CN115808400A - 分泌型免疫球蛋白a的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了分泌型免疫球蛋白A的检测方法，属于检测领域。本发明的检测方法创新地采用前处理、分析超速离心‑沉降速率技术，检测牛奶或乳制品中的sIgA含量。在前处理中可以将待测乳制样品预先形成合适pH值的水溶液以调节至酪蛋白的等电点，使其中酪蛋白沉淀并析出，再通过离心以去除酪蛋白和低分子量成分。进而将获得的滤液经分析型超速离心机检测。本发明的方法对于检测对象的品质要求低，适合各类乳制品的检测，应用范围广。

Description

分泌型免疫球蛋白A的检测方法

技术领域

本发明属于检测领域，具体涉及一种蛋白/肽物质，尤其是免疫球蛋白的分析检测技术领域，更具体而言，本发明涉及乳制品尤其是初乳品中分泌型免疫球蛋白A的检测方法。

背景技术

分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）是外分泌液中的一种抗体，主要存在于乳汁、胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道和口腔/鼻腔粘膜部位，是肠道黏膜免疫系统中主要的效应因子，它区别于血清型免疫球蛋白A（IgA）而被命名为sIgA。sIgA是由外分泌腺和黏膜相关的淋巴组织合成的一种免疫球蛋白，分子质量约为390 kDa，主要由两个单体IgA、J链和一个分泌片(SC)连接而成，SC是sIgA特异性受体，借二硫键与sIgA共价结合。

sIgA的主要功能有：阻抑黏附、免疫排除、溶解细菌、中和病毒、介导ADCC、抗炎症、促进天然因子的作用以及调节黏膜免疫反应。例如，当肠道中sIgA的含量减少时，会使肠道中产气荚膜梭菌增加，致使婴幼儿肠道免疫功能降低，肠道菌群失调。

研究发现，sIgA是婴儿出生后最早获得的免疫物质，保护初生婴幼儿免受病原微生物的感染，在维持婴儿肠道的微生物稳态和婴儿肠道免疫功能方面具有重要意义。婴幼儿的免疫系统发育缓慢，自出生起的4-6月内，新生儿消化道和呼吸道等防御病原微生物的免疫力主要来源于母乳中的sIgA。相关研究证明母乳中的sIgA含量与喂养小孩的患病有相关性，较高的sIgA含量可被认为是健康婴儿的生物标志物。

奶粉重要来源为牛奶，因此检测牛奶中sIgA含量有重要意义。牛犊在出生时体内没有免疫球蛋白，出生后通过摄取奶牛的初乳而获得免疫球蛋白。初乳中免疫球蛋白主要是IgA，且以分泌型的sIgA为主。新生牛犊摄取初乳后经肠上皮进入循环，为机体提供了来自奶牛的免疫球蛋白，进入牛犊消化道的病毒是通过与初乳中的抗体在肠道不断中和而起主要保护作用的。

由于牛初乳中成分复杂，不仅有sIgA同时有免疫球蛋白G（IgG），因而需要将sIgA纯化出来再进行检测，对于牛初乳中sIgA的分离纯化，引用文献1中公开了通过聚乙二醇法（PEG）、果菜胶法、硫酸铵盐析法进行粗提，再通过凝胶过滤法、亲和色谱法、嗜硫色谱法、超滤法、酶解法、离子交换法等方法进行提纯。引用文献2中公开了一种sIgA的纯化方法，其通过对去除了酪蛋白后的初乳的上清液进行除盐处理后，进而采用凝胶色谱柱或者凝胶电泳处理以得到纯化的sIgA。然而，这些纯化方法对于精确的定量分析而言仍然是困难的甚至是无法完成的。

进一步，现有sIgA检测技术大多利用高效液相色谱法分析检测，例如，引用文献3中所公开的，由于牛奶中成分复杂，前处理需要盐析、超滤、离子交换和凝胶层析技术纯化牛初乳sIgA，才能上机检测，依然是由于前处理复杂，从而导致了检测成本高。

