CN108152385A - 一种婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法及实现该方法的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法及实现该方法的试剂盒，所述方法包括以下步骤：(1)检测样品中总蛋白的含量；(2)检测样品中αs1‑酪蛋白、αs2‑酪蛋白、β‑酪蛋白以及κ‑酪蛋白四种酪蛋白的含量；(3)通过计算总蛋白与四种酪蛋白的含量的差值，该差值即乳清蛋白的含量。本发明通过测定出样品中总蛋白与四种酪蛋白的含量的差值，即可准确的得到乳清蛋白的含量，而且本发明中检测样品中所有的酪蛋白，不涉及到换算系数，检测方法简单方便，检测结果准确可靠，可以准确检测出配方奶粉中乳清蛋白的含量。

Description

一种婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法及实现该方 法的试剂盒

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法及实现该方法的试剂盒。

背景技术

定量蛋白质组学的目的是对复杂的混合体系中所有的蛋白质进行鉴定，并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定，是当前系统生物科学研究的重要内容。近年来，由于质谱技术和生物信息学的进步，定量蛋白质组学在分析蛋白质组或亚蛋白质组方面已取得了令人瞩目的成就。

在种种成熟的蛋白质定量分析技术中，应用三重四极杆质谱(triplequadrupole)，在选择反应监控模式(selected reaction monitoring，SRM)中，对蛋白质中特异肽进行检测，在完全酶解的情况下，特异肽的摩尔浓度与对应蛋白质的摩尔浓度相同，故可以通过其与蛋白质分子量计算获得蛋白质的浓度。公开号为CN103616454A的专利文献公开了一种定量检测人β-酪蛋白含量的方法以及试剂盒，该方法中利用人β-酪蛋白酶解后所获得的特异多肽序列，设计出同位素标记的特异肽和同位素标记内标物的序列，并基于内标法对人β-酪蛋白进行定量检测。

乳中的蛋白质分为乳清蛋白和酪蛋白两大类，酪蛋白是奶酪中的主要蛋白质，并且因此而得名。在酸性环境中(特别是pH4.6)，酪蛋白会凝结沉淀，而婴幼儿的肠胃功能在尚未发育完全，在食用酪蛋白含量较高的牛奶后，会在胃酸的作用下凝结成块，难以消化和排空，导致婴幼儿出现胃胀、厌食等症状。乳清蛋白是奶酪制作的副产品，其中含有大量的活性蛋白质，例如乳铁蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白等，这些蛋白质具有杀菌、抗病毒的活性，能够帮助婴幼儿建立自身免疫系统。

在牛奶中酪蛋白和乳清蛋白的比例约为8:2。在母乳中该比例为4:6。因此，我国《食品安全国家标准-婴儿配方食品》(GB 10765-2010)中规定“乳基婴儿配方食品中乳清蛋白含量应≥60％”。我国的《食品安全国家标准-婴幼儿配方食品和乳粉乳清蛋白的测定》(GB/T 5413.2-1997)中介绍了一种基于十二烷基环酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的检测方法。样品用SDS-PAGE进行分离后，对酪蛋白与乳清蛋白各谱带的光密度进行测定，从而求得酪蛋白与乳清蛋白的含量比率。该方法由于本身性能限制，只适宜作为定性方法和半定量方法，无法用于定量检测，所以没有能够广泛推广使用。

在过去5年间，有部分团队拟采用胰蛋白酶酶解-同位素稀释-液相色谱串联质谱法建立检测方法。《食品安全国家标准-婴幼儿配方食品和乳粉中乳清蛋白的测定(征求意见稿)》(GB 5413.xx-201x)采用了该方法，以VGINYWLAHK和IDALNENK作为特异肽，分别检测样品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量，通过一个换算系数折算出乳清蛋白含量。虽然α-乳白蛋白和β-乳球蛋白占总乳清蛋白的75％左右，但是其比例随着生产条件、加工工艺的不同而有较大改变。所以，难以通过α-乳白蛋白和β-乳球蛋白来准确计算乳清蛋白含量。虽然可以通过增加被测乳清蛋白种类的方法来提高计算准确率，但是该方法存在严重的缺陷，由于乳清蛋白中含有数百种乳清蛋白，将会极大增加实验的成本和复杂程度。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法，可以准确检测出配方奶粉中乳清蛋白的含量。

