CN104513306B

CN104513306B - 载脂蛋白A1的纯化方法和ApoAI蛋白注射抗原

Info

Publication number: CN104513306B
Application number: CN201410778677.8A
Authority: CN
Inventors: 李光飞; 苏少博
Original assignee: SHANXI REALLY TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Ruiyali Group Co.,Ltd.
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2014-12-15
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-12-15
Also published as: CN104513306A

Abstract

本发明提供了一种载脂蛋白A1的纯化方法，包括：获取血浆样品，并进行澄清处理；对澄清后的血浆样品进行第一次疏水层析，得第一次纯化产物；将第一次纯化产物进行脱脂处理；将脱脂处理后的第一次纯化产物进行第二次疏水层析；其中，第一次纯化的洗脱中包括两次洗脱；第一次洗脱用5～10％的有机醇进行洗脱、第二次洗脱用25～30％的醇进行洗脱；第二次疏水层析用洗脱强度低于25～30％的醇的洗脱液洗脱。本发明的方法利用HDL结构中存在脂质产生的强疏水性的机理进行第一次纯化，然后破坏HDL的脂蛋白结构使载脂蛋白A1与脂类分离，造成载脂蛋白A1与同样高疏水性杂蛋白质疏水性差异增大后再次疏水分离，即得到纯度较好载脂蛋白A1；方法简便新颖、处理样品的量更大、效率高。

Description

载脂蛋白A1的纯化方法和ApoAI蛋白注射抗原

技术领域

本发明属于生物分离技术领域，具体涉及一种载脂蛋白A1的纯化方法和ApoAI蛋白注射抗原。

背景技术

载脂蛋白是构成血浆脂蛋白的蛋白质组分，主要分A、B、C、D、E五类，是构成血浆脂蛋白的重要组分；其基本功能是与脂类和固醇类分子形成复合球体，以运载脂类和固醇类物质。由于载脂蛋白的上述基本特性功能，因此其常是构成高密度脂蛋白(High Density Lipprotein，HDL)的结构功能成分。所构成的高密度脂蛋白(High Density Lipprotein，HDL)是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是心脑血管疾病的保护因子，HDL主要在肝(部分在小肠)合成。由于其可输出胆固醇促进胆固醇的代谢，所以被作为动脉硬化预防因子而受到重视。

在高密度脂蛋白HDL的结构蛋白中，占HDL总蛋白的75％的是载脂蛋白A1(apolipoprotein A1，ApoA1)，而其他结构蛋白主要是ApoAⅡ约占20％比例。ApoAI由243个氨基酸残基组成，分子量28300D，由于去氨基酸构成多为疏水性氨基酸，因此其是一种极其疏水的蛋白质，并通过其疏水性较高的特点和脂类以及胆固醇结合，起到稳定脂蛋白复合体结构，运载脂类到达特定的组织中去。基于上述高密度脂蛋白HDL的蛋白构成特点，因此通过检测ApoAI的含量即可直接反映出HDL的水平，进一步通过其含量的测定，可以实现对动脉粥样硬化、心血管疾病进行判断和预测。

而目前，ApoAI的测定主要采用免疫比浊法和酶联免疫吸附法，这些测定方法需要的试剂主要由标准ApoAI样品和抗ApoAI抗体组成；检测的过程的关键在于高效快速的从血浆中获取高纯度的ApoAI样品以及所选择的抗ApoAI抗体的特异性。其中从血浆中获取高纯度的ApoAI样品的制备，现有主要采用的是包括或部分包括超高速梯度离心、离子交换层析、凝胶排阻层析和高效液相色谱等，逐步进行分离、纯化和验证，从而获得高纯度的ApoAI样品。该方法过程中处理设备昂贵，处理样品体积有限，工艺时间较长，造成制造ApoAI检测的成本居高，并且在长时间的处理中ApoAI部分发生异构、降解等，降低了检测的准确性。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种使用同一种疏水层析填料，从人血浆中快速高效大量分离纯化载脂蛋白A1的方法和ApoAI蛋白注射抗原。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种载脂蛋白A1的纯化方法，包括如下步骤：

获取血浆样品，并将血浆样品进行澄清处理；

对澄清后的所述血浆样品进行第一次疏水层析，得第一次纯化产物；

将所述第一次纯化产物进行脱脂处理；

将所述脱脂处理后的第一次纯化产物进行第二次疏水层析；

其中，所述第一次纯化过程的洗脱中包括第一次洗脱和第二次洗脱，且第二次洗脱的洗脱液为所述第一次纯化产物；所述第一次洗脱为采用5～10％的有机醇进行洗脱、第二次洗脱为25～30％的醇进行洗脱；

