BR112021008095A2 - análise de beta-caseína de leite e de produtos de leite - Google Patents

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Abstract

ANÁLISE DE BETA-CASEÍNA DE LEITE E DE PRODUTOS DE LEITE. É revelado um método para testar a presença e quantificação de variantes da beta-caseína do tipo A1 ou de beta-caseína do tipo A2, no leite e em produtos lácteos derivados do leite, usando digestão com quimiotripsina seguida por análise LC-MS para determinar as concentrações de peptídeos de digestão de beta-caseína e utilizando as suas concentrações para calcular as quantidades de variantes da beta-caseína do tipo A1 ou variantes da beta-caseína do tipo A2 presentes.

Description

“ANÁLISE DE BETA-CASEÍNA DE LEITE E DE PRODUTOS DE LEITE” CAMPO TÉCNICO
[0001] A presente invenção se refere à análise de proteínas beta-caseína presentes no leite animal e em produtos lácteos preparados a partir do leite animal. Em particular, a invenção se refere a testes para a presença e quantificação de beta- caseínas do tipo A1 e beta-caseínas do tipo A2 e variantes relacionadas à beta- caseína no leite e em produtos lácteos derivados do leite.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] O leite, principalmente leite bovino, consumido em populações de todo o mundo, é uma importante fonte de proteína na dieta humana. O leite bovino normalmente contém cerca de 30 a 40 gramas por litro de proteína. As caseínas constituem o maior componente (80%) desta proteína e as beta-caseínas constituem cerca de 37% das caseínas. Nas últimas duas décadas, o corpo de evidências que implicam as proteínas caseína, especialmente beta-caseínas, em uma série de ações fisiológicas ou biológicas (com algumas associadas a distúrbios de saúde) tem crescido.
[0003] As beta-caseínas podem ser categorizadas como beta-caseínas do tipo A1 e beta-caseínas do tipo A2. As beta-caseína A1 e beta-caseína A2 são as beta- caseínas predominantes no leite bovino consumido na maioria das populações humanas. Uma série de variantes da beta-caseína podem ser categorizadas como tipo A1 ou tipo A2 com base no resíduo de aminoácido na posição 67 da sequência de 209 aminoácidos da beta-caseína. A beta-caseína A1 difere da beta-caseína A2 por um único aminoácido. Um aminoácido histidina está localizado na posição 67, enquanto uma prolina está localizada na mesma posição da beta-caseína A2. Esta única diferença de aminoácidos é, no entanto, extremamente importante para a digestão enzimática das beta-caseínas no intestino. A presença de histidina na posição 67 permite que um fragmento de proteína composto por sete aminoácidos, conhecido como beta-casomorfina-7 (BCM-7), seja produzido por digestão enzimática. Assim, BCM-7 é um produto da digestão da beta-caseína A1. No caso da beta-caseína A2, a posição 67 é ocupada por uma prolina que impede a clivagem da ligação de aminoácidos naquele local. Assim, o BCM-7 não é um produto da digestão da beta-caseína A2.
[0004] Outras variantes da beta-caseína, como as variantes B, C, F, G e H1, também têm histidina na posição 67, enquanto as variantes A3, D, E, H2 e 1 têm prolina na posição 67 como a variante A2. Mas essas variantes são encontradas apenas em níveis muito baixos, ou não são encontradas, no leite de vacas de origem europeia. Assim, no contexto desta invenção, o termo A1 beta-caseína pode se referir a qualquer beta-caseína com histidina na posição 67, e o termo beta-caseína A2 pode se referir a qualquer beta-caseína com prolina na posição 67.
[0005] BCM-7 é um peptídeo opióide e pode se ligar e ativar receptores opióides em todo o corpo, e foi demonstrado que limita a produção de glutationa / antioxidante levando a uma mudança na função celular e na expressão gênica. 1 BCM-7 tem a capacidade de cruzar o tubo gastrointestinal parede e entrar na circulação, permitindo- lhe influenciar as atividades sistêmicas e celulares por meio de receptores opióides. O requerente e outros determinaram, previamente, uma associação adversa entre o consumo de beta-caseína A1 encontrada no leite ou produtos lácteos e diabetes tipo 12, doença cardíaca coronária3, distúrbios neurológicos4, inflamação do intestino5, em sintomas de intolerância à lactose6, regulação de níveis de glicose no sangue7, função cognitiva8 e microbiota intestinal9.
[0006] Todas essas descobertas relatadas estão relacionadas à influência de BCM-7, ou as variantes da beta-caseína que produzem BCM-7 durante a digestão, nas características comportamentais de indivíduos que sofrem de doenças ou condições diagnosticadas clinicamente. Os resultados não se referem a indivíduos saudáveis. Além disso, é bem conhecido que o resultado dos estudos baseados em experimentos de cultura de células não pode ser extrapolado de forma confiável para efeitos in vivo ou clínicos, uma vez que existem muitas variáveis relacionadas à produção, transporte e metabolismo de BCM-7 que afetam a exposição do tecido e, portanto, a resposta biológica. Por exemplo, sabe-se que as concentrações de opióides e sua afinidade pelos receptores opióides são importantes para a resposta celular.
[0007] O crescente corpo de evidências científicas ligando as variantes da beta- caseína aos efeitos adversos do consumo de leite e produtos lácteos levou à importância de ser capaz de analisar de forma confiável e precisa o leite e os produtos lácteos para a presença de variantes da beta-caseína, particularmente A1 beta- caseína e suas variantes relacionadas com histidina na posição 67 da sequência de aminoácidos.
[0008] A determinação dos níveis totais de beta-caseína no leite bovino é relativamente trivial. A abordagem mais comum envolve a separação das proteínas intactas por cromatografia líquida (LC), seguida pela detecção usando um detector ultravioleta (UV) ou por espectrometria de massa (MS). Esta abordagem foi recentemente aplicada por Vincent et al10 para investigar o leite na Austrália e por Givens et al11 para investigar o leite no Reino Unido. Em ambos os casos, as principais variantes da beta-caseína podem ser detectadas separadamente, mas como as variantes purificadas da beta-caseína não estão disponíveis comercialmente como padrões analíticos, elas não podem ser quantificadas individualmente. Além disso, ambos os métodos exigiram o uso de um espectrômetro de massas de alta resolução e nenhum deles é sensível o suficiente para distinguir os níveis de traços de uma variante da beta-caseína A1 na presença de um excesso de uma variante da beta- caseína A2.
[0009] Uma abordagem alternativa envolve digerir as proteínas do leite e quantificar os peptídeos resultantes. Esta abordagem foi adotada por Lutter et al.12, que usaram a tripsina para digerir uma variedade de alimentos para determinar as concentrações das principais proteínas do leite. As amostras foram analisadas por LC-MS / MS usando calibração interna. Embora este método seja mais sensível e específico do que os métodos de proteína intacta, ele não tem a capacidade crítica de distinguir variantes de beta-caseína.
