CN110618228A - 一种乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法及其应用 - Google Patents

一种乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳制品Kappa‑酪蛋白类型的检测方法，特别是牛乳中Kappa酪蛋白类型的检测方法，属于乳制品领域。本发明的检测方法，通过制备待测样品和标准品，利用反相高效液相色谱依次检测标准品和样品，采集色谱图，根据标准品中KCN‑A和KCN‑B的保留时间，确定样品中Kappa‑酪蛋白的类型和含量；洗脱程序为梯度洗脱，流动相A为体积比0.1%三氟乙酸水溶液、流动相B为体积比0.1%三氟乙酸乙腈溶液。该检测方法可准确分析检测牛奶的Kappa‑酪蛋白类型，省时省力；可根据检测结果区分不同变异体基因类型的奶牛，进而实现优化养殖及育种，同时可根据检测结果有针对性的分类开发高品质乳制品。

Description

一种乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种酪蛋白检测方法，特别涉及一种乳制品Kappa酪蛋白检测方法，特别是牛乳中Kappa酪蛋白类型的检测方法，属于乳制品领域。
背景技术
Kappa-酪蛋白(kappa-casein, K-CN)是牛乳中酪蛋白的组成之一，是酪蛋白中唯一含有糖成分、对钙不敏感的蛋白质，在牛脱脂乳中约占总酪蛋白的13%，在人乳中占总酪蛋白的30%。Kappa-酪蛋白是使牛奶保持稳定的乳浊液态的重要因子。它不仅在酪蛋白微团的稳定性方面起至关重要的作用, 而且对奶牛泌乳性能及乳成分组成和奶酪品质均有一定程度的影响。Kappa-酪蛋白的水解产物具有抗凝血酶原肽、免疫刺激肽、酪蛋白阿片肽等具有生理活性功能物质。
Kappa-酪蛋白由于氨基酸结构不同，分为Kappa-酪蛋白A型（KCN-A）和Kappa-酪蛋白B型（KCN-B）两种不同的变异体。相对于用含有KCN-A型酪蛋白的牛奶，用含有KCN-B型酪蛋白的牛奶在生产乳酪时，产量更高、凝乳更快、硬度适中；同时，Kappa-酪蛋白B的糖化基被认为是更接近于母乳的低聚糖，是母乳替代品的更佳选择。由于KCN-B酪蛋白比KCN-A酪蛋白有更好的性状，有必要对牛奶中Kappa-酪蛋白类型进行检测。
现有对Kappa-酪蛋白类型检测的方式为间接确定。由于牛基因不同所产牛奶中含有不同结构类型的Kappa-酪蛋白变异体，只有携带Kappa-酪蛋白B型基因的奶牛产的牛乳为Kappa-酪蛋白B型牛奶。现有技术中通过对奶牛基因的DNA进行检测，来间接确定牛奶中Kappa-酪蛋白的类型。现有方法所需基因鉴定设备复杂，成本高、操作繁琐、效率低，且不易推广。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中通过间接方法检测Kappa-酪蛋白类型费用高的问题，提供一种乳制品中Kappa-酪蛋白类型的检测方法，该检测方法可直接检测牛奶中Kappa-酪蛋白的基因类型。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种乳制品Kappa-酪蛋白基因类型的检测方法，包括以下步骤：
S1准备样品和标准品
101样品准备：如果是奶粉则加水配制成乳液，将乳液或牛乳进行脱脂处理，得到样品待处理液；加入缓冲溶液一，混匀，室温静置孵育，所述缓冲溶液一使得Kappa-酪蛋白与其他物质分离，取中层液体，得到样品清液；加入缓冲溶液二和还原剂；混匀，过滤，得到待上机样品液。
102标准品准备，取Kappa-酪蛋白标准品，加入缓冲溶液一，溶解均匀，室温静置孵育，定容，得到标准品清液；加入缓冲溶液二和还原剂；混匀，过滤，得到已知酪蛋白浓度的待上机标准液。