所述第二次疏水层析过程中采用洗脱强度低于25～30％的醇的洗脱液洗脱。

本发明的方法通过利用HDL自身结构中存在脂质产生的强疏水性的机理进行第一次纯化，通过化学手段破坏HDL的脂蛋白结构使载脂蛋白A1与脂类分离，造成载脂蛋白A1与第一次纯化所得的其他杂蛋白质疏水性呈现较大差异进行第二次纯化，即得到纯化了的载脂蛋白A1；纯化过程成本低、且能够简单的线性放大，处理样品的量更大，方法简便新颖、效率高。

本发明进一步还提出一种ApoAI蛋白注射抗原，该ApoAI蛋白注射抗原为采用上述方法步骤得到的纯化产物。

本发明的ApoAI蛋白注射抗原，其直接由上述方法制备获得，其组分中的蛋白活性以及成分于生物体无害，且本身以机体最适合的PH7.4的缓冲系作为ApoAI蛋白注射抗原的溶剂，直接最适于机体环境。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例1的各步骤中分别获得的样品的SDS-PAGE二维电泳检测结果图；

图2为本发明实施例2的各步骤中分别获得的样品的SDS-PAGE二维电泳检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种载脂蛋白A1的纯化方法，包括如下步骤：

S10，获取血浆样品，并将血浆样品进行澄清处理；

S20，用疏水层析对澄清后的血浆样品进行第一次纯化；

S30，将第一次纯化产物进行脱脂处理；

S40，将脱脂处理后的一次纯化产物用疏水层析进行第二次纯化。

本发明的上述方法过程中，首先在步骤S10中采用将样品进行澄清处理，其目的是除去血浆中含有的非蛋白类的其它成分物质，出于提升工艺的时间效率，在该步骤中还可以将血浆样品进行低速离心(3000～4500g)，在低速离心处理中还能进一步加快提升非蛋白类的颗粒等成分的分离，进一步使澄清液中含有目的载脂蛋白A1之外的其它结合物尽量摈除。

同时，在步骤S10之后，步骤S20采用疏水层析对澄清液进行一次纯化，其中在一次纯化的过程中，本发明中疏水层析采用装柱的填料为phenylsepharose high performance(苯基-琼脂糖)；并且在将澄清后的血浆样品装柱上样之后，对目的载脂蛋白A1洗脱的过程中本发明采用分步洗脱的方式进行，其具体包括：

第一次洗脱：采用5～10％的有机醇进行洗脱；

第二次洗脱：采用25～30％有机醇进行洗脱；

采用不同浓度的有机醇进行分次梯度洗脱，洗脱的过程中基于本身高密度脂蛋白HDL由蛋白和脂类共同构成的特点，脂类具有极高的疏水性，当使用疏水层析填料处理含有HDL的人血浆时，HDL与其他的杂蛋白或者其他也能与层析柱疏水结合的成分相比，可以更加牢固的与疏水填料结合，其结合强度远大于普通的蛋白质。因此在第一次纯化中采用的第二次洗脱的过程中，采用常规以及超过常规洗脱能力的有机醇进行洗脱，从而在第二次洗脱过程中便可以达到高效的初步分离。

同时，步骤S30中进一步将第一次分离纯化产物即第二次洗脱的洗脱液进行脱脂处理，脱脂处理的方法可以采用S/D法或高浓度尿素处理进行；其中：

S/D法：向第二次洗脱的洗脱液中加入0.3％磷酸三丁酯和1％曲拉通X-100，室温静置处理；

高浓度尿素法：将第二次洗脱的洗脱液边搅拌边加入一定量的固体尿素，使溶液中尿素的终浓度为6M，持续搅拌进行脱脂；

在该步骤S30中采用化学手段进一步破坏HDL的脂蛋白结构，使本身结合在载脂蛋白AI表面的脂类脱离，脂质脱离以后，则ApoAI在疏水层析填料上的结合能力大幅降低。而第二次洗脱液中存在的其它疏水能力较强的费目的蛋白则依然能保持其本身的疏水结合性，不受脱脂过程的影响，疏水性并未降低。