[0010] Embora os métodos publicados acima possam ser adequados para a análise de leite fresco, não existe nenhum método que satisfaça todos os requisitos analíticos necessários para produtos lácteos de uma única variante moderna. Isto é especialmente verdadeiro para produtos como leite UHT ou fórmula infantil, onde podem ocorrer modificações significativas das proteínas durante o processamento. Durante a análise, as caseínas nessas matrizes podem não se comportar da mesma maneira que as caseínas 'de tipo selvagem' de leite fresco e, portanto, os procedimentos analíticos devem ser adaptados de acordo com a matriz. Por exemplo, a análise de beta caseínas intactas de amostras de leite cru usando LC-UV produz picos individuais para cada variante de beta caseína que são adequados para análise qualitativa e quantitativa, pois podem ser facilmente identificados e integrados. Por outro lado, o mesmo procedimento aplicado à fórmula infantil produz amplos picos que não se resolvem entre si e não são apropriados para análises qualitativas ou quantitativas.
[0011] Os métodos de análise que usam digestão com enzimas proteolíticas também podem estar sujeitos a problemas que impedem sua aplicação na análise de beta-caseína. A protease mais amplamente aplicada é a tripsina, que ao entrar em contato com a beta caseína, produz um longo peptídeo contendo 48 resíduos. O comprimento substancial deste peptídeo significa que ele é sujeito a múltiplas modificações, o que resulta em uma mudança de massa, que por sua vez complica substancialmente a detecção usando espectrometria de massa. Além disso, o comprimento torna este peptídeo difícil de sintetizar para uso como um padrão analítico e, consequentemente, significa que os métodos de digestão à base de tripsina não são apropriados para a análise quantitativa de beta-caseína em certos produtos lácteos. O uso de enzimas alternativas é, portanto, necessário para a análise da beta caseína.
[0012] O requerente desenvolveu agora um método para a determinação absoluta das variantes da beta-caseína A1 e beta-caseína A2 no leite e produtos lácteos em níveis comercialmente relevantes.
[0013] É portanto um objetivo da presente invenção fornecer um método para analisar variantes de beta-caseína em leite animal e produtos derivados de leite animal, ou pelo menos fornecer uma alternativa útil aos métodos existentes.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[0014] Em um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um método para determinar as quantidades de variantes da beta-caseína do tipo A1 ou variantes da beta-caseína do tipo A2 em uma composição com mais de 80% de precisão, onde a beta-caseína do tipo Al variantes são variantes de beta-caseína com histidina na posição 67 da sequência de aminoácidos de beta-caseína e as variantes de beta- caseína do tipo A2 são variantes de beta-caseína com prolina na posição 67 da sequência de aminoácidos de beta-caseína, e onde o composição é leite ou um produto preparado a partir de leite, compreendendo as etapas: (i) contato da composição com quimotripsina sob condições que permitem a digestão de beta-caseínas na composição pela quimiotripsina; (ii) obtenção de uma solução aquosa de peptídeos de digestão de beta- caseína; (iii) determinação das concentrações de: a) dois ou mais peptídeos de digestão de beta-caseína presentes na solução, em que cada peptídeo compreende 8 a 20 resíduos de aminoácidos e tem histidina em uma posição correspondente à posição 67 da sequência de aminoácidos de beta-caseína; e b) dois ou mais peptídeos de digestão com beta-caseína presentes na solução, em que cada peptídeo compreende 8 a 20 resíduos de aminoácidos e tem prolina numa posição correspondente à posição 67 da sequência de aminoácidos da beta-caseína; analisando a mistura usando cromatografia líquida-espectrometria de massa; e (iv) cálculo da concentração de variantes de beta-caseína do tipo A1 na composição ou a concentração de variantes de beta-caseína do tipo A2 na composição usando as concentrações dos peptídeos de digestão de beta-caseína determinados na etapa (iii).
[0015] Em certas modalidades da invenção, as variantes de beta-caseína do tipo A1 compreendem qualquer um ou mais dentre beta-caseína A1, beta-caseína B, beta- caseína C, beta-caseína F, beta caseína G e beta-caseína H1. Por exemplo, as variantes da beta-caseína do tipo A1 podem compreender apenas a beta-caseína A1.
[0016] Em certas modalidades da invenção, as variantes da beta-caseína do tipo
A2 compreendem qualquer um ou mais dentre beta-caseína A2, beta-caseína A3, beta-caseína D, beta-caseína E, beta-caseína H2 e beta-caseína I. Por exemplo, as variantes da beta-caseína do tipo A2 podem compreender apenas a beta-caseína A2.
[0017] Em algumas modalidades, as variantes da beta-caseína do tipo Al compreendem apenas a beta-caseína A1 e as variantes da beta-caseína do tipo A2 compreendem apenas a beta-caseína A2.
[0018] Em algumas modalidades da invenção, as concentrações de três ou quatro peptídeos de digestão da beta-caseína com histidina em uma posição correspondente à posição 67 da sequência de aminoácidos da beta-caseína são determinadas. Em algumas modalidades, onde o leite é leite bovino, os peptídeos de digestão de beta- caseína são selecionados do grupo que compreende VYPFPGPIHN, SLVYPFPGPIHN, VYPFPGPIHNSLPQ e SLVYPFPGPIHNSLPQ.
[0019] Em algumas modalidades da invenção, as concentrações de três ou quatro peptídeos de digestão da beta-caseína com prolina em uma posição correspondente à posição 67 da sequência de aminoácidos da beta-caseína são determinadas. Em algumas modalidades, onde o leite é leite bovino, os peptídeos de digestão de beta- caseína são selecionados do grupo que compreende VYPFPGPIPN, SLVYPFPGPIPN, VYPFPGPIPNSLPQ e SLVYPFPGPIPNSLPQ.
[0020] Em certas modalidades da invenção, a mistura analisada usando cromatografia líquida-espectrometria de massa contém peptídeos marcados isotopicamente correspondentes a cada um dos peptídeos de a) e b). Os peptídeos marcados isotopicamente podem ser adicionados à composição antes do tratamento com quimiotripsina na etapa (i) ou após o tratamento com quimotripsina na etapa (i).
[0021] Em algumas modalidades da invenção em que o leite é leite bovino, os peptídeos marcados isotopicamente podem corresponder aos peptídeos de digestão da seguinte forma: Peptídeo de digestão Peptídeo marcado isotopicamente VYPFPGPIHN (*V)YPFPGPIHN SLVYPFPGPIHN SL(*V)YPFPGPIHN VYPFPGPIHNSLPQ VYPFPGPIHNS(*L)PQ SLVYPFPGPIHNSLPQ SL(*V)YPFPGPIHNSLPQ
[0022] Em algumas modalidades da invenção em que o leite é leite bovino, os peptídeos marcados isotopicamente podem corresponder aos peptídeos de digestão da seguinte forma: Peptídeo de digestão Peptídeo marcado isotopicamente VYPFPGPIPN (*V)YPFPGPIPN SLVYPFPGPIPN SL(*V)YPFPGPIPN VYPFPGPIPNSLPQ VYPFPGPIPNS(*L)PQ SLVYPFPGPIPNSLPQ SL(*V)YPFPGPIPNSLPQ
[0023] Em algumas formas de realização da invenção, onde o leite é leite bovino as concentrações dos peptídeos seguintes são determinadas na etapa (iii): VYPFPGPIHN, SLVYPFPGPIHN, VYPFPGPIHNSLPQ, SLVYPFPGPIHNSLPQ, VYPFPGPIPN, SLVYPFPGPIPN, VYPFPGPIPNSLPQ, e SLVYPFPGPIPNSLPQ.
