CN113341037B - 检测乳粉中乳清蛋白、酪蛋白含量和/或二者比例的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种液质联用检测乳粉中乳清蛋白含量、酪蛋白含量和/或二者的含量比例的方法。本发明所述方法通过选取乳清蛋白和酪蛋白各自的特征性肽段,使用各自的特征性肽段进行校正,提高了使用外标法质谱检测肽段的准确性与稳定性;除此之外,本发明所述方法还具有以下优势:试样预处理简单,成本低,适用性广,能够一次性完成乳清蛋白定量检测,不受生产过程中蛋白变性的影响,无需合成同位素内标,通过自身多条特征肽段比值的方式避免了质谱检测中离子化效率和基质的影响。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域,具体涉及一种液质联用检测乳粉中乳清蛋白含量、酪蛋白含量和/或二者的含量比例的方法。
背景技术
乳清蛋白作为婴幼儿配方乳粉中重要的营养成分之一,其在配方乳粉中的营养占比显得尤为重要。乳清蛋白的主要成分如下表1所示:
表1、乳清蛋白主要成分
乳清蛋白 | 占比(%) | 相对分子质量 | 等电点 | 功能作用 |
α-La | 20~25% | 14.2 | 4.20~4.50 | 结合包括钙在内的金属离子;有助于钙的运输和吸收;参与乳糖的合成;调节神经递质帮助睡眠;促进婴儿大脑发育;具有抗癌的作用。 |
β-Lg | 50~55% | 18.3 | 5.35~5.49 | 结合并运输脂溶性维生素和脂肪酸;参与前列腺素的相关酶的合成,具有抗高血压,抗肿瘤的作用;。 |
Ig | 10~15% | <150.0 | 5.50~8.30 | 抵抗微生物致病菌和毒素等,是人体免疫的重要组成部分;能够保护乳腺,防止感染。 |
BSA | 5~10% | 66.4 | 5.13 | 参与运输、代谢和分配配体;调节血液渗透压。 |
乳清蛋白中含有多种人体必需氨基酸,有极高的生物利用效价。所含的支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等)占其三分之一,这些支链氨基酸在为机体提供能量的同时也被证明是人体内谷氨酸盐合成的重要前体物质之一,另外,亮氨酸还能够参与调节骨骼肌蛋白合成的细胞内代谢通路,进而增强骨骼肌蛋白的合成。
乳清蛋白也是人体中含硫氨基酸(半胱氨酸)的重要来源,含硫氨基酸是组成谷胱甘肽和牛磺酸的重要前体物质。谷胱甘肽在自由基清除和免疫应答中发挥着关键作用,其和牛磺酸都能够抑制脂质过氧化,发挥抗氧化的作用。乳清蛋白中的苏氨酸在被肠道获取后,直接转化成为肠道粘液素,进而对肠细胞及肠道屏障连贯性提供保护。最后,乳清蛋白中的赖氨酸和精氨酸能够通过刺激机体代谢激素的分泌,促进肌肉的生长。
作为配方奶粉一项重要检测指标,在食品安全国家标准GB 10765-2010中规定婴幼儿配方奶粉乳清蛋白的含量应大于60%。由于婴幼儿配方乳粉中复杂的添加成分以及生产过程中加热,使得乳清蛋白与酪蛋白的蛋白空间结构发生变化,例如,二硫键打开,发生聚集反应,进而形成多种蛋白的聚合体,使得配方乳粉中乳清蛋白的检测变得极为困难。
当前,已有多种方法用于乳清蛋白的含量检测。然而,这些方法中,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱、高效毛细管电泳等均受加工过程中蛋白变性的影响,无法准确的定量,测量结果偏差较大;氨基酸折算法,其测定乳清蛋白含量的方法适用范围窄,容易受到添加物的影响;利用同位素内标的液质检测法,则由于需要合成内标同位素,检测成本高而无法广泛应用于实际生产中。
酪蛋白是奶中的主要蛋白质,经肠胃道消化后,会水解形成多种具有生物活性的多肽。目前配方乳粉中酪蛋白的检测主要是通过高效液相色谱进行的,但配方粉中的酪蛋白在高效液相中呈现的峰形并不理想,κ-酪蛋白与αS2-酪蛋白两者色谱峰不易区分。酶联免疫吸附和液相质谱联用等检测方法也相继被提出,在对酪蛋白检测方面具有较好的表现。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
针对上述现有技术中的检测方法缺陷,本发明的目的在于提供一种液质联用检测乳粉中乳清蛋白含量、酪蛋白含量和/或二者的含量比例的方法。本发明的方法通过选取乳清蛋白和酪蛋白各自的特征性肽段,通过使用各自的特征性肽段的校正,提高了使用外标法质谱检测肽段的准确性与稳定性。
