CN101205250A - 高纯度载脂蛋白a-i的制备方法 - Google Patents

高纯度载脂蛋白a-i的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101205250A
CN101205250A CNA2006101475037A CN200610147503A CN101205250A CN 101205250 A CN101205250 A CN 101205250A CN A2006101475037 A CNA2006101475037 A CN A2006101475037A CN 200610147503 A CN200610147503 A CN 200610147503A CN 101205250 A CN101205250 A CN 101205250A
Authority
CN
China
Prior art keywords
damping fluid
urea
apoa
component
exchange chromatography
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2006101475037A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100586958C (zh
Inventor
黄凯
何秋
许必雄
包骧飞
李军辉
沈积慧
李春洲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI RAAS BLOOD PRODUCTS CO Ltd
Original Assignee
SHANGHAI RAAS BLOOD PRODUCTS CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CN200610147503A priority Critical patent/CN100586958C/zh
Application filed by SHANGHAI RAAS BLOOD PRODUCTS CO Ltd filed Critical SHANGHAI RAAS BLOOD PRODUCTS CO Ltd
Priority to BRPI0721238A priority patent/BRPI0721238B8/pt
Priority to JP2009542756A priority patent/JP2010513480A/ja
Priority to MYPI20092514A priority patent/MY154897A/en
Priority to EP07861342.9A priority patent/EP2125861B1/en
Priority to PCT/US2007/020258 priority patent/WO2008088403A2/en
Priority to KR1020097014720A priority patent/KR101363106B1/ko
Priority to MX2009006766A priority patent/MX2009006766A/es
Priority to RU2009127816/04A priority patent/RU2453555C2/ru
Priority to CA2673516A priority patent/CA2673516C/en
Priority to TW096145616A priority patent/TWI357347B/zh
Publication of CN101205250A publication Critical patent/CN101205250A/zh
Priority to EG2009060940A priority patent/EG26516A/en
Priority to US12/457,796 priority patent/US8013122B2/en
Priority to AU2009202827A priority patent/AU2009202827B8/en
Application granted granted Critical
Publication of CN100586958C publication Critical patent/CN100586958C/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种获得载脂蛋白A－I的方法，它包括步骤：a.将经Cohn低温乙醇法获得的组份四和1－8M的尿素混合形成组份四预处理溶液；b.步骤a得到的组份四预处理溶液流过阴离子交换层析柱后，用含1－8M尿素的缓冲液洗涤层析柱，得到初步纯化的载脂蛋白A－I；c.含步骤b得到的初步纯化的载脂蛋白A－I的溶液流过阴离子交换层析柱，洗脱杂质后用含0－1M尿素的缓冲液洗涤层析柱，得到纯化的载脂蛋白A－I。所述的方法蛋白得率高、成本低，适合工业化生产；同时，该方法还充分利用了血浆资源。

