CN103529138B

CN103529138B - 一种牛β-酪蛋白定量检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN103529138B
Application number: CN201310314220.7A
Authority: CN
Inventors: 任一平; 陈启; 张京顺; 赖世云; 章宇
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2033-07-23
Also published as: CN103529138A

Abstract

本发明提供了一种牛β-酪蛋白定量检测试剂盒，主要包括牛β-酪蛋白特异肽（氨基酸序列为：VLPVPQK）、同位素标记牛β-酪蛋白特异肽（VL^*PV^*PQK）和同位素标记牛β-酪蛋白内标物（氨基酸序列为：QSVLSLSQSKVL^*PV^*PQKAVPYPQRD）。本发明试剂盒定量限为1mg/100g，重现性为RSD<9.50%（n=11），在食品基质中的回收率为73.41～93.88%（n=6），奶粉基质中的回收率为91.62～107.28%（n=6），试样预处理简单、快速、成本低。可适用于多种食品基质，对其中常量和微量的牛β-酪蛋白进行准确定量。

Description

一种牛β-酪蛋白定量检测试剂盒及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一种牛β-酪蛋白定量检测试剂盒，以及该试剂盒在定量检测含乳食品或乳制品中牛β-酪蛋白含量中的应用。

（二）背景技术

酪蛋白（casein）是哺乳动物乳液中的主要蛋白质之一，负责传输营养与能量。酪蛋白会在酸性条件下（pH=4.6时）凝固沉淀，其沉淀物可以制作成奶酪，酪蛋白也因此得名。酪蛋白以外的蛋白质总称为乳清蛋白。在不同哺乳动物乳液中，乳清蛋白和酪蛋白比例有所不同，牛乳中该比例约为2:8，而在人乳中此比例约为6:4。由于各种蛋白质的氨基酸序列不同，酪蛋白又可细分为α_s1、α_s2、β以及κ酪蛋白，在牛乳中其比例约为38:10:36:13。母乳中的酪蛋白含量与牛乳有较大差异，在母乳中不含有α_s2-酪蛋白，只含有微量α_s1-酪蛋白，β-酪蛋白的含量占总酪蛋白的50-70%。所以在母乳化配方奶粉中的β-酪蛋白含量是一个非常重要的质量指标，用于评估其配方与母乳接近程度。

另外，牛酪蛋白被世界卫生组织（WHO）以及国际免疫学会联合会（IUIS）定义为牛奶过敏原。世界范围内大约有5～7%的0～3岁婴幼儿以及2%成人患有牛奶过敏症。对过敏患者危害极大的是隐蔽过敏原，即食品中存在、却未在包装上以及配料表中注明该过敏原名称与含量。例如在生产牛奶面包后，使用同一流水线生产不含牛奶的面包，可能会导致牛奶过敏原的交叉污染。牛奶过敏患者在进食含有牛奶的食物后，会产生皮肤红肿，瘙痒，呼吸困难，呕吐，腹泻等症状，严重时甚至会导致休克。

作为一种营养物质，国内外β-酪蛋白的定量检测方法主要有液相色谱法、毛细管电泳法，凝胶分子体积排阻色谱等方法。此类方法均采用了紫外检测器，导致其检测灵敏度不高。同时上述分离手段的分离效果较差，不适合用于分析婴幼儿配方奶粉这样含有复杂组分的样品。