[0024] Em algumas modalidades da invenção, as quantidades de variantes da beta-caseína do tipo A1 e variantes da beta-caseína do tipo A2 na composição são determinadas com mais de 90% de precisão, mais de 95% de precisão ou mais de 99% de precisão.
[0025] Em algumas modalidades da invenção, a composição é leite bovino ou um produto lácteo preparado a partir de leite bovino.
[0026] Em algumas modalidades da invenção, o leite é leite fresco, leite cru, leite em pó, leite líquido reconstituído a partir de pó, leite desnatado, leite homogeneizado, leite condensado, leite evaporado, leite aromatizado, leite UHT, leite pasteurizado ou leite não pasteurizado. Em algumas modalidades da invenção, o produto lácteo é fórmula infantil, creme, iogurte, requeijão, queijo, manteiga ou sorvete.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0027] A Figura 1 mostra a proporção de beta-caseínas do tipo Al em uma série de padrões de leite relativos analisados usando o método da invenção, bem como análise de HPLC intacta.
[0028] A Figura 2 mostra a quantidade de beta-caseína em uma série de amostras de leite e produtos lácteos conforme medido pelo método da invenção, em comparação com o nível teórico de beta-caseína determinado a partir do teor de proteína das amostras.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[0029] O termo "beta-casomorfina-7" ou "BCM-7" refere-se ao fragmento de proteína Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile, um heptapeptídeo produzido na digestão enzimática de variantes de beta-caseína bovina que têm um histidina, em vez de uma prolina, na posição 67 da sequência de aminoácidos
[0030] O termo "variante de beta-caseína do tipo A1" significa qualquer variante de beta-caseína com um resíduo de histidina na posição 67 de sua sequência de aminoácidos e inclui qualquer um ou mais de beta-caseína A1, beta-caseína B, beta- caseína C, beta-caseína F e beta caseína G.
[0031] O termo "variante de beta-caseína do tipo A2" significa qualquer variante de beta-caseína com um resíduo de prolina na posição 67 de sua sequência de aminoácidos e inclui beta-caseína A2, beta-caseína A3, beta-caseína D, beta- caseína E, beta-caseína H1, beta-caseína H2 e beta-caseína I.
[0032] O termo "posição 67" da sequência de aminoácidos da beta-caseína significa a posição numerada com 67 contando os resíduos de aminoácidos da sequência do terminal N da beta-caseína (após a remoção do peptídeo sinal).
[0033] O termo "AQ", às vezes referido como "AQUA", significa "quantificação absoluta" e indica que o método da invenção pode ser usado para medir a concentração absoluta de beta-caseínas como uma fração de uma amostra (por exemplo, fração de massa), em contraste com outros métodos que não medem concentrações absolutas, mas medem a proporção de beta-caseínas em relação a outro componente em uma amostra, ou a proporção de uma variante de beta-caseína em relação a outra.
[0034] Ao longo deste relatório descritivo, a menos que especificamente indicado de outra forma ou o contexto exija o contrário, a referência a uma única etapa, composição da matéria, grupo de etapas ou grupo de composições da matéria deve ser considerada para abranger uma e uma pluralidade (ou seja, uma ou mais) dessas etapas, composições de matéria, grupos de etapas ou grupo de composições de matéria.
[0035] Pretende-se que qualquer referência a uma faixa de números descritos nesta especificação (por exemplo, 1 a 10) também incorpore a referência a todos os números relacionados dentro dessa faixa (por exemplo, 1, 1,1, 2, 3, 3,9, 4, 5, 6 , 6,5, 7, 8, 9 e 10) e também qualquer intervalo de números racionais dentro desse intervalo (por exemplo, 2 a 8, 1,5 a 5,5 e 3,1 a 4,7) e, portanto, todos os subfaixas de todas as faixas descritas nesta especificação são divulgado expressamente. Estes são apenas exemplos do que é especificamente pretendido e todas as combinações possíveis de valores numéricos entre o valor mais baixo e o valor mais alto enumerado devem ser consideradas expressamente declaradas nesta especificação de maneira semelhante.
[0036] Ao longo deste relatório descritivo, a palavra "compreende", ou variações como "compreendem" ou "compreendendo", serão entendidas como implicando a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou parcial, ou grupo de elementos, inteiros ou parciais, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou parcial, ou grupo de elementos, inteiros ou parciais.
[0037] Os técnicos no assunto entenderão que a invenção descrita neste relatório descritivo é suscetível a variações e modificações diferentes daquelas especificamente descritas. Deve ser entendido que a invenção inclui todas essas variações e modificações. A invenção também inclui todas as etapas ou características referidas ou indicadas neste relatório descritivo, individualmente ou coletivamente, e qualquer e todas as combinações ou quaisquer duas ou mais das referidas etapas ou características.
[0038] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelos exemplos específicos descritos neste relatório descritivo, que se destinam apenas ao propósito de ilustração. Produtos, composições e métodos funcionalmente equivalentes estão claramente dentro do escopo da invenção.
[0039] Qualquer referência a documentos do estado da técnica neste relatório descritivo não deve ser considerada uma admissão de que tal estado da técnica é amplamente conhecido ou faz parte do conhecimento geral comum no campo da invenção. Metodologia de teste
[0040] A invenção fornece um método para determinar as quantidades de variantes da beta-caseína do tipo A1 e variantes da beta-caseína do tipo A2 em uma composição. É importante ressaltar que o método permite que as quantidades dos dois tipos de variantes de beta-caseína sejam determinadas com mais de 80% de precisão e até mesmo até 100% de precisão. O grau de precisão tornou-se crítico à medida que a demanda por leite e produtos lácteos sem beta-caseína A1 (e variantes relacionadas) aumentou dramaticamente na última década. Os consumidores, bem como os fabricantes e fornecedores, precisam saber se um produto é ou não substancialmente livre de variantes da beta-caseína do tipo A1.
[0041] O método envolve a digestão de proteínas beta-caseína em uma composição com a enzima serina protease quimiotripsina. O requerente determinou que o processo de digestão produz peptídeos identificáveis específicos. A presença e as quantidades de cada peptídeo produzido a partir da composição podem ser determinadas e as quantidades então usadas para calcular as quantidades percentuais de variantes da beta-caseína do tipo Al e variantes da beta-caseína do tipo A2 na composição. O número de peptídeos (por exemplo, 2, 3, 4 ou mais) analisados determina o grau de precisão. Por exemplo, a análise de apenas dois peptídeos pode produzir uma determinação final das quantidades percentuais dos dois tipos de variantes de beta-caseína na composição com um nível de precisão de apenas 80%. A análise de três peptídeos pode produzir um nível de precisão de cerca de 90% e a análise de quatro peptídeos pode produzir um nível de precisão de cerca de 95%.
[0042] A composição a ser analisada pode ser leite de qualquer animal ou um produto preparado a partir do leite animal. A composição também pode ser um produto não lácteo contendo beta-caseína que foi obtida do leite.
[0043] O leite pode estar na forma de leite fresco, leite cru, leite em pó, leite líquido reconstituído a partir de pó, leite desnatado, leite homogeneizado, leite condensado, leite evaporado, leite aromatizado, leite UHT, leite pasteurizado ou leite não pasteurizado, ou qualquer outra forma de leite. O método da presente invenção é mais adequado para analisar leite bovino e produtos lácteos bovinos, mas pode ser facilmente adaptado para leite e produtos lácteos de uma ampla variedade de animais, incluindo humanos, ovelhas, cabras, cavalos, porcos, búfalos, veados e qualquer outros mamíferos que produzem caseínas em seu leite.
