CN109283239B - 一种检测牛乳中不同β-酪蛋白变体型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测牛乳中不同β‑酪蛋白变体型的方法，所述方法包括：S1.对待测样品进行蛋白质提取；S2.采用胰蛋白酶和V8蛋白酶对提取的蛋白质进行酶解消化；S3.对蛋白质酶解的肽段进行质谱检测，鉴定β‑酪蛋白的变体型。本发明检测方法设计合理，可以有效检测乳品中的不同β‑酪蛋白变体型(A1，A2，A3，B，C，E，F，H1，I)，并且检测准确性高、操作简便。本发明可以对奶牛的终端乳制品进行A2型β‑酪蛋白变体型判定，可规范A2奶乳制品市场。本发明是蛋白检测技术在生产实践上的一次很好应用，能够产生巨大的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于动物育种和食品检测技术领域，具体涉及一种同时检测乳品中β-酪蛋白A1、A2、A3、B、C、E、F、H1和I变体型的方法。
背景技术
该部分内容仅提供与本发明有关的背景信息，并不必然构成现有技术。
酪蛋白和乳清蛋白是牛奶中主要的两种蛋白质。其中，酪蛋白约占牛奶中总蛋白质的80％，包括αs1，αs2，β，κ四种类型。β-酪蛋白(β-casein，CSN2)作为氨基酸的重要来源，约占蛋白质总量的30％。由于β-酪蛋白基因中含有多个单核苷酸多态性(SNP)位点，使得β-酪蛋白呈现不同的蛋白变体型。据报道，它至少有12种不同的氨基酸序列组成形式，如A1、A2、A3、B、C、D、E、F、H1、H2、I、G等遗传蛋白变体型。
研究发现不同变体型β-酪蛋白是引起人喝牛奶后腹痛、拉肚子等症状的一个重要原因，这主要在于β-酪蛋白发生碱基变化，导致相应氨基酸的改变，最终影响了人体消化酶对牛奶的消化过程。A2纯合型β-酪蛋白的牛奶简称A2奶，它有助于消除部分人喝牛奶出现肠道反应的症状，有效避免婴幼儿喝牛奶引起的不良反应。
在分子检测方面，已有相关的技术方法能够同时区分β-酪蛋白基因不同的SNP位点，从而在基因水平上间接鉴别不同β-酪蛋白变体型(申请号：201710423750.3；申请号：201710438948.9)。在蛋白检测水平上，还没有同时对乳制品中β-酪蛋白多种变体型进行检测的方法。虽然，发明专利(申请号：2016107841806；申请号2016109833819)公开了检测乳品中A1型β-酪蛋白和A2型β-酪蛋白的方法，但是，这两种蛋白检测方法都仅基于检测一个β-酪蛋白氨基酸突变位点来区分A1和A2奶，由于A2和A3、E、H1、I变体型存在共同的突变位点，如果只检测一个位点会导致假阳性结果。目前，已有A2乳品上市，生产者、消费者和食品监管者迫切需要一种准确、快速的鉴定方法，来鉴定乳品中β-酪蛋白不同的蛋白变体型，进而识别A2奶的真伪。该鉴定技术是保障纯A2高端乳品生产的迫切需求和首要前提，是实现产品质量控制和防止假冒产品的重要基础，对中国奶业的健康发展和食品安全具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明为更准确、高效的对乳品中β-酪蛋白不同变体型进行鉴定，经过仔细的甄别筛选和大量的试验，得到了一种能够用于检测乳品中不同β-酪蛋白变体型(A1，A2，A3，B，C，E，F，H1，I)的方法。所述检测方法可同时检测多个氨基酸突变位点，而且特异性强、灵敏度高，能够准确的检测乳品中(鲜牛奶、奶粉)不同β-酪蛋白变体型。
本发明的目的之一在于提供一种检测牛乳中不同β-酪蛋白变体型的方法。
本发明的目的之二在于提供上述方法的应用。
为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种检测牛乳中不同β-酪蛋白变体型的方法，所述方法包括：
S1.对待测样品进行蛋白质提取；
S2.采用胰蛋白酶和V8蛋白酶对提取的蛋白质进行酶解消化；
S3.对蛋白质酶解的肽段进行质谱检测，鉴定β-酪蛋白的变体型。
其中，步骤S1中，待测样品包括但不限于生乳样品或奶粉样品；
具体的，对待测样品进行蛋白质提取的方法包括：
S1.1向待测样品中加入裂解液进行冰上裂解，离心；
S1.2加入二硫苏糖醇进行水浴，然后加入碘乙酰胺静置；
S1.3对蛋白质进行定量分析并进行凝胶电泳。
进一步的，
所述步骤S1.1中，裂解液为尿素和4-羟乙基哌嗪乙磺酸的混合物，所述尿素和4-羟乙基哌嗪乙磺酸的摩尔比为8:0.02～0.04(优选为8:0.03)；
所述步骤S1.2中，
水浴温度控制为55～60℃(优选56℃)；静置为暗室静置；
所述步骤S1.3中，