作为过敏原，牛奶在食品中的含量很低，并且含有大量的其它蛋白质，所以无法用上述检测方法对其进行定量检测。目前国内外定量检测牛奶过敏原的方法主要以PCR和ELISA法为主。PCR法通过检测食品中DNA来间接检测食品中过敏原含量。牛奶中只含有极其微量DNA，需要经过复杂的纯化富集操作，才能利用PCR技术进行扩增检测。同时，PCR技术无法区分同源性食品，比如牛奶与牛肉制品之间的区别。利用实时荧光PCR技术可以半定量检测，但是准确度不高。ELISA法主要利用了抗体与过敏原特异性结合，从而达到检测目的。抗体是通过致敏动物血清制备的，批次间差异非常大。同时抗体对过敏原的空间结构有要求，无法检测变性后的过敏原。并且ELISA法具有假阳性现象，会导致检测结果的不准确。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种应用同位素标记内标肽稀释法，结合LC-ESI-MS/MS准确定量检测含乳食品中牛β-酪蛋白含量的检测试剂盒及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种牛β-酪蛋白定量检测试剂盒，主要包括牛β-酪蛋白特异肽、同位素标记牛β-酪蛋白特异肽和同位素标记牛β-酪蛋白内标物，所述牛β-酪蛋白特异肽的氨基酸序列为：VLPVPQK；所述同位素标记牛β-酪蛋白特异肽的氨基酸序列为：VL^*PV^*PQK，其中L^*和V^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛β-酪蛋白内标物的氨基酸序列为：QSVLSLSQSKVL^*PV^*PQKAVPYPQRD，其中L^*和V^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

本发明试剂盒的关键：在碱性胰蛋白酶酶解的牛β-酪蛋白产物中经实验确认了牛β-酪蛋白所独有的氨基酸肽段；根据该肽段的氨基酸序列设计出同位素标记的特异肽和同位素标记内标物的序列，经化学合成获得三种高纯度的多肽成品。试剂盒中的其他试剂和物品，可根据需求在市场选择，例如参照CN102590413A中所使用的部分试剂。

本发明试剂盒中，牛β-酪蛋白特异肽（以下简称：特异肽）是指牛β-酪蛋白经筛选酶解后所产生的肽段，通过研究发现VLPVPQK是牛β-酪蛋白的特异肽段之一，经对比网上数据库以及使用高分辨液相色谱串联质谱法检测鉴定结果表明：存在牛乳及其制品中其他蛋白质中不存在与该氨基酸序列一致的氨基酸序列和胰蛋白酶酶解肽段。该氨基酸序列是牛β-酪蛋白经牛胰蛋白酶酶解后所特有的肽段（图2）。经化学合成、提纯后纯度可达99.0%以上，在本试剂盒中作为优化液质谱参数使用（图3）；

同位素标记牛β-酪蛋白特异肽是一条依据牛β-酪蛋白特异肽序列，经化学合成后的带有同位素标记氨基酸的特异肽段（以下简称：同位素特异肽）。其氨基酸序列为VL^*PV^*PQK，其中L^*和V^*为碳氮全同位素标记的氨基酸，经合成、提纯后纯度可达97.0%以上，而且其中不存在特异肽。在本试剂盒中作为优化内标酶解后质谱标记物质的液质谱参数使用（图4）；

同位素标记牛β-酪蛋白内标是专门为定量测定而设计与合成的内标物（以下简称：同位素内标）。同位素内标物的氨基酸序列为QSVLSLSQSKVL^*PV^*PQKAVPYPQRD，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸。该肽段具有与牛β-酪蛋白同样的酶解效率，可获得等量的同位素特异肽，可以对样品中的牛β-酪蛋白做准确定量。经合成、提纯后纯度可达97.0%以上，而且在测定过程中不产生特异肽。在本试剂盒中作为内标物质使用（图5）；

本发明利用牛β-酪蛋白酶解后所获得的特异多肽序列VLPVPQK进行定量检测，能对不同基质食品中的牛β-酪蛋白进行准确定量检测。

具体的，所述试剂盒中还可包括：氯化钙、碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘代乙酰胺、牛β-酪蛋白标准品（纯度大于98%）、胰蛋白酶和质控样品（图1）。

本发明还涉及所述的试剂盒在定量检测含乳食品或乳制品中牛β-酪蛋白含量中的应用。

各种合成肽产品的质量控制方法：

建立高效液相色谱（HPLC）和高效液相四级杆时间飞行串联质谱联用（HPLC-Q-TOF）的检测方法对牛β-酪蛋白特异肽、同位素标记特异肽和同位素标记内标进行纯度与杂质鉴定。

