CN105396122B

CN105396122B - 重建高密度脂蛋白制剂及其生产方法

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Publication number: CN105396122B
Application number: CN201510593566.4A
Authority: CN
Inventors: S·莱特; M·伊姆波登; R·波利; M·韦尔希里
Original assignee: Jeter Ltd
Current assignee: Jeter Ltd
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2031-06-30
Also published as: CN103118683A; US9439946B2; ES2718234T3; US10335457B2; CN103118683B; DK2588113T3; JP5989641B2; US8999920B2; WO2012000048A1; CA2803031A1; US20170196935A1; CN105396122A; HUE032560T2; AU2011274238A1; US20130190226A1; US11723953B2; KR101782309B1; US20200171126A1; EP2588113B1; TWI531388B

Abstract

一种重建的具有相对低毒性的高密度脂蛋白制剂包含载脂蛋白(如ApoAI)或其片段、脂质和去污剂，去污剂的水平为给予人时通常引起肝毒性的去污剂水平的约5‑50％。脂质最好为约30‑50g/L的磷脂酰胆碱，并且载脂蛋白:脂质的摩尔比最佳在1:40至1:75的范围内。该制剂可用于治疗疾病或病症，如心血管疾病、高胆甾醇血症或低胆甾醇血症，包括急性冠脉综合征(ACS)、动脉粥样硬化和心肌梗死。

Description

重建高密度脂蛋白制剂及其生产方法

本申请是申请日为2011年6月30日、申请号为201180036314.1、发明名称为“重建高密度脂蛋白制剂及其生产方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及重建的高密度脂蛋白制剂。更特别地，本发明涉及毒性降低的重建高密度脂蛋白制剂。

背景

高密度脂蛋白(HDL)是一类含有脂质和蛋白质的异源脂蛋白，其特征在于高密度(>1.063g/mL)和小的尺寸(Stoke’s直径＝5至17nm)。各种HDL亚类的脂质、载脂蛋白、酶和脂质转移蛋白的含量和质量不同，导致形状、密度、大小、电荷和抗原性的不同。载脂蛋白A-I(Apo-AI)是主要的HDL蛋白，尽管可能存在其他载脂蛋白，如Apo-AII和Apo-V。

流行病学和临床研究已经确定了高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平与心血管疾病风险之间的逆相关(Assmann等的综述，2004，Circulation 109III-8)。更特别地，重建HDL制剂的临床给药已经显示出能给患有近期急性冠脉综合征(ACS)的患者提供益处。

通常，这样的重建HDL制剂包含如Apo-AI这样的蛋白质，如磷脂酰胆碱这样的脂质以及如胆酸盐或脱氧胆酸盐这样的去污剂。此外，可以包括胆固醇。如美国专利5,652,339中公开的，不使用有机溶剂生产重建的HDL制剂是有利的，在某些情况下，生产重建HDL制剂时，有机溶剂用于溶解脂质成分(例如，磷脂酰胆碱)。在临床上试验了这种类型的称为CSL-111的重建HDL制剂，但早在肝功能测试异常后就没有继续较高剂量的治疗了。用CSL111治疗的患者在斑块负荷指数中显示出有益趋势。然而，与安慰剂比较时，在动脉粥样化体积的百分比变化或斑块体积的标称变化中没有获得统计学显著性(Tardif等，2007，JAMA-Exp.297E1)。

概述

本发明的目的是提供一种重建的HDL制剂，其减轻或避免了现有技术重建HDL制剂的一个或多个缺点。

本发明的优选目的是提供一种毒性降低或最小化的重建HDL制剂。

本发明的另一个优选目的是提供一种重建HDL制剂，其在包括但不限于冠状动脉粥样硬化的疾病或病症的预防性和/或治疗性处理中是有效的。

本发明宽泛地涉及一种脂蛋白制剂，其包含载脂蛋白、磷脂和去污剂，其水平是无毒的，或至少呈现出相对低的毒性。在特定的实施方案中，去污剂和脂质的水平处于低于引起、导致肝毒性或与肝毒性相关的水平。