所述缓冲溶液一是含有盐酸胍、双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷和磷酸氢二钠的混合水溶液，样品待处理液：缓冲溶液一的体积比为1:2-10；
所述缓冲溶液二是盐酸胍水溶液；所述还原剂为二硫苏糖醇水溶液或β-巯基乙醇水溶液；
S2色谱检测
采用反相高效液相色谱依次检测标准液和样品液，采集色谱图，确定标准品中Kappa-酪蛋白A和Kappa-酪蛋白B保留时间和峰面积，将样品的色谱图与标准品色谱图进行对比分析，确定样品中Kappa-酪蛋白的类型并计算其含量；
色谱参数如下：
色谱柱：SB-C8 300Å 4.6×250mm 5-Micron 或等效柱。
采用梯度洗脱程序进行洗脱，流动相A：体积比为0.1%的三氟乙酸-水溶液、流动相B：体积比0.1%的三氟乙酸-乙腈溶液；
洗脱程序：
时间/min 流动相A/% 流动相B/% 流速/mL/min
0 75.7 24.3 0.7
2 71.2 28.8 0.7
17 64.8 35.2 0.7
30 61.8 38.2 0.7
45 75.7 24.3 0.7
50 75.7 24.3 0.7
检测波长：214nm；
进样量：50μL ；
柱温：40℃。
本发明乳制品中Kappa-酪蛋白类型的检测方法，结合发明人的长期研究经验总结，提出适宜的样品准备方法和相应的标准品配制方法，实现样品准备和标准品能够充分溶解提取制备成优秀的HPLC分析上机样品。在使用HPLC对样品或者标准品进行检测时，相应的流动相A、流动相B、组分的比例关系以及洗脱程序的设计，使得样品或者标准品的洗脱分离效果好，实现高效率的检测分析。对乳制品中的Kappa-酪蛋白的类型检测和含量检测的分析精确度高，结果准确可靠。
其中S1中包括的101和102步骤不分先后顺序。
在样品准备中，先通过脱脂处理，得到样品待处理液；再加入缓冲溶液一，静置，离心，通过加入缓冲溶液一，使得Kappa-酪蛋白与其他物质分离，取中层液体；排除了乳糖、矿物质、脂肪等成分的干扰，精确的筛选酪蛋白，进而为准确的酪蛋白检测提供基础条件。
标准品可冷藏保存有效期7天。在对标准品使用时，如预计样品中酪蛋白的浓度较低，可根据样品中酪蛋白的浓度，对标准品稀释后再进行检测。
标准品采用市售的sigma Kappa酪蛋白混合标准品，其中KCN-A和KCN-B的重量含量比为：4.2：5.8。
标准品也可采用KCN-A和KCN-B纯品，在对标准样品的检测时，分别获得KCN-A和KCN-B的色谱图；然后再通过将样品的检测结果与两种标准样品的检测结果进行对比，即可得到样品中KCN的类型和含量。
使用的色谱柱可以为：
Agilent ZORBAX 300Å SB-C8 stableBond Analytical 4.6×250mm 5-Micron；
进一步的，101样品准备中，脱脂处理的具体步骤为：将待处理样品预冷至2-4℃，经10000-12000×g 离心力冷冻离心10-15分钟，弃去上层脂肪。
经过上述脱脂处理，有效去除乳液中的脂肪，使得样品待处理液与缓冲溶液一的反应更为充分，避免杂质的影响。
进一步的，所述缓冲溶液一是含有5-7mol/L盐酸胍、0.08-0.12mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷 (BIS-TRIS)、4-6mmol/L磷酸氢二钠的混合水溶液。
缓冲溶液一，是本发明人结合检测分析酪蛋白的分子结构特点设计的缓冲溶液，能够很好的溶解酪蛋白，实现对待检测成分的精确萃取。
进一步的，所述101样品准备时，样品待处理液：缓冲溶液一的体积比为为1:2-4。