引用文献：

引用文献1：“牛初乳sIgA分离纯化及其检测方法的研究进展”，刘晓飞等，《东北农业大学学报》，2008；

引用文献2：CN105713085A；

引用文献3：“高效液相色谱法检测牛初乳sIgA方法研究”，刘晓飞等，《乳业科学与技术》，2007。

发明内容

发明要解决的问题

在乳制品，尤其是初乳制品中的sIgA的检测过程中，现有技术基于色谱方法测定存在很多条件制约。由于奶制品中成分复杂，前处理需要盐析、超滤、离子交换和凝胶层析技术纯化牛初乳sIgA，才能上机检测，因此，现有定量分析方法过程复杂、效率不高，导致检测成本高，使得目前的检测方法在使用时易受到限制。

基于上述存在的问题，本发明提供了一种新的检测乳制品、尤其是初乳中sIgA的方法，本发明的方法具有样品前处理效果好、分离度高的优势，同时，旨在降低检测成本，并且本发明的方法尤其适合针对牛初乳制品中sIgA成分的定量分析。

更具体地，本发明通过调节样品溶液pH的手段，去除了样本中的杂蛋白（例如酪蛋白）。进一步，利用分析型超速离心技术进行分析，可将IgG与sIgA区分开，因此，在定量检测中能够排除IgG等的干扰，提高了分离度，实现对sIgA的准确检测。

用于解决问题的方案

通过发明人长期的研究，发现通过以下技术方案的实施能够解决上述技术问题：

[1]. 本发明主要提供了一种分泌型免疫球蛋白A的检测方法，其中，所述检测方法包括：

前处理步骤：所述前处理步骤包括对检测对象进行分离酪蛋白的步骤和去除低分子量成分的步骤以得到检测样品；所述低分子量成分去除的步骤中，至少将分子量低于80kDa的成分去除；

样品检测步骤：利用分析超速离心-沉降速率法对所述检测样品进行检测。

[2]. 根据[1]所述的方法，其中，所述检测对象为乳制品；所述前处理步骤中还包括使用含有磷酸-盐的复合缓冲性成分水溶液溶解所述检测对象的步骤。

[3]. 根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述分离酪蛋白的步骤中，将检测对象形成pH值为4.2～4.6范围的水溶液。

[4]. 根据[1]~[3]任一项所述的方法，其中，所述前处理的步骤中，还包括去除所述检测对象中油脂的步骤。

[5]. 根据[1]~[4]任一项所述的方法，其中，所述去除低分子量成分的步骤中，将分子量低于100kDa的成分去除。

[6]. 根据[1]~[5]任一项所述的方法，其中，所述去除低分子量成分的步骤通过超滤进行。

[7]. 根据[6]所述的方法，其中超滤通过离心处理进行。

[8]. 根据[1]~[7]任一项所述的方法，其中，所述样品检测步骤中，通过测定具有不同沉降系数组分的吸光度，以确定所述分泌型免疫球蛋白A的含量。

[9]. 根据[8]所述的方法，其中，所述样品检测步骤中，通过紫外/可见光进行所述吸光度的测定。

[10]. 根据[1]~[9]任一项所述的方法，其中，所述样品检测的步骤中，使用分析型超速离心机，其转速为30,000~35,000rpm。

发明的效果

通过上述技术方案的实施，与现有的检测sIgA的工艺技术相比，本发明技术方案具有如下的优势：

（1）本发明的检测对象的前处理步骤简单、便捷，大大降低了检测成本；

（2）本发明的检测方法对于检测对象的品质要求低，适合各类乳制品的检测尤其是初乳制品中sIgA的定量分析，应用范围广；

（3）本发明首次提出了利用分析超速离心-沉降速率法技术检测sIgA的方法，可有效对不同的免疫球蛋白进行分离，尤其是排除IgG的干扰，提高了分离度，从而实现对sIgA的准确检测。

附图说明

图1为本发明的实施例中IgA和IgG标准品图谱；其中纵坐标“C(s)”表示紫外吸光信号值，横坐标表示沉降系数，单位为 S（即，Svedberg，1S=10^-13s）。

图2为本发明的实施例中IgA和IgG单体峰重叠图谱。

图3为本发明的实施例1牛初乳粉样品图谱。

图4为本发明的对比例1样品检测图谱。

图5为本发明的对比例2样品检测图谱。

具体实施方式

以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是，除非另有定义则：

本说明书中，使用“数值A~数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“以上”或“以下”表示的数值范围是指包含本数的数值范围。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，使用“D”或“Da”表示分子量单位“道尔顿”。