在一个方面中，本发明提供了一种重建高密度脂蛋白(rHDL)制剂，其包含载脂蛋白或其片段；脂质；和去污剂，其水平为给予人时呈现出肝毒性的rHDL制剂中存在的去污剂水平的约5-50％。

在另一个方面中，本发明提供了一种生产包含载脂蛋白；脂质；和去污剂的rHDL制剂的方法，所述方法包括提供所述去污剂的步骤，所述去污剂的水平为给予人时呈现出肝毒性的rHDL制剂中存在的去污剂水平的约5-50％。

在再另一个方面中，本发明提供了一种治疗人疾病、障碍或病症的方法，包括将根据本发明第一个方面的rHDL或根据第二个方面的方法生产的rHDL给予人的步骤，以由此治疗人的所述疾病、障碍或病症。

在再另一个方面中，本发明提供了根据第一个方面的rHDL制剂或根据第二个方面的方法生产的rHDL制剂，用于治疗人的疾病、障碍或病症。

优选地，去污剂的水平为呈现出肝毒性的去污剂水平的约5-10％。在某些实施方案中，这等于约0.03g/g载脂蛋白。

优选地，去污剂是胆汁盐或胆汁酸。更优选地，去污剂是胆酸钠。

载脂蛋白可以是高密度脂蛋白(HDL)的常规和/或功能性成分的任何脂蛋白。载脂蛋白优选为约20-50g/L的浓度。优选地，载脂蛋白是Apo-A1或其片段。

合适地，脂质的水平为引起肝毒性或与肝毒性相关的脂质水平的约20-70％。优选地，脂质浓度为约30-60g/L。特别有利的脂质浓度为约30-50g/L，或在某些实施方案中，约34或47g/L。

优选地，脂质是磷脂。更优选地，磷脂是或包含磷脂酰胆碱(PC)。

在一个优选的实施方案中，载脂蛋白:脂质的摩尔比在1:20至1:100的范围中。更优选地，载脂蛋白:脂质的摩尔比在1:40至1:75的范围中。载脂蛋白:脂质特别有利的比例为约1:40或1:55。

合适地，rHDL制剂进一步包含稳定剂。优选地，稳定剂是糖，如蔗糖。优选的浓度为约65-85g/L rHDL制剂。

在整个说明书中，除非文中另外需要，词语“包含(comprise)”，“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为表示包含所述的整体或整体组，但不排除任何其他整体或整体组。

附图简述

参照以下附图，其有助于理解下文详细描述的本发明的非限制性实施方案，其中：

图1显示了急性大鼠研究的结果，表明胆酸盐和磷脂酰胆碱的同时减少降低了肝毒性；

图2显示出急性大鼠研究的结果，表明了胆酸盐的选择性减少降低了肝毒性；

图3显示出在不同浓度的胆酸盐存在下，CSL111的浊度分析结果；

图4显示出在冷冻干燥和重建后，在不同浓度的胆酸盐的存在下，CSL111的浊度结果；

图5显示出在室温下(RT)，重建HDL 1:50PC的浊度分析结果；

图6显示出在37℃下，重建HDL 1:50PC的浊度分析结果；

图7显示出在RT下，重建HDL 1:75PC的浊度分析结果；

图8显示出在37℃下，重建HDL 1:75PC的浊度分析结果；和

图9提供了rHDL制剂制造方法的实施方案的概览。

详述

本发明至少部分地源于出乎意料的发现：在现有技术中所述的由CSL111重建HDL(rHDL)制剂呈现的肝毒性是由于过量的去污剂引起的，特别是就制剂中的去污剂与Apo-AI的比例来考虑时。在这点上，胆酸钠的水平为约0.3g/g Apo-AI。然而，本发明人还发现了不能全部消除去污剂并且必须保留一定水平，由此rHDL制剂呈现出充分的稳定性和治疗活性。

此外，出乎意料地发现了与CSL111中存在的相比，脂质浓度的降低减轻了肝毒性，而基本上没有损害rHDL制剂的治疗活性。

在进一步的发现中，鉴定出对rHDL制剂最佳的载脂蛋白:脂质的摩尔比。

因此，在一个方面中，本发明提供了一种rHDL制剂，其包含载脂蛋白或其片段；脂质和一定水平的去污剂，所述去污剂的水平为给予人时呈现出肝毒性的rHDL制剂中存在的去污剂水平的约5-50％。