所以在上述脱脂的过程处理之后，步骤S40中将脱脂处理后的一次纯化产物进行第二次疏水层析，那么在该步骤中经过初步分离后ApoAI溶液中残留的其它极高疏水蛋白质，不受该脱脂过程的影响，疏水性并未降低，从而显示出疏水性的差异，再次通过疏水性洗脱的难以程度，便可以通过合适的洗脱能力的洗脱液洗脱进行分离。该步骤S40实施中也可以依然继续采用上述步骤S20中的phenyl sepharose high performance疏水层析柱进行，但是洗脱的过程中采用1mM EDTA洗脱液进行洗脱，洗脱下的洗脱组分即为高度纯化的ApoAI。

本发明的上述方法步骤，通过利用HDL自身结构中存在脂质产生的强疏水性的机理，通过化学手段破坏HDL的脂蛋白结构，使结合在ApoAI表面的脂类脱离，从而造成脂类的脱离解吸附使ApoAI在疏水层析填料上的结合能力大幅降低；从而通过前后疏水能力的变化将ApoAI与普通的疏水能力蛋白和其它该疏水能力蛋白实现分离；整个过程中采用单一的疏水层析方法即可实现大量制备高纯度的载脂蛋白A1样品。

本发明的上述方法相比现有高速离心、凝胶排阻层析、以及液相色谱等结合才能制备少量载脂蛋白A1样品的方法，首先其不需要依赖价值昂贵的设备，成本低；且能够简单的线性放大，处理样品的量更大；其次血浆应用于疏水层析，采用不同的乙醇溶液洗脱得到的目的ApoAI蛋白，洗脱液成分于生物体无害，可直接作为注射抗原使用；并且整个血浆样品采用疏水层析填料分两步处理即可得到纯化的目的蛋白，方法简便新颖、效率高。

同时，本发明的上述步骤S20的疏水层析第一次纯化过程中，进行洗脱的有机醇溶液，需要根据对疏水层析柱的上样的平衡缓冲液进行替换。比如在本发明中该步骤可以采用的装柱的平衡液为PH7.4的25mM Tris-HCl+25mM NaCl的平衡体系；澄清后的血样样品过柱时的上样缓冲液用25mM Tris-HCl PH7.4，那么在之后进行洗脱的梯度洗脱液即为：

第一次洗脱的洗脱液：PH7.4的25mM Tris-HCl+5～10％乙醇(V/V)

第二次洗脱的洗脱液：PH7.4的25mM Tris-HCl+25～30％乙醇(V/V)

当然，上述乙醇是最常用的洗脱有机醇，根据工业现存条件，也可以甲醇、丙醇等有机醇进行类似替换。

因此，在上述实施方式中，如果采用疏水层析的平衡和上样的缓冲体系为PBS磷酸缓冲系，那么相应的两次洗脱过程中的有机醇溶液也采用对应的缓冲系作为洗脱体系。

基于在步骤S40中疏水层析进行第二次纯化中基于的疏水结合能力，通过该第二次的疏水层析即可将脱脂之后高疏水性降低的载脂蛋白A1，与步骤S20的第二次洗脱液中的其它高疏水能力保持不变的非目的蛋白进行分离。在本发明的疏水能力上进行区分，在第一次疏水层析得到的第一次纯化液中，其包含的蛋白质采用相同浓度的25％～30％的醇洗脱所得，因此疏水性的能力本身相近，且均为高疏水性蛋白(低疏水性的杂蛋白被5％～10％的醇第一次洗脱去除)，因此在该步骤中通过疏水能力的变化即可以直接将步骤S20的第二次洗脱液中的载脂蛋白A1采用低于25％～30％洗脱强度的洗脱液将载脂蛋白洗脱下来；经过多重考量洗脱过程中的效果和本身的成分对蛋白结构的影响，本发明中优选采用的低于25％～30％洗脱强度的洗脱液为1～3mM EDTA的洗脱液。

在该步骤中采用的洗脱液如果依然是PH7.4的Tris-HCl平衡上样体系，那么洗脱液即采用PH7.4的2.5mM Tris-HCl+1～3mM EDTA进行。当然，洗脱过程中可以根据疏水能力的大小，还可以采用符合这一条件要求的洗脱液，在此不做限定。

进一步，在上述实施方式中优选采用的疏水层析填料为phenyl sepharosehigh performance(苯基-琼脂糖)，在使用中基于目的蛋白质的等电点的范围，也可以选择工作pH范围为3-13的Octyl Sepharose 4Fast Flow、Butyl-S-QZT 6FF等作为疏水层析填料，当然在工作中需要将其pH进行调整，使其适合于AI等电点等结合效果。在本发明中采用苯基-琼脂糖的疏水层析填料介质，其原因在于采用的这一中疏水调料其本身是胺基烷烃与BrCN一活化的琼脂糖反应形成的改性琼脂糖，之后将一系列长度不同的碳氢化合物接到琼脂糖载体上，从而得到一系列相应的疏水性琼脂糖层析介质。由于其疏水性主要是由3,6-甲烯二醚键桥提供的，其表面积大、多孔性更加利于本发明中含有多种载脂蛋白和之类结合的大体积结构的高密度脂蛋白HDL的结合与分离。

并且，进一步苯基-琼脂糖在水中溶胀，含水量可达96肠，可以保证其中的的水分环境，而这一环境在再结合本发明中采用的上述带有25mM NaCl的上上样平衡体系，在盐离子的降低极性效果下，更加利于改变影响蛋白质的构造，因为本身盐具有加强疏水反应的作用，水盐离子会按照盐析的特性排列，盐析离子的存在会增强含有脂质的高密度脂蛋白HDL蛋白质吸附在碳氢化合物接枝的琼脂糖上的能力，更利于实现本发明中大量高效制备高纯度载脂蛋白A1。

为使本发明上述纯化方法的实施细节更加清楚完整、易于本领域技术人员的实施参考，以及使本发明方法的突出的进步性效果更加显著，以下通过实施例对上述过程的实施进行具体举例说明。

实施例1

在该实施例1中采用疏水层析填料phenyl sepharose high performance处理经过静置的人血浆。

S11，将装填有phenyl sepharose high performance填料的层析柱，高度10cm、直径1.6cm，用平衡液A(PH7.4的25mM Tris-HCl+25mM NaCl)平衡，平衡至层析柱出液口液体pH值与平衡液相同；

S12，将静置后的人血浆经过低速离心(4000g)，除去悬浮颗粒物后的澄清液作为样品备用。

S21，将步骤S12的20ml样品用血浆稀释液(25mM Tris-HCl PH7.4)稀释4倍体积后，直接上样于经平衡液A平衡的上述层析柱。上样完成后采用平衡液A冲洗层析填料中未结合的人血浆成分；其中，平衡、上样和冲洗过程中控制流速均为3ml/min；

S22，使用洗脱液A1(25mM PH7.4的Tris-HCl+5％乙醇(V/V))进行洗脱，获得洗脱组分A1；再使用洗脱液A2(25mM PH7.4的Tris-HCl+25％乙醇(V/V))进行洗脱，获得洗脱组分A2；洗脱完毕后采用50ml的200mM氢氧化钠在位清洗层析柱中的层析填料。洗脱和在位清洗流速3ml/min。

S30，S/D法脱脂：将步骤S22的洗脱组分A2按照溶液体积在其中加入0.3％磷酸三丁酯和1％曲拉通X-100室温放置处理4个小时。

S40，将步骤S30经处理后的溶液上样于经过平衡液B(10mM Tris-HClPH7.4)平衡phenyl sepharose high performance层析柱，高度10cm，直径1.6cm；

然后将步骤S30脱脂后的溶液进行上样，上样完成后采用洗脱液B1(PH7.4的2.5mM Tris-HCl+1mM EDTA)洗脱，得到洗脱组分B1；洗脱组分B1即为高度纯化的ApoAI。

S50，然后采用20％乙醇洗脱，得到洗脱组分B2；洗脱完毕后采用50ml的250mM氢氧化钠在位清洗层析柱中的层析填料；洗脱和在位清洗流速3ml/min。该步骤中洗脱的洗脱组分B2及洗脱组分A2中除去ApoAI之外的其它疏水性强的杂蛋白。

同时在该实施例1中，将各步骤中分别获得的澄清血浆样品、未被填料吸附的上样穿透液、洗脱组分A1、洗脱组分A2、洗脱组分B2、洗脱组分B1进行SDS-PAGE二维电泳检测，其检测之后的胶片染色结果图如图1所示。其中图1中条带1为澄清血浆样品、条带2为未被填料吸附的上样穿透液、条带3为洗脱组分A1、条带4为洗脱组分A2、条带5为洗脱组分B2、条带6为洗脱组分B1。