[0044] A composição também pode ser qualquer produto derivado de leite, como fórmula infantil, creme, iogurte, queijo, manteiga ou sorvete.
[0045] Quando a composição a ser analisada for leite, é necessária uma preparação mínima da amostra. É preferível desnaturar as proteínas contidas na amostra de leite, por exemplo, por tratamento com um agente desnaturante, como cloridrato de guanidina ou ureia.
[0046] No caso de produtos lácteos que são sólidos ou semissólidos, a preparação da amostra envolve tipicamente a pesagem de uma quantidade homogeneizada do produto em um recipiente separado e a extração das proteínas da caseína em um volume conhecido de solução.
[0047] A digestão das beta-caseínas na amostra usando quimotripsina pode ser realizada em condições adequadas para permitir uma digestão eficaz. A amostra é tipicamente incubada a cerca de 37 °C por várias horas antes de ser temperada com um reagente, como o ácido fórmico, para desativar a quimiotripsina.
[0048] Uma vez que a amostra foi submetida à digestão com quimotripsina e qualquer preparação de amostra pós-digestão, certos peptídeos marcados isotopicamente são adicionados à amostra antes da análise de LC-MS (cromatografia líquida - espectro de massas). Os peptídeos marcados isotopicamente são selecionados com base na determinação prévia do requerente de que a quimiotripsina decompõe as variantes da beta-caseína do tipo A1 para produzir os peptídeos de digestão:
[0049] VYPFPGPIHN, SLVYPFPGPIHN, VYPFPGPIHNSLPQ e
SLVYPFPGPIHNSLPQ
[0050] e decompõe as variantes da beta-caseína do tipo A2 para produzir os peptídeos de digestão:
[0051] VYPFPGPIPN, SLVYPFPGPIPN, VYPFPGPIPNSLPQ e
SLVYPFPGPIPNSLPQ
[0052] Os peptídeos marcados isotopicamente podem ser do grupo:
[0053] (*V) YPFPGPIHN, SL (*V) YPFPGPIHN, VYPFPGPIHNS (*L) PQ, SL (*V) YPFPGPIHNSLPQ, (*V) YPFPGPIPN, SL (*V) YPFPGPIPN, VYPFPGPIPNS, e (LQ) *V) YPFPGPIPNSLPQ, onde *V representa um resíduo de valina marcado isotopicamente e *L representa um resíduo de leucina marcado isotopicamente.
[0054] Deve ser apreciado que qualquer, ou múltiplos, resíduos de aminoácidos de um peptídeo podem ser marcados isotopicamente. No entanto, valina ou leucina marcada isotopicamente são geralmente preferidas.
[0055] Em algumas modalidades da invenção, os peptídeos marcados isotopicamente usados correspondem aos peptídeos de digestão de acordo com a Tabela 1.
Tabela 1: Peptídeos de digestão e seus equivalentes isotopicamente marcados Peptídeo de digestão Peptídeo marcado isotopicamente VYPFPGPIHN (*V)YPFPGPIHN SLVYPFPGPIHN SL(*V)YPFPGPIHN VYPFPGPIHNSLPQ VYPFPGPIHNS(*L)PQ SLVYPFPGPIHNSLPQ SL(*V)YPFPGPIHNSLPQ VYPFPGPIPN (*V)YPFPGPIPN SLVYPFPGPIPN SL(*V)YPFPGPIPN VYPFPGPIPNSLPQ VYPFPGPIPNS(*L)PQ SLVYPFPGPIPNSLPQ SL(*V)YPFPGPIPNSLPQ
[0056] O método da invenção requer a adição de pelo menos dois dos peptídeos marcados isotopicamente acima à amostra. No entanto, para maior precisão, três, quatro ou possivelmente mais, peptídeos marcados isotopicamente são adicionados à amostra.
[0057] LC-MS / MS permite a pronta identificação da presença de qualquer um dos peptídeos de digestão com base no tempo de retenção dos peptídeos e as razões de íons dos fragmentos produzidos quando analisados no modo MS / MS.
[0058] Isso é alternativamente referido como modo de monitoramento de reação múltipla (MRM) ou modo de monitoramento de reação selecionada (SRM). A comparação das respostas de cada peptídeo a um peptídeo padrão interno marcado isotopicamente presente na mistura e a uma curva padrão de execução simultânea permite que a concentração de cada peptídeo seja determinada, a partir da qual as concentrações das variantes de beta-caseína do tipo Al no composição e as variantes de beta caseína do tipo A2 na composição podem ser calculadas. Discussão dos exemplos
[0059] Exemplos das etapas experimentais são fornecidos abaixo. O Exemplo 1 mostra como as amostras podem ser preparadas para análise. Isto geralmente inclui a extração de beta-caseínas em um estado aquoso, em que podem ser desdobradas pela ação de um agente desnaturante caotrópico, como a ureia, de modo que a ação posterior da quimiotripsina na amostra seja mais eficiente. No caso de amostras líquidas, como leite integral ou leite UHT, isso envolve simplesmente a transferência de uma alíquota da amostra para um recipiente e a adição do agente desnaturante. Para amostras sólidas ou semissólidas, isso envolve a preparação de uma solução definida com precisão do sólido dissolvido em um tampão de extração, normalmente um tampão aquoso. Posteriormente, as amostras são tratadas da mesma maneira que as amostras líquidas.
[0060] O exemplo 2 descreve a etapa de digestão da quimiotripsina. As amostras desnaturadas são expostas a uma solução de quimotripsina sob condições cuidadosamente controladas. Estas condições incluem tipicamente um tampão para controlar o pH da solução, visto que as enzimas proteolíticas são ativas apenas dentro de uma faixa estreita de pH. As condições tipicamente também incluem agitação mecânica do digerido para reduzir ou eliminar as limitações de transferência de massa e calor para acelerar a reação. Isto resulta em uma clivagem controlada das beta- caseínas e outras proteínas dentro da matriz, para produzir um conjunto de peptídeos que podem ser identificados exclusivamente como originários de uma proteína específica. Após um período de tempo pré-determinado, a reação é interrompida ('extinta') pela adição de uma solução ácida concentrada em solvente orgânico, que interrompe imediatamente a digestão. As amostras são então fortificadas pela adição de peptídeos padrão internos marcados isotopicamente que são subsequentemente usados para calcular as concentrações das beta-caseínas.
[0061] O Exemplo 3 descreve a análise de amostras usando cromatografia líquida com detecção de espectrometria de massa triplo quadrupolo. Isto resulta na separação espacial e temporal dos peptídeos uns dos outros, que podem ser quantificados individualmente pela passagem do eluente para um espetrômetro de massa operado em modo de monitoramento de reação múltipla ou um procedimento de detecção específico equivalente, como monitoramento de íons selecionados de alta resolução. As áreas de pico dos peptídeos alvo são determinadas por integração, bem como os padrões internos marcados isotopicamente. As razões de área do pico são então utilizadas para determinar a concentração dos peptídeos alvo por comparação com uma curva padrão. Para garantir que os peptídeos sejam identificados corretamente, os critérios de controle de qualidade, tais como correspondência do tempo de retenção e correspondência da razão de íons, são empregados no procedimento.