如在此所用的，“重建HDL(rHDL)”制剂可以是功能上与血浆中通常存在的高密度脂蛋白(HDL)相似、类似、相应或模拟的任何人工生产的脂蛋白制剂或组合物。rHDL制剂包括在“HDL模拟物”和“合成HDL颗粒”的范围内。

关于这点，“将rHDL制剂给予人时呈现出肝毒性”意思是给予人后rHDL制剂中存在的去污剂水平引起、导致此后的不利事件或至少与此后的不利事件相关。通常，不利事件是肝毒性，如通过异常或受损的肝功能所证实的。异常或受损的肝功能的非限制性实例包括升高的丙氨酸转氨酶活性(ALT)、升高的天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性和/或升高的胆红素水平。根据本发明，不会引起、导致不利事件或与不利事件无关的去污剂的合适水平，如前所述。通常，这将在灌输结束时进行测量。

优选地，去污剂的水平为呈现肝毒性的去污剂水平的约5-35％。该范围包括，例如，5％，10％，15％，20％，25％，30％和35％。更优选地，去污剂的水平为呈现肝毒性的去污剂水平的约5-20％。有利地，去污剂的水平为呈现肝毒性的去污剂水平的约5-10％。优选地，这些水平以呈现肝毒性的去污剂的最小或极限水平来表示。

例如，形成本发明的工作中已经显示出引起、导致肝毒性或至少与肝毒性相关的去污剂水平为0.3g/g Apo-AI或6g/L rHDL制剂(20g/L Apo-AI)。因此，5-10％的该去污剂水平为0.015-0.03g/g Apo-AI或0.5-0.9g/L rHDL制剂(30g/L Apo-AI)。

去污剂的“水平”可以是去污剂的绝对量、去污剂的浓度(例如，每单位体积rHDL制剂的质量)和/或去污剂的量或浓度相对于rHDL制剂的成分的另一个量或浓度的比例。只是举例，去污剂的水平可以用rHDL制剂中存在的载脂蛋白(例如，Apo-AI)的总质量来表示。

尽管安全性和肝毒性的避免是本发明的一个目的，但本发明还需要足以维持rHDL制剂稳定性的去污剂水平。如将在实施例中更详细描述的，不低于约0.45g/L rHDL制剂(具有30g/L载脂蛋白)的去污剂浓度就稳定性和无毒性两者而言是最佳的。可以通过本领域已知的任何方式来有利地测量稳定性，尽管rHDL制剂的浊度是优选的测量方式。

去污剂可以是适用于rHDL制剂中的任何离子型(例如，阳离子、阴离子、两性离子)去污剂或非离子去污剂，包括胆汁酸及其盐。离子型去污剂可以包括胆汁酸及其盐、聚山梨酸酯(例如，PS80)、CHAPS、CHAPSO、鲸蜡基三甲基-溴化铵、月桂酰肌氨酸、叔-辛基苯基丙烷磺酸和4’-氨基-7-苯甲酰胺基-牛磺胆酸。

胆汁酸通常是具有24个碳的二羟基化或三羟基化类固醇，包括胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸或熊果脱氧胆酸。优选地，去污剂是胆汁盐，如胆酸盐、脱氧胆酸盐、鹅脱氧胆酸盐或熊果脱氧胆酸盐。特别优选的去污剂是胆酸钠。

载脂蛋白可以是天然产生的HDL或重建高密度脂蛋白(rHDL)的功能性的、生物活性成分的任何载脂蛋白。通常，载脂蛋白是血浆衍生的或是重建的载脂蛋白，如Apo-AI、Apo-AII或Apo-AV、前-apo-AI或变体，如Apo-AI Milano。优选地，载脂蛋白是Apo-AI。还考虑了载脂蛋白的生物活性片段。片段可以是天然产生的、化学合成的或重组的。只是举例，Apo-AI的生物活性片段优选具有至少50％，60％，70％，80％，90％或95-100％乃至高于100％的Apo-AI的卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)刺激活性。

