CN111153985B

CN111153985B - 血清载脂蛋白a-ii的分离纯化方法

Info

Publication number: CN111153985B
Application number: CN202010063680.7A
Authority: CN
Inventors: 夏杰; 王剑; 王民燕; 普筱薇; 叶浩威
Original assignee: Ningbo Saipo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Ningbo Saipo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2040-01-20
Also published as: CN111153985A

Abstract

本发明公开了一种从血清中分离纯化载脂蛋白A‑II的方法，包括利用疏水层析填料对血清中的载脂蛋白A‑II成分进行初步提纯，用不含盐的缓冲液洗杂，用含有有机醇的缓冲液洗脱并收集含A‑II载脂蛋白的洗脱液，以及利用阴离子交换层析填料对收集的含A‑II载脂蛋白的洗脱液进行精细提纯，用含有去污剂和有机醇的缓冲液对载脂蛋白A‑II进行柱上脱脂等步骤。本方法仅通过2步层析即得到纯度≥95％的载脂蛋白A‑II，回收率≥50％。

Description

血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种载脂蛋白AII的分离纯化方法。

背景技术

ApoAⅡ是HDL中含量第二多的载脂蛋白，早在1985年ApoAⅡ蛋白质的氨基酸序列、cDNA序列及基因序列均已阐明。ApoAⅡ在人血清中以二聚体的形式存在，其单体分子量为8700Da。人ApoAⅡ蛋白C端氨基酸残基为谷氨酸，N端为吡咯烷酮酸，缺乏组氨酸，精氨酸及色氨酸。ApoAⅡ有多态性存在，最主要的多态型等电点为4.9，而含量较少的多态型的等电点为5.17、4.68、4.42和4.20。

ApoAⅡ的生理功能是：

1、维持HDL结构。ApoAⅡ肽段12-31和肽段50-77具有与磷脂的结合能力，经二级结构分析认为，残基17-30和51-62形成的双性螺旋结构是人ApoAⅡ与脂质结合的分子基础。

2、激活肝脂酶。用以水解CM和VLDL中的TG和PL。还有报道，ApoAⅡ可抑制LCAT活性。ApoAⅡ由肝脏和小肠合成。人血浆中的ApoAⅡ生物半寿期为4.4天。

目前已知提取血清载脂蛋白A-II方法比较少，主要为超速离心法后用Scanu(1971)法脱脂。此方法制备载脂蛋白A-II的缺陷包括：1)成本高，对设备要求高；2)制备规模小；3)有机试剂脱脂容易导致样品失活等。

发明内容

本发明的目的是提供一种血清载脂蛋白A-II的纯化方法，它具有步骤简单，制备规模易放大，样品不易失活的特点。

本发明所采用的技术方案是：

血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，包括有以下步骤：

1)利用疏水层析填料对血清中的载脂蛋白A-II成分进行初步提纯，用不含盐的缓冲液洗杂，用含有有机醇的缓冲液洗脱并收集含A-II载脂蛋白的洗脱液；

2)利用阴离子交换层析填料对步骤1)中收集的含A-II载脂蛋白的洗脱液进行精细提纯，用含有去污剂和有机醇的缓冲液对载脂蛋白A-II进行柱上脱脂。

所述步骤1)中，疏水层析填料为Phenyl Sepharose High Performance。

所述步骤1)中，疏水层析初步提纯的过程包括平衡、上样、洗杂、洗脱。

所述步骤1)中，不含盐的缓冲液为pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液。

所述步骤1)中，含有有机醇的缓冲液为30—50％的pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液。

所述步骤2)中，阴离子交换层析填料为Q Sephrose HP。

所述步骤2)中，利用阴离子交换层析填料对步骤1)中收集的含A-II载脂蛋白的洗脱液进行精细提纯过程包括平衡、上样、脱脂、再平衡、洗脱。

所述步骤2)中，含有去污剂和有机醇的缓冲液为含有0.5％的去污剂，30—50％的有机醇的pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液。

所述去污剂为曲拉通X-100和聚多卡醇(Thesit)。

所述有机醇为乙二醇。

本发明的步骤1)，主要利用载脂蛋白具有很强的疏水性的原理，除去血清中的白蛋白及抗体，而载脂蛋白能够被疏水填料捕获，为了进一步提高纯度，采用无盐缓冲液对填料清洗，来去除与疏水填料结合比较弱的蛋白，在洗脱缓冲液中增加洗脱能力很强且对蛋白比较友好的乙二醇进行洗脱并收集了洗脱样品，在保护蛋白的同时提高蛋白回收率。