[0062] No Exemplo 4, as concentrações dos peptídeos são utilizadas para calcular as concentrações das beta-caseínas parentais. Em geral, os fatores de conversão são derivados com base na razão entre a massa do peptídeo e a massa da proteína original e são usados para converter a concentração do peptídeo na concentração da proteína. Como os peptídeos alvo têm sequências sobrepostas, as concentrações podem então ser somadas para encontrar o conteúdo total de beta-caseína do tipo A1 e o conteúdo total de beta-caseína do tipo A2, bem como números derivados desses valores, como a proporção de beta-caseína do tipo A1 na amostra em relação à beta- caseína total.
[0063] O Exemplo 5 mostra a aplicação do método à análise de uma variedade de produtos lácteos. Os resultados são comparados e contrastados com os resultados dos métodos existentes para determinar a porcentagem de beta-caseínas do tipo A1 em uma amostra de leite ou um produto lácteo. Para uma variedade de tipos de matriz, é mostrado que a concentração de beta-caseínas na amostra é consistente com os valores esperados com base no conteúdo de proteína rotulada e, portanto, a proporção de beta-caseínas do tipo A1 nas amostras está correta. Além disso, a proporção de beta-caseínas do tipo A1 é consistente com métodos anteriores para matrizes simples como leite ou leite em pó, mas fornece uma estimativa mais precisa para produtos fortemente modificados, como fórmulas infantis. Os resultados são mostrados na Tabela 6.
[0064] A coluna 1 da Tabela 6 indica a identidade dos produtos analisados. A coluna 2 mostra o teor de proteína total de cada amostra conforme determinado pela análise de nitrogênio Kjeldahl. Isto pode ser comparado à coluna 3, que mostra o conteúdo de proteína conforme especificado no rótulo do produto. Em geral, há uma boa concordância entre essas duas medidas, indicando que o conteúdo da proteína rotulada é preciso. A coluna 4 mostra o teor teórico de beta-caseína de cada amostra, determinado pela multiplicação do valor da proteína rotulada por 0,32, um fator de conversão comumente aceito que representa a fração de massa de beta-caseína em produtos lácteos em relação ao teor de proteína total.
[0065] A coluna 9 mostra o teor total de beta-caseína, expresso em g / 100g, como a soma de beta-caseínas do tipo A1 e beta-caseínas do tipo A2, conforme determinado pelo método da invenção. Estes mostram geralmente uma boa concordância com os valores na coluna 4, indicando que o método é preciso e adequado para o propósito.
[0066] A coluna 10 mostra a porcentagem de beta-caseínas do tipo A1 do conteúdo total de beta-caseínas, calculada como a soma das beta-caseínas do tipo A1 e beta-caseínas do tipo A2. Esses resultados podem ser comparados aos resultados da coluna 5, que apresenta a% A1 conforme determinado por análise de proteína intacta usando cromatografia líquida de alta performance com detecção ultravioleta. Para leite e produtos lácteos que não são significativamente modificados, existe uma boa concordância entre estes dois valores. No entanto, existem discrepâncias significativas no caso de amostras de fórmulas infantis, que, pela natureza de sua fabricação, são inadequadas para análise intacta e produzem resultados errôneos. Tendências semelhantes são vistas quando a Coluna 10 é comparada com a coluna 6, que mostra a porcentagem de beta-caseínas do tipo Al determinada usando um método enzimático primitivo utilizando uma digestão tríptica de amostras com calibração subsequente contra padrões de leite relativos diluídos volumetricamente.
[0067] A Figura 1 mostra a proporção de beta-caseínas do tipo Al em uma série de padrões de leite relativos analisados usando o método da invenção, bem como análise de HPLC intacta. As amostras foram criadas por diluição volumétrica do leite de dois animais individuais, um verificado ser do genótipo A1 / A1 e, portanto, produzir leite contendo beta-caseína do tipo A1 puro, e o outro do genótipo A2 / A2, produzindo leite contendo beta-caseína do tipo A2 pura. O agrupamento restrito de pontos de dados em torno da linha de melhor ajuste indica que o método atual é preciso, conforme indicado pelo coeficiente de correlação (R2 = 0,9996). A inclinação da linha (0,9861) é interpretada para indicar que o método atual também é preciso.
[0068] A Figura 2 mostra a quantidade de beta-caseína em uma série de amostras de leite e produtos lácteos conforme medido pelo método da invenção, em comparação com o nível teórico de beta-caseína determinado a partir do teor de proteína das amostras. O bom agrupamento de pontos de dados sobre a linha de melhor ajuste indica que o método é preciso, também indicado pelo coeficiente de correlação (R2 = 0,9075). A inclinação da linha (0,9075) também indica que o método é preciso.
[0069] A invenção é ainda descrita com referência aos seguintes exemplos. Deve ser entendido que a invenção conforme reivindicada não se destina a ser limitada de forma alguma pelos exemplos.
EXEMPLOS Exemplo 1: Preparação da amostra
[0070] Amostras líquidas - Para amostras líquidas não viscosas, por ex. leite, o líquido (40 mL) foi transferido para um tubo de centrífuga de 2 mL. Solução de ureia (120 mL, 500 g / L) foi adicionada para desnaturar as proteínas e a mistura foi então misturada a 2.000 RPM durante 5 min.
[0071] Amostras sólidas - Para amostras sólidas ou líquidas viscosas, a amostra (5,00 ± 0,01 g) foi pesada em um tubo falcon (50 ml). Foi adicionada solução de bicarbonato de amônio (46,6 ml, 4 g / L) e a mistura foi agitada para molhar todo o pó. Após incubação a 50 °C durante 15 min, a mistura foi agitada até ficar homogénea. No caso da fórmula infantil, uma amostra (100 mL) foi transferida para um tubo de centrífuga de 2 mL, precipitante de caseína (150 g / L de acetato de amônio pH 4,2, 1000 mL) foi adicionado e a mistura misturada a 2.000 RPM por 5 min e em seguida, centrifugado a 5000 RCF por 5 min. Após decantação do sobrenadante, precipitante de caseína (1000 mL) foi adicionado ao sedimento sólido e a mistura misturada a 2000 RPM por 5 min e então centrifugada a 5000 RCF por 5 min antes de decantar o sobrenadante. Água (1000 mL) foi adicionada ao sedimento sólido, as etapas de mistura e centrifugação repetidas e o sobrenadante decantado. Solução de ureia (120 mL, 500 g / L) foi adicionada para desnaturar as proteínas e a mistura foi então misturada a 2.000 durante 5 min. Exemplo 2: digestão de quimotripsina
[0072] Solução de quimotripsina (1000 mL) foi adicionada a uma amostra preparada de acordo com o Exemplo 1. A mistura foi incubada a 37 °C durante 8 horas com agitação a 200 RPM. Solução de extinção (120 mL, 500 g / L de solução de ácido fórmico) foi adicionada e a mistura misturada a 2.000 RPM por 5 min e centrifugada a
10.000 RCF por 10 min. A amostra (980 mL) foi transferida para um frasco de LC, uma solução de padrões de peptídeos marcados isotopicamente (20 mL) foi adicionada e a mistura agitada em vórtice por 10 seg. A solução de padrões de peptídeos marcados (Biomatik, ordem personalizada, > 95,0%) foi preparada pesando cada um dos peptídeos (2,00 ± 0,10 mg) na Tabela 1 em um tubo de centrífuga de polietileno de 2 mL. Os peptídeos foram dissolvidos por adição de acetonitrilo a 20% contendo ácido fórmico a 0,1%. O volume foi ajustado para obter a concentração de 1.000,0 mg / L. Por exemplo, se apenas 1,90 mg foi pesado, então 1,90 mL de solução foi adicionado. Os padrões de peptídeos marcados da Tabela 2 correspondem aos peptídeos alvo da Tabela 3.
