定量和定性过渡，总共获得32个MRM。所有这些在采集期间都连续监测，而无需使用排程。驻留时间设为10m，Q1和Q3分辨率设为2Da，和CID气体设置为2mTorr。表5中显示了过渡和相关参数的列表。
表5：十六种靶标肽监测方法的MRM数据
Figure BDA0003132788680000141
Figure BDA0003132788680000151
实施例4：A1型β-酪蛋白变体和A2型β-酪蛋白变体的浓度测定
尽管可以手动完成计算，但可以使用预先设计的数字电子表格自动进行计算。A1-β-酪蛋白变体的浓度是通过将每种肽的浓度乘以亲本蛋白质质量与肽质量的商的乘积求和，然后乘以制备因子来计算的：
Figure BDA0003132788680000152
将相同的计算用于计算A2-β-酪蛋白变体的浓度，但使用相应调整的质量：
Figure BDA0003132788680000153
制备因子，P，如下计算：
Figure BDA0003132788680000154
其中v1是提取后产品的最终体积，m1是称重的产品质量，v2是淬灭后消化管中的体积，v3是添加到消化管中的提取物的体积，v4是LC小瓶中的最终体积，和v5是转移到LC小瓶中的消化液的体积。
通过将两种多晶型物的浓度相加来计算总的β-酪蛋白浓度：
C总βCN＝CA1βCN+CA2βCN
产品中的A1-β-酪蛋白变体百分比是通过将A1-β-酪蛋白变体浓度除以A1-和A2-β-酪蛋白变体浓度之和计算的：
Figure BDA0003132788680000155
实施例5：乳和乳产品分析
根据实施例1-4中概述的方法测试了各种鲜乳、乳粉、婴儿配方乳和UHT乳样品。还准备并测试了一系列乳标品。结果显示在表4中，其中将根据本发明的方法确定的结果与用于确定β-酪蛋白含量的其他方法进行比较。
Figure BDA0003132788680000171
Figure BDA0003132788680000181
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Claims (20)

1.一种以高于80％的准确性测定组合物中A1型β-酪蛋白变体或A2型β-酪蛋白变体含量的方法，其中A1型β-酪蛋白变体是在β-酪蛋白氨基酸序列的67位具有组氨酸的β-酪蛋白变体，而A2型β-酪蛋白变体是在β-酪蛋白氨基酸序列的67位具有脯氨酸的β-酪蛋白变体，并且其中组合物是乳或从乳制得的产品，其包括步骤：
(i)在能够通过胰凝乳蛋白酶消化组合物中的β-酪蛋白的条件下将组合物接触胰凝乳蛋白酶；
(ii)获得β-酪蛋白消化肽的水溶液；
(iii)通过使用液相色谱-质谱分析混合物测定以下的浓度：
a)溶液中存在的两种或更多种β-酪蛋白消化肽，其中每种肽包含8至20个氨基酸残基，并且在对应于β-酪蛋白氨基酸序列的67位的位置具有组氨酸；和
b)溶液中存在的两种或更多种β-酪蛋白消化肽，其中每种肽包含8至20个氨基酸残基，并且在对应于β-酪蛋白氨基酸序列的67位的位置具有脯氨酸；和
(iv)使用步骤(iii)中测定的β-酪蛋白消化肽的浓度计算组合物中A1型β-酪蛋白变体的浓度或组合物中A2型β-酪蛋白变体的浓度。
2.如权利要求1中所要求的方法，A1型β-酪蛋白变体包括A1β-酪蛋白、Bβ-酪蛋白、Cβ-酪蛋白、Fβ-酪蛋白和Gβ-酪蛋白中的任何一种或多种。
3.如权利要求1或权利要求2中所要求的方法，其中A1型β-酪蛋白变体仅包括A1β-酪蛋白。
4.如权利要求1至3任一项中所要求的方法，其中A2型β-酪蛋白变体包括A2β-酪蛋白、A3β-酪蛋白、Dβ-酪蛋白、Eβ-酪蛋白、H1β-酪蛋白、H2β-酪蛋白和Iβ-酪蛋白中的任何一种或多种。