解决方案
为实现本发明目的,本发明采用的技术方案如下:
第一方面,本发明提供了一种液质联用检测乳粉中乳清蛋白含量、酪蛋白含量和/或乳清蛋白/酪蛋白比率的方法,所述方法包括:
1)使用α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特征性肽段,按照α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分别占乳清蛋白20%、50%的配比,配制乳清蛋白标准品溶液;
2)使用α-酪蛋白和β-酪蛋白的特征性肽段,按照α-酪蛋白和β-酪蛋白分别占酪蛋白50%、40%的配比,配制酪蛋白标准品溶液;
3)将步骤1)所得乳清蛋白标准品溶液与步骤2)所得酪蛋白标准品溶液混合,配制成一系列的乳清蛋白:酪蛋白比率的混合蛋白标准品溶液;
4)以乳清蛋白:酪蛋白比率为横坐标,以α-乳白蛋白与β-酪蛋白、β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值为纵坐标,绘制标准曲线;
5)检测待测乳粉中β-乳球蛋白与α-酪蛋白、α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值;
6)将所检测的乳粉中β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值代入标准曲线,确定乳清蛋白与酪蛋白的比例M,根据由此确定的乳清蛋白与酪蛋白的比例M,计算得出β-乳球蛋白与α-酪蛋白的实际量;
并且,将所检测的乳粉中α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比代入标准曲线,确定乳清蛋白与酪蛋白的比例N,根据由此确定的乳清蛋白与酪蛋白的比例N,计算得α-乳白蛋白与β-酪蛋白的实际量;
7)根据步骤6)中得出的α-乳白蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白的实际量,得到实际的乳清蛋白含量、酪蛋白含量和/或乳清蛋白/酪蛋白比率。
上述方法中,作为优选,所述α-乳白蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白的特征性肽段分别为如SEQ ID.NO.1所示的LDQWLCEK、如SEQ ID.NO.2所示的VLPVPQK、如SEQID.NO.3所示的TPEVDDEALEK、如SEQ ID.NO.4所示的FALPQYLK。
作为优选,步骤3)中,所述乳清蛋白:酪蛋白的比率系列包括乳清蛋白:酪蛋白的比率分别为0.25、0.43、0.67、1、1.5、2.33。
作为优选,步骤6)中,所述β-乳球蛋白与α-酪蛋白的实际量的计算公式分别为:
其中,M1为根据β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比确定的乳清蛋白与酪蛋白比例M中的前项,M2为根据β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值确定的乳清蛋白与酪蛋白比例M中的后项,规定:M=M1/M2,M1+M2=1;并且,
其中,X为样品总蛋白浓度。
作为优选,步骤6)中,所述α-乳白蛋白与β-酪蛋白的实际量的计算公式分别为:
其中,N1为根据α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比确定的乳清蛋白与酪蛋白比例N中的前项,N2为根据α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值确定的乳清蛋白与酪蛋白比例N中的后项,规定:N=N1/N2,N1+N2=1;并且,
其中,X为样品总蛋白浓度。
作为优选,步骤7)中,
所述实际的乳清蛋白含量的计算公式为:
所述实际的酪蛋白含量的计算公式为:
所述实际的乳清蛋白/酪蛋白比率的计算公式为:
其中,M1为根据β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比确定的乳清蛋白与酪蛋白比例M中的前项,M2为根据β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值确定的乳清蛋白与酪蛋白比例M中的后项,规定:M=M1/M2,M1+M2=1;