Description

高纯度载脂蛋白A-I的制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白质制备，尤其涉及载脂蛋白A-I的制备方法。
背景技术
载脂蛋白A-I(Apolipoprotein A-I，apoA-I)是高密度脂蛋白(HighDensity Lipoprotein，HDL)的主要载脂蛋白，为单一多肽链，由243个氨基酸残基组成，分子量28.3kD。HDL主要功能是参与胆固醇逆向转运(ReverseCholesterol Transport，RCT)，将外周组织细胞中的胆固醇移出并转运至肝脏转化清除，因而具有对抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)发生及发展的重要作用，而apoA-I是HDL抗AS功能的主要承担者。apoA-I还具有抗炎抗内毒素的功能，因此是脂类代谢研究重点之一。由于apoA-I具有肝脏靶向作用的特点，在靶向药物研究中也有良好的应用前景。
目前，获得apoA-I的常用制备方法有超速离心法、有机溶剂沉淀法和高效液相法等，虽然能得到高纯度apoA-I，但具有一些很明显的缺点：①制备量小，一般只能获得毫克级的apoA-I蛋白，不适于工业生产；②蛋白得率低，经超离心、有机溶剂沉淀、柱层析等多步处理，在制备过程中损失了大部分apoA-I；③成本高，需要超速离心机等贵重仪器；④安全性差，乙醇、丙酮、三氯乙酸等有机溶剂不仅具有生理毒性，而且易燃易爆，不利与安全生产。
另一方面，血浆组份四是人血浆经Cohn低温乙醇法处理后的剩余部分，常因不能利用而被丢弃，其主要蛋白成分是白蛋白和β脂蛋白。
因此，本领域迫切需要提供一种制备apoA-I的方法，该方法的蛋白得率高、能较好地保持蛋白活性，同时成本低、而且适合于大规模的工业生产。另外，该方法还能将被丢弃的组份四加以合理应用，使血浆资源得到更充分的利用。
发明内容
本发明旨在提供一种从人血浆中获得apoA-I的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种获得载脂蛋白A-I的方法，它包括步骤：
a.将经Cohn低温乙醇法获得的组份四和1-8M的尿素混合形成组份四预处理溶液；
b.步骤a得到的组份四预处理溶液流过阴离子交换层析柱后，用含1-8M尿素，电导值1-4ms/cm的缓冲液I洗涤层析柱，得到含初步纯化的载脂蛋白A-I的洗脱液I；
c.洗脱液I流过阴离子交换层析柱，用电导值1-15ms/cm的缓冲液II洗脱杂质后用电导30-100ms/cm的缓冲液III洗脱下纯化的载脂蛋白A-I。
在另一优选例中，步骤a中组份四和尿素的重量比为1∶30-300。
在另一优选例中，步骤a中组份四和尿素的重量混合比为1∶90-240。
在另一优选例中，步骤a中组份四和尿素的重量混合比为1∶150-210。
在另一优选例中，步骤a、b中所述的尿素浓度为3-8M。
在另一优选例中，步骤a、b中所述的尿素浓度为5-7M。
在另一优选例中，缓冲液I的电导值为2-4ms/cm；缓冲液II的电导值为7-15ms/cm；缓冲液III的电导值为70-95ms/cm。
在另一优选例中，缓冲液I的电导值为2.5-3.6ms/cm；缓冲液II的电导值为9-12ms/cm；缓冲液III的电导值为80-90ms/cm。
在另一优选例中，步骤b、c中的洗脱缓冲液I、II或III中含有NaCl、KCl、MgCl2或CaCl2。
在另一优选例中，步骤b、c中的洗脱缓冲液I、II或III中含有NaCl。
在另一优选例中，步骤c所述的缓冲液II或III中含有0-1M尿素。
在另一优选例中，所述的阴离子交换层析柱为弱酸性或弱碱性阴离子交换层析柱。
在另一优选例中，所述的阴离子交换层析柱为QAE或DEAE阴离子交换层析柱。
在另一优选例中，所述的阴离子交换层析柱为DEAE阴离子交换层析柱。
在另一优选例中，步骤a和b之间还包括步骤a’：将组份四预处理溶液离心除不溶性杂质，并用滤膜过滤。
在另一优选例中，离心速度为6000-10,000rpm，滤膜孔径为0.2-0.6μm。
在另一优选例中，步骤b和c之间还包括步骤b’：用电导值4.5-70ms/cm的缓冲液IV洗脱除去大部分杂质。
在另一优选例中，步骤c后还包括步骤c’：超滤换液，添加稳定剂，然后灌装、冷冻干燥得成品。
在另一优选例中，缓冲液IV或V中含0-1M尿素。
在另一优选例中，缓冲液IV或V中含有NaCl、KCl、MgCl2或CaCl2。
在另一优选例中，缓冲液IV或V中含有NaCl。
在另一优选例中，上述的各缓冲液的pH7.2-8.5，更佳地pH7.5-8，最佳地pH7.8。。