Tabela 2: Padrões de peptídeos marcados isotopicamente Peptídeo Sequência Fórmula Íon [M+H]+ (m/z) A1C-VN(10)-H (*V)YPFPGPIHN [13C5,15N1]-C51H77N11O13 1146,32
A1C-SN(12)-H SL(*V)YPFPGPIHN [13C5,15N1]-C60H93N14O16 1346,56 A1C-VQ(14)-H VYPFPGPIHNS(*L)PQ [13C6,15N1]-C69H108N17O19 1572,81 A1C-SQ(16)-H SL(*V)YPFPGPIHNSLPQ [13C5,15N1]-C79H124N19O22 1772,16 A2C-VN(10)-H (*V)YPFPGPIPN [13C5,15N1]-C50H77N10O13 1106,29 A2C-SN(12)-H SL(*V)YPFPGPIPN [13C5,15N1]-C59H93N12O16 1306,53 A2C-VQ(14)-H VYPFPGPIPNS(*L)PQ [13C6,15N1]-C68H108N15O19 1532,78 A2C-SQ(16)-H SL(*V)YPFPGPIPNSLPQ [13C5,15N1]-C78H124N17O22 1732,02 Tabela 3: Peptídeos alvo Peptídeo Sequência Fórmula Íon [M+H]+ (m/z) A1C-VN(10) VYPFPGPIHN C56H77N13O13 1140,28 A1C-SN(12) SLVYPFPGPIHN C65H93N15O16 1340,65 A1C-VQ(14) VYPFPGPIHNSLPQ C75H108N18O19 1565,81 A1C-SQ(16) SLVYPFPGPIHNSLPQ C84H124N20O22 1766,16 A2C-VN(10) VYPFPGPIPN C55H77N11O13 1100,39 A2C-SN(12) SLVYPFPGPIPN C64H93N13O16 1300,62 A2C-VQ(14) VYPFPGPIPNSLPQ C74H108N16O19 1525,78 A2C-SQ(16) SLVYPFPGPIPNSLPQ C83H124N18O22 1726,13 Exemplo 3: Análise LC-MS / MS
[0073] As amostras (1 mL) foram injetadas em uma coluna Waters Xselect HSS T3 C18 (2,5 um x 2,1 mm x 50 mm) com Phenomenex KrudCatcher anexado usando um sistema Thermo Vanquish LC. Os parâmetros de separação estão resumidos na Tabela 4. Resumidamente, um gradiente foi executado de 20% de acetonitrila até 40% de acetonitrila para separar os peptídeos alvo, ponto durante o qual o eluente foi passado para um espectrômetro de massa para detecção. A coluna foi então lavada com fluxo elevado antes de começar a próxima injeção. Durante este período de lavagem, os componentes indesejados da amostra foram desviados para o lixo e a aquisição desligada.
Tabela 4: Gradiente e parâmetros de aquisição selecionados Tempo %A %B Fluxo Desvio Aquisição MS 0,0 80 20 0,5 1-6 Desligado 0,5 80 20 0,5 1-2 Ligado 4,0 60 40 0,5 1-2 Desligado 4,5 0 100 0,8 1-6 Desligado
6,0 0 100 0,8 1-6 Desligado 6,5 80 20 0,8 1-6 Desligado 7,5 80 20 0,5 1-6 Desligado 8,0 80 20 0,5 1-6 Desligado
[0074] A aquisição espectral de massas foi realizada usando um espectrômetro de massas Thermo TSQ Altis, operando no modo MRM de posicionamento de íon. Cada peptídeo tem transições quantificadoras e qualificadoras, resultando em um total de 32 MRMs. Todos foram monitorados continuamente ao longo do período de aquisição, sem o uso de agendamento. O tempo de permanência foi definido para 10 ms, as resoluções Q1 e Q3 para 2 Da e o gás CID para 2 mTorr. Uma lista das transições e parâmetros associados é mostrada na Tabela 5. Tabela 5: Dados de MRM para o método monitorado de dezesseis peptídeos alvo Designação Transição(ções) Uso CE (V) Rf (V) A1C-VN(10) 571,2  440,1 Quantificador 16 60 571,2  634,3 Qualificador 22 60 A1C-SN(12) 671,2  878,6 Quantificador 21 60 671,2  300,2 Qualificador 22 60 A1C-VQ(14) 783,9  244,4 Quantificador 27 70 783,9  652,5 Qualificador 22 70 A1C-SQ(16) 883,5  244,4 Quantificador 28 70 883,5  1523,1 Qualificador 25 70 A1C-VN(10)-H 574,2  440,1 Quantificador 16 60 574,2  634,3 Qualificador 22 60 A1C-SN(12)-H 674,3  878,6 Quantificador 21 60 674,3  306,2 Qualificador 22 60 A1C-VQ(14)-H 787,4  244,4 Quantificador 27 70 787,4  656,0 Qualificador 22 70 A1C-SQ(16)-H 886,8  244,4 Quantificador 28 70 886,8  1523,1 Qualificador 25 70 A2C-VN(10) 1100,6  594,3 Quantificador 39 60 1100,6  838,4 Qualificador 37 60 A2C-SN(12) 1300,7  594,4 Quantificador 42 60 1300,7  838,4 Qualificador 42 60 A2C-VQ(14) 763,4  244,2 Quantificador 20 70 763,4  655,4 Qualificador 19 70 A2C-SQ(16) 863,5  244,2 Quantificador 24 70 863,5  655,3 Qualificador 20 70 A2C-VN(10)-H 1107,0  594,3 Quantificador 39 60
1107,0  838,4 Qualificador 37 60 A2C-SN(12)-H 1307,1  594,4 Quantificador 42 60 1307,1  838,4 Qualificador 42 60 A2C-VQ(14)-H 767,4  244,2 Quantificador 20 70 767,4  662,4 Qualificador 19 70 A2C-SQ(16)-H 867,0  244,2 Quantificador 24 70 867,0  655,3 Qualificador 20 70 Exemplo 4: Determinações de concentração para variantes de beta-caseína do tipo A1 e variantes de beta-caseína do tipo A2
[0075] Os cálculos foram realizados automaticamente usando uma planilha digital pré-projetada, embora possam ser feitos manualmente. A concentração de variantes de A1-beta-caseína foi calculada somando os produtos da concentração de cada peptídeo pelo quociente da massa da proteína original e a massa do peptídeo, então multiplicando pelo fator de preparação: 𝑀𝑤𝐴1−𝛽𝐶𝑁 𝑀𝑤𝐴1−𝛽𝐶𝑁 𝐶𝐴1−𝛽𝐶𝑁 = ((𝐶𝐴1𝐶−𝑉𝑁(10) × ) + (𝐶𝐴1𝐶−𝑆𝑁(12) × ) 𝑀𝑤𝐴1𝐶−𝑉𝑁(10) 𝑀𝑤𝐴1𝐶−𝑆𝑁(12) 𝑀𝑤𝐴1−𝛽𝐶𝑁 𝑀𝑤𝐴1−𝛽𝐶𝑁 + (𝐶𝐴1𝐶−𝑉𝑄(14) × ) + (𝐶𝐴1𝐶−𝑆𝑄(16) × )) × 𝑃 𝑀w𝐴1𝐶−𝑉𝑄(14) 𝑀𝑤𝐴1𝐶−𝑆𝑄(16)
[0076] O mesmo cálculo foi usado para calcular a concentração de variantes A2- beta-caseína, mas com as massas ajustadas de acordo: 𝑀𝑤𝐴2−𝛽𝐶𝑁 𝑀𝑤𝐴2−𝛽𝐶𝑁 𝐶𝐴2−𝛽𝐶𝑁 = ((𝐶𝐴2𝐶−𝑉𝑁(10) × ) + (𝐶𝐴2𝐶−𝑆𝑁(12) × ) 𝑀𝑤𝐴2𝐶−𝑉𝑁(10) 𝑀𝑤𝐴2𝐶−𝑆𝑁(12) 𝑀𝑤𝐴2−𝛽𝐶𝑁 𝑀𝑤𝐴2−𝛽𝐶𝑁 + (𝐶𝐴2𝐶−𝑉𝑄(14) × ) + (𝐶𝐴2𝐶−𝑆𝑄(16) × )) × 𝑃 𝑀𝑤𝐴2𝐶−𝑉𝑄(14) 𝑀𝑤𝐴2𝐶−𝑆𝑄(16)
[0077] O fator de preparação, P, foi calculado da seguinte forma:
𝑣1 𝑣2 𝑣4 𝑃= × × 𝑚1 𝑣3 𝑣5 onde v1 é o volume final do produto após a extração, mi é a massa do produto pesado, v2 é o volume no tubo de digestão após a extinção, V 3 é o volume de extrato adicionado ao tubo de digestão, V4 é o volume final no frasco de LC, e V5 é o volume de digestão transferido para o frasco LC.