其中,N1为根据α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比确定的乳清蛋白与酪蛋白比例N中的前项,N2为根据α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值确定的乳清蛋白与酪蛋白比例N中的后项,规定:N=N1/N2,N1+N2=1;并且,
其中,X为样品总蛋白浓度。
作为优选,步骤5)的检测包括以下样品处理和酶切步骤:
将待测奶粉样品溶解成蛋白浓度在0.1~0.4 mg/ml、优选0.2 mg/ml的样品溶液;使用纯醋酸滤膜,优选地孔径在0.45μm的纯醋酸滤膜,进行粗滤;将粗滤后的样品溶液加入碳酸氢铵溶液,然后加入二硫苏糖醇溶液,65~75℃、优选70℃水浴25~35min、优选30min;冷却后,加入碘乙酰胺溶液,避光静置25~35min、优选30min;光照8~12min、优选 10min,加入氯化钙溶液;加入胰蛋白酶溶液,于37℃酶切26~30h;加入醋酸溶液,终止酶切;用聚醚砜滤膜过滤,然后采用质谱进行选择性离子扫描分析。
在具体的实施方案中,本发明所述方法的检测上限为:蛋白总浓度在0.4 mg/ml。
第二方面,本发明提供了用于通过液质联用检测乳清蛋白:酪蛋白比率的特征性肽段组合,其包括:氨基酸序列分别如SEQ ID.NO.1、SEQ ID.NO.2、SEQ ID.NO.3、SEQID.NO.4所示的α-乳白蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白的特征性肽段。
在一个具体实施方案中,所述特征性肽段组合由氨基酸序列分别如SEQ ID.NO.1、SEQ ID.NO.2、SEQ ID.NO.3、SEQ ID.NO.4所示的α-乳白蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白的特征性肽段组成。
有益效果
与现有技术相比,本发明的检测乳粉中乳清蛋白含量、酪蛋白含量和/或乳清蛋白/酪蛋白比率的相对定量方法具有很高的准确性与稳定性,除此之外还具有以下优势:试样预处理简单,成本低,适用性广,能够一次性完成乳清蛋白定量检测,不受生产过程中蛋白变性的影响,无需合成同位素内标,通过自身多条特征肽段比值的方式避免了质谱检测中离子化效率和基质的影响。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明,这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为实施例中所使用的混合标品全扫描质谱图;
图2为奶粉样品全扫描质谱图;
图3为四条特征性肽段PRM模式下质谱图;
图4为如SEQ ID.NO.1所示的特征性肽段(LDQWLCEK)的全部碎片离子图;
图5为如SEQ ID.NO.3所示的特征性肽段(TPEVDDEALEK)的全部碎片离子图;
图6为如SEQ ID.NO.4所示的特征性肽段(FALPQYLK)的全部碎片离子图;
图7为如SEQ ID.NO.2所示的特征性肽段(VLPVPQK)的全部碎片离子图;
图8为四条特征性肽段的定量子离子峰形图;
图9显示在不同酶浓度下,经过不同的酶解时间,特征性肽段LDQWLCEK/VLPVPQK的峰面积比的变化,其中,横坐标为酶解时间,纵坐标为两种特征性肽段的峰面积比;
图10显示在不同酶浓度下,经过不同的酶解时间,特征性肽段TPEVDDEALEK/FALPQYLK的峰面积比的变化,其中,横坐标为酶解时间,纵坐标为两种特征性肽段的峰面积比;
图11显示在酶浓度1:20和酶解时间28h下,不同底物浓度对特征性肽段LDQWLCEK/VLPVPQK峰面积比值的影响,其中,横坐标为底物浓度,纵坐标为两种特征性肽段的峰面积比;
图12显示在酶浓度1:20和酶解时间28h下,不同底物浓度对特征性肽段TPEVDDEALEK/FALPQYLK峰面积比值的影响,其中,横坐标为底物浓度,纵坐标为两种特征性肽段的峰面积比;
图13为特征性肽段TPEVDDEALEK/FALPQYLK峰面积比 vs 浓度比的标准曲线,其中,横坐标为两种特征性肽段的浓度比,纵坐标为两种特征性肽段的峰面积比;该标准曲线回归方程的R2为0.9935;
图14为特征性肽段LDQWLCEK/VLPVPQK峰面积比 vs 浓度比的标准曲线,其中,横坐标为两种特征性肽段的浓度比,纵坐标为两种特征性肽段的峰面积比;该标准曲线回归方程的R2为0.992;