在另一优选例中，上述的各缓冲液为Tris缓冲液。
在本发明的第二方面，提供了一种用上述方法得到的载脂蛋白A-I。
据此，本发明提供了一种制备apoA-I的方法，所制得的蛋白得率高、蛋白活性好。所述的方法成本低、适于大规模的工业化生产。该方法使血浆资源得到充分的利用。
附图说明
图1是人血浆载脂蛋白apoA-I生产工艺流程图。
图2是实施例1中第一次DEAE阴离子交换柱层析的洗脱曲线图；
其中，横坐标表示从层析柱出口端流出的洗脱液体积，纵坐标表示在线测得的层析柱出口端洗脱液的蛋白浓度；1，2，3，4，5，6，7，8，9为取样点，分别对应图3中的1，2，3，4，5，6，7，8，9号电泳条带。
图3是实施例1第一次DEAE阴离子交换柱层析的SDS-PAGE电泳结果图；
其中，1，2，3，4，5，6，7，8，9号蛋白条带分别对应图2中1，2，3，4，5，6，7，8，9号取样点；箭头→所指处的蛋白条带表示apoA-I。
图4是实施例1第二次DEAE阴离子交换柱层析的SDS-PAGE电泳结果图；
其中，1为上柱流穿液的蛋白条带，2为低分子量标准蛋白，3，4，5为先洗脱下来的杂蛋白，6，7，8，9，10为后洗脱下来的apoA-I，其中6，7为5倍稀释样品，8为10倍稀释样品，箭头→所指处的蛋白条带表示apoA-I。
图5是实施例4apoA-I中试纯化的SDS-PAGE电泳结果图；
其中，1为组份四预处理液上清液，4，5，6，7，8为DEAE层析纯化得到的目的蛋白；10为杂蛋白；箭头→所指处的蛋白条带表示apoA-I。
图6是实施例2第二次DEAE阴离子交换柱层析的SDS-PAGE电泳结果图；
其中，1为低分子量标准蛋白，2，3，4为纯化得到的目的蛋白。
图7是实施例3第二次DEAE阴离子交换柱层析的SDS-PAGE电泳结果图；
其中，1为低分子量标准蛋白，2，3，4为纯化得到的目的蛋白。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，将一定浓度的尿素与目前被丢弃的人血浆组份四以一定的比例混合，apoA-I在尿素溶液中性质变化，使其与阴离子交换层析柱的结合具有高度特异性，通过两步阴离子交换层析，得到了高纯度的apoA-I。
本发明提供的制备apoA-I的方法，参见附图1的流程图，它包括以下步骤：
(1)组份四沉淀预处理
所述的组份四是人血浆经cohn低温乙醇法所得到的沉淀(Cohn E J，StrongLE，Huges WL，et al.Preparation and properties of serum and plasma proteins IVA system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein componentsof biological tissues and fluids.Amer Chem Soc，1946，68：459-475.)。将组份四沉淀溶于缓冲液中，再加入一定浓度的尿素，充分混匀，使组份四中的apoA-I等蛋白变性，所谓的变性是可逆的。
所加入的尿素浓度为1-8M，优选地3-7M，更佳地为5-6M。组份四沉淀与所加入的尿素的重量比为1∶30-300，优选地1∶90-240，更佳地为1∶150-210。
可使用本领域熟知的碱性缓冲液，如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液，其中优选Tris缓冲液。缓冲液的pH为7.2-8.5，优选地pH7.5-8，更优选地pH7.8。
在另一优选例中，在低温环境(0-4℃)将组份四沉淀溶于缓冲液。
在一个优选例中，组份四和尿素在缓冲液中充分混匀后，再离心除去不溶性杂质，然后用滤膜过滤。离心速度为6000-10,000rpm，更佳地为8000rpm；滤膜孔径为0.2-0.6μm，更佳地为0.45μm。
(2)第一次阴离子交换柱层析(apoA-I的粗纯)
将步骤(1)的组份四复溶液以一定流速流过阴离子交换层析柱，apoA-I与杂蛋白均结合到层析柱上。
先以含尿素且较低离子强度的缓冲液洗涤阴离子交换层析柱，此时apoA-I与层析柱具有较弱的结合力，含有少量杂蛋白的apoA-I首先被洗脱下来，而绝大部分杂蛋白则留在层析柱；再以离子强度较高的缓冲液洗涤阴离子交换层析柱，将绝大部分杂质洗脱下来，杂质中不含apoA-I。apoA-I得到初步纯化。
在将含少量杂蛋白的apoA-I洗脱下来的洗脱液中含有1-8M尿素，较佳地3-7M，更佳地为5-6M。在该洗脱液的电导值为1-4ms/cm，较佳地2-3.8ms/cm，更佳地2.5-3.6ms/cm；该洗脱液中可含有的盐包括但不限于：NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2，其中优选NaCl。