控制样品待处理液和缓冲溶液一的体积比，在上述范围内，可有效的将蛋白质溶解变性。
进一步的，所述102标准品准备时，标准品清液中标准品和缓冲溶液一的重量体积比为30-70mg：10mL。
即将30-70mg的Kappa酪蛋白溶解在10mL缓冲溶液一中所得到的溶液浓度，即标准品清液的浓度为30-70mg/10mL。牛奶中Kappa-酪蛋白的含量在30-45mg/10mL，将标准品清液的浓度控制在30-70mg/10mL的范围内，其与待测样品的浓度接近，更利于对样品的准确分析。
标准品清液的浓度在30-70mg/10mL时，经梯度洗脱时，保留时间合理，呈现的峰形良好。
进一步的，所述缓冲溶液二为4-5mol/L盐酸胍水溶液。
进一步的，所述还原剂为 8-12%体积比的二硫苏糖醇水溶液或8-12%体积比的β-巯基乙醇水溶液。
进一步的，所述样品处理液：缓冲溶液二：还原剂的体积比为100:97-99:3-1。
采用上述浓度的盐酸胍水溶液以及上述浓度的还原剂，经与样品处理液按照比例混合后，可有效的将蛋白质中的二硫键还原，在盐酸胍的变性条件下还原效果更佳。
进一步的，所述S1准备样品和标准品
101准备样品具体为：
如果是奶粉则加水配制成乳液，将乳液或牛乳样品预冷至2-4℃，再经10000-12000×g离心力冷冻离心10-20分钟，弃去上层脂肪，得中层清液；取中层清液1ml于 10毫升的离心管中，加入2-5ml 缓冲溶液一，混合均匀，在室温下静置反应1-2小时；将样品涡旋混匀，在14000-18000×g 离心力作用下离心10-20分钟；离心后，取下层液体1ml ，放入新的 5mL离心管中， 加入970-990 μL缓冲溶液二 和 10-30μL 还原剂溶液，涡旋混匀，离心，将离心后液体用0.22μm醋酸纤维素微孔滤膜过滤于样品瓶中，得到待测样品；
所述缓冲溶液一为：6mol/L盐酸胍、0.1mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷(BIS-TRIS)、5mmol/L磷酸氢二钠混合水溶液；所述缓冲溶液二为：4.5mol/L盐酸胍水溶液；所述还原剂为体积分数为10%的二硫苏糖醇水溶液或体积分数为10%β-巯基乙醇水溶液。
进一步的，所述S1准备样品和标准品
102标准品准备具体为
称取已知Kappa-酪蛋白A和Kappa-酪蛋白B含量的混合标准品30-70mg至10mL容量瓶中，加入缓冲溶液一，溶解均匀，室温静置反应，定容，得到标准品清液；加入缓冲溶液二和还原剂；微孔滤膜过滤得到已知酪蛋白浓度的待上机标准溶液。
所述缓冲溶液一为：6mol/L盐酸胍、0.1mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷 (BIS-TRIS)、5mmol/L磷酸氢二钠混合水溶液；所述缓冲溶液二为：4.5mol/L盐酸胍水溶液；所述还原剂为体积分数为10%的二硫苏糖醇水溶液或体积分数为10% β-巯基乙醇水溶液。
本发明的另一目的是将所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法用于区分奶牛基因类型。
由于只有携带Kappa-酪蛋白B型基因的奶牛产的牛乳中含有B型Kappa-酪蛋白（KCN-B），携带Kappa-酪蛋白A型基因的奶牛产的牛乳中含有A型Kappa-酪蛋白（KCN-A），可根据样品牛乳中的Kappa-酪蛋白类型来反推出奶牛所携带的Kappa-酪蛋白基因类型，进而可以实现对奶牛的优化养殖及育种模式。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明检测分析方法可实现对乳制品中Kappa-酪蛋白类型的检测分析研究，通过预处理以及色谱条件多因素调整协同，实现对KCN-A和KCN-B两种酪蛋白的类型和含量的快速检测。