合适地，载脂蛋白的浓度为约20-50g/L。这包括20，25，30，35，40，45和50g/L以及这些含量之间的任何范围。载脂蛋白优选浓度为约30g/L。

rHDL制剂包含其水平不会引起肝毒性的脂质。合适地，脂质的水平为引起肝毒性或与肝毒性相关的约20-70％。在特定的实施方案中，脂质的水平优选为引起肝毒性或与肝毒性相关的脂质水平约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％，以及这些量之间的任何范围。优选地，这些水平以呈现肝毒性的脂质的最小或极限水平来表示。

例如，形成本发明的工作中已经显示出引起、导致肝毒性或至少与肝毒性相关的脂质水平为84g/L。因此，脂质的浓度优选为约30-60g/L。这包括30、35、40、45、50、55和60g/L以及这些量之间的任何范围。特别有利的脂质浓度为约30-50g/L，或在某些实施方案中，为约34或47g/L。

脂质的“水平”可以是脂质的绝对量、脂质的浓度(例如，每单位体积rHDL制剂的质量)和/或脂质的含量或浓度相对于rHDL制剂的成分的另一个量或浓度的比例。只是举例，脂质的水平可以根据rHDL制剂中存在的载脂蛋白(例如，Apo-AI)的摩尔比来表示。

在一个优选实施方案中，载脂蛋白:脂质的摩尔比在1:20至1:100的范围内。该范围包括如1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80和1:90的莫尔比。更优选地，载脂蛋白:脂质的摩尔比在1:40至1:75的范围内。特别有利的载脂蛋白:脂质的比例为约1:40或1:55。

脂质可以是天然产生的HDL或重建高密度脂蛋白(rHDL)的功能性的、生物活性成分的任何脂质。这样的脂质包括磷脂、胆固醇、胆固醇-酯、脂肪酸和/或甘油三酯。优选地，脂质是磷脂。磷脂的非限制性实例包括磷脂酰胆碱(PC)(卵磷脂)、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)(脑磷脂)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)或其天然或合成的衍生物。天然衍生物包括蛋PC、蛋PG、大豆PC、氢化大豆PC、大豆PG、脑PS、鞘脂类、脑SM、半乳糖脑苷脂、神经节苷脂、脑苷脂、脑磷脂、心磷脂和联十六丸剂磷酸酯。合成的衍生物包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二癸酰磷脂酰胆碱(DDPC)、二瓢儿菜基磷脂酰胆碱(DEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰鞘磷脂(DPSM)和二硬脂酰鞘磷脂(DSSM)。磷脂还可以是以上任一种磷脂的衍生物或类似物。

优选地，磷脂是或包含磷脂酰胆碱，单独地或结合一种或多种其他磷脂。另一种磷脂的实例是鞘磷脂。

合适地，rHDL制剂进一步包含稳定剂。特别地，稳定剂可维持rHDL制剂在冷冻干燥过程中的稳定性。合适地，稳定剂是碳水化合物，如糖或糖醇。合适的糖醇的实例是甘露糖醇和山梨糖醇。优选地，稳定剂是双糖，如蔗糖。优选的蔗糖浓度为rHDL制剂的约65-85g/L(等于约6.5-8.5％w/v)。优选地，蔗糖浓度为约75g/L(等于约7.5％w/w)。就绝对项而言和相对于脂蛋白浓度，与CSL111相比，这是降低的蔗糖浓度。提出了这种相对降低的蔗糖可以使得本发明的rHDL制剂有更快速的灌输速度。尽管对其没有限制，但是其他稳定剂可以是或包括氨基酸(例如，甘氨酸、脯氨酸)、抗氧化剂、乳化剂、表面活性剂、螯合剂、明胶、合成油、多元醇、海藻酸盐或任何药物学上可接受的载体和/或赋形剂。在这点上，例如参考“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins(肽和蛋白质的药物制剂研发)”，Frokjaer等，Taylor&；Francis(2000)，“Handbook of PharmaceuticalExcipients(药物赋形剂手册)”，第3版，Kibbe等，Pharmaceutical Press(2000)和国际公开WO2009/025754。