5.如权利要求1至4任一项中所要求的方法，其中A2型β-酪蛋白变体仅包括A2β-酪蛋白。
6.如权利要求1至5任一项中所要求的方法，其中A1型β-酪蛋白变体仅包括A1β-酪蛋白，而A2型β-酪蛋白变体仅包括A2β-酪蛋白。
7.如权利要求1至6任一项中所要求的方法，其中测定了在对应于β-酪蛋白氨基酸序列的67位的位置具有组氨酸的三种或四种β-酪蛋白消化肽的浓度。
8.如权利要求7中所要求的方法，其中乳是牛乳，并且β-酪蛋白消化肽选自：
(i)VYPFPGPIHN；
(ii)SLVYPFPGPIHN；
(iii)VYPFPGPIHNSLPQ；和
(iv)SLVYPFPGPIHNSLPQ。
9.如权利要求1至6任一项中所要求的方法，其中测定了在对应于β-酪蛋白氨基酸序列的67位的位置具有脯氨酸的三种或四种β-酪蛋白消化肽的浓度。
10.如权利要求8中所要求的方法，其中乳是牛乳，并且β-酪蛋白消化肽选自：
(i)VYPFPGPIPN；
(ii)SLVYPFPGPIPN；
(iii)VYPFPGPIPNSLPQ；和
(iv)SLVYPFPGPIPNSLPQ。
11.如权利要求1至10任一项中所要求的方法，其中使用液相色谱-质谱分析的混合物含有对应于来自步骤(iii)的a)和b)的每种肽的同位素标记的肽。
12.如权利要求11中所要求的方法，其中同位素标记的肽对应于如下的消化肽：
消化肽 同位素标记的肽 VYPFPGPIHN (*V)YPFPGPIHN SLVYPFPGPIHN SL(*V)YPFPGPIHN VYPFPGPIHNSLPQ VYPFPGPIHNS(*L)PQ SLVYPFPGPIHNSLPQ SL(*V)YPFPGPIHNSLPQ
。
13.如权利要求11中所要求的方法，其中同位素标记的肽对应于如下的消化肽：
消化肽 同位素标记的肽 VYPFPGPIPN (*V)YPFPGPIPN SLVYPFPGPIPN SL(*V)YPFPGPIPN VYPFPGPIPNSLPQ VYPFPGPIPNS(*L)PQ SLVYPFPGPIPNSLPQ SL(*V)YPFPGPIPNSLPQ
。
14.如权利要求1中所要求的方法，其中乳是牛乳，并且在步骤(iii)中测定了以下肽的浓度：
(i)VYPFPGPIHN；
(ii)SLVYPFPGPIHN；
(iii)VYPFPGPIHNSLPQ；
(iv)SLVYPFPGPIHNSLPQ；
(v)VYPFPGPIPN；
(vi)SLVYPFPGPIPN；
(vii)VYPFPGPIPNSLPQ；和
(viii)SLVYPFPGPIPNSLPQ。
15.如权利要求1至14任一项中所要求的方法，其中以高于90％的准确性测定组合物中A1型β-酪蛋白变体和A2型β-酪蛋白变体的含量。
16.如权利要求1至15任一项中所要求的方法，其中以高于95％的准确性测定组合物中A1型β-酪蛋白变体和A2型β-酪蛋白变体的含量。
17.如权利要求1至16任一项中所要求的方法，其中以高于99％的准确性测定组合物中A1型β-酪蛋白变体和A2型β-酪蛋白变体的含量。
18.如权利要求1至17任一项中所要求的方法，其中组合物是牛乳或从牛乳制得的乳产品。
19.如权利要求18中所要求的方法，其中乳是鲜乳、生乳、乳粉、从乳粉重建的液体乳、脱脂乳、均质乳、浓缩乳、淡炼乳、调味乳、UHT乳、巴氏杀菌乳或未巴氏杀菌的乳。
20.如权利要求18中所要求的方法，其中乳产品是婴儿配方乳、奶油、酸奶、夸克、干酪、黄油或冰淇淋。
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