在将大部分杂质洗脱下来的洗脱液中含有0-1M尿素，优选不含尿素。其电导值为4.5-100ms/cm；其中所含的盐包括但不限于：NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2，其中优选NaCl。
所述的洗脱液可使用本领域熟知的碱性缓冲液，如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液，其中优选Tris缓冲液。缓冲液的pH为7.2-8.5，优选地pH7.5-8，更优选地pH7.8。
步骤(1)的组份四复溶液流过阴离子交换层析柱的流速为0.5-1.5ml/min，优选0.8-1.2ml/min。组份四沉淀的重量和层析柱体积的比例为1∶5-50，优选1∶15-40，更优选1∶20-30。
(3)第二次阴离子交换柱层析(apoA-I的精纯)
初步纯化的apoA-I溶液(含apoA-I，尿素及微量杂蛋白)用水稀释到较低的盐浓度，并以一定流速流过阴离子交换层析柱，apoA-I与微量杂蛋白结合到层析柱上。
以离子强度较低的缓冲液洗涤层析柱，此时apoA-I与层析柱具有较强的结合力，尿素和杂蛋白被首先洗脱下来；再以离子强度较高的缓冲液洗涤层析柱，将apoA-I洗脱下来，得到电泳纯的apoA-I。
将尿素和杂蛋白洗脱下来的洗脱液电导值为1-20ms/cm，较佳地7-15ms/cm，更佳地9-12ms/cm，其中可含有0-1M尿素，优选不含尿素。在该洗脱液中可含有的盐包括但不限于：NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2，其中优选NaCl。
将apoA-I洗脱下来的洗脱液电导值为50-100ms/cm，较佳地70-95ms/cm，更佳地80-90ms/cm，其中可含有0-1M尿素，优选不含尿素。其中所含的盐包括但不限于：NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2，其中优选NaCl。
在另一优选例中，可以在apoA-I与微量杂蛋白结合到层析柱上后，用电导从1-100ms/cm，以3ms/cm/min的速度变化的梯度洗脱液进行洗脱，截取电导30-60ms/cm时洗脱下的纯化的载脂蛋白A-I。
所述的洗脱液可使用本领域熟知的碱性缓冲液，如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液，其中优选Tris缓冲液。缓冲液的pH为7.2-8.5，优选地pH7.5-8，更优选地pH7.8。
用1-10倍体积的水稀释初步纯化的apoA-I溶液，优选的稀释倍数为3-7倍。稀释后的初步纯化的apoA-I溶液流过阴离子交换层析柱的流速为0.5-1.5ml/min，优选0.8-1.2ml/min。
本发明还可包括apoA-I洗脱液后处理的步骤，即将洗脱下来的精纯(电泳纯)apoA-I超滤浓缩换液，并添加稳定剂，再经冷冻干燥，制成apoA-I冻干制剂。
可使用本领域熟知的方法进行超滤，采用Millipore公司聚醚砜(PES)超滤膜(截留分子量5k)，4℃超滤，压力不超过0.3Mpa。
所添加的稳定剂是本领域熟知的，选自但不限于：羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、蔗糖、山梨醇等。
使用本领域常用的真空冷冻干燥方法冻干：物料于-36℃下预冻3-4小时，控制真空度7-9Pa冷冻干燥，冷阱温度-55℃左右，解析阶段搁板温度40℃，冻干时间约15小时。
本发明提供的纯化apoA-I的方法中所使用的阴离子交换层析柱可使用本领域熟知的，优选填料为QAE或DEAE的阴离子交换层析柱，更优选DEAE阴离子交换层析柱。
apoA-I是血浆高密度脂蛋白(HDL)的主要载脂蛋白，与HDL的生理功能密切相关，是HDL抗动脉粥样硬化病(AS)功能的主要承担者。国外研究表明，apoA-I缺乏导致动脉粥样硬化和增加炎症。本发明所制得的高纯度apoA-I在动脉粥样硬化的治疗以及抗内毒素抗炎症药物、肝脏靶向药物等方面均有较好的应用前景。
本发明的主要优点在于：
1、所提供的纯化apoA-I的方法具有很高的特异性，apoA-I收率高；
2、纯化过程不需使用有机溶剂，操作安全方便；
3、设备要求低、工艺步骤少，节约成本；
4、中试试验证明，通过简单的增大层析柱尺寸即可很容易的实现工艺放大，纯化结果完全保持一致，非常适合工业化生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
制备apoA-I①
组份四0.2克，层析柱采用5ml DEAE阴离子交换预装柱(购自GEHealthcare公司)，纯化设备为AKTA EXPLORER 100(购自GE Healthcare公司)，电导测定采用AKTA EXPLORER 100自带的电导检测装置。
(1)组份四沉淀预处理