2、本发明检测方法可以替代现有的通过检测牛基因DNA来间接确定牛奶中Kappa-酪蛋白的类型的方法。
3、本发明检测方法可根据测定的牛奶中的Kappa-酪蛋白的类型，确定产该牛奶的奶牛拥有的Kappa-酪蛋白的基因变异体类型。
4、本发明检测方法可根据测试结果，精确计算牛奶中KCN-A和KCN-B的含量，进而开发针对性的高品质乳制品。
附图说明：
图1为实施例1中标准品色谱图。
图2为实施例1中样品色谱图。
图3为对比例1中不同浓度的标准品色谱图。
图4为试验例1中样品色谱图。
图5为试验例2中样品色谱图。
图6为试验例3中样品色谱图。
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
本实施例中采用试剂如下：
缓冲溶液一：
6mol/L盐酸胍+0.1mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷 (BIS-TRIS)+ 5mmol/L磷酸氢二钠混合水溶液
缓冲溶液二：4.5mol/L盐酸胍水溶液
还原剂：10%二硫苏糖醇水溶液
S1准备样品和标准品
样品准备：将牛奶样品在冰箱预冷到4℃，再经10000×g 离心力冷冻离心10分钟，弃去上层脂肪，得到牛奶中层清液。取上述牛奶中层清液1ml于 10毫升的离心管中，加入3ml 缓冲溶液一，混合均匀，在室温下静置反应1.5小时。反应完成后将样品涡旋混匀，在 16000×g 离心力作用下离心10分钟。离心之后，取中层液体1ml ，放入新的 5mL离心管中， 加入980 μL缓冲溶液二 和 20μL 10%二硫苏糖醇水溶液 ，涡旋混匀。将上述离心后液体用0.22μm醋酸纤维素微孔滤膜过滤于2ml样品瓶中，得到用于液相色谱分析的待测样品。
标准品准备：称取sigma混合标准品（Kappa-酪蛋白A和Kappa-酪蛋白B的含量比例为4.2：5.8）50mg至10mL容量瓶中，加入缓冲溶液一，溶解均匀，用缓冲溶液一定容，微孔滤膜过滤得到Kappa-酪蛋白标准品清液。 取1mL标准品清液，加入980 μL缓冲溶液二 和 20μL 10%二硫苏糖醇水溶液 ，涡旋混匀。将上述离心后液体用0.22μm醋酸纤维素微孔滤膜过滤于样品瓶中，得到已知酪蛋白浓度的待上机标准溶液。
S2色谱检测
采用Agilent 1260高效液相色谱仪进行反相色谱检测，依次检测标准品和样品，采集色谱图，对比分析标准品和样品的色谱图，根据标准品中Kappa-酪蛋白A和Kappa-酪蛋白B不同保留时间和峰面积，确定样品中相应Kappa-酪蛋白的类型并计算其含量。
色谱参数
色谱柱： Agilent ZORBAX 300Å SB-C8 stableBond Analytical 4.6×250mm 5-Micron
检测波长：214nm进样量：50μL ；
柱温：40℃；
流速：0.7mL/min
流动相A：0.1%三氟乙酸、
流动相B：0.1%三氟乙酸乙腈
起始混合洗脱剂A和B 的浓度分别是：75.7% 和 24.3%
洗脱程序：
时间/min 流动相A/% 流动相B/% 流速/mL/min
0 75.7 24.3 0.7
2 71.2 28.8 0.7
17 64.8 35.2 0.7
30 61.8 38.2 0.7
45 75.7 24.3 0.7
50 75.7 24.3 0.7
标准品的检测结果如图1所示，图1中Kappa-酪蛋白标准品HPLC图谱中出现KCN-A和KCN-B两个峰值。两个峰峰形良好，相互分离效果好，无相互干扰，保留时间适宜，适于做标准品，可以用于定性/定量分析研究。
样品测试结果如图2所示，牛奶样品中出现KCN-A和KCN-B两个峰，其峰形、保留时间与标准品检测结果一致。