在特别优选的实施方案中，rHDL制剂包含：

(i)约30g/L Apo-AI；

(ii)约0.03g胆酸钠/g Apo-AI；

(iii)约34或47g/L磷脂酰胆碱；和

(iv)约75g/L蔗糖；

其中Apo-AI:磷脂酰胆碱的摩尔比为约1:40或1:55。

优选地，所述方法包括提供所述去污剂的步骤，所述去污剂的水平为给予人时呈现肝毒性的去污剂水平的约5-10％。

在该方法的优选实施方案中，将去污剂的初始或起始水平降低或去除至将rHDL制剂给予人时没有呈现肝毒性的水平。

可以通过本领域已知的任何方式，例如包括过滤、疏水性吸附或亲水性相互作用色谱、渗析、离子交换吸附和离子交换色谱，来进行去污剂的降低或去除。

在一些实施方案中，非极性聚苯乙烯树脂适用于降低去污剂水平。这样的树脂优选是交联共聚物的形式(例如，交联的苯乙烯和二乙烯基苯共聚物)。非限制性实例包括Amberlite XAD-2和Bio Beads SM。

如本领域公知的，过滤包括凝胶过滤、凝胶渗透、渗滤和超滤，尽管不限于此。凝胶渗透的非限制性实例可以利用多孔的、交联葡聚糖，如Sephadex树脂。

在特别适用于大规模制造的特别优选的实施方案中，通过渗滤来降低去污剂水平。

合适地，该方法包括在有机溶剂不存在的情况下将脂质和载脂蛋白混合的步骤。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种生产rHDL制剂的方法，包括步骤：

(I)将不含有机溶剂的磷脂酰胆碱和胆酸盐去污剂加入Apo-AI溶液中；

(II)将步骤(I)产生的溶液中的胆酸盐去污剂水平降至约0.03g/g Apo-AI；

(III)将稳定剂，优选蔗糖，加入步骤(II)的溶液中。

优选地，在步骤(I)中，加入磷脂酰胆碱，使得Apo-AI:磷脂酰胆碱比例为约1:40或1:55。

优选地，步骤(III)中蔗糖的终浓度为约75g/L。

合适地，该方法进一步包括将步骤(III)产生的rHDL制剂冷冻干燥的步骤(IV)。

将认识到在特定的实施方案中，生产rHDL制剂的方法适用于质量和安全性适用于给予人的rHDL制剂的大规模、商业制造。图9中概述了大规模、商业制造方法的非限制性实例。

在另一个方面中，本发明提供了治疗人疾病、障碍或病症的方法，包括将之前所述的rHDL或根据之前所述的方法产生的rHDL给予人的步骤，以由此治疗所述的人疾病、障碍或病症。

本发明还提供了如之前所述的或根据之前所述的方法生产的rHDL制剂，用于治疗人的疾病、障碍或病症。

合适地，所述疾病、障碍或病症响应所述rHDL制剂的预防性或治疗性给药。这些疾病、障碍或病症的非限制性实例包括心血管疾病(例如，急性冠脉综合征(ACS，动脉粥样硬化和心肌梗死))或以下的疾病、障碍或病症，如糖尿病、中风或倾向于ACS的心肌梗死、高胆甾醇血症(例如，升高的血清胆固醇或升高的LDL胆固醇)以及由降低水平的高密度脂蛋白(HDL)引起的低胆甾醇血症，如为Tangier病的症状。

可以通过本领域已知的任一种给药途径来给予rHDL制剂。通常，将rHDL制剂通过非肠道，如通过静脉内灌输或注射来给药。

rHDL制剂的给药剂量可以在1-120mg/kg体重的范围内。优选地，该剂量在5-80mg/kg的范围内，包括10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg和70mg/kg剂量。

所以参照以下非限制性实施例可以完全理解本发明的优选实施方案并付诸实践。

实施例

下文中提供的实施例描述了确定rHDL制剂(如CSL111)的哪些因素引起肝毒性的最初研究(实施例1&2)以及本发明rHDL制剂的实施方案的开发和毒性测试(实施例3至8)。