对蛋白质进行定量分析优选为考马斯亮蓝染色法(bradford法)，凝胶电泳具体为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；
步骤S2中，所述方法具体包括：
S2.1蛋白样品离心去废液后，加入碳酸氢铵调节并稳定pH；
S2.2加入胰蛋白酶(Trypsin)和V8蛋白酶(Glu-C)，在35～40℃(优选37℃)水温下进行水浴，离心后得消化后肽段；
S2.3真空抽干消化后的肽段，然后用甲酸复溶肽段。
其中，
步骤S2.1中，碳酸氢铵加入浓度为25mM；
步骤S2.2中，胰蛋白酶和V8蛋白酶加入浓度均为1μg/μl；
步骤S2.3中，甲酸加入浓度为0.1％。
本发明的第二个方面，提供上述方法在检测A2乳品中的应用。
本发明有益效果：
本发明检测方法设计合理，可以有效检测乳品中的不同β-酪蛋白变体型(A1，A2，A3，B，C，E，F，H1，I)，并且检测准确性高、操作简便；
本发明可以对奶牛的终端乳制品进行A2型β-酪蛋白变体型判定，可规范A2奶乳制品市场。本发明是蛋白检测技术在生产实践上的一次很好应用，能够产生巨大的经济和社会效益。
附图说明
图1：检测乳品中不同β-酪蛋白变体型方法的流程示意图；
图2：蛋白质的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；
图3：A2型β-酪蛋白对应的氨基酸序列及不同变体型对应的氨基酸突变位点；灰色字体为不同变体型β-酪蛋白中存在突变的位点，灰色框内为氨基酸突变类型；
图4：DNA直接测序鉴定奶牛β-酪蛋白基因型，图中，两个生乳样本对应奶牛的β-酪蛋白(CSN2)基因测序结果，箭头标出的位置是不同变体型CSN2基因中存在突变的位点，Δ标出了样本2中存在的突变位点(363位核苷酸由C突变为A，导致121位氨基酸由His突变为Gln)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明公开了一种检测乳品中不同β-酪蛋白变体型的方法。利用该方法可同时检测β-酪蛋白多个氨基酸突变位点，准确鉴别出乳品中不同β-酪蛋白变体型，且操作简便。
本发明建立了一种利用质谱检测来鉴别乳品中不同β-酪蛋白变体型(A1，A2，A3，B，C，E，F，H1，I)的方法。不同β-酪蛋白变体型是由于其内部多个氨基酸突变位点共同决定的，但现有的检测方法都仅检测一个β-酪蛋白突变氨基酸位点(p.82P>H)，来区分乳品中β-酪蛋白A1和A2-酪蛋白变体型，但由于A2和A3、E、H1、I变体型的此位点氨基酸相同，如果只检测这一个位点会导致假阳性结果。在A2奶食品市场检测实际应用过程中，对于准确鉴别乳品中的A2造成了诸多干扰。发明人针对现有的检测方式，针对同时检测β-酪蛋白不同变体型的可行性进行分析，提出了本发明。
本发明的设计思路为：对乳品(生乳或奶粉)进行检测前，要确保乳品样品在-80℃保存，从而有效保证蛋白质活性。首先，对乳品样品裂解、提取总蛋白，并对蛋白进行定量和质控。然后，对乳品中提取的蛋白质进行酶解；最后，对酶解蛋白质产生的肽段进行质谱检测，输出检测结果，根据质谱检测到的肽段，结合不同氨基酸突变组合对应的变体型，统计β-酪蛋白的变体型(图1)。
不同β-酪蛋白变体型(A1，A2，A3，B，C，E，F，H1，I)的确定是基于β-酪蛋白不同变体型共发生的8个氨基酸突变位点(p.51E>K、p.52E>K、p.82P>H、p.103I>L、p.108M>L、p.121H>Q、p.137S>R、p.167P>L)(GenBank:AAA30431.1)，实现对不同β-酪蛋白变体型检测的目的。
本发明的一个具体实施方式中，提供一种可以检测乳品制品中β-酪蛋白不同变体型的方法。该方法经过长时间条件的摸索和优化，具有准确、简便的特点。
所述的方法，包括如下步骤：
1、对生乳或奶粉样品进行蛋白质提取和质控；
2、对上述提取的蛋白质进行酶解消化；
3、对上述蛋白质酶解的肽段进行质谱检测；
4、根据质谱检测到的肽段，结合不同氨基酸突变组合对应的变体型，鉴定β-酪蛋白的变体型。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤1具体包括：
(1)取生乳样本50μl或奶粉样本30mg，加入500μl裂解液(8M尿素，30mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes))。冰上裂解10min。离心，4℃，20000g，30min，取上清，避免吸到油脂。