本发明的步骤2)，首先利用阴离子填料对在中性pH条件下带负电载脂蛋白A-II有一定的捕获作用，再用去污剂加乙二醇的方式对载脂蛋白进行柱上脱脂，此步脱脂过程避免增加步骤的同时对一些非特异性吸附的杂质有一定的去除作用，最后利用各种载脂蛋白在阴离子层析上的电荷强度不同，来分离载脂蛋白A-II。

本发明的步骤2)中，最后的洗脱方式为常规低盐到高盐的线性洗脱方式，并有效达到分离。

经测试，本发明的方法仅通过2步层析即得到纯度≥95％的载脂蛋白A-II，且回收率≥50％。即，具有操作简单、提纯程度较高、回收率亦较高的优点。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：

图1是本发明的载脂蛋白A-II的纯化工艺流程示意图；

图2-1是实施例1疏水层析色谱图，图2-2是实施例2疏水层析色谱图，图2-3是实施例3疏水层析色谱图；

图3-1是实施例1阴离子交换层析色谱图，图3-2是实施例2阴离子层析色谱图，图3-3是实施例2阴离子层析色谱图；

图4-1是实施例1的SDS-PAGE电泳图，图4-2是实施例2的SDS-PAGE电泳图，图4-3是实施例3的SDS-PAGE电泳图；

其中，

图4-1中：1号泳道为蛋白Marker、2号泳道为疏水层析洗脱、3号泳道为阴离子交换层析洗脱；

图4-2中：1号泳道为阴离子交换层析洗脱、2号泳道为疏水层析洗脱、3号泳道为蛋白Marker；

图4-3中：1号泳道为蛋白Marker、2号泳道为疏水层析洗脱、3号泳道为阴离子交换层析洗脱。

具体实施方式

为了使本发明技术方案及目的更加明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。

如图1所示，血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，首先对血清进行澄清处理。

之后，该血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法还包括以下步骤：

1)利用疏水层析填料对血清中的载脂蛋白A-II成分进行初步提纯，用不含盐的缓冲液洗杂，用含有有机醇的缓冲液洗脱并收集含A-II载脂蛋白的洗脱液。即，疏水层析初步提纯的过程包括平衡、上样、洗杂、洗脱等步骤。

2)利用阴离子交换层析填料对步骤1)中收集的含A-II载脂蛋白的洗脱液进行精细提纯，用含有去污剂和有机醇的缓冲液对载脂蛋白A-II进行柱上脱脂。即，阴离子交换层析精细提纯的过程包括平衡、上样、脱脂、再平衡、洗脱等步骤。

此步骤中主要对血清样品进行澄清处理，通过高速离心(10000r/min)可加速非蛋白类的颗粒物质沉积，再用0.22μm的滤膜截留包括微生物及其他细小颗粒物质，使样品进一步澄清，提高样品处理效率。

本发明第一步层析是疏水层析，即，利用疏水层析填料对血清中的载脂蛋白A-II成分进行初步提纯。其主要原理是根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离蛋白，高浓度的盐会增强蛋白和填料的相互作用，而低浓度的盐(或无盐)减弱相互作用，有机试剂可进一步减弱其之间的相互作用。由于载脂蛋白A-II具有很强的疏水性，无盐缓冲液仅能对其部分洗脱，且杂质较多，采用含有机试剂的缓冲液则可几乎全部将其洗脱。

本发明第一步层析采用的是Phenyl Sepharose High Performance填料，其配基为苯基，基质为高度交联的6％葡聚糖的颗粒(其平均粒径为34微米)，小颗粒有助于在高样品上样量和高流速下的快速结合、解离。

在第一步层析中，用不含盐的缓冲液洗杂，洗脱大多数疏水性较弱的蛋白。不含盐的缓冲液优选为pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液。含有有机醇的缓冲液为30％-50％的乙二醇pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液。

第二步层析为阴离子交换层析，即，利用阴离子交换层析填料对步骤1)中收集的含A-II载脂蛋白的洗脱液进行精细提纯。由于载脂蛋白A-II的等电点在5左右，因此在pH中性条件下可被阴离子交换填料捕获，但由于色素脂类也同时结合于填料上，对载脂蛋白和其他杂蛋白的分离具有很大的干扰作用。通过柱上脱脂提高回收率的同时提高效率。

阴离子交换层析填料为Q Sepharose High Performance，该填料配基为季胺盐离子，基质为高度交联的6％葡聚糖的颗粒(粒径的平均大小为34微米)，在高载量高流速条件下快速结合，同时保证系统的高分辨率，获得高纯度样品。

含有去污剂和有机醇的缓冲液为含有0.5％的去污剂、30％-50％的有机醇的pH7.4的20mM Tris-HCl缓冲液，且去污剂为曲拉通X-100和聚多卡醇(Thesit)，有机醇为乙二醇。