本说明书中，使用“任选”或“任选的”表示某些物质、组分、执行步骤、施加条件等因素使用或者不使用以及对使用方式没有限定。

本说明书中，所使用的单位名称均为国际标准单位名称，并且如果没有特别声明，所使用的“%”均表示重量或质量百分含量。

本说明书中，使用“常温”或“室温”指的均为23±2℃的环境温度。

本说明书中，使用“溶液”表示乳制品组分与水形成的溶解或分散体系，并非意指均一溶解的体系，其存在形式可以包括基本均匀的（微）乳液。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本发明主要的提供了一种简便、经济的针对检测乳制品，尤其是初乳制品中分泌型免疫球蛋白A的含量的检测方法。本发明主要基于以下见解而得到：

对于乳制品，尤其初乳制品中含有的各种免疫球蛋白定量检测，其杂蛋白的去除以及避免不同类型的免疫球蛋白之间的检测干扰是重要的方面之一。本发明的检测方法创新地采用前处理、分析超速离心-沉降速率技术，检测牛奶或乳制品中的sIgA含量。在前处理中可以将待测乳制样品预先形成合适pH值的水溶液以调节至酪蛋白的等电点，使其中酪蛋白沉淀并析出，再通过离心以去除酪蛋白和低分子量成分。进而将获得的滤液经分析型超速离心机检测。

本发明的方法对检测对象进行了简单的前处理，能够去除影响测定结果的杂质，方便且高效，再利用分离超速离心中的沉降速率技术进行检测，进一步排除了IgG等的干扰，高效、便捷且降低了检测成本。

以下对本发明的sIgA的测定方法进行具体说明。

＜检测对象＞

在本发明的检测方法中，对于测试样品或者检测对象没有特别的限制，例如可以为任何含有分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的乳制品。

本发明中对于“乳制品”，其可以是人乳或者动物乳制品。在本发明一些具体的实施方案中，所述动物乳可以如牛、山羊、绵羊、牦牛、马、骆驼以及其他哺乳动物生产乳。优选地，本发明的乳制品可以为源自于牛乳或羊乳的乳制品。

由于免疫球蛋白在初乳制品中的含量明显高于其他乳制品（例如常乳制品），因此，在本发明一些优选的实施方案中，所述乳制品可以为各种初乳制品。对于本发明所述的初乳制品，可以为源自于母体产后3天内分泌的乳汁的乳制品。

进一步，对于乳制品的种类或状态，原则上也没有特别的要求，其可以为液态的乳制品（例如牛奶、羊奶等），也可以为固态、粉末状的乳制品。此外，对于本发明的乳制品，也可以是上述动物乳的再加工乳制品。

对于本发明的乳制品，具体可以列举的包括：低脂乳(例如，0.1％、0.5％或1.5％的脂肪)、脱脂乳、无脂乳、全脂乳、乳粉、酪乳、炼生乳、鲜奶油、奶酪、冰淇淋和甜食产品、包含益菌饮料或益生菌酸奶型饮料。其中，上述“乳粉”是指通过蒸发奶至干燥而制成的粉状乳制品。在本发明一些优选的实施方案中，这些乳粉可以为动物乳粉（牛奶粉、羊奶粉等）、婴幼儿配方奶粉、儿童配方奶粉、中老年奶粉或其他功能性奶粉等。

进一步，由于sIgA是例如牛乳粉，牛初乳粉，婴幼儿配方乳制品，儿童配方奶粉、中老年奶粉等乳粉的重要营养指标。因此，本发明的检测方法尤其适合这些类型的乳制品。

＜前处理步骤＞

本发明中，在对检测对象中的sIgA检测前，为保证检测的精确性和准确性，应当排除检测对象中含有的杂蛋白或杂质给检测带来的干扰，因此，首先需要对于检测对象进行前处理。

具体而言，本发明的前处理步骤，主要包括对于酪蛋白的分离。由于酪蛋白的存在可能使得各种组分在后续的分析超速离心-沉降速率法检测中难以分离，因此，去除酪蛋白是必要的。