(2)加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度10mM。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺(IAM)至终浓度55mM，暗室静置1h。
(3)使用考马斯亮蓝染色法(bradford法)对蛋白质进行定量。
(4)对定量后的蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤2具体包括：
(1)每个样品取20μg蛋白体积，加入到10K超滤管中，14000g，4℃，离心40min，弃废液。
(2)加入200μl的25mM碳酸氢铵(NH4HCO3)，14000g，4℃，离心40min，弃废液。
(3)重复上述步骤两遍。
(4)加入1μg/μl的胰蛋白酶(Trypsin，Promega)和V8蛋白酶(Glu-C，Sigma)各1μl，37℃水浴24h，离心收集消化后肽段，通过使用适宜浓度和配比关系的胰蛋白酶(Trypsin)和V8蛋白酶进行双酶解，不仅提高了酶解速率，同时经质谱检测采用肽段覆盖率显著高于单一酶解，从而有效保证了后续质谱检测的检测效率和准确性。然而当V8蛋白酶添加量增加时，酶解体系的反应初速度增大，使得一部分大分子蛋白在较短时间内降解成多肽，而后其与蛋白质形成竞争关系，进而形成氨基酸，反而抑制酶解过程，酶解效率降低，同时获得的肽段覆盖率也显著降低，甚至劣于单一添加胰蛋白酶。
(5)真空抽干消化后的肽段。
(6)0.1％甲酸(FA)复溶肽段。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤3具体包括：
(1)将肽段上机检测。使用Q-Exactive质谱仪检测肽段信号。
(2)质谱扫描完毕，得到质谱原始文件。
(3)将质谱原始文件输入到PD(Proteome Discoverer 1.3，thermo)软件后，软件会对质谱谱图进行筛选。
(4)PD提取后的谱图用mascot软件进行搜索，搜索结束后，PD软件根据mascot软件搜索结果输出鉴定结果。
(5)根据质谱检测到的肽段，结合不同氨基酸突变组合对应的变体型，统计β-酪蛋白的变体型。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。其中，胰蛋白酶购自于Promega公司，V8蛋白酶购自于Sigma公司。
实施例1：检测不同β-酪蛋白变体型方法的构建
1、对牛奶或奶粉样品进行蛋白质提取和质控。
使用8M尿素充分溶解样品中的蛋白质，利用离心的方法分离样品中的蛋白质和油脂，并对获得的蛋白质样品进行二硫苏糖醇(DTT)还原和碘乙酰胺(IAM)烷基化保护。然后使用考马斯亮蓝染色法(bradford法)对蛋白进行定量，使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白条带是否清晰无降解。
2、对上述提取的蛋白质进行酶解消化；
取适量的上述样品，利用超速离心的方法，将样品中的缓冲液更换为25mM碳酸氢铵(NH4HCO3)，以便于后续的酶解，然后加入胰蛋白酶和V8蛋白酶将蛋白质酶解成肽段，真空抽干溶液后，用甲酸(FA)复溶肽段，待质谱上样检测。
3、对上述蛋白质酶解肽段进行质谱检测。
使用Q-Exactive质谱仪检测肽段，将质谱扫描得到的原始文件输入到PD(Proteome Discoverer 1.3，thermo)软件进行筛选，筛选后的谱图用mascot软件进行搜索，最后输出鉴定结果。
4、统计β-酪蛋白的变体型
根据质谱检测到的肽段，结合不同氨基酸突变组合对应的变体型，统计β-酪蛋白的变体型。
实施例2：方法的准确性和重复性检测。
以经过DNA直接测序鉴定，已确定β-酪蛋白基因型的奶牛作为检测对象，采用实施例1的方法对牛奶中β-酪蛋白不同变体型进行鉴定，准确率达100％。表明本检测方法是准确、有效的。
以已知β-酪蛋白变体型的牛奶样品作为检测对象，采用本检测方法进行多次重复试验，多次重复检测的结果一致，说明本方法具有很好的稳定性。
实施例3：实际样本的检测。
采用本发明实施例1的方法对2个生乳样本进行检测。
1、蛋白质提取和质控；
(1)取生乳样本50μl，加入500μl裂解液(8M尿素，30mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes))。冰上裂解10min。离心，4℃，20000g，30min，取上清，避免吸到油脂。
(2)加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度10mM。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺(IAM)至终浓度55mM，暗室静置1h。
(3)使用考马斯蓝染色法(bradford法)对蛋白质进行定量。
(4)对定量后的蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(图2)。
2、对上述提取的蛋白质进行蛋白质酶解消化；
(1)每个样本取20μg蛋白体积，加入到10K超滤管中，14000g，4℃，离心40min，弃废液。
(2)加入200μl的25mM碳酸氢铵(NH4HCO3)，14000g，4℃，离心40min，弃废液。
(3)重复上述步骤两遍。
(4)加入1μg/μl的胰蛋白酶(Trypsin)和V8蛋白酶(Glu-C)1μl，37℃水浴24h。离心收集消化后肽段。
(5)真空抽干消化后的肽段。
(6)0.1％甲酸(FA)复溶肽段。
3、对上述蛋白质消化的肽段进行质谱检测。
(1)将肽段上机检测。使用Q-Exactive质谱仪检测肽段信号。
(2)质谱扫描完毕，得到质谱原始文件。
(3)将质谱原始文件输入到PD(Proteome Discoverer 1.3，thermo)软件后，软件会对质谱谱图进行筛选。
(4)PD提取后的谱图用mascot软件进行搜索，搜索结束后，PD软件根据mascot软件搜索结果输出鉴定结果。
4、根据样品中检测到的含有突变位点的肽段(表1，表2)，结合不同氨基酸突变组合对应的变体型(表3，图3)，统计β-酪蛋白的不同变体型。样品1的β-酪蛋白为A2变体型，样品2的β-酪蛋白为A3变体型。与DNA直接测序鉴定到的奶牛β-酪蛋白的基因型一致(图4)。
| 肽段序列 | 修饰/突变 |
| FQs<u>EE</u>QQQTEDELQDK(<u>51</u>,<u>52</u>) | S3(Phospho) |
| <u>H</u>KEMPFPK(<u>121</u>) | |
| IHPFAQTQSLVYPFPGPI<u>P</u>NSLPQNIPPLTQTPVVVPPF<u>L</u>QPEV<u>M</u>GVSK(<u>82</u>,<u>103</u>,<u>108</u>) |
表1样品1蛋白肽段鉴定列表，小写字母代表修饰/突变位点，划线字母代表不同变体型β-酪蛋白中的氨基酸突变位点，括号内数字代表氨基酸位置
| 肽段序列 | 修饰/突变 |
| FQsEEQQQTEDELQDK(<u>51</u>,<u>52</u>) | S3(Phospho) |
| hKEMPFPKY(<u>121</u>) | H2(His->Gln) |
| IHPFAQTQSLVYPFPGPI<u>P</u>NSLPQNIPPLTQTPVVVPPF<u>L</u>QPEV<u>M</u>GVSK(<u>82</u>,<u>103</u>,<u>108</u>) |
表2样品2蛋白肽段鉴定列表，小写字母代表修饰/突变位点，划线字母代表不同变体型β-酪蛋白中的氨基酸突变位点，括号内数字代表氨基酸位置
表3不同变体型β-酪蛋白对应的氨基位点图
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (12)
1.一种检测牛乳中不同β-酪蛋白变体型的方法，其特征在于，所述方法用于检测牛乳中不同β-酪蛋白变体型A1，A2，A3，B，C，E，F，H1，I，同时检测β-酪蛋白多个氨基酸突变位点，所述方法包括：
S1.对待测样品进行蛋白质提取；
S2. 采用胰蛋白酶和V8蛋白酶对提取的蛋白质进行酶解消化；胰蛋白酶和V8蛋白酶加入浓度均为1 μg/μl；
S3. 对蛋白质酶解的肽段进行质谱检测，结合不同氨基酸突变组合对应的变体型鉴定β-酪蛋白的变体型；基于β-酪蛋白不同变体型A1、A2、A3、B、C、E、F、H1、I共发生的8个氨基酸突变位点：GenBank:AAA30431.1的p.51E>K、p.52E>K、p.82P>H、p.103I>L、p.108M>L、p.121H>Q、p.137S>R、p.167P>L；
其中，步骤S1中，待测样品为生乳样品或奶粉样品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中对待测样品进行蛋白质提取的方法包括：
S1.1 向待测样品中加入裂解液进行冰上裂解，离心；
S1.2 加入二硫苏糖醇进行水浴，然后加入碘乙酰胺静置；