下面，结合若干更具体的实施例予以进一步说明。

实施例1

收集50ml血清，血清经常规检测乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒表面抗原以及人类免疫缺陷病毒I型和II型抗体均为阴性。经10000r/min离心10min，收集上清，以0.22μm滤膜过滤，收集过滤液。

首先进行第一步层析：

取20％乙醇保存的Phenyl Sepharose High Performance凝胶，用水置换3次，去除乙醇后装入XK16/20层析柱中，柱高为10cm，层析过程均在GE AKTA Purifier 100蛋白纯化仪上进行。

平衡步骤为：用20mM Tris，0.5M NaCl，pH7.4作为平衡液(选用20mM Tris，0.5MNaCl，pH7.4)平衡至与层析柱流出液与平衡液电导和pH一致；

上样步骤为：将50ml过滤液后的血清的pH调节至7.4上样，流速为4ml/min；图2-1a段，图中显示有大量的杂质流穿，主要为白蛋白和抗体；

洗杂步骤为：用无盐洗杂缓冲液(选用20mM Tris，pH7.4)清洗3倍柱体积；图2-1b段，与疏水填料结合力较弱的蛋白被洗脱；

洗脱步骤为：用含有机试剂洗脱缓冲液(选用20mM Tris，30％乙二醇，pH7.4)洗脱，并收集洗脱样品。图2-1c段，与疏水填料结合更强的载脂蛋白被洗脱。

接着进行第二步层析：

取30ml 20％乙醇保存的Q Sepharose High Performance凝胶，用水置换3次，去除乙醇后装入XK16/20层析柱中，柱高11cm，层析过程均在GE AKTA Purifier 100蛋白纯化仪上进行。

平衡步骤为：用平衡液平衡(选用20mM Tris，pH 7.4)至与层析柱流出液与平衡液电导和pH一致；

上样步骤为：疏水层析的洗脱样品用平衡液稀释1倍上样；

脱脂步骤为：用脱脂缓冲液(选用20mM Tris，30％乙二醇，0.5％曲拉通X-100，pH7.4)清洗3倍柱体积；图3-1a段可以看到在样品结合到填料上后有杂质被洗下来，其中包括了脂类物质，经生化仪检测并未发现载脂蛋白活性物质。

再平衡步骤为：用平衡液(选用20mM Tris，pH 7.4)平衡至与层析柱流出液与平衡液电导和pH一致；

洗脱步骤为：洗脱液为A和B线性洗脱，A为20mM Tris-HCl缓冲液、pH 7.4，B为20mMTris-HCl缓冲液、1M NaCl、pH7.4，以100％A平衡液为起始10倍柱体积达到100％B线性洗脱。图3-1b段，用线性洗脱载脂蛋白A-II与其他杂质基本被分离。

将实施例1中的疏水层析洗脱样品和阴离子交换层析样品检测其活性及SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE结果图如图4-1所示，疏水层析洗脱样品载脂蛋白A-II的灰度值约为15％，阴离子层析洗脱样品灰度值为95％；经全自动7180生化仪载脂蛋白A-II活性测定，疏水层析回收率约为75％阴离子层析回收率约为70％。

实施例2

首先进行第一步层析：

取20％乙醇保存的Phenyl Sepharose High Performance凝胶，用水置换3次，去除乙醇后装入XK16/20层析柱中，柱高为12cm，层析过程均在GE AKTA Purifier 100蛋白纯化仪上进行。

平衡步骤为：用平衡液(选用20mM Tris，0.5M NaCl，pH7.4)平衡至与层析柱流出液与平衡液电导和pH一致；

上样步骤为：将50ml过滤液后的血清的pH调节至7.4上样，流速为4ml/min；图2-2a段，图中显示有大量的杂质流穿，主要为白蛋白和抗体；

洗杂步骤为：用无盐洗杂缓冲液(选用20mM Tris，pH7.4)清洗3倍柱体积；图2-2b段，与疏水填料结合力较弱的蛋白被洗脱；

洗脱步骤为：用含有机试剂洗脱缓冲液(选用20mM Tris，50％乙二醇，pH7.4)洗脱，并收集洗脱样品。图2-1c段，与疏水填料结合更强的载脂蛋白被洗脱。

接着进行第二步层析：

上样步骤为：疏水层析的洗脱样品用平衡液稀释1倍上样；

脱脂步骤为：用脱脂缓冲液(选用20mM Tris，50％乙二醇，0.5％Thesit，pH7.4)清洗3倍柱体积；图3-2a段可以看到在样品结合到填料上后有杂质被洗下来，其中包括了脂类物质，经生化仪检测并未发现载脂蛋白活性物质。