0.2克组份四沉淀于4℃溶于100ml pH7.8的Tris缓冲液，并加入尿素至终浓度6mol/L，充分混匀。8000rpm离心除去不溶性杂质，然后用0.45μm滤膜过滤。
(2)第一次DEAE阴离子交换柱层析
DEAE柱以含6mol/L尿素Tris缓冲液(pH7.8)平衡，步骤(1)的过滤液以1ml/min流速流过DEAE阴离子交换层析柱，apoA-I与杂蛋白均结合到层析柱上。
以含6mol/L尿素的Tris缓冲液(电导为3.5ms/cm，pH7.8)洗涤DEAE层析柱，apoA-I首先被洗脱下来，洗脱液体积约20ml；再以四种不含尿素的pH7.8Tris缓冲液(电导分别为4.3ms/cm，5.4ms/cm，6.7ms/cm，59.2ms/cm)洗涤DEAE层析柱，将绝大部分杂质洗脱下来。
洗脱曲线及SDS-PAGE电泳结果见附图2和3。
(3)第二次DEAE阴离子交换柱层析
apoA-I洗脱液(含apoA-I，尿素及微量杂蛋白，电导3.5，pH7.8)以纯水5倍稀释，上DEAE阴离子交换层析柱(流速1ml/min)，apoA-I与微量杂蛋白结合到层析柱上。
以不含尿素的Tris缓冲液(电导为11.7ms/cm，pH7.8)洗涤DEAE层析柱，微量杂蛋白被首先洗脱下来；再以不含尿素的Tris缓冲液(电导为85.2ms/cm，pH7.8)洗涤DEAE层析柱，将apoA-I洗脱下来。
经SDS-PAGE电泳检测，获得了电泳纯的apoA-I，而杂蛋白溶液中不含apoA-I(图4)。
实施例2
制备apoA-I②
称取组份四0.2克，实验设备同实施例1。
(1)组份四沉淀预处理
0.2克组份四沉淀于4℃溶于100ml pH7.8的Tris缓冲液，并加入尿素至终浓度1mol/L，充分混匀。8000rpm离心除去不溶性杂质，然后用0.45μm滤膜过滤。
(2)第一次DEAE阴离子交换柱层析
DEAE柱以含1mol/L尿素Tris缓冲液(pH7.8)平衡，步骤(1)的过滤液以1ml/min流速流过DEAE阴离子交换层析柱，apoA-I与杂蛋白均结合上柱。
以含1mol/L尿素的Tris缓冲液(电导为3.5ms/cm，pH7.8)洗脱apoA-I，洗脱液体积约20ml；再以pH7.8电导59.2ms/cm的Tris缓冲液洗涤DEAE层析柱，将绝大部分杂质洗脱下来。
(3)第二次DEAE阴离子交换柱层析
方法同实施例1，纯化结果见图6。
实施例3
制备apoA-I③
称取组份四0.2克，实验设备同实施例1。
(1)组份四沉淀预处理
0.2克组份四沉淀于4℃溶于100ml pH7.8的Tris缓冲液，并加入尿素至终浓度8mol/L，充分混匀。8000rpm离心除去不溶性杂质，然后用0.45μm滤膜过滤。
(2)第一次DEAE阴离子交换柱层析
DEAE柱以含8mol/L尿素Tris缓冲液(pH7.8)平衡，步骤(1)的过滤液以1ml/min流速流过DEAE阴离子交换层析柱，apoA-I与杂蛋白均结合上柱。
以含8mol/L尿素的Tris缓冲液(电导为3.5ms/cm，pH7.8)洗脱apoA-I，洗脱液体积约20ml；再以pH7.8电导59.2ms/cm的Tris缓冲液洗涤DEAE层析柱，将绝大部分杂质洗脱下来。
(3)第二次DEAE阴离子交换柱层析
方法同实施例1，纯化结果见图7。
实施例4
放大(中试)制备apoA-I
组份四60克，DEAE阴离子交换层析柱体积1500ml(购自上海锦华层析设备厂)，层析填料DEAE Sepharose FF(购自GE Healthcare公司)，纯化设备为国产蠕动泵和紫外检测仪(购自上海锦华层析设备厂)，电导测定采用AKTAEXPLORER 100上的电导检测装置(购自GE Healthcare公司)。
(1)组份四沉淀预处理
60克组份四沉淀于4℃溶于30L pH7.8的Tris缓冲液，并加入尿素至终浓度6mol/L，充分混匀。8000rpm离心除去不溶性杂质，然后用0.45μm滤膜过滤。
(2)第一次DEAE阴离子交换柱层析
DEAE柱以含6mol/L尿素Tris缓冲液(pH7.8)平衡，步骤(1)的过滤液以1ml/min流速流过DEAE阴离子交换层析柱，apoA-I与杂蛋白均结合到层析柱上。
以含6mol/L尿素的Tris缓冲液(电导为3.7ms/cm，pH7.8)洗涤DEAE层析柱，apoA-I首先被洗脱下来，洗脱液体积约10L；再以不含尿素的pH7.8Tris缓冲液(电导为80.3ms/cm)洗涤DEAE层析柱，洗脱绝大部分杂质。
(3)第二次DEAE阴离子交换柱层析
apoA-I洗脱液(含apoA-I，尿素及微量杂蛋白，电导3.7ms/cm，pH7.8)以纯水5倍稀释，上DEAE阴离子交换层析柱(流速1ml/min)，apoA-I与微量杂蛋白结合到层析柱上。
以不含尿素的Tris缓冲液(电导为12.2ms/cm，pH7.8)洗涤DEAE层析柱，微量杂蛋白被首先洗脱下来；再以不含尿素的Tris缓冲液(电导为50.4ms/cm，pH7.8)洗涤DEAE层析柱，将apoA-I洗脱下来。