对于去除酪蛋白的方法，虽然原则上没有特别限定，但本发明中通过使用合适的成分以调整pH环境以将其沉淀的方法是优选的，这一方面是利用了等电点原理能够较为充分的去除检测对象中的酪蛋白，另外，通过合适的成分进行pH环境的调整，也为下文将述的样品检测步骤中的检测样品提供合适的检测溶液环境，便于各种免疫蛋白能够较为明晰的出现检测峰，而不至于产生相互的干扰。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中，前处理步骤中，将上述检测对象溶解于水、优选的可以溶解于含有缓冲性成分的水中而得到水溶液。进一步，通过调节所述水溶液的pH值，去除水溶液中的杂质，所述杂质中包含酪蛋白，酪蛋白主要分为α-酪蛋白和β-酪蛋白，在乳制品中，主要为β-酪蛋白。另外，对于上述检测对象的调节好pH值后的水溶液的浓度，没有特别限制，通常可以为1～4g/L。

对于上述含有缓冲性成分的水中的所述缓冲性成分，从为后续样品检测步骤提供理想的检测条件的角度考虑，在一些优选的实施方案中，其可以为磷酸-盐复合型缓冲性成分，例如，可以为磷酸氢盐与碱金属卤化物形成的复合缓冲成分。典型地，例如PBS缓冲性成分。

对于进一步调整所述水溶液pH值时的pH值范围，在本发明一些具体的实施方案中，从去除杂蛋白充分的角度考虑，可以为4.2～4.6，优选地，可以为4.3~4.5。对于调整pH值范围方法，可以通过向含有检测对象的水溶液中加入酸性成分或者另外的缓冲性成分而进行。对于酸性成分，可以为各种有机酸，例如甲酸或乙酸等，对于缓冲性成分，可以为磷酸类缓冲性成分或者磷酸-盐复合型缓冲成分。

示例性的，可以将0.05～0.2g的检测对象溶解于含有PBS的水相体系中（pH=7.0±0.5），配制成浓度为2.5~3.5g/L的水溶液，溶解后用磷酸溶液调节pH至4.3~4.5，再添加水得到浓度为1.5~2.5g/L的水溶液，并保持水溶液的pH为4.3~4.5。

优选地，将0.1g检测对象溶解于含有PBS的水相体系中，配制成水溶液（pH=7.0±0.5），再用磷酸缓冲液调节pH至4.3~4.5，再添加水得到浓度为1.5~2.5g/L，并保持水溶液的pH至4.3~4.5。

通过上述处理，可以使得检测对象中的杂质蛋白，尤其是酪蛋白以沉淀的形式聚集。并且，在本发明一些具体的实施方案中，通过前处理步骤，可以将检测对象中80质量%以上、85质量%以上，甚至是90质量%以上，或者是实质上全部的酪蛋白进行去除（以检测对象中总酪蛋白的含量计）。

进一步，本发明中，待沉淀析出后，将含有沉淀的水溶液进行超滤离心，以去除沉淀和低分子量成分，获得前处理后的样品溶液。

在本发明一些实施方案中，将pH调整后的溶液加入超滤离心管中进行离心，离心后取滤液。所述离心的条件为：在转速为8,000~10,000 rpm，温度为20±5℃下，离心时间5±2分钟；优选为，在10,000 rpm、20℃下离心5分钟。

进一步，所述超滤离心管中的超滤膜可以为聚醚砜、三醋酸纤维素、再生纤维素或Hydrosart中的至少一种。通过超滤离心，截留分子量80kDa以上的成分，优选地，截留分子量90kDa以上成分，更优选地，截留100kDa以上的成分。若低分子量成分去除不充分，则会使得sIgA和IgG无法分离，导致检测结果不准确。

通过上述的前处理，最终可以使用超滤管中截留的液体作为下文将述的样品检测的步骤中的检测样品。

此外，对于本发明的检测对象的前处理方法中，除了进行上述去除酪蛋白的步骤以外，还可以根据任何的需要而采用其他的前处理步骤，典型的，还可以包括去除油脂的步骤、去除乳糖、脱盐的步骤等，虽然这些步骤对于本发明而言并非必须包括的步骤。

对于去除油脂的步骤，原则上没有特别限制，可以列举的例如，通过离心处理以去除检测对象中的油脂。在一些具体的实施方案中，通过去除脂肪的步骤，将检测对象中80质量%以上，优选为90质量%以上，或者实质上的全部油脂进行去除。

对于去除乳糖的步骤，原则上没有特别限制，可以列举的包括通过（超滤）膜处理分离的方法。在一些具体的实施方案中，通过去除乳糖的步骤，将检测对象中80质量%以上，优选为90质量%以上，或者实质上的全部乳糖进行去除。