洗脱步骤为：洗脱液为A和B线性洗脱，A为20mM Tris-HCl缓冲液、pH 7.4，B为20mMTris-HCl缓冲液、1M NaCl、pH7.4，以100％A平衡液为起始10倍柱体积达到100％B线性洗脱。图3-2b段，用线性洗脱载脂蛋白A-II与其他杂质基本被分离。

将案例实施2中的疏水层析洗脱样品和阴离子交换层析样品检测其活性及SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE结果图如图4-2所示，疏水层析洗脱样品载脂蛋白A-II的灰度值约为10％，阴离子层析洗脱样品灰度值为95％；经全自动7180生化仪载脂蛋白A-II活性测定，疏水层析回收率约为78％，阴离子层析回收率约为70％。

实施例3

首先进行第一步层析：

取20％乙醇保存的Phenyl Sepharose High Performance凝胶，用水置换3次，去除乙醇后装入XK16/20层析柱中，柱高为9cm，层析过程均在GE AKTA Purifier 100蛋白纯化仪上进行。

上样步骤为：将50ml过滤液后的血清的pH调节至7.4上样，流速为4ml/min；图2-3a段，图中显示有大量的杂质流穿，主要为白蛋白和抗体；

洗杂步骤为：用无盐洗杂缓冲液(选用20mM Tris，pH7.4)清洗3倍柱体积；图2-3b段，与疏水填料结合力较弱的蛋白被洗脱；

洗脱步骤为：用含有机试剂洗脱缓冲液(选用20mM Tris，40％乙二醇，pH7.4)洗脱，并收集洗脱样品。图2-3c段，与疏水填料结合更强的载脂蛋白被洗脱。

接着进行第二步层析：

上样步骤为：疏水层析的洗脱样品用平衡液稀释1倍上样；

脱脂步骤为：用脱脂缓冲液(选用20mM Tris，40％乙二醇，0.5％Thesit，pH7.4)清洗3倍柱体积；图3-3a段可以看到在样品结合到填料上后有杂质被洗下来，其中包括了脂类物质，经生化仪检测并未发现载脂蛋白活性物质。

洗脱步骤为：洗脱液为A和B线性洗脱，A为20mM Tris-HCl缓冲液、pH 7.4，B为20mMTris-HCl缓冲液、1M NaCl、pH7.4，以100％A平衡液为起始10倍柱体积达到100％B线性洗脱。图3-3b段，用线性洗脱载脂蛋白A-II与其他杂质基本被分离。

将案例实施2中的疏水层析洗脱样品和阴离子交换层析样品检测其活性及SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE结果图如图4-3所示，疏水层析洗脱样品载脂蛋白A-II的灰度值约为12％，阴离子层析洗脱样品灰度值为96％；经全自动7180生化仪载脂蛋白A-II活性测定，疏水层析回收率约为72％，阴离子层析回收率约为75％。

综上所述，本发明的血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法仅通过2步层析即得到纯度≥95％的载脂蛋白A-II，且回收率≥50％。即，具有操作简单、提纯程度较高、回收率亦较高的优点。

需要说明的是，前述实施例1和2中，前处理阶段采用收集50ml血清，血清经常规检测乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒表面抗原以及人类免疫缺陷病毒I型和II型抗体均为阴性。经10000r/min离心10min，收集上清，以0.22μm滤膜过滤，收集过滤液，只是为了便于说明，并不限定本发明的方法仅适应于分离纯化50ml的血清以及以及进行10000r/min离心10min，收集上清，以0.22μm滤膜过滤等条件。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，包括有以下步骤：

2.根据权利要求1所述的血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤1)中，疏水层析填料为Phenyl Sepharose High Performance。

3.根据权利要求1所述的血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤1)中，疏水层析初步提纯的过程包括平衡、上样、洗杂、洗脱。

4.根据权利要求1所述的血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤1)中，不含盐的缓冲液为pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液。

5.根据权利要求1所述的血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤1)中，含有有机醇的缓冲液为30—50％的pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液。

6.根据权利要求1所述的血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤2)中，阴离子交换层析填料为Q Sephrose HP。

7.根据权利要求1所述的血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤2)中，利用阴离子交换层析填料对步骤1)中收集的含A-II载脂蛋白的洗脱液进行精细提纯过程包括平衡、上样、脱脂、再平衡、洗脱。

8.根据权利要求1所述的血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤2)中，含有去污剂和有机醇的缓冲液为含有0.5％的去污剂，30—50％的有机醇的pH 7.4的20mM Tris-HCl缓冲液。

9.根据权利要求8所述的血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，其特征在于：所述去污剂为曲拉通X-100和聚多卡醇。

10.如权利要求8中所述的血清载脂蛋白A-II的分离纯化方法，其特征在于：所述有机醇为乙二醇。