S1.3 对蛋白质进行定量分析并进行凝胶电泳。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述步骤S1.1中，裂解液为尿素和4-羟乙基哌嗪乙磺酸的混合物，所述尿素和4-羟乙基哌嗪乙磺酸的摩尔比为8:0.02~0.04。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述步骤S1.1中，裂解液为尿素和4-羟乙基哌嗪乙磺酸的混合物，所述尿素和4-羟乙基哌嗪乙磺酸的摩尔比为8:0.03。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述步骤S1.2中，
水浴温度控制为55~60℃；静置为暗室静置。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述步骤S1.2中，
水浴温度控制为56℃。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述步骤S1.3中，
对蛋白质进行定量分析方法为考马斯亮蓝染色法，凝胶电泳具体为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述方法具体包括：
S2.1 蛋白样品离心去废液后，加入碳酸氢铵调节并稳定pH；
S2.2 加入胰蛋白酶和V8蛋白酶，在35~40℃水温下进行水浴，离心后得消化后肽段；
S2.3 真空抽干消化后的肽段，然后用甲酸复溶肽段。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤S2.2中，加入胰蛋白酶和V8蛋白酶，在37℃水温下进行水浴。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，
步骤S2.1中，碳酸氢铵加入浓度为25 mM。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，
步骤S2.3中，甲酸加入浓度为0.1%。
12.权利要求1-11任一项所述方法在检测A2乳品中的应用。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101703145A (zh) * | 2009-11-12 | 2010-05-12 | 天宁香料（江苏）有限公司 | 咸味香精用风味料原料肽的制备方法及制得产品的应用 |
| CN103251926A (zh) * | 2013-03-26 | 2013-08-21 | 代龙 | 一种中药水蛭提取物及其用途 |
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Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN103529138B (zh) * | 2013-07-23 | 2015-07-08 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种牛β-酪蛋白定量检测试剂盒及其应用 |
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| CN106855543A (zh) * | 2016-12-22 | 2017-06-16 | 绿城农科检测技术有限公司 | 一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法 |
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-
2018
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101703145A (zh) * | 2009-11-12 | 2010-05-12 | 天宁香料（江苏）有限公司 | 咸味香精用风味料原料肽的制备方法及制得产品的应用 |
| CN103251926A (zh) * | 2013-03-26 | 2013-08-21 | 代龙 | 一种中药水蛭提取物及其用途 |
| CN104222999A (zh) * | 2014-09-26 | 2014-12-24 | 大连雅威特生物技术股份有限公司 | 一种新型低钠盐的组成、制备和用途 |
| CN105925717A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-09-07 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的方法及其试剂盒 |
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