对于脱盐的步骤，也没有特别限制，可以使用本领域常用的脱盐的方式进行处理。

＜样品检测步骤＞

本发明中，对于经前处理得到检测样品，通过分析超速离心法（AUC）测定sIgA含量。所述分析超速离心可以采用沉降速率法进行检测。

所述沉降速率是一种时间依赖性技术，在高转速离心下记录浓度随时间实时变化数据，采用紫外和干涉检测系统实时监测沉降过程，从而分析测定蛋白质分子质量和单体聚体纯度，并根据沉降系数、扩散系数、流体力学半径等性质表征生物分子的构象变化及蛋白质相互作用。

本发明中，将样品添加至分析型超速离心机中进行检测。所述分析型超速离心机由动力系统和光学检测系统组成。

对于上述所述的动力系统，可包括驱动系统、真空系统、控制系统、防护系统、转子和样品池。

在本发明一些实施方案中，所述转子有多种型号，可分为4孔的An-60Ti和8孔的An-50Ti，在检测过程中，可根据样品数量进行选择相应孔数的转子，本发明中优选为4孔的An-60Ti。对于转子的材质，一般为钛合金。

此外，所述样品池由中心件、窗口、垫片、螺丝和外壳组成；所述中心件的材质一般为铝合金；所述窗口的材质选自为蓝宝石或石英，更优选地，窗口的材质为蓝宝石。

进一步，所述光学检测系统包含紫外/可见光吸收检测器、干涉光检测器和荧光检测器中的任意一种。

所述紫外/可见光吸收检测器可以当样品在某波长内有吸收时，记录离心过程中样品在转子径向上不同位置的吸光度，完成检测。所述干涉光检测器可当光透过参比液和样品时，由于二者的折射率不同导致光程变化，在收集器上等光程的点发生位移，干涉条纹位移距离与溶质浓度成正比；通过监测干涉条纹位移情况，可以获得溶质浓度在转子径向上随时间的变化。

在本发明一些优选的实施方案中，选择紫外/可见光吸收检测器对样品进行检测。具体为，将检测样品上样后，利用紫外光进行检测，并记录数据。

进一步，所述检测样品上样量为350~400μL，优选为400μL。加样后在20±5℃、30,000~35,000rpm下利用250~300nm波长进行检测，每隔50~70s收一个数据；优选地，加样后在20℃、32,000rpm下利用280nm波长进行检测，每隔60s收一个数据，且共进行3次离心。

通过上述检测，可以检测不同沉降系数所对应的组分的光吸收数据，从而计算sIgA的含量。

此外，由于检测样品中可能包含有缓冲性成分，为了确保结果的准确性，设置了以相同的缓冲性成分（例如PBS）溶液为样本的对照组，以去除PBS溶液作为溶剂对结果带来的干扰。所述PBS溶液的pH=7.0±0.5，上样量为350~400μL，更优选为400μL。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为重量百分比。

除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

一、试剂和材料

标准品IgA、标准品IgG：来源于北京美正生物科技有限公司。

牛初乳：市售冻干型和喷雾干燥型牛初乳粉。

二、标准品的检测

利用分析超速离心-沉降速率技术检测IgA标准品和IgG标准品，利用标准品的沉降系数定性，以验证分析超速离心-沉降速率法可将IgA和IgG很好地分离开、实现准确检测。

1、IgA标准品检测

分析超速离心机上机条件：沉降速率SV实验，20℃，32000rpm，检测波长280nm，每隔60s收一个数据。60Ti转子，共进行3次离心。样品池采用蓝宝石窗口，铝合金中心件，标准品溶解于PBS溶液中，上样量为390 μL，对照为相同浓度的PBS溶液。

2、IgG标准品检测

分析超速离心机上机条件：沉降速率SV实验，20℃，32000rpm，检测波长280nm，每隔60s收一个数据。60Ti转子，共进行3次离心。样品池采用蓝宝石窗口，铝合金中心件，标准品溶解于PBS溶液中，上样量为390μL，对照为相同浓度的PBS溶液。

3、将IgA和IgG单体峰图谱利用软件进行重叠，根据IgA和IgG单体及二聚体不同沉降系数，分别定性各组分。

标准品检测图谱如图1和图2所示：

图1中，IgG标准品有两个主要峰，分别位于沉降系数为7和沉降系数为10处，为单体和二聚体；IgA标准品有两个峰，分别位于沉降系数为11和沉降系数为15处，为单体和二聚体。

图2显示，虽然IgG二聚体和IgA单体峰重叠，但是IgA二聚体（sIgA）不受影响，所以可以准确检测sIgA，不受IgG干扰。

实施例1

牛初乳粉样品的检测

1. 称取0.1 g牛初乳粉样品，并加入30 mL PBS（pH=7）缓冲液溶解。待溶解后用0.1 M磷酸溶液调节pH至4.3~4.5。再次用PBS缓冲液定容至50 mL，并检查溶液pH是否于4.3~4.5区间，若不是，则用1 M磷酸溶液调节pH至4.3~4.5。将样品放置于10,000 rpm，20℃条件下100 kDa超滤管超滤离心5分钟；取390 μL超滤管中液体于计量瓶中，上机检测。

2. 利用分析超速离心机，选用沉降速率SV实验，具体条件为：

20℃，32000 rpm，检测波长280 nm，每隔60s收一个数据。选用4孔的An-60Ti转子，每次2个样品，共进行3次离心。样品池采用蓝宝石窗口，铝合金中心件，上样量为390 μL；对照为PBS溶液。

牛初乳样品检测结果如图3所示，根据标准品所对应分子量及保留时间，去除杂峰后，假设各峰面积总体为100%，各组分峰面积占总体峰面积的比值，即利用峰面积计算各组分占比，再根据牛初乳粉的整体免疫球蛋白含量计算出sIgA含量。图3所示牛初乳粉的免疫球蛋白含量为26.5 g/100g，其中sIgA占总免疫球蛋白8.78%，即sIgA占牛初乳粉样品含量为2.33 g/100g。如图所示，各组分分离度好，相互之间不受干扰，可提供较为准确的结果。

对比例1

称取0.1 g牛初乳粉样品，并加入50 mL PBS缓冲液（pH=7）溶解。待溶解后于10,000 rpm，20℃条件下50 kDa超滤管超滤离心5分钟。取390 μL超滤管中液体于计量瓶中上机检测。

分析超速离心机上机条同实施例1。

结果如图4所示，将样品经50 kDa超滤后，大于50 kDa的杂质会残留，对IgA和IgG有干扰，图中导致IgA和IgG二聚体峰占比较高，IgG和IgA单体分离效果不好，检测结果不准确。

对比例2

称取0.1 g牛初乳粉样品，并加入50 mL PBS缓冲液（pH=7）溶解。待溶解后于10,000 rpm，20℃条件下100 kDa超滤管超滤离心5分钟。取390μL超滤管中液体于计量瓶中上机检测。

分析超速离心机上机条件同实施例1。

检测结果如图5所示，根据标准品保留时间计算，5min以内的峰均为杂质峰，采用直接提取方法来检测牛初乳粉样品，5min以内的杂质峰面积占比超50%，从而干扰了检测，导致检测结果偏低。

由此可见，没有经过本发明限定的前处理步骤，会导致检测结果的偏差。

产业上的可利用性

本发明提供的sIgA检测方法可用于各类乳制品，尤其是初乳制品中的sIgA的检测。

Claims (10)

1.一种分泌型免疫球蛋白A的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

前处理步骤：所述前处理步骤包括对检测对象进行分离酪蛋白的步骤和去除低分子量成分的步骤，以得到检测样品；

所述去除低分子量成分的步骤中，至少将分子量低于80kDa的成分去除；

样品检测步骤：利用分析超速离心-沉降速率法对所述检测样品进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测对象为乳制品；所述前处理步骤中还包括使用含有磷酸-盐的复合缓冲性成分水溶液溶解所述检测对象的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述分离酪蛋白的步骤中，将检测对象形成pH值为4.2～4.6范围的水溶液。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述前处理步骤中，还包括去除所述检测对象中的油脂的步骤。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述去除低分子量成分的步骤中，将分子量低于100kDa的成分去除。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述去除低分子量成分的步骤通过超滤进行。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述超滤通过离心处理进行。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样品检测步骤中，通过测定具有不同沉降系数组分的吸光度，以确定所述分泌型免疫球蛋白A的含量。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述样品检测步骤中，通过紫外/可见光进行所述吸光度的测定。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样品检测的步骤中，所述分析超速离心-沉降速率法中使用分析型超速离心机，其转速为30,000~35,000rpm。

Images