图15为脱盐乳清粉一级质谱图;
图16显示脱盐乳清粉蛋白的构成。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
另外,为了更好的说明本发明,在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解,没有某些具体细节,本发明同样可以实施。在一些实施例中,对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述,以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示,否则在整个说明书和权利要求书中,术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分,而并未排除其它元件或其它组成部分。
以下实施例中,所用试剂如下:
二硫苏糖醇(sigma,≥98% HPLC);碘代乙酰胺(sigma,≥99% NMR);α-乳白蛋白标品(sigma,≥85%);β-乳球蛋白标品(sigma,≥90%);α-酪蛋白标品 (sigma,≥70%);β-酪蛋白标品(sigma,≥98%);碱性牛胰蛋白酶 (sigma,≥10,000 BAEE);氯化钙(AR);碳酸氢铵(AR);乙酸(AR)。
以下实施例中,采用了纳升高效液相色谱-静电场轨道阱组合式高分辨质谱(NanoLC-Orbitrap MS)进行选择性离子扫描检测,所用色谱条件如下:
纳升高效液相UltiMate 3000(ACCELA)
色谱柱:Acclaim® PepMap RSLC(75μm×15cm,nanoViper C18,2μm,100A ThermoFisher Scientific); :Acclaim PepMapTM 100(75μm×2cm, nanoViper C18,3μm,100AThermo Fisher Scientific)
柱温:50℃
流动相A:2%乙腈+98%水+0.1%甲酸
流动相B:80%乙腈+20%水+0.1%甲酸
Loading:2%乙腈+98%水
流速:NC:0.25μl/min,上样流速:0.3μl/min
进样量:1μl
梯度洗脱条件
梯度洗脱
洗脱时间(min) | 流速(μl/min) | A% | B% |
0 | 0.25 | 96 | 4 |
5 | 0.25 | 96 | 4 |
65 | 0.25 | 78 | 22 |
70 | 0.25 | 10 | 90 |
75 | 0.25 | 96 | 4 |
76 | 0.25 | 96 | 4 |
以下实施例中,对特征性肽段进行PRM模式下的质谱扫描,所使用的质谱条件如下:
质谱Q Exactive(Thermo Fisher Scientific)
PRM模式
运行试剂:5至75 min
极性:阳性
分辨率:17500
AGC目标:1e5
最大IT:100ms
分离窗:1.0m/z
起始质荷比:Fixed first mass
NCE:27%,28%。
实施例1:特征性肽段的选择
对α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白的混合标准品以及奶粉样品进行质谱全扫描,其质谱图分别如图1、图2所示。
使用expasy peptide mass网站,对搜索NCBI数据库所得的4种蛋白:α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白进行模拟酶切(其模拟酶切肽段见下文),比较。将比较后的肽段代入到NCBI网站中进行BLAST比对分析,选取响应值高,且序列长度在5-25个氨基酸之间,最终确定特异性肽段,分别为:
α-乳白蛋白(下文也称为α-la)特征性肽段- LDQWLCEK(如SEQ ID.NO.1所示),
β-乳球蛋白(下文也称为β-lg)特征性肽段- TPEVDDEALEK(如SEQ ID.NO.3所示),
α-酪蛋白(下文也称为α-cs)特征性肽段- FALPQYLK(如SEQ ID.NO.4所示),
β-酪蛋白(下文也称为β-cs)特征性肽段- VLPVPQK(如SEQ ID.NO.2所示)。
上述四种特征性肽段的具体信息见表2,其PRM模式下的质谱图如图3所示。