经SDS-PAGE电泳结果见图5。结果表明，放大后同样可获得电泳纯的apoA-I，而且杂蛋白溶液中不含apoA-I。
实施例5
apoA-I蛋白测定
用太阳生物技术公司的apoA-I免疫浊度试剂盒检测实施例1所制得的apoA-I①蛋白。
取10μl纯化得到的蛋白样品，加入1ml apoA-I抗血清，于37℃孵育15min，在波长505nm下检测吸光度，检测结果该蛋白样品为apoA-I蛋白。
实施例6-8
apoA-I蛋白测定
同实施例5所述的方法，用太阳生物技术公司的apoA-I免疫浊度试剂盒检测实施例2、3所制得的apoA-I②、③及实施例4所制得的apoA-I蛋白。
结果类似。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (10)

1.一种获得载脂蛋白A-I的方法，其特征在于，它包括步骤：
a.将经Cohn低温乙醇法获得的组份四和1-8M的尿素混合形成组份四预处理溶液；
b.步骤a得到的组份四预处理溶液流过阴离子交换层析柱后，用含1-8M尿素，电导值1-4ms/cm的缓冲液I洗涤层析柱，得到含初步纯化的载脂蛋白A-I的洗脱液I；
c.洗脱液I流过阴离子交换层析柱，用电导值1-15ms/cm的缓冲液II洗脱杂质后用电导30-100ms/cm的缓冲液III洗脱下纯化的载脂蛋白A-I。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a、b中所述的尿素浓度为3-8M。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a、b中所述的尿素浓度为5-7M。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，缓冲液I的电导值为2-4ms/cm；缓冲液II的电导值为7-15ms/cm；缓冲液III的电导值为70-95ms/cm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析柱为弱酸性或弱碱性阴离子交换层析柱。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中组份四和尿素的重量比为1∶30-300。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b、c中的洗脱缓冲液I、II或III中含有NaCl、KCl、MgCl2或CaCl2。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a和b之间还包括步骤a’：将组份四预处理溶液离心除不溶性杂质，并用滤膜过滤。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b和c之间还包括步骤b’：用电导值4.5-70ms/cm的缓冲液IV洗脱除去大部分杂质。
10.如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述的各缓冲液pH7.2-8.5。
CN200610147503A 2006-12-20 2006-12-20 高纯度载脂蛋白a-i的制备方法 Active CN100586958C (zh)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200610147503A CN100586958C (zh) 2006-12-20 2006-12-20 高纯度载脂蛋白a-i的制备方法
CA2673516A CA2673516C (en) 2006-12-20 2007-09-19 Method of purifying apolipoprotein a-1
MYPI20092514A MY154897A (en) 2006-12-20 2007-09-19 Method of purifying apolipoprotein a-1
EP07861342.9A EP2125861B1 (en) 2006-12-20 2007-09-19 Method of purifying apolipoprotein a-1
PCT/US2007/020258 WO2008088403A2 (en) 2006-12-20 2007-09-19 Method of purifying apolipoprotein a-1
KR1020097014720A KR101363106B1 (ko) 2006-12-20 2007-09-19 아포리포 단백질 ａ-1 정제 방법
MX2009006766A MX2009006766A (es) 2006-12-20 2007-09-19 Metodo de purificacion de apolipoproteina a-1.