对比样品和标准品的色谱测试结果，可判断牛奶样品中含有的Kappa-酪蛋白类型及含量。
实施例2
采用与实施例1相同的HPLC仪器及参数进行检测分析，只是在样品准备过程中参数控制 和实施例1略有不同，具体如下：
7mol/L盐酸胍+0.08mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷(BIS-TRIS)+ 4mmol/L磷酸氢二钠混合水溶液
缓冲溶液二：4mol/L盐酸胍水溶液
还原剂：12%二硫苏糖醇水溶液
S1准备样品和标准品
样品准备：将牛奶样品在冰箱预冷到4℃，再经12000×g 离心力冷冻离心15分钟，弃去上层脂肪，得到牛奶下清液。取上述牛奶下清液1ml于 10毫升的离心管中，加入4ml 缓冲溶液一，混合均匀，在室温下静置反应2小时。反应完成后将样品涡旋混匀，在 14000×g 离心力作用下离心15分钟。离心之后，取下面的液体1ml 样品，放入新的 5mL离心管中， 加入970 μL缓冲溶液二 和 30μL 10%二硫苏糖醇水溶液 ，涡旋混匀。将上述离心后液体用0.22μm醋酸纤维素微孔滤膜过滤于2ml样品瓶中，得到用于液相色谱分析的待测样品。
标准品准备：同实施例1
对比样品和标准品的色谱测试结果，可判断牛奶样品中含有的Kappa-酪蛋白类型及含量。
实施例3
采用与实施例1相同的HPLC仪器及参数进行检测分析，只是在样品准备过程中参数控制 和实施例1略有不同，具体如下：
5mol/L盐酸胍+0.12mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷(BIS-TRIS)+ 6mmol/L磷酸氢二钠混合水溶液
缓冲溶液二：5mol/L盐酸胍水溶液
还原剂：8%二硫苏糖醇水溶液
S1准备样品和标准品
样品准备：将牛奶样品在冰箱预冷到4℃，再经10000×g 离心力冷冻离心20分钟，弃去上层脂肪，得到牛奶下清液。取上述牛奶下清液1ml于 10毫升的离心管中，加入4.5ml 缓冲溶液一，混合均匀，在室温下静置反应1小时。反应完成后将样品涡旋混匀，在 18000×g 离心力作用下离心10分钟。离心之后，取下面的液体1ml 样品，放入新的 5mL离心管中， 加入990 μL缓冲溶液二 和 10μL 10%二硫苏糖醇水溶液，涡旋混匀。将上述离心后液体用0.22μm醋酸纤维素微孔滤膜过滤于2ml样品瓶中，得到用于液相色谱分析的待测样品。
标准品准备：同实施例1
对比样品和标准品的色谱测试结果，可判断牛奶样品中含有的Kappa-酪蛋白类型及含量。
实施例4
采用与实施例1相同的HPLC仪器及参数进行检测分析，只是在样品准备过程中参数控制 和实施例1略有不同，具体如下：
6mol/L盐酸胍+0.1mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷 (BIS-TRIS)+ 5mmol/L磷酸氢二钠混合水溶液
缓冲溶液二：4.5mol/L盐酸胍水溶液
还原剂：10%β-巯基乙醇水溶液
S1准备样品和标准品
样品准备：将牛奶样品在冰箱预冷到4℃，再经11000×g 离心力冷冻离心12分钟，弃去上层脂肪，得到牛奶下清液。取上述牛奶下清液1ml于 10毫升的离心管中，加入3.5ml 缓冲溶液一，混合均匀，在室温下静置反应1小时。反应完成后将样品涡旋混匀，在 15000×g 离心力作用下离心20分钟。离心之后，取下面的液体1ml 样品，放入新的 5mL离心管中， 加入980 μL缓冲溶液二 和 20μL 10%β-巯基乙醇，涡旋混匀。将上述离心后液体用0.22μm醋酸纤维素微孔滤膜过滤于2ml样品瓶中，得到用于液相色谱分析的待测样品。
标准品准备：同实施例1
对比样品和标准品的色谱测试结果，可判断牛奶样品中含有的Kappa-酪蛋白类型及含量。
实施例5
采用与实施例1相同的HPLC仪器及参数进行检测分析，只是在标准品准备过程中参数控制 和实施例1略有不同，具体如下：
缓冲溶液一：
6mol/L盐酸胍+0.1mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷 (BIS-TRIS)+ 5mmol/L磷酸氢二钠混合水溶液
缓冲溶液二：4.5mol/L盐酸胍水溶液
还原剂：12%β-巯基乙醇水溶液
S1准备样品和标准品
样品准备：同实施例1
标准品准备：称取混合标准品（Kappa-酪蛋白A和Kappa-酪蛋白B的含量比例为4.2：5.8）60mg至10mL容量瓶中，加入缓冲溶液一，溶解均匀，用缓冲溶液一定容，微孔滤膜过滤得到Kappa-酪蛋白标准品清液。取1ml 标准品清液，放入新的 5mL离心管中， 加入970 μL缓冲溶液二 和 30μL 10%二硫苏糖醇水溶液 ，涡旋混匀。将上述离心后液体用0.22μm醋酸纤维素微孔滤膜过滤于2ml样品瓶中，得到已知酪蛋白浓度的待上机标准溶液。
对比样品和标准品的色谱测试结果，可判断牛奶样品中含有的Kappa-酪蛋白类型及含量。
由实施例2-5，可知，在一定范围内调整缓冲溶液的配合比例不影响最终测试结果的准确性。更换还原剂也不影响测试结果的准确性。
对比例1
不同浓度标准品色谱测试
样品准备和色谱参数同实施例1。标准品准备中Kappa酪蛋白添加量不同，得到的标准品Kappa酪蛋白的含量不同。
标准品准备：分别称取混合标准品（Kappa-酪蛋白A和Kappa-酪蛋白B的含量比例为4.2：5.8）30mg，50mg，70mg至10mL容量瓶中，加入缓冲溶液一，溶解均匀，用缓冲溶液一定容，微孔滤膜过滤得到Kappa-酪蛋白标准品清液。标准品清液的浓度分别为3mg/mL，5mg/mL，7mg/mL，分别取1mL上述三种 标准品清液，放入新的 5mL离心管中， 分别加入970 μL缓冲溶液二 和 30μL 10%二硫苏糖醇水溶液 ，涡旋混匀。将上述离心后液体用0.22μm醋酸纤维素微孔滤膜过滤于2ml样品瓶中，得到已知酪蛋白浓度的待上机标准溶液。
不同浓度的标准品色谱结果如图3所示，如图3可知，不同浓度的Kappa-酪蛋白在色谱中的保留时间、峰形均趋于一致。使用浓度为3-7mg/mL浓度的标准品清液重现性好，确保测试结果的准确性。
对比例2
不同浓度标准品色谱测试
样品准备和色谱参数同实施例1。标准品准备中Kappa酪蛋白添加量不同，得到的标准品Kappa酪蛋白的含量不同。
标准品准备：分别称取混合标准品（Kappa-酪蛋白A和Kappa-酪蛋白B的含量比例为4.2：5.8）20mg，80mg至10mL容量瓶中，加入缓冲溶液一，溶解均匀，用缓冲溶液一定容，微孔滤膜过滤得到Kappa-酪蛋白标准品清液。标准蛋白储备液的浓度分别为2mg/mL，10mg/mL，分别取1mL 储备液，放入新的 5mL离心管中， 分别加入970 μL缓冲溶液二 和 30μL10%二硫苏糖醇水溶液 ，涡旋混匀。将上述离心后液体用0.22μm醋酸纤维素微孔滤膜过滤于2ml样品瓶中，得到已知酪蛋白浓度的待上机标准溶液。
结果显示，浓度为2mg/mL的标准品清液的KCN-A和KCN-B的峰的高度较低，而样品中的KCN-A和KCN-B的浓度较高，二者在高度上的差异较大，浓度为2mg/mL的标准品清液不适于作为牛乳中KCN-A或KCN-B含量检测的标准品。浓度为10mg/mL的标准品清液所使用的标准品重量较多，浪费标准品原料，且其峰值高度过高，也同样不适于作为牛乳中KCN-A或KCN-B含量检测的标准品。
对比例3