实施例2

S12，将静置后的人血浆经过低速离心(4100g)，除去悬浮颗粒物后的澄清液作为样品备用。

S22，使用洗脱液A1(25mM PH7.4的Tris-HCl+10％乙醇(V/V))进行洗脱，获得洗脱组分A1；再使用洗脱液A2(25mM PH7.4的Tris-HCl+30％乙醇(V/V))进行洗脱，获得洗脱组分A2；洗脱完毕后采用50ml的200mM氢氧化钠在位清洗层析柱中的层析填料。洗脱和在位清洗流速3ml/min。

S30，高浓度尿素法脱脂：将步骤S22的洗脱组分A2边搅拌边加入一定量的固体尿素，使溶液中尿素的终浓度为6M，持续搅拌2小时以使脱脂完全。。

同时在该实施例2中，将各步骤中分别获得的澄清血浆样品、洗脱组分A1、洗脱组分A2、洗脱组分B2、洗脱组分B1进行SDS-PAGE二维电泳检测，其检测之后的胶片染色结果图如图2所示。其中图2中条带1为澄清血浆样品、条带2为洗脱组分A1、条带3为洗脱组分A2、条带4为洗脱组分B1、条带5为洗脱组分B2。

从上述各实施例的2D电泳的条带中可以看出，标准洗脱组分B1的条带清晰，且不带有杂带，因此分离的效果和纯度比较理想。同时进一步根据上述疏水层析柱用不同的上样量进行能效分析。每毫升疏水层析填料可以最多可处理13ml血清，并对最大的上样量洗脱的结果中计量，其能吸附其中17mg载脂蛋白A1，并最后获得至少13mg高纯度载脂蛋白A1，根据不同的脱脂方法，全程操作步骤需要3～5个小时。同时，由于层析纯化的线性放大特点，理论上任何规模的工艺放大，所需要的时间相同。在本发明的上述10cm、直径1.6cm的层析柱最大可获得260mg目的产物。

在对比条件下，若采用高速离心方法获取高纯度HDL蛋白，每次离心需要至少30分钟的离心时间，并只能处理约60ml血清，并且不可以线性放大，若需要扩大处理规模只能通过增加离心机数量和离心次数达到。若采用分子筛过滤方式获得目的蛋白，每次处理样品的体积不能超过层析柱体积的5％，且以实验室常用的60cm高，2.6cm直径的凝胶过滤为例，每次只能处理6ml血清。因此与现有的产业应用中的方法过程中处理设备昂贵，处理样品体积有限，工艺时间较长的的能效相比，本发明的上述方法的思路以及实施步骤本身就有突出的进步性效果和优良的经济效益。

基于本发明的上述实施方式，本发明进一步还提出一种ApoAI蛋白注射抗原，该ApoAI蛋白注射抗原为采用上述方法步骤得到的洗脱组分B1，即用疏水层析进行第二次纯化后的纯化产物。其组分中的蛋白活性以及成分于生物体无害，且本身以机体最适合的PH7.4的缓冲系作为ApoAI蛋白注射抗原的溶剂，直接最适于机体环境。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种载脂蛋白A1的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取血浆样品，并将血浆样品进行澄清处理；

将所述第一次纯化产物进行脱脂处理；

将所述脱脂处理后的第一次纯化产物进行第二次疏水层析；

其中，所述第一次疏水层析过程的洗脱中包括第一次洗脱和第二次洗脱，且第二次洗脱的洗脱液为所述第一次纯化产物；所述第一次洗脱的洗脱液为25mM PH7.4的Tris-HCl和体积百分含量为5-10％有机醇的混合液、第二次洗脱的洗脱液为25mM PH7.4的Tris-HCl和体积百分含量为25-30％有机醇的混合液；

所述第二次疏水层析的洗脱液为PH7.4的2.5mM Tris-HCl+1-3mM EDTA；

所述第一次疏水层析和第二次疏水层析中采用的层析柱的疏水填料为phenyl sepharose high performance；

所述脱脂处理为S/D法脱脂或高浓度尿素法脱脂。

2.如权利要求1所述的载脂蛋白A1的纯化方法，其特征在于，在所述第一次疏水层析过程前，还包括进行第一次平衡处理，采用的层析柱平衡液为含有25mM NaCl的PH7.4的25mM Tris-HCl缓冲系。

3.如权利要求1或2所述的载脂蛋白A1的纯化方法，其特征在于，所述醇为乙醇。