[0078] A concentração total de beta-caseína foi calculada somando as concentrações dos dois polimorfos: 𝐶𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝛽𝐶𝑁 = 𝐶𝐴1𝛽𝐶𝑁 + 𝐶𝐴2𝛽𝐶𝑁
[0079] A porcentagem de variantes de beta-caseína A1 no produto foi calculada dividindo a concentração de variantes de Al-beta-caseína pela soma das concentrações de variantes de beta-caseína A1 e A2: 𝐶𝐴1𝛽𝐶𝑁 %𝐴1 = × 100% 𝐶𝐴1𝛽𝐶𝑁 + 𝐶𝐴2𝛽𝐶𝑁 Exemplo 5: Análise de leite e produtos lácteos
[0080] Várias amostras de leite fresco, leite em pó, fórmula infantil e leite UHT foram testadas de acordo com o método descrito nos Exemplos 1-4. Uma série de padrões de leite também foi preparada e testada. Os resultados são apresentados na Tabela 4, em que os resultados determinados de acordo com o método da invenção são comparados com outros métodos para a determinação do teor de beta-caseína.
Tabela 6: Dados de concentração para variantes de beta-caseína em leite e produtos lácteos Amostra Proteína Proteína bCN %A1 %A1 AQ A1 AQ A2 AQ Total AQ %A1 Kjeldahl marcada calculado intacta tríptica (g/100g) (g/100g) bCN (g/100g) (g/100g) (g/100g) UV (g/100g)
Petição 870210038352, de 28/04/2021, pág. 34/42 Leite (não-homogeneizado, A1/A2) 3,62 3,80 1,22 39,79 18,26 0,34 0,84 1,18 28,77 Leite (integral, A1/A2) 3,17 3,30 1,06 40,93 18,10 0,03 0,07 1,09 28,59 Leite (baixa gordura, A1/A2) 3,09 3,30 1,06 42,04 19,28 0,35 0,80 1,15 30,26 Leite (desnatado, A1/A2) 3,57 4,00 1,28 38,53 18,54 0,34 0,85 1,19 28,52 Leite em pó (integral, A2) 21,3 23,80 7,62 0,00 0,00 0,01 8,11 8,12 0,13 Leite em pó (baixa gordura, A2) 29,9 33,60 10,75 0,00 0,00 0,02 10,89 10,90 0,15 Leite em pó (integral, A1/A2) 21,8 24,00 7,68 35,83 16,03 2,29 6,09 8,39 27,35 Leite em pó (baixa gordura, A1/A2) 29,3 32,80 10,50 34,77 16,78 3,10 7,70 10,81 28,71 Fórmula infantil (Fase 1, A2) 9,41 10,15 1,51 28,24 0,00 0,18 2,15 2,33 7,64 Fórmula infantil (Fase 2, A2) 13,3 15,25 2,82 32,44 0,00 0,14 4,52 4,66 2,94 22/24
Fórmula infantil (Fase 3, A2) 12,8 13,91 2,60 38,32 0,67 0,18 3,89 4,07 4,52 Fórmula infantil (Fase 1, A1/A2) 9,6 10,55 1,56 39,56 14,02 0,72 1,85 2,57 28,19 Fórmula infantil (Fase 2, A1/A2) 13,3 15,03 2,80 32,79 14,67 1,08 2,67 3,74 28,71 Fórmula infantil (Fase 3, A1/A2) 15,7 16,10 2,97 43,00 23,37 2,19 4,25 6,44 34,02 Leite UHT (baixa gordura, A1/A2) 4,82 3,90 1,25 42,96 18,62 0,44 1,12 1,57 28,38 Leite UHT (full fat, A1/A2) 3,73 4,00 1,28 39,20 18,14 0,39 0,91 1,30 30,12 Padrão relativo de leite (0,0% A1) - - - 0,14 0,00 0,00 1,51 1,52 0,16 Padrão relativo de leite (0,5% A1) - - - 0,44 0,43 0,01 1,54 1,55 0,48 Padrão relativo de leite (1,0% A1) - - - 0,96 - 0,01 1,45 1,47 0,92 Padrão relativo de leite (2,0% A1) - - - 1,73 2,55 0,03 1,45 1,48 1,91 Padrão relativo de leite (5,0% A1) - - - 4,60 4,41 0,07 1,45 1,52 4,87 Padrão relativo de leite (10,0% A1) - - - 9,68 9,38 0,15 1,41 1,56 9,80 Padrão relativo de leite (20,0% A1) - - - 20,93 20,93 0,30 1,22 1,52 20,00 Padrão relativo de leite (40,0% A1) - - - 40,01 37,86 0,57 0,94 1,51 37,99
Padrão relativo de leite (60,0% A1) - - - 59,88 64,97 0,81 0,59 1,39 58,02 Padrão relativo de leite (80,0% A1) - - - - - 1,08 0,29 1,37 78,76 Padrão relativo de leite (100% A1) - - - 98,58 - 1,41 0,00 1,41 99,93
Petição 870210038352, de 28/04/2021, pág. 35/42 23/24
REFERÊNCIAS
[0081] 1. Trivedi, M.S., Shah, J.S., Al-Mughairy, S., Hodgson, N.W., Simms, B., Trooskens, G., Van Criekinge, W., e Deth, R.C., J. Nutr. Biochem., 2014, 25, 1011-
1018.