RU2009127816/04A RU2453555C2 (ru) 2006-12-20 2007-09-19 Способ очистки аполипопротеина а-1
BRPI0721238A BRPI0721238B8 (pt) 2006-12-20 2007-09-19 método de purificação da apolipoproteina a-1
JP2009542756A JP2010513480A (ja) 2006-12-20 2007-09-19 アポリポ蛋白ａ−１の精製方法
TW096145616A TWI357347B (en) 2006-12-20 2007-11-30 Method of purifying apolipoprotein a-1
EG2009060940A EG26516A (en) 2006-12-20 2009-06-18 Method to purify the fatty protein core A-1
US12/457,796 US8013122B2 (en) 2006-12-20 2009-06-22 Method of purifying apolipoprotein A-1
AU2009202827A AU2009202827B8 (en) 2006-12-20 2009-07-14 Method of purifying apolipoprotein A-1

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200610147503A CN100586958C (zh) 2006-12-20 2006-12-20 高纯度载脂蛋白a-i的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101205250A true CN101205250A (zh) 2008-06-25
CN100586958C CN100586958C (zh) 2010-02-03

Family

ID=39565747

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200610147503A Active CN100586958C (zh) 2006-12-20 2006-12-20 高纯度载脂蛋白a-i的制备方法

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP2125861B1 (zh)
JP (1) JP2010513480A (zh)
KR (1) KR101363106B1 (zh)
CN (1) CN100586958C (zh)
AU (1) AU2009202827B8 (zh)
BR (1) BRPI0721238B8 (zh)
CA (1) CA2673516C (zh)
EG (1) EG26516A (zh)
MX (1) MX2009006766A (zh)
MY (1) MY154897A (zh)
RU (1) RU2453555C2 (zh)
TW (1) TWI357347B (zh)
WO (1) WO2008088403A2 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011085598A1 (zh) * 2010-01-15 2011-07-21 上海莱士血液制品股份有限公司 从血浆组分四沉淀中制备高纯ApoA-Ⅰ的生产工艺
CN102731642A (zh) * 2011-04-14 2012-10-17 上海莱士血液制品股份有限公司 从人血浆组分四沉淀制备高纯Apoa-I的生产工艺
CN103505720A (zh) * 2012-06-30 2014-01-15 复旦大学 载脂蛋白a-i在制备预防和治疗肝病代谢综合征药物中的用途
CN105396122A (zh) * 2010-06-30 2016-03-16 杰特有限公司 重建高密度脂蛋白制剂及其生产方法
CN107033237A (zh) * 2017-05-11 2017-08-11 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种人血浆载脂蛋白a‑i的分离纯化方法
CN111153985A (zh) * 2020-01-20 2020-05-15 宁波赛珀生物技术有限公司 血清载脂蛋白a-ii的分离纯化方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120177610A1 (en) * 2007-09-19 2012-07-12 Kieu Hoang Manufacturing and Purification Processes of Complex Protein found in Fraction IV to make a separated Apo, Transferrin , and Alpha 1 Anti strepsin (A1AT) or A combined Transferrin / Apo/Human Albumin/A1AT and all new found proteins
CN103492852B (zh) * 2011-04-28 2016-08-17 独立行政法人理化学研究所 生物材料的透明化方法、及其利用
CN107300496B (zh) 2011-05-20 2020-11-24 国立研究开发法人理化学研究所 生物材料用透明化试剂、及其利用
EP2748178B1 (en) 2011-08-25 2018-10-31 F. Hoffmann-La Roche AG Cation and anion exchange chromatography method
US9534029B2 (en) 2012-10-03 2017-01-03 Csl Behring Ag Method of purifying proteins
WO2015022883A1 (ja) 2013-08-14 2015-02-19 独立行政法人理化学研究所 光透過性に優れた生物材料を調製するための組成物およびその利用
CN110590935B (zh) * 2019-09-23 2024-01-30 华兰生物工程重庆有限公司 人血白蛋白去除多聚体工艺

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1752187A3 (ru) * 1990-12-11 1992-07-30 А.Б.Сигалов Способ делипидировани лиофилизированных липопротеинов высокой плотности из сыворотки крови человека
WO1993000443A1 (en) * 1991-06-26 1993-01-07 Bio-Technology General Corp. Purification of recombinant apolipoprotein e from bacteria
SE9500778D0 (sv) * 1995-03-03 1995-03-03 Pharmacia Ab Process for producing a protein
SE9603068D0 (sv) * 1996-08-23 1996-08-23 Pharmacia & Upjohn Ab Process for purifying a protein