上述四种特征性肽段的各自的子离子信息图分别如图4、5、6、7所示,由其可以看出,实验所选的定量子离子在检测过程中有较高的响应值;图8为4条肽段子离子单独检测的峰(这里将其合在一张图上),用以说明其在检测过程中独立成峰且相互无干扰;另外,定量碎片离子信息见表3;选取各特异性肽段的具有合适响应值与质量数的碎片离子作为定量离子。
上文所述的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白的模拟酶切肽段如下所示:
β-乳球蛋白
蛋白序列:
理论酶切肽:
牛α-乳白蛋白的F链,晶体结构
蛋白序列:
理论酶切肽:
α-S1-酪蛋白,部分 [牛]
蛋白序列:
理论酶切肽:
α-S2-酪蛋白前体 [牛]
蛋白序列:
理论酶切肽:
β-酪蛋白
蛋白序列:
理论酶切肽:
表2、特征性肽段信息
蛋白 | 肽段 | 分子量 | 氨基酸链 |
β-lg | TPEVDDEALEK | 623.29 | Thr-Pro-Glu-Val-Asp-Asp-Glu-Ala-Leu-Glu-Lys |
α-la | LDQWLCEK | 546.23 | Leu-Asp-Gln-Trp-Leu-Cys-Glu-Lys |
α-cs | FALPQYLK | 490.19 | Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr-Leu-Lys |
β-cs | VLPVPQK | 390.75 | Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys |
表3、定量碎片离子信息
母粒子 | 子离子质量数(KDa) | 保留时间(min) |
TPEVDDEALEK | 199.10836 | 27.5 |
LDQWLCEK | 268.16794 | 55.2 |
FALPQYLK | 120.08216 | 57.8 |
VLPVPQK | 372.2257 | 23.7 |
实施例2:酶解条件的优化、底物浓度的选择以及滤膜的选择
酶解条件优化:
实验以三元、爱力优品牌的奶粉样品(蛋白浓度为11.6g/100g奶粉样品)为底物,根据产品公司提供的信息,以酶浓度1:20,1:40,1:60,1:80,1:100进行酶解,根据酶解中特征性肽段LDQWLCEK/VLPVPQK的峰面积比的变化以及特征性肽段TPEVDDEALEK/FALPQYLK的峰面积比的变化,确定选用酶浓度1:20,酶解时间28h;在酶浓度为1:20时,在酶解时间28h之后上述两种肽段的比值均趋于稳定(详见图9、图10)。
底物浓度选择:
取奶粉样品分别溶解至蛋白浓度在0.1~1.0 mg/ml之间的十个梯度,使用孔径0.45 μm的纯醋酸滤膜进行粗滤,取250μl样品溶液加入150μl碳酸氢铵溶液,加入10μl二硫苏糖醇溶液,70℃水浴30min。冷却后加入30μl碘乙酰胺溶液,避光静置30min。光照10min,加入10μl氯化钙溶液,加入50μl Trypsin 溶液,37℃酶切28 h,加入10μl醋酸溶液,静置15min,终止酶切。用0.22 μm的聚醚砜滤膜过滤后,采用纳升液相色谱进行选择性离子扫描分析。结果显示:在0.4 mg/ml蛋白浓度以下时,酶解后两种特征性肽段的比值保持相对稳定的定值,检测效果良好(见图11、12)。
滤膜选择:
使用纯醋酸0.45 nm大孔径滤膜对奶粉样品初步过滤,去除部分添加物,以避免对后续实验产生影响,保证方法稳定性。上机前选取0.22 μm的、对蛋白吸附性极低的聚醚砜滤膜过滤。
实施例3:本申请所述方法的检测程序
1)标准曲线的建立:
使用α-乳白蛋白,β-乳球蛋白,α-酪蛋白,β-酪蛋白四种蛋白标准品,根据α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分别占乳清蛋白的20%、50%,配置乳清蛋白标准品溶液(即,其中,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的百分含量分别为20%、50%);根据α-酪蛋白和β-酪蛋白分别占酪蛋白的50%、40%,配置酪蛋白标准品溶液(即,其中,α-酪蛋白和β-酪蛋白的百分含量分别为50%、40%);所配制的乳清蛋白标准品溶液和酪蛋白标准品溶液的浓度相同。