①.应用HPLC检测合成肽的纯度

称取待测肽段1mg，加入1mL水溶解，用水再将溶解液稀释至5mL，用HPLC-UV法在220nm波长下进行检测，面积归一法计算纯度。

②.应用UPLC-Q-TOF检测合成肽的杂质

称取待测肽段1mg，加入1mL水溶解，用水再将溶解液稀释20倍，用HPLC-Q-TOF法进行检测，通过全扫描以质量数的差异来鉴别杂质。

其中液相色谱分离条件如下：色谱柱：C18（孔径）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.08%（v/v）的三氟乙酸水溶液，流动相B为含0.08%（v/v）的三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

其中质谱检测条件如下：毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0，全扫描质量数区间200-2000m/z，停留时间100ms。

食品中牛奶过敏原的定量检测方法：

本发明适用于各种含量的牛β-酪蛋白样品的定量检测，样品基质包括奶粉原料、配方奶粉、面包、饼干、蛋糕、馒头、零食、麦片以及烘焙预混粉等。样品加入同位素标记内标后经胰蛋白酶酶切等样品前处理后，通过液相色谱分离，进入串联四级杆质谱，采用多反应监测方法进行检测，内标法计算结果。

所述样品前处理过程如下：

精密称取约10g样品，加入100mL碳酸氢铵溶液后均质，将样品悬浊液用适量碳酸氢铵溶液稀释，使其β-酪蛋白浓度在1～10μg/mL范围内，取1mL悬浊液，加入10μL同位素内标溶液和10μL二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入10μL碘代乙酰胺溶液，在室温下暗处静置30min，加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2h后加入5μL纯甲酸，室温静置1h，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析；

稀释牛β-酪蛋白标准储备液，使其β-酪蛋白含量为1、2、4、6、8和10μg/mL，取100μL标准溶液，加入900μL碳酸氢铵溶液和10μL同位素内标溶液，其余步骤按照样品前处理参考步骤操作，标准品酶切产物经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。

所述液相色谱分离参考条件如下：色谱柱：C18（孔径）色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.1%（v/v）的甲酸水溶液，流动相B为含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。

所述质谱检测参考条件如下：毛细管电压：3.0kv，锥孔电压：15kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：400L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.6；低端分辨率2：2.0V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：2.0；离子源温度：150℃，提取器电压：5.0V，入口透镜电压：10V，出口电压：10V。

所述质谱多反应监测方法的参数参考条件如下：牛β-酪蛋白特异肽的氨基酸序列为VLPVPQK，其双电荷质荷比为390.8m/z，它的三个特征碎片离子分别为213.5m/z、371.8m/z和568.3m/z，对应的碰撞能量分别为12eV、18eV和12eV；同位素特异肽的氨基酸序列为VL^*PV^*PQK（其中L^*和V^*为碳氮全同位素标记的氨基酸），其双电荷质荷比为397.2m/z，它的三个特征碎片离子分别为220.3m/z、371.8m/z和574.3m/z，对应的碰撞能量分别为12eV、18eV和12eV。

所述内标法计算过程如下：用全脂牛奶粉标准品与同位素内标按照比例配得标准曲线，按照步骤⑺样品前处理过程进行酶切处理，处理后样品进样分析，其液相色谱质谱条件与酶解后的样品溶液相同，根据得到的标准工作曲线中特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的溶液浓度，进行线性回归，得出线性方程Y=kX+b，其中Y为牛β-酪蛋白特异肽和同位素特异肽的峰面积比；X为牛β-酪蛋白的浓度，单位为μg/mL；k为线性方程的斜率；b为线性方程的截距。将酶解后样品溶液中测得的特异肽和同位素特异肽的峰面积比代入线性方程，即可计算得到样液中牛奶过敏原的浓度（以全脂牛奶粉计），将此浓度代入含量计算公式C_x=n_a×N×f,即可得到被测样品中牛奶过敏原的含量C_x。公式中C_x为被测样品中β-酪蛋白的含量，单位为mg/100g或者g/100g；n_a为被测样液中β-酪蛋白的浓度；N为样品稀释倍数；f为单位之间的换算因子。

本发明利用胰蛋白酶只作用于精氨酸（R）和赖氨酸（K）的专一性，把牛奶中所有蛋白质酶切成分子量从几十至上千道尔顿的肽段分子，从中选择牛β-酪蛋白所特有的特征肽段分子（特异肽）作为定量目标，使用全脂牛奶粉作为标准品参与酶解，采用同位素稀释法，克服了酶解效率不稳定以及基质效应，能准确定量食品中牛奶过敏原。

本发明采用的装置为：高效液相串联四级杆质谱联用仪，高效液相四级杆时间飞行串联质谱，配备相应的控制软件，恒温水浴摇床或恒温箱，蛋白质序列合成仪，微量移液器，超声仪，涡旋器。

本发明的有益效果主要体现在：

1、本发明试剂盒，配置种类齐全，通过试剂配制指南可操作简便地完成试剂配制，且易在一般实验室推广应用；

2、技术先进、可靠的质量检测和控制方法，保证了试剂盒的质量和检测结果的重现性；可满足大批量样品定量检测的需求。

3、本发明所开发的方法使用经研究设计合成的同位素标记内标物，能够准确的对食品中的牛β-酪蛋白过敏原进行定量，保证结果的可信度。

4、本发明所使用的试剂用量较少，检测成本较低，利于在普通实验室批量样品快速检测。

（四）附图说明

图1试剂盒所涉及的核心试剂整体外观照片；

图2为牛β-酪蛋白特异肽在牛β-酪蛋白一级结构中的位置及氨基酸序列图；

图3为本发明中所选牛β-酪蛋白特异肽色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）；

图4为本发明中同位素特异肽的色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）；

图5为本发明中同位素内标的色谱分离图（a）和质谱鉴别图（b）；

图6为本发明中所选特异肽与同位素特异肽中各个离子通道里的保留时间比较图；

图7为本发明中所选特异肽与同位素特异肽的裂解方式比较图；

图8为本发明中外标法与同位素内标法的回收率比较图。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1.本发明同位素特异肽的设计与确定：

根据实验确定的牛β-酪蛋白特异肽的氨基酸序列，充分考虑其相关理化性质以及在质谱检测过程中的干扰与离子化效率问题，并兼顾实际生产应用的成本与可行性，引入稳定同位素标记的亮氨酸（L^*）和缬氨酸（V^*）设计合成了牛β-酪蛋白特异肽的同位素特异肽，其氨基酸序列为VL^*PV^*PQK。

本发明引入了同位素特异肽的目的是为了克服由提取试剂以及基质所引起的基质效应。为了验证本发明所设计的同位素特异肽对牛β-酪蛋白特异肽在相同基质下结果的一致性，实验设计比较了同位素特异肽对牛β-酪蛋白特异肽在同一液相色谱以及质谱条件下的保留时间，子离子裂解方式以及线性。分别配制本发明中的同位素特异肽与牛β-酪蛋白特异肽的标准系列工作溶液，在相同的色谱质谱条件下进样分析，得其保留时间（图6）与线性回归方程。其中本发明中的同位素特异肽与牛β-酪蛋白特异肽的保留时间均为4.08min，充分证明这两者在液相色谱行为方面的一致性。

牛β-酪蛋白特异肽的三个子离子的质荷比分别是213.5m/z、371.8m/z和568.3m/z，其对应的裂解方式分别是b2、y3和y5。同位素特异肽所选择的子离子的质荷比分别是220.5m/z、371.8m/z和574.3m/z，第一个子离子包含了一个L^*，故质荷比与牛β-酪蛋白特异肽相比提高了7m/z；两者的第二个子离子不包含任何同位素标记的氨基酸，所以质荷比一致；最后一个子离子包含一个V^*，故质荷比提高了6m/z。同位素特异肽的子离子裂解方式与牛β-酪蛋白特异肽的裂解方式一致，均为b2、y3和y5（图7）。

2.本发明同位素内标的设计与确定：

在食品中，尤其是在加热处理后食品中，部分牛奶蛋白质会与基质中的碳水化合物，脂类以及其他蛋白质反应；部分蛋白质不参与基质反应，但是会包裹在基质中；只有一部分牛奶蛋白质是处于游离状态的，严重影响了蛋白质提取效率，从而影响了酶解以及检测结果。为了消除这些因素对定量结果带来的影响，在已设计选择并验证确定的同位素特异肽的基础上，充分考虑保留酶解位点的完整性并兼顾实际生产应用的成本与可行性，引入稳定同位素标记的亮氨酸（L^*）和缬氨酸（V^*）设计合成了同位素内标，其氨基酸序列为QSVLSLSQSKVL^*PV^*PQKAVPYPQRD，该同位素内标经碱性胰蛋白酶酶解后可产生同位素特异肽VL^*PV^*PQK。

为了验证本发明中的同位素内标与牛β-酪蛋白是否具有更加相近的酶解效率，设计进行了如下实验：

精密称取1g阴性样品，加入1mL的牛β-酪蛋白溶液，其浓度分别为10以及100μg/mL，随后加入9mL碳酸氢铵溶液后均质，1：10稀释后取1mL悬浊液，加入10μL同位素内标，充分涡旋震荡混合后加入10μL二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入10μL碘代乙酰胺溶液，暗处静置30min，加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2h后加入5μL纯甲酸，室温静置1h，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。将所获得的结果代入线性回归方程，可获得其含量与回收率。通过比较外标法和同位素稀释内标法回收率（图8）可知，同位素稀释内标法在回收率与结果稳定性上明显优于外标法，说明同位素稀释内标法能够有效排除酶解提取不稳定以及基质效应所带来的影响。

实施例2：试剂盒配制及使用说明

一、试剂配制：

1、牛β-酪蛋白特异肽标准溶液的配制：准确移取1mL超纯水，加入标准物质1管中（该管内装有已预先准确称量的牛β-酪蛋白特异肽），超声溶解（30s），所得溶液即为1μg/mL的牛β-酪蛋白特异肽溶液；

2、同位素特异肽标准溶液的配制：准确移取1mL超纯水，加入标准物质2管中（该管内装有已预先准确称量的同位素特异肽），超声溶解（30s），所得溶液即为1μg/mL的同位素特异肽溶液；

3、同位素内标标准储备液的配制：准确移取1mL超纯水，加入标准物质3管中（该管内装有已预先准确称量的同位素内标），超声溶解（30s），所得溶液即为1μg/mL的同位素内标溶液；

4、牛β-酪蛋白标准储备液的配制：准确移取1mL超纯水，加入标准物质4管中（该管内装有已预先准确称量的牛β-酪蛋白），超声溶解（5min）所得溶液即为100μg/mL的同位素内标溶液；

5、胰蛋白酶溶液的配制：准确移取1mL1mmol/L盐酸溶液，加入试剂1管中（该管内装有已预先准确称量的牛胰蛋白酶，比活>3000USP/mgpro），超声溶解（30s），所得溶液即为200μg/mL的胰蛋白酶溶液；

6、碳酸氢铵（NH₄HCO₃）溶液的配制：准确称取1.98g NH₄HCO₃（试剂2）于500mL容量瓶中，加入超纯水超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为50mmol/L的碳酸氢铵溶液；

7、碘代乙酰胺（IAA）溶液的配制：准确称取0.28g IAA（试剂3）于10mL容量瓶中，加入50mmol/L的碳酸氢铵溶液约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为150mmol/L的碘代乙酰胺溶液；

8、二硫苏糖醇（DTT）溶液的配制：准确称取0.08g DTT（试剂4）于10mL容量瓶中，加入50mmol/L的碳酸氢铵溶液约9mL，超声溶解（3min），待冷却至室温后定容到刻度，所得溶液即为50mmol/L的二硫苏糖醇溶液；

二、样品前处理及分析：

精密称取约10g样品，加入100mL碳酸氢铵溶液后均质，将样品悬浊液用碳酸氢铵溶液稀释，使其β-酪蛋白浓度在1～10μg/mL范围内，取1mL悬浊液，加入10μL同位素内标溶液和10μL二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入10μL碘代乙酰胺溶液，在室温下暗处静置30min，加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2h后加入5μL纯甲酸，室温静置1h，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析；

稀释牛β-酪蛋白标准储备液至1、2、4、6、8和10μg/mL，取100μL标准溶液，加入900μL碳酸氢铵溶液和10μL同位素内标溶液其余步骤按照样品前处理参考步骤操作，标准品酶切产物经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。

实施例3：

样品类型：市售饼干；

精密称取约10g样品，加入100mL碳酸氢铵溶液后均质，将样品悬浊液用碳酸氢铵溶液1：100稀释后，取1mL悬浊液，加入10μL同位素内标溶液和10μL二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入10μL碘代乙酰胺溶液，在室温下暗处静置30min，加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2h后加入5μL纯甲酸，室温静置1h，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。测得其中含有牛β-酪蛋白192.51±15.42mg/100g。

实施例4：

样品类型：市售馒头；

精密称取约10g样品，加入100mL碳酸氢铵溶液后均质，取1mL悬浊液，加入10μL同位素内标溶液和10μL二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入10μL碘代乙酰胺溶液，在室温下暗处静置30min，加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2h后加入5μL纯甲酸，室温静置1h，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。测得其中含有牛β-酪蛋白含量为0.14±0.016mg/100g。

实施例5：

样品类型：市售巧克力；

精密称取约10g样品，加入100mL碳酸氢铵溶液后在50℃水浴加热10min，其间摇晃5次以上，将样品悬浊液用碳酸氢铵溶液1：200稀释后，取1mL悬浊液，加入10μL同位素内标溶液和10μL二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入10μL碘代乙酰胺溶液，在室温下暗处静置30min，加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2h后加入5μL纯甲酸，室温静置1h，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。测得其牛β-酪蛋白含量为0.95±0.094g/100g。

实施例6：

样品类型：市售全脂奶粉；

精密称取约10g样品，加入100mL碳酸氢铵溶液后在50℃水浴加热10min使之溶解，将样品溶液用碳酸氢铵溶液1：500稀释后，取1mL溶液，加入10μL同位素内标溶液和10μL二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入10μL碘代乙酰胺溶液，在室温下暗处静置30min，加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2h后加入5μL纯甲酸，室温静置1h，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。测得其牛β-酪蛋白含量为7.42±0.17g/100g。

实施例7：

样品类型：实验室合成阴性样品；

称取取面粉125g、食盐2.5g、花生油15g，鸡蛋10g以及碳酸氢钠1g，加水50mL后揉制成面团，擀平，在170℃烘培25min。

精密称取约10g样品，加入100mL碳酸氢铵溶液后均质，取1mL悬浊液，加入10μL同位素内标溶液和10μL二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入10μL碘代乙酰胺溶液，在室温下暗处静置30min，加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2h后加入5μL纯甲酸，室温静置1h，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。在其中未检出牛β-酪蛋白。

实施例8：

样品类型：高纯度牛乳白蛋白；

精密称取约0.1g样品，加入1mL碳酸氢铵溶液后在50℃水浴加热10min使之溶解加入10μL同位素内标溶液和10μL二硫苏糖醇溶液，50℃恒温反应30min，取出冷却至室温，加入10μL碘代乙酰胺溶液，在室温下暗处静置30min，加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2h后加入5μL纯甲酸，室温静置1h，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。在其中未检出牛β-酪蛋白。

本发明试剂盒的牛β-酪蛋白定量检测方法的特点：定量限为1mg/100g，重现性为RSD<9.50%（n=11），在食品基质中的回收率为73.41～93.88%（n=6），奶粉基质中的回收率为91.62～107.28%（n=6），试样预处理简单、快速、成本低。可适用于多种食品基质，对其中常量和微量的牛β-酪蛋白进行准确定量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种牛β-酪蛋白定量检测试剂盒，主要包括牛β-酪蛋白特异肽、同位素标记牛β-酪蛋白特异肽和同位素标记牛β-酪蛋白内标物，其特征在于，所述牛β-酪蛋白特异肽的氨基酸序列为：VLPVPQK；所述同位素标记牛β-酪蛋白特异肽的氨基酸序列为：VL*PV*PQK，其中L*和V*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛β-酪蛋白内标物的氨基酸序列为：QSVLSLSQSKVL*PV*PQKAVPYPQRD，其中L*和V*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

2.如权利要求1所述的试剂盒在定量检测含乳食品或乳制品中牛β-酪蛋白含量中的应用。