US6953840B2 (en) * 2002-07-30 2005-10-11 Esperion Therapeutics, Inc. Methods of using non-human animal Apolipoprotein A-I protein

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011085598A1 (zh) * 2010-01-15 2011-07-21 上海莱士血液制品股份有限公司 从血浆组分四沉淀中制备高纯ApoA-Ⅰ的生产工艺
CN102127165B (zh) * 2010-01-15 2013-09-04 上海莱士血液制品股份有限公司 一种从血浆组分四沉淀中制备高纯ApoA-I的生产工艺
CN105396122A (zh) * 2010-06-30 2016-03-16 杰特有限公司 重建高密度脂蛋白制剂及其生产方法
CN105396122B (zh) * 2010-06-30 2020-09-11 杰特有限公司 重建高密度脂蛋白制剂及其生产方法
CN102731642A (zh) * 2011-04-14 2012-10-17 上海莱士血液制品股份有限公司 从人血浆组分四沉淀制备高纯Apoa-I的生产工艺
CN102731642B (zh) * 2011-04-14 2014-01-29 上海莱士血液制品股份有限公司 从人血浆组分四沉淀制备高纯Apoa-I的生产工艺
CN103505720A (zh) * 2012-06-30 2014-01-15 复旦大学 载脂蛋白a-i在制备预防和治疗肝病代谢综合征药物中的用途
CN107033237A (zh) * 2017-05-11 2017-08-11 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种人血浆载脂蛋白a‑i的分离纯化方法
CN111153985A (zh) * 2020-01-20 2020-05-15 宁波赛珀生物技术有限公司 血清载脂蛋白a-ii的分离纯化方法
CN111153985B (zh) * 2020-01-20 2023-06-13 宁波赛珀生物技术有限公司 血清载脂蛋白a-ii的分离纯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
MY154897A (en) 2015-08-28
EP2125861A2 (en) 2009-12-02
CA2673516A1 (en) 2008-07-24
EP2125861B1 (en) 2014-07-16
EG26516A (en) 2014-01-08
BRPI0721238A2 (pt) 2015-06-23
WO2008088403A3 (en) 2008-11-06
KR101363106B1 (ko) 2014-02-13
BRPI0721238B8 (pt) 2021-05-25
CA2673516C (en) 2013-10-08
MX2009006766A (es) 2009-08-12
RU2009127816A (ru) 2011-01-27
TWI357347B (en) 2012-02-01
EP2125861A4 (en) 2011-02-02
AU2009202827A8 (en) 2012-03-08
CN100586958C (zh) 2010-02-03
JP2010513480A (ja) 2010-04-30
AU2009202827A1 (en) 2009-08-06
AU2009202827B8 (en) 2012-03-08
AU2009202827B2 (en) 2011-12-15
TW200922675A (en) 2009-06-01
WO2008088403A2 (en) 2008-07-24
KR20090116706A (ko) 2009-11-11
RU2453555C2 (ru) 2012-06-20
BRPI0721238B1 (pt) 2018-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100586958C (zh) 高纯度载脂蛋白a-i的制备方法
US11066441B2 (en) Method for separating and purifying α2-macroglobulin from Cohn Fraction IV precipitation
Geng et al. Co-purification of chicken egg white proteins using polyethylene glycol precipitation and anion-exchange chromatography
CN102127165B (zh) 一种从血浆组分四沉淀中制备高纯ApoA-I的生产工艺
CN103539831B (zh) 山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途
CN103539833B (zh) 高活性α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途
CN107216228B (zh) 一种低共熔溶剂及用于提取大黄中蒽醌的方法
CN108373499B (zh) 一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法
CN103725664B (zh) 一种高度纯化激肽释放酶的方法
CN102977180A (zh) 一种综合利用Cohn组分IV的方法
CN106167522A (zh) 一种大规模分离纯化特立帕肽（Teriparatide）的方法
US8013122B2 (en) Method of purifying apolipoprotein A-1
CN103833840A (zh) 一种从人血浆中提取高密度脂蛋白及分离纯化载脂蛋白apoA-I的方法
CN102731642B (zh) 从人血浆组分四沉淀制备高纯Apoa-I的生产工艺
CN107033237A (zh) 一种人血浆载脂蛋白a‑i的分离纯化方法
CN107056913A (zh) 一种制备蜂毒肽的方法
CN105223296A (zh) 一类多肽的纯化方法
CN102757479B (zh) 高活性降血压肽及其制备方法
Hazra et al. Large-scale crystallization as an intermediate processing step in insulin downstream process: explored advantages and identified tool for process intensification
CN106632615B (zh) 一种升压素溶液的提取工艺
CN104480091A (zh) 一种高度纯化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的药物组合物
CN113563424B (zh) 一种达托霉素的纯化方法
CN114315932B (zh) 一种两性霉素b的杂质a或杂质b的分离纯化方法
CN1116303C (zh) 一种植物血球凝集素简便分离纯化技术及其晶体生长
CN118852395A (zh) 一种人血清中天然α2巨球蛋白高纯抗原的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant