CN106546680B - 一种水解胶原蛋白口服液中多肽分子量的快速测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水解胶原蛋白口服液中多肽分子量的快速测定方法，包括以下步骤：(1)制备检测样品：取市售水解胶原蛋白口服液10ml，水解胶原蛋白的质量浓度为105g/L，加入200μL去离子水搅拌均匀，再加入5ml的0.1mol/L的Tris‑HCL缓冲液，2ml的2,5‑二羟基苯甲酸搅拌离心处理后用滤膜进行第一次粗滤，得到滤液；(2)将所得滤液通过特制的凝胶层析柱，经与分子量已知的标准品在相同条件下通过凝胶层析柱来计算待测样品的分子量，计算公式为：Ve＝k1‑k2logMr，其中，Ve为洗脱体积，k1和k2为常系数，Mr为分子量。

Description

一种水解胶原蛋白口服液中多肽分子量的快速测定方法
技术领域
本发明涉及混凝土技术领域，具体地是涉及一种水解胶原蛋白口服液中多肽分子量的快速测定方法。
背景技术
蛋白多肽的测定方法一般包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、凝胶过滤法和沉降法等，不同的方法用于测定不同类型蛋白质分子量，胶原蛋白属于结构蛋白，故不能用电泳法，而凝胶层析法具有简单快速的优点，可用于胶原蛋白的测定。
凝胶层析法测定蛋白质的分子质量是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法，排阻层析法，凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样，将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。凝胶过滤法最主要的就是要选择合适的凝胶，凝胶是溶胶或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的液体(在干凝胶中也可以是气体，干凝胶也称为气凝胶)，这样一种特殊的分散体系称作凝胶。无论是天然凝胶或是人工合成凝胶内部均为多孔网状结构，而凝胶孔隙的性质决定了其分离的质量。
现有凝胶虽都具有一定的分离层析效果，但都存在孔隙不均匀，性质不稳定，机械结构强度不够等缺点，如何在现有技术基础上改进凝胶的性质，实现更加稳定的分筛方法就是本发明要研究的问题。
发明内容
本发明解决的技术问题就是提供一种水解胶原蛋白口服液中多肽分子量的快速测定方法。
本发明的技术方案为：
一种水解胶原蛋白口服液中多肽分子量的快速测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备检测样品：取市售水解胶原蛋白口服液10ml，水解胶原蛋白的质量浓度为105g/L，加入200μL去离子水搅拌均匀，再加入5ml的0.1mol/L的Tris-HCL缓冲液，2ml的2,5-二羟基苯甲酸搅拌离心处理后用滤膜进行第一次粗滤，得到滤液；
(2)将所得滤液通过特制的凝胶层析柱，经与分子量已知的标准品在相同条件下通过凝胶层析柱来计算待测样品的分子量，计算公式为：Ve＝k1-k2logMr，其中，Ve为洗脱体积，k1和k2为常系数，Mr为分子量。
进一步地，通过所述标准品的洗脱体积和分子量计算出常系数k1和k2，再结合待测样品的洗脱体积套用到公式里计算其分子量。
进一步地，所述Tris-HCL缓冲液中还有含质量浓度为0.02mol/L的LHAC。
进一步地，所述(2)中滤液在通过特制的凝胶层析柱前可将滤液中加入胃蛋白酶，加酶量为滤液的3％，5℃下搅拌均匀后静置8h，灭酶活后离心处理30min，取上清液，可对口服液中的胶原蛋白多肽进行进一步提纯，增加检测结果的准确性。
进一步地，所述标准品为牛血清蛋白。
进一步地，所述特制的凝胶层析柱是将交联葡聚糖、生物胶-P和蔗渣以1:2：0.015的质量比混合后在无盐水中溶胀20h，先用搅拌棒持续搅拌2h，使三者充分混合均匀，再每两小时间歇搅拌，所述搅拌棒为加热搅拌棒，可加快凝胶的溶胀，等其完全溶胀真空抽滤脱气后即可装柱。
进一步地，所述蔗渣经超纤维化处理，可增加凝胶的孔隙稳定性及其分布均匀性，同时可保证其具有足够的机械强度。
本发明的有益效果是：本发明是通过凝胶层析法测定水解胶原蛋白口服液中多肽分子量，采用分子筛的原理，分子体积小的进入层析介质内部孔隙，分子体积大的直接就从介质之间的孔隙流出，所以层析分离时，分子量越大越先流出，再以已知分子量大小的蛋白质为标准品，通过相同条件下其分子量洗脱公式换算出常数值代入公式中计算待测品的分子量，采用特制的凝胶洗脱，以交联葡聚糖和生物胶-P混合配比，克服传统单一凝胶性质不稳定的缺陷，凝胶中加入超纤维化的蔗渣，可使凝胶孔隙分布均匀且具有足够的机械强度，便于层析的进行。
具体实施方式
实施例:
一种水解胶原蛋白口服液中多肽分子量的快速测定方法，包括以下步骤：
(1)制备检测样品：取市售水解胶原蛋白口服液10ml，水解胶原蛋白的质量浓度为105g/L，加入200μL去离子水搅拌均匀，再加入5ml的0.1mol/L的Tris-HCL缓冲液，2ml的2,5-二羟基苯甲酸搅拌离心处理后用滤膜进行第一次粗滤，得到滤液；
(2)将所得滤液通过特制的凝胶层析柱，经与分子量已知的标准品在相同条件下通过凝胶层析柱来计算待测样品的分子量，计算公式为：Ve＝k1-k2logMr，其中，Ve为洗脱体积，k1和k2为常系数，Mr为分子量。
其中，通过所述标准品的洗脱体积和分子量计算出常系数k1和k2，再结合待测样品的洗脱体积套用到公式里计算其分子量；所述Tris-HCL缓冲液中还有含质量浓度为0.02mol/L的LHAC；所述(2)中滤液在通过特制的凝胶层析柱前可将滤液中加入胃蛋白酶，加酶量为滤液的3％，5℃下搅拌均匀后静置8h，灭酶活后离心处理30min，取上清液，可对口服液中的胶原蛋白多肽进行进一步提纯，增加检测结果的准确性；所述标准品为牛血清蛋白；所述特制的凝胶层析柱是将交联葡聚糖、生物胶-P和蔗渣以1:2：0.015的质量比混合后在无盐水中溶胀20h，先用搅拌棒持续搅拌2h，使三者充分混合均匀，再每两小时间歇搅拌，所述搅拌棒为加热搅拌棒，可加快凝胶的溶胀，等其完全溶胀真空抽滤脱气后即可装柱；所述蔗渣经超纤维化处理，可增加凝胶的孔隙稳定性及其分布均匀性，同时可保证其具有足够的机械强度。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种水解胶原蛋白口服液中多肽分子量的快速测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备检测样品：取市售水解胶原蛋白口服液10ml，水解胶原蛋白的质量浓度为105g/L，加入200μL去离子水搅拌均匀，再加入5ml的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，2ml的2,5-二羟基苯甲酸搅拌离心处理后用滤膜进行第一次粗滤，得到滤液；
（2）将所得滤液通过特制的凝胶层析柱，经与分子量已知的标准品在相同条件下通过凝胶层析柱来计算待测样品的分子量，计算公式为：Ve=k1-k2logMr，其中，Ve为洗脱体积，k1和k2为常系数，Mr为分子量；
所述（2）中滤液在通过特制的凝胶层析柱前将滤液中加入胃蛋白酶，加酶量为滤液的3%，5℃下搅拌均匀后静置8h，灭酶活后离心处理30min，取上清液；
所述特制的凝胶层析柱是将交联葡聚糖、生物胶-P和蔗渣以1:2：0.015的质量比混合后在无盐水中溶胀20h，先用搅拌棒持续搅拌2h，使三者充分混合均匀，再每两小时间歇搅拌，所述搅拌棒为加热搅拌棒，等其完全溶胀真空抽滤脱气后即可装柱；
所述蔗渣经超纤维化处理。
2.如权利要求1所述的一种水解胶原蛋白口服液中多肽分子量的快速测定方法，其特征在于，通过所述标准品的洗脱体积和分子量计算出常系数k1和k2，再结合待测样品的洗脱体积套用到公式里计算其分子量。
3.如权利要求1所述的一种水解胶原蛋白口服液中多肽分子量的快速测定方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液中还有含浓度为0.02mol/L的HAc。
4.如权利要求1所述的一种水解胶原蛋白口服液中多肽分子量的快速测定方法，其特征在于，所述标准品为牛血清蛋白。
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