采用与实施例1相同的HPLC仪器及参数进行检测分析，待测牛乳样品同实施例1，不同之处在于，用不同的缓冲溶液一，分析不同配比的缓冲溶液一对检测分析的影响：
方案A，3mol/L盐酸胍+0.1mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷 (BIS-TRIS)+5mmol/L磷酸氢二钠混合水溶液 ；
方案B，10mol/L盐酸胍+0.1mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷 (BIS-TRIS)+5mmol/L磷酸氢二钠混合水溶液
方案C，6mol/L盐酸胍+0.1mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷(BIS-TRIS)+8mmol/L磷酸氢二钠混合水溶液
测试结果：
盐酸胍含量为3mol/L的方案A测试结果的酪蛋白含量较低，仅为实施例1测试结果的1/2左右，表明盐酸胍含量过少的情况下，检测值明显降低，测试结果准确性降低。
盐酸胍含量为10mol/L的方案B测试结果的酪蛋白含量基本相当，表明过多的盐酸胍未提升检测的准确性，且盐酸胍量的增加，使得峰形有所偏移，降低定性分析的准确性。
磷酸氢二钠的增加至8mol/L，缓冲溶液失衡，蛋白质的分离不佳，检测值明显降低。
试验例1
奶牛基因检测分析
用基因测试的方式获知本试验例中的奶牛基因类型只含有KCN-B类型基因，取其牛奶，按照实施例1的方式进行测试分析。
测试结果如图4所示，在图4中，可见KCN-B型酪蛋白，结果与奶牛基因测试结果一致。
试验例2
奶牛基因检测分析
用基因检测的方式获知本试验例中的奶牛基因类型不含KCN-B类型基因，含KCN-A类型基因，取其牛奶，按照实施例1的方式进行检测。
测试结果如图5所示，在图5中，未见KCN-B的峰，只有KCN-A的峰，结果与奶牛基因测试结果一致。
试验例3
奶牛基因检测分析
用基因检测的方式获知本试验例中的奶牛基因类型同时含有KCN-A和KCN-B类型基因，取其牛奶，按照实施例1的方式进行检测。
测试结果如图6所示，在图6中，同时有KCN-A和KCN-B的峰，结果与奶牛基因测试结果一致。

Claims (10)

1.一种乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1准备样品和标准品：
101样品准备：如果是奶粉则加水配制成乳液，将乳液或牛乳则进行脱脂处理，得到样品待处理液；在样品待处理液中加入缓冲溶液一，静置，离心，混匀，室温静置孵育，所述缓冲溶液一使得Kappa-酪蛋白与其他物质分离；取中层液体，得到样品清液；在杨品清液中加入缓冲溶液二和还原剂；混匀，过滤，得到待上机检测的样品液；
102标准品准备：取Kappa-酪蛋白标准品，加入缓冲溶液一，溶解均匀，室温静置孵育，定容，得到标准品清液；加入缓冲溶液二和还原剂；混匀，过滤，得到已知酪蛋白浓度的待上机标准液；
所述缓冲溶液一是含有盐酸胍、双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷和磷酸氢二钠的混合水溶液；
样品待处理液：缓冲溶液一的体积比为1:2-10；
所述缓冲溶液二是盐酸胍水溶液；所述还原剂为二硫苏糖醇水溶液或β-巯基乙醇水溶液；
S2色谱检测：
采用反相高效液相色谱依次检测标准液和样品液，采集色谱图，确定标准品中Kappa-酪蛋白A和Kappa-酪蛋白B保留时间和峰面积，将样品色谱与标准品色谱进行对比分析，确定样品中Kappa-酪蛋白的类型并计算其含量；
色谱参数如下：
色谱柱：SB-C8 300A 4.6×250mm 5-Micron 或等效柱；
采用梯度洗脱程序进行洗脱，流动相A：体积比0.1%的三氟乙酸-水溶液、流动相B：体积比0.1%的三氟乙酸乙腈溶液；