本发明的技术方案为：一种婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法，包括以下步骤：

(1)检测样品中总蛋白的含量；

(2)检测样品中αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白以及κ-酪蛋白四种酪蛋白的含量；

(3)通过计算总蛋白与四种酪蛋白的含量的差值，该差值即乳清蛋白的含量。

与乳清蛋白相比，酪蛋白的种类比较少，仅有αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白四种，本发明通过测定出样品中总蛋白与四种酪蛋白的含量的差值，即可得到乳清蛋白的含量。

本发明中测定总蛋白含量的方法有多种，作为优选，所述步骤(1)中，采用凯氏定氮法对总蛋白含量进行检测。

本发明中测定四种酪蛋白含量的方法有多种，作为优选，所述步骤(2)中采用蛋白酶解-同位素稀释-液相色谱串联质谱法对四种酪蛋白的含量进行检测。

作为优选，所述蛋白酶为碱性胰蛋白酶。

作为优选，所述αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白分别选择YLGYLEQLLR、ALNEINQFYQK、VLPVPQK、YIPIQYVLSR作为特异肽。

作为优选，所述αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的分别选择YLGYLEQLL*R、AL*NEINQFYQK、VL*PVPQK、YIPIQYVL*SR作为同位素特异肽，其中L*是[¹³C₆,N₁₅]-亮氨酸。

本发明还提供了一种用于实现上述婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法的试剂盒。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明通过测定出样品中总蛋白与四种酪蛋白的含量的差值，即可准确的得到乳清蛋白的含量，而且本发明中检测样品中所有的酪蛋白，不涉及到换算系数，检测方法简单方便，检测结果准确可靠，可以准确检测出配方奶粉中乳清蛋白的含量。

附图说明

图1为本发明应用例1中αs1-酪蛋白一级结构数据库比对图。

图2为本发明应用例1中αs2-酪蛋白一级结构数据库比对图。

图3为本发明应用例1中β-酪蛋白一级结构数据库比对图。

图4为本发明应用例1中κ-酪蛋白一级结构数据库比对图。

图5为本发明应用例1中四种酪蛋白(αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白以及κ-酪蛋白)的特异肽的色谱峰图。

具体实施方式

实施例1

1、总蛋白的测定(凯氏定氮法)(参考GB 5009.5-2010)

精密称取1～2g婴幼儿配方奶粉于消化管内，加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾和20mL硫酸，加热至410℃孵育至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5～1h。待冷却后，将消化管放入蒸馏仪中，加入30mL氢氧化钠溶液(40g/L)，通入水蒸气进行蒸馏。用硼酸溶液(20g/L)吸收馏出物。用自动电位滴定仪，用盐酸标准滴定液(0.0500mol/L)滴定至pH 5.1。

通过盐酸标准滴定液可以计算得样品中的含氮量，以6.25作为凯氏定氮系数(氮换算为蛋白质的系数)，最终计算得样品中总蛋白的含量。

2、四种酪蛋白的测定

精密称取约1g样品于100mL容量瓶中，用碳酸氢铵溶液(500mmol/L)溶解和定容。取0.1mL溶液，加入10μL同位素内标溶液(YLGYLEQLL*R和VL*PVPQK为100mmol/L，AL*NEINQFYQK和YIPIQYVL*SR为20mmol/L)和10μL二硫苏糖醇溶液，70℃恒温水浴30min，取出冷却至室温，加入10μL碘代乙酰胺溶液，在室温下暗处静置30min，加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温酶解2h后，加入5μL纯甲酸终止反应，最后将所得溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析；

其中液相色谱分离参考条件如下：

色谱柱：C18(孔径)色谱柱；柱温为40℃，流动相A为0.1％(v/v)的甲酸水溶液，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min。洗脱梯度：流动相B在10分钟内从3％线性上升至40％，然后再1分钟内上升至100％，保留1分钟后下降至3％，平衡3分钟。

质谱检测参考条件如下：

毛细管电压：3.0kv，锥孔电压：15kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：400L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10^-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.6；低端分辨率2：2.0V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：2.0；离子源温度：150℃，提取器电压：5.0V，入口透镜电压：10V，出口电压：10V。

质谱多反应监测方法的参数参考条件如表1。

表1

标准曲线配制：配制四种酪蛋白特异肽标准曲线，其中SEQ ID No.1和SEQ IDNo.3为200、150、100、50、10mmol/L，SEQ ID No.2和SEQ ID No.4为40、30、20、10、2mmol/L，取上述溶液各10μL，加入10μL内标溶液(含YLGYLEQLL*R和VL*PVPQK100mmol/L，AL*NEINQFYQK和YIPIQYVL*SR20mmol/L)和980μL的0.1％甲酸溶液。