吸取一定量上述乳清蛋白标准品溶液与酪蛋白标准品溶液配置成1ml的乳清蛋白/酪蛋白为0.25,0.43,0.67,1,1.5,2.33(质量比值)的混合溶液,进行检测,绘制标准曲线;特征性肽段TPEVDDEALEK/FALPQYLK峰面积比 vs 浓度比的标准曲线如图13所示,特征性肽段LDQWLCEK/VLPVPQK峰面积比 vs 浓度比的标准曲线如图14所示。
2)待测乳粉样品的处理与酶切:
将待测乳粉样品溶解成蛋白浓度在0.2 mg/ml的样品溶液;使用孔径0.45μm的纯醋酸滤膜,进行粗滤;将粗滤后的样品溶液加入碳酸氢铵溶液,然后加入二硫苏糖醇溶液,70℃水浴30min;冷却后,加入碘乙酰胺溶液,避光静置30min;光照10min,加入氯化钙溶液;加入胰蛋白酶溶液,于37℃酶切26~30h;加入醋酸溶液,终止酶切;
3)将步骤2)所得酶解产物用聚醚砜滤膜过滤,然后采用质谱进行选择性离子扫描分析,测得乳粉中β-乳球蛋白与α-酪蛋白、α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比;
4)将步骤3)所检测的乳粉中β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值代入标准曲线,确定乳清蛋白与酪蛋白的比例M,根据由此确定的乳清蛋白与酪蛋白的比例M,计算得出β-乳球蛋白与α-酪蛋白的实际量;
并且,将步骤3)所检测的乳粉中α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比代入标准曲线,确定乳清蛋白与酪蛋白的比例N,根据由此确定的乳清蛋白与酪蛋白的比例N,计算得α-乳白蛋白与β-酪蛋白的实际量;
所述β-乳球蛋白与α-酪蛋白的实际量的计算公式分别为:
其中,M1为根据β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比确定的乳清蛋白与酪蛋白比例M中的前项,M2为根据β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值确定的乳清蛋白与酪蛋白比例M中的后项,规定:M=M1/M2,M1+M2=1;并且,X为样品总蛋白浓度;
所述α-乳白蛋白与β-酪蛋白的实际量的计算公式分别为:
其中,N1为根据α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比确定的乳清蛋白与酪蛋白比例N中的前项,N2为根据α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值确定的乳清蛋白与酪蛋白比例N中的后项,规定:N=N1/N2,N1+N2=1;并且,X为样品总蛋白浓度;
5)根据步骤4)中得出的α-乳白蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白的实际量,得到实际的乳清蛋白含量、酪蛋白含量和/或乳清蛋白/酪蛋白比率;
所述实际的乳清蛋白含量的计算公式为:
所述实际的酪蛋白含量的计算公式为:
所述实际的乳清蛋白/酪蛋白比率的计算公式为:
其中,M1为根据β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比确定的乳清蛋白与酪蛋白比例M中的前项,M2为根据β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值确定的乳清蛋白与酪蛋白比例M中的后项,规定:M=M1/M2,M1+M2=1;
其中,N1为根据α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比确定的乳清蛋白与酪蛋白比例N中的前项,N2为根据α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值确定的乳清蛋白与酪蛋白比例N中的后项,规定:N=N1/N2,N1+N2=1;并且,
其中,X为样品总蛋白浓度。
实施例4:使用脱盐乳清粉,对本申请所述检测方法进行方法学验证
加标回收率
选取脱盐乳清粉作为加标样,根据脱盐乳清粉商品标注,其蛋白含量占12%,通过仪器检测其蛋白均为乳清蛋白,酪蛋白仅含极少量忽略不计;所用脱盐乳清粉的一级质谱图如图15所示,根据分析,其构成如图16所示。
使用该脱盐乳清粉,对本申请所述检测方法进行验证;具体地,以配方乳粉(实验室自产)为底物,通过加入不同添加量的脱盐乳清粉,测量乳清蛋白的含量变化,以验证本申请检测方法的准确性,其验证结果如下表4所示。