[0082] 2. WO 1996 /014577
[0083] 3. WO 1996 /036239
[0084] 4. WO 2002 /019832
[0085] 5. WO 2014 /193248
[0086] 6. WO 2015 /005804
[0087] 7. WO 2015 /026245
[0088] 8. WO 2017 /171563
[0089] 9. WO 2018 /063008
[0090] 10. Vincent, D., Elkins, A., Condina, M.R., Ezernieks, V., e Rochfort, S., 2016, PLOS ONE 11, e0163471.
[0091] 11. Givens, I., Aikman, P., Gibson, T., e Brown, R., Food Chemistry, 2013, 139, 549-552.
[0092] 12. Lutter, P., Parisod, V., e Weymuth, H., J. AOAC Int., 2011, 94, 1043-
1059.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para determinar as quantidades de variantes da beta-caseína do tipo A1 ou variantes da beta-caseína do tipo A2 em uma composição com mais de 80% de precisão, em que as variantes da beta-caseína do tipo A1 são variantes da beta-caseína com histidina na posição 67 da sequência de aminoácidos da beta- caseína e as variantes da beta-caseína do tipo A2 são variantes da beta-caseína com prolina na posição 67 da sequência de aminoácidos da beta-caseína, e onde a composição é leite ou um produto preparado a partir do leite, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas: (i) contato da composição com quimotripsina sob condições que permitem a digestão de beta-caseínas na composição pela quimiotripsina; (ii) obtenção de uma solução aquosa de peptídeos de digestão de beta- caseína; (iii) determinação das concentrações de: a) dois ou mais peptídeos de digestão de beta-caseína presentes na solução, em que cada peptídeo compreende 8 a 20 resíduos de aminoácidos e tem histidina em uma posição correspondente à posição 67 da sequência de aminoácidos de beta-caseína; e b) dois ou mais peptídeos de digestão de beta-caseína presentes na solução, em que cada peptídeo compreende 8 a 20 resíduos de aminoácidos e tem prolina em uma posição correspondente à posição 67 da sequência de aminoácidos de beta-caseína; analisando a mistura usando cromatografia líquida-espectrometria de massa; e (iv) cálculo da concentração de variantes de beta-caseína do tipo A1 na composição ou a concentração de variantes de beta-caseína do tipo A2 na composição usando as concentrações dos peptídeos de digestão de beta-caseína determinados na etapa (iii).
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as variantes da beta-caseína do tipo A1 compreendem qualquer uma ou mais dentre beta-caseína A1, beta-caseína B, beta-caseína C, beta-caseína F e beta-caseína G.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as variantes da beta-caseína do tipo A1 compreendem apenas a beta-caseína A1.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as variantes da beta-caseína do tipo A2 compreendem qualquer um ou mais de beta-caseína A2, beta-caseína A3, beta-caseína D, beta- caseína E, beta -caseína H1, beta-caseína H2 e beta-caseína I.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as variantes da beta-caseína do tipo A2 compreendem apenas a beta-caseína A2.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as variantes da beta-caseína do tipo A1 compreendem apenas beta-caseína A1 e as variantes da beta-caseína do tipo A2 compreendem apenas beta-caseína A2.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as concentrações de três ou quatro peptídeos de digestão da beta-caseína com histidina em uma posição correspondente à posição 67 da sequência de aminoácidos da beta-caseína são determinadas.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o leite é leite bovino e os peptídeos de digestão de beta-caseína são selecionados do grupo que compreende: (i) VYPFPGPIHN; (ii) SLVYPFPGPIHN; (iii) VYPFPGPIHNSLPQ; e (iv) SLVYPFPGPIHNSLPQ.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as concentrações de três ou quatro peptídeos de digestão da beta-caseína com prolina em uma posição correspondente à posição 67 da sequência de aminoácidos da beta-caseína são determinadas.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o leite é leite bovino e os peptídeos de digestão de beta-caseína são selecionados do grupo que compreende: (i) VYPFPGPIPN; (ii) SLVYPFPGPIPN; (iii) VYPFPGPIPNSLPQ; e (iv) SLVYPFPGPIPNSLPQ.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a mistura analisada por cromatografia líquida- espectrometria de massas contém peptídeos marcados isotopicamente correspondentes a cada um dos peptídeos de a) e b) da etapa (iii).
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os peptídeos marcados isotopicamente correspondem aos peptídeos de digestão como a seguir: Peptídeo de digestão Peptídeo marcado isotopicamente VYPFPGPIHN (*V)YPFPGPIHN SLVYPFPGPIHN SL(*V)YPFPGPIHN VYPFPGPIHNSLPQ VYPFPGPIHNS(*L)PQ SLVYPFPGPIHNSLPQ SL(*V)YPFPGPIHNSLPQ
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os peptídeos marcados isotopicamente correspondem aos peptídeos de digestão como a seguir: Peptídeo de digestão Peptídeo marcado isotopicamente VYPFPGPIPN (*V)YPFPGPIPN SLVYPFPGPIPN SL(*V)YPFPGPIPN VYPFPGPIPNSLPQ VYPFPGPIPNS(*L)PQ SLVYPFPGPIPNSLPQ SL(*V)YPFPGPIPNSLPQ
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o leite é leite bovino e as concentrações dos seguintes peptídeos são determinadas na etapa (iii): (i) VYPFPGPIHN; (ii) SLVYPFPGPIHN;
(iii) VYPFPGPIHNSLPQ; (iv) SLVYPFPGPIHNSLPQ; (v) VYPFPGPIPN; (vi) SLVYPFPGPIPN; (vii) VYPFPGPIPNSLPQ; e (viii) SLVYPFPGPIPNSLPQ.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que as quantidades de variantes da beta-caseína do tipo A1 e variantes da beta-caseína do tipo A2 na composição são determinadas com mais de 90% de precisão.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que as quantidades de variantes da beta-caseína do tipo A1 e variantes da beta-caseína do tipo A2 na composição são determinadas com mais de 95% de precisão.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que as quantidades de variantes da beta-caseína do tipo A1 e variantes da beta-caseína do tipo A2 na composição são determinadas com mais de 99% de precisão.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a composição é leite bovino ou um produto lácteo preparado a partir de leite bovino.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o leite é leite fresco, leite cru, leite em pó, leite líquido reconstituído a partir de pó, leite desnatado, leite homogeneizado, leite condensado, leite evaporado, leite aromatizado, leite UHT, leite pasteurizado ou leite não-pasteurizado.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o produto lácteo é fórmula infantil, creme, iogurte, requeijão, queijo, manteiga ou sorvete.
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WO2024070874A1 (ja) * 2022-09-30 2024-04-04 医療法人創和会 モノクローナル抗体、及びａ１ベータカゼインの検出方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN108519485B (zh) 2018-04-10 2020-09-08 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 一种A1/A2β-酪蛋白的质谱检测方法
CN108709939A (zh) * 2018-05-21 2018-10-26 杭州璞湃科技有限公司 一种用于检测牛乳品中A2β-酪蛋白含量的特征肽及方法
CN109283239B (zh) * 2018-10-22 2022-01-04 山东省农业科学院奶牛研究中心 一种检测牛乳中不同β-酪蛋白变体型的方法

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