洗脱程序：
时间/min 流动相A/% 流动相B/% 流速/mL/min 0 75.7 24.3 0.7 2 71.2 28.8 0.7 17 64.8 35.2 0.7 30 61.8 38.2 0.7 45 75.7 24.3 0.7 50 75.7 24.3 0.7
检测波长：214nm；
进样量：50μL ；
柱温：40℃。
2.根据权利要求1所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述101样品准备中，所述脱脂处理具体为：
将待处理样品预冷至2-4℃，经10000-12000×g 离心力冷冻离心10-15分钟，弃去上层脂肪，得到样品待处理液。
3.根据权利要求1所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液一是含有5-7mol/L盐酸胍、0.08-0.12mol/L双(2-羟基乙胺基) 三(羟甲基) 甲烷、4-6mmol/L磷酸氢二钠的混合水溶液。
4.根据权利要求3所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述101样品准备时，样品待处理液：缓冲溶液一的体积比为1:2-4。
5.根据权利要求1所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述102标准品准备时，标准品清液中标准品和缓冲溶液一的重量体积比为30-70mg：10mL。
6.根据权利要求5所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液二为4-5mol/L盐酸胍水溶液，所述还原剂为 8-12%体积比的二硫苏糖醇水溶液或8-12% 体积比的β-巯基乙醇水溶液。
7.根据权利要求6所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述样品清液：缓冲溶液二：还原剂的体积比为100:97-99:3-1。
8.根据权利要求1所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述S1准备样品和标准品中；
101准备样品具体为：
如果是奶粉则加水配制成乳液，将乳液或牛乳样品预冷至2-4℃，再经10000-12000×g离心力冷冻离心10-20分钟，弃去上层脂肪，得中层清液；取中层清液1ml于 10毫升的离心管中，加入2-5ml 缓冲溶液一，混合均匀，在室温下静置反应1-2小时；将样品涡旋混匀，在14000-18000×g 离心力作用下离心10-20分钟；离心后，取下层液体1ml ，放入新的 5ml离心管中， 加入970-990 μL缓冲溶液二 和 10-30μL 还原剂溶液，涡旋混匀，离心，将离心后液体用0.22μm微孔滤膜过滤于样品瓶中，得到待测样品。
9.根据权利要求1所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法，其特征在于，所述S1准备样品和标准品中；
102标准品准备具体为：
称取已知Kappa-酪蛋白A和Kappa-酪蛋白B含量的混合标准品30-70mg至10mL容量瓶中，加入缓冲溶液一，溶解均匀，室温静置反应，定容，得到标准品清液；加入缓冲溶液二和还原剂；混匀，微孔滤膜过滤得到Kappa-酪蛋白标准品清液；得到已知酪蛋白浓度的待上机标准溶液。
10.将权利要求1-9任一所述的乳制品Kappa-酪蛋白类型的检测方法用于区分奶牛基因类型。
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