表4、使用脱盐乳清粉加标,验证本申请检测方法的准确性
根据表4,使用本申请检测方法检测脱盐乳清粉的加标回收率在98.63%~113.33%,对应的RSD在0.84%~7.42%之间。
实施例5:使用市售配方奶粉,对本申请所述检测方法进行方法学验证
根据实施例3中记载的本申请所述检测方法,对三种品牌的市售配方奶粉进行检测:分6组平行检测,每天检测一次,共检测3天,以验证本申请所述检测方法的重复性与精密度;三种品牌的市售配方奶粉的检测结果分别如表5-7所示,表5-7中,LD代表α-乳白蛋白特征性肽段- LDQWLCEK(如SEQ ID.NO.1所示),TP代表β-乳球蛋白特征性肽段-TPEVDDEALEK(如SEQ ID.NO.3所示),FAL代表α-酪蛋白特征性肽段- FALPQYLK(如SEQID.NO.4所示),VL代表β-酪蛋白特征性肽段- VLPVPQK(如SEQ ID.NO.2所示)。
表5、使用品牌一配方奶粉(三元,恩贝益一段)进行检测的检测重复性与精密度结果
表6、使用品牌二配方奶粉(三元,爱欣宝一段)进行检测的检测重复性与精密度结果
表7、使用品牌三配方奶粉(三元,爱力优一段)进行检测的检测重复性与精密度结果
根据表5-7可知,上述检测的组内RSD在2.03%~9.35%之间,组间RSD在0.61%~11.02%,这说明:本申请所述检测方法的重复性与精密度均良好。
实施例6:本申请所述检测方法的检测实例
根据实施例3中记载的本申请所述检测方法,检测市售配方奶粉(雅培,经典恩美力一段)中的乳清蛋白含量,具体程序如下:
称取0.2g市售配方奶粉(雅培,经典恩美力一段)加超纯水定容至200ml,使用孔径0.45μm的纯醋酸滤膜进行粗滤,取250μl样品溶液加入150μl碳酸氢铵溶液, 10μl二硫苏糖醇溶液,70℃水浴30min。冷却至室温后加入 30μl 碘乙酰胺溶液,避光静置30min。光照10min,加入 10μl 氯化钙溶液,加入 50μl Trypsin 溶液,37℃酶切28h,加入10μl醋酸溶液静置15min终止酶切。用0.22μm的聚醚砜滤膜过滤后上机检测。计算得样品中乳清蛋白占总蛋白含量的61.77%。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京三元食品股份有限公司
<120> 检测乳粉中乳清蛋白、酪蛋白含量和/或二者比例的方法
<130> 1064-210129F
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Bovine
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<400> 1
Leu Asp Gln Trp Leu Cys Glu Lys
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Bovine
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(7)
<400> 2
Val Leu Pro Val Pro Gln Lys
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Bovine
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(11)
<400> 3
Thr Pro Glu Val Asp Asp Glu Ala Leu Glu Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Bovine
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<400> 4
Phe Ala Leu Pro Gln Tyr Leu Lys
1 5
Claims (8)
1.一种液质联用检测乳粉中乳清蛋白含量、酪蛋白含量和/或乳清蛋白/酪蛋白比率的方法,所述方法包括:
1)使用α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的特征性肽段,按照α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分别占乳清蛋白20%、50%的配比,配制乳清蛋白标准品溶液;