通过上述检测步骤和标准曲线，可获得样品酶解液中特异肽的摩尔浓度。在完全酶解的情况下，特异肽和酪蛋白的摩尔浓度相同。所以可以通过特异肽的摩尔浓度乘以酪蛋白分子量计算得酪蛋白的质量浓度。

3、计算

乳清蛋白含量计算公式如下：

应用例1(验证特异肽的通用性)

我国《关于禁止以委托、贴牌、分装等方式生产婴幼儿配方乳粉的公告》的第6条规定，“婴幼儿配方乳粉生产企业不得使用除牛、羊乳及其乳粉、乳成分制品(包括乳蛋白、乳糖等)以外的其他动物乳和乳制品生产婴幼儿配方乳粉。”根据该《公告》和目前生产现状，适宜作为婴幼儿配方乳粉原料的奶源有水牛奶、奶牛奶、绵羊奶、山羊奶。上述四种物种虽然都属于偶蹄目牛科动物，但是在蛋白质一级结构上还是有所区别。为了保证本发明在上述物种的通用性，故选择一组能在上述物种奶中都能酶解获得的多肽作为特异肽。为了验证本发明所选择特异肽的通用性，本发明通过数据库比对的方式和实际样品的检测来进行验证。

从网上公开数据库UniprotKB(www.uniprot.org)中下载四个物种的酪蛋白一级序列，并且对其一级序列进行对比，结果如图1至图4所示。本发明所选择的特异肽理论上均能四个物种的酪蛋白中酶解获得。

图1为αs1-酪蛋白一级结构数据库比对图，从上至下的样品奶源依次为：奶牛、水牛、山羊、绵羊；所选择的特异肽用框表示；Identity处的*表示该位置氨基酸序列完全一致。

图2为αs2-酪蛋白一级结构数据库比对图，从上至下的样品奶源依次为：奶牛、水牛、山羊、绵羊；所选择的特异肽用框表示；Identity处的*表示该位置氨基酸序列完全一致。

图3为β-酪蛋白一级结构数据库比对图，从上至下的样品奶源依次为：奶牛、水牛、山羊、绵羊；所选择的特异肽用框表示；Identity处的*表示该位置氨基酸序列完全一致。

图4为κ-酪蛋白一级结构数据库比对图，从上至下的样品奶源依次为：奶牛、水牛、山羊、绵羊；所选择的特异肽用框表示；Identity处的*表示该位置氨基酸序列完全一致。

本方法又采集了牛奶、水牛奶、山羊奶、绵羊奶四种样品，分别按照说实施例1的方法进行酶解后进样，结果显示，四个样品均能检测到，如图所示的色谱峰，进一步证明本发明所选择的特异肽通用于四个物种的酪蛋白，其中四种酪蛋白(αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白)的特异肽，从前至后分别是SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.1。

应用例2(验证本发明的准确度)

取牛奶粉(理论乳清蛋白占总蛋白20％)和婴幼儿配方奶粉(设计乳清蛋白占总蛋白63％)，按照实施例1的方法进行检测，检测结果见表2。检测结果符合理论值/设计值，证实了本方法的正确性。

表2检测结果

样品	牛奶	婴幼儿配方奶粉
			总蛋白g/100g	24.73	12.37
αs1-酪蛋白g/100g	8.51	2.10
			αs2-酪蛋白g/100g	2.03	0.45
β-酪蛋白g/100g	6.52	1.48
			κ-酪蛋白g/100g	2.42	0.52
总酪蛋白g/100g	19.48	4.55
			总乳清蛋白g/100g	5.25	7.82
乳清蛋白占总蛋白百分比	21.2％	63.2％

实施例2(与《食品安全国家标准-婴幼儿配方食品和乳粉中乳清蛋白的测定(征求意见稿)》对比)

选择两个婴幼儿配方奶粉分别作为样品1和样品2，分别采用实施例1所述的方法和《食品安全国家标准-婴幼儿配方食品和乳粉中乳清蛋白的测定(征求意见稿)》(简称《征求意见稿》)所述方法进行检测。其中样品1采用轻度水解乳清蛋白配方，乳清蛋白设计值为64％；样品2采用β-乳球蛋白降低配方，乳清蛋白设计值为63％。

检测结果参见表3和表4，样品1采用实施例1所述的方法的检测结果是65.4％，符合产品设计值的预期；采用《征求意见稿》的检测结果是51.9％，严重低于设计值。其原因在于，部分乳清蛋白在水解过后，乳清蛋白的一级结构破坏，无法酶解获得对应的特异肽，所以采用《征求意见稿》的检测结果偏低。

样品2采用实施例1所述的方法的检测结果是62.3％，符合产品设计值的预期；采用《征求意见稿》的检测结果是40.3％，严重低于设计值。β-乳球蛋白在母乳中不存在，被认为是牛奶过敏的主要因素，所以该产品所采用的乳清粉分离了部分β-乳球蛋白。因此，β-乳球蛋白含量降低导致按照《征求意见稿》所获得的乳清蛋白低于设计值。

表3采用本发明的检测结果

样品	样品1	样品2
			总蛋白g/100g	11.85	10.22
αs1-酪蛋白g/100g	1.98	1.63
			αs2-酪蛋白g/100g	0.55	0.48
β-酪蛋白g/100g	1.22	1.37
			κ-酪蛋白g/100g	0.35	0.37
总酪蛋白g/100g	4.10	3.85
			总乳清蛋白g/100g	7.75	6.37
乳清蛋白占总蛋白百分比	65.4％	62.3％

表4采用《征求意见稿》的检测结果

	样品1	样品2
			总蛋白g/100g	11.85	13.22
α-乳白蛋白g/100g	0.82	1.79
			β-乳球蛋白g/100g	2.87	1.41
总乳清蛋白g/100g	6.15	5.33
			乳清蛋白占总蛋白百分比	51.9％	40.3％

实施例3(乳清蛋白天然含量波动)

本实施例中经由人工配制7个样品，设计乳清蛋白含量为63％。所采用的乳清蛋白原料采用相似的甜乳清制备工艺，分别来自美国、德国、荷兰、新西兰、澳大利亚、法国和英国。7个样品分别采用实施例1和《征求意见稿》所述方法进行检测，检测结果见表5。

由结果显示，采用本发明的检测结果在设计值63％左右小范围浮动，相对标准偏差仅为3.2％，结果精确。采用《征求意见稿》的检测结果波动幅度较大，最大值为70.5％，最小值为53.6％，结果与设计值有较大差异。

《征求意见稿》采用α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作为标记物，通过换算系数计算得乳清蛋白含量。在不同的奶牛养殖条件和乳清生产工艺下，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量可能有所波动，不一定适用《征求意见稿》中涉及的换算系数，导致计算得的乳清蛋白含量产生较大幅度波动。本发明检测样品中所有的酪蛋白，不涉及到换算系数，所以检测结果准确可靠。

表5

序列表

<110> 杭州谱胜检测科技有限责任公司

<120> 一种婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法及实现该方法的试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成序列(unkonw)

<400> 1

Tyr Leu Gly Tyr Leu Glu Gln Leu Leu Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成序列(unkonw)

<400> 2

Ala Leu Asn Glu Ile Asn Gln Phe Tyr Gln Lys

1 5 10

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成序列(unkonw)

<400> 3

Val Leu Pro Val Pro Gln Lys

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成序列(unkonw)

<400> 4

Tyr Ile Pro Ile Gln Tyr Val Leu Ser Arg

1 5 10

Claims (7)

1.一种婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)检测样品中总蛋白的含量；

(2)检测样品中αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白以及κ-酪蛋白四种酪蛋白的含量；

(3)通过计算总蛋白与四种酪蛋白的含量的差值，该差值即乳清蛋白的含量。

2.如权利要求1所述的婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用凯氏定氮法对总蛋白含量进行检测。

3.如权利要求1所述的婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用蛋白酶解-同位素稀释-液相色谱串联质谱法对四种酪蛋白的含量进行检测。

4.如权利要求3所述的婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶为碱性胰蛋白酶。

5.如权利要求3或4所述的婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白分别选择YLGYLEQLLR、ALNEINQFYQK、VLPVPQK、YIPIQYVLSR作为特异肽。

6.如权利要求5所述的婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的分别选择YLGYLEQLL*R、AL*NEINQFYQK、VL*PVPQK、YIPIQYVL*SR作为同位素特异肽，其中L*是[¹³C₆,N₁₅]-亮氨酸。

7.一种用于实现如权利要求1～6任一所述婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法的试剂盒。