2)使用α-酪蛋白和β-酪蛋白的特征性肽段,按照α-酪蛋白和β-酪蛋白分别占酪蛋白50%、40%的配比,配制酪蛋白标准品溶液;
3)将步骤1)所得乳清蛋白标准品溶液与步骤2)所得酪蛋白标准品溶液混合,配制成一系列的乳清蛋白:酪蛋白比率的混合蛋白标准品溶液;
4)以乳清蛋白:酪蛋白比率为横坐标,以α-乳白蛋白与β-酪蛋白、β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值为纵坐标,绘制标准曲线;
5)检测待测乳粉中β-乳球蛋白与α-酪蛋白、α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值;
6)将所检测的乳粉中β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值代入标准曲线,确定乳清蛋白与酪蛋白的比例M,根据由此确定的乳清蛋白与酪蛋白的比例M,计算得出β-乳球蛋白与α-酪蛋白的实际量;
并且,将所检测的乳粉中α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比代入标准曲线,确定乳清蛋白与酪蛋白的比例N,根据由此确定的乳清蛋白与酪蛋白的比例N,计算得α-乳白蛋白与β-酪蛋白的实际量;
7)根据步骤6)中得出的α-乳白蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白的实际量,得到实际的乳清蛋白含量、酪蛋白含量和/或乳清蛋白/酪蛋白比率。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述α-乳白蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白的特征性肽段分别为如SEQ ID.NO.1所示的LDQWLCEK、如SEQ ID.NO.2所示的VLPVPQK、如SEQ ID.NO.3所示的TPEVDDEALEK、如SEQ ID.NO.4所示的FALPQYLK。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,步骤3)中,所述乳清蛋白:酪蛋白的比率系列包括乳清蛋白:酪蛋白的比率分别为0.25、0.43、0.67、1、1.5、2.33。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中,步骤7)中,
所述实际的乳清蛋白含量的计算公式为:
所述实际的酪蛋白含量的计算公式为:
所述实际的乳清蛋白/酪蛋白比率的计算公式为:
其中,M1为根据β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比确定的乳清蛋白与酪蛋白比例M中的前项,M2为根据β-乳球蛋白与α-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值确定的乳清蛋白与酪蛋白比例M中的后项,规定:M=M1/M2,M1+M2=1;
其中,N1为根据α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比确定的乳清蛋白与酪蛋白比例N中的前项,N2为根据α-乳白蛋白与β-酪蛋白的特征性肽段的峰面积比值确定的乳清蛋白与酪蛋白比例N中的后项,规定:N=N1/N2,N1+N2=1;并且,
其中,X为样品总蛋白浓度。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其中,步骤5)的检测包括以下样品处理和酶切步骤:
将待测奶粉样品溶解成蛋白浓度在0.1~0.4mg/ml的样品溶液;使用孔径在0.45μm的纯醋酸滤膜,进行粗滤;将粗滤后的样品溶液加入碳酸氢铵溶液,然后加入二硫苏糖醇溶液,65~75℃水浴25~35min;冷却后,加入碘乙酰胺溶液,避光静置25~35min;光照8~12min,加入氯化钙溶液;加入胰蛋白酶溶液,于37℃酶切26~30h;加入醋酸溶液,终止酶切;用聚醚砜滤膜过滤,然后采用质谱进行选择性离子扫描分析。
8.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述方法的检测上限为:蛋白总浓度在0.4mg/ml。
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