实施例1

比较不同Apo-AI:PC比例的肝毒性研究和控制胆酸盐水平的作用

对含有不同Apo AI:PC比例(1:150、1:100&1:50)的HDL制剂，在大鼠模型中(参见以下实施例2中的模型详情)测定了通过ALT活性测量的肝毒性水平。每种HDL制剂含有不同的胆酸盐浓度，其水平范围从1:150制剂的6g/L至1:50制剂的1.1g/L。

结果表明了对1:150HDL制剂，从300mg/kg开始的剂量，观察到了提高的ALT水平。1:100HDL制剂从400mg/kg剂量开始，引起了提高的ALT水平，在600mg/kg水平显著提高。相反，对1:50HDL制剂，直至600mg/kg剂量，也没有观察到ALT活性的提高(图1)。这些结果表明通过HDL制剂中的PC水平和/或胆酸盐水平降低了肝毒性。为了研究是否是胆酸盐的水平对ALT活性具有直接作用，进行了进一步的研究，其中将CSL111的胆酸盐耗尽。结果证明了当以300mg/kg灌输给大鼠时，CSL111制剂中的胆酸盐的降低导致了ALT水平的降低(图2)。此外，如果之后将胆酸盐加回耗尽的HDL制剂中，以300mg/kg灌输给大鼠时，重新补充的HDL制剂引起提高的ALT水平(图2)。这些研究证明了将胆酸盐降至约1g/L实质性地降低了rHDL毒性，但还有另外的作用因素是PC降至约1:50apoAI:PC的比例。

实施例2

比较分级的胆酸盐水平和Apo-AI:PC比例的肝毒性研究

介绍

该研究的目的是为了确定具有分级的胆酸盐浓度和如下的Apo A-I与PC比例的重建HDL制剂(rHDL)肝中毒，rHDL PC 1:150(3g/L胆酸盐)、rHDL PC 1:100(1g/L胆酸盐)、rHDL PC 1:50(3g/L胆酸盐)、rHDL PC 1:50(0.2g/L胆酸盐)。将有意的大鼠模型用于测定上述制剂对肝功能的影响。通过测定血清中肝酶活性(ALT和AST)来评价肝中毒。

认为Apo-AI是制剂的活性成分，并且Apo-AI的血浆水平是暴露的关键指示。

材料和方法

测试rHDL制剂的给药

测试rHDL制剂1

测试rHDL制剂2

测试rHDL制剂3

测试rHDL制剂4

研究设计

将该研究设计为总共14只大鼠的开放式四臂试验。剂量给药方案概括于表1中。

处理组

表1：处理组

实验动物

将动物置于约束装置(大鼠固定器)中，并且用静脉内导管刺破侧尾静脉。将测试物质灌输60/120分钟。

从眶后静脉复合物中采取血样并且在基线、静脉内灌输后1小时/2小时和7小时/8小时时收集至血清管中。将血样加工成血清，存储在-20℃。

肝酶的测定

使用可购得的酶测光测试盒(Greiner Biochemica)分析样品的AST和ALT活性。

Apo A-I血浆水平的测定

通过浊度试验进行了人Apo A-I水平的测定。

结果

所研究的是具有1:50、1:100和1:150Apo A-I比PC的比例以及限定的1或3g/L胆酸盐浓度或耗尽胆酸盐(0.2g/L)的rHDL制剂。盐水作为载体，并且CSL 111作为阳性对照。在基线(时间点0)和灌输结束(分别1小时或2小时，600和900mg/kg)时以及在7小时或8小时时采取血样。估算上述时间点的肝酶活性(ALT和AST)和人Apo A-I水平。

在基线时的AST浓度范围为63至87U/L。除了Apo AI:PC 1:50(胆酸盐0.2g/L)，对于所有制剂，AST浓度在灌输结束时和在时间点7小时/8小时时升高。

基线时的ALT浓度范围为39至45U/L。除了Apo AI:PC 1:50(胆酸盐0.2g/L)，对于所有制剂，AST浓度在灌输结束和时间点7小时/8小时时升高。

基线时的人Apo A-I浓度低于检测的最低限制。在灌输结束时，对于所有以600mg/kg给药的制剂，浓度提高至大约13g/L。制剂1:50在900mg/kg时导致了15g/L的Apo A-I浓度。

表2至4中给出了所有组的平均和标准偏差、剂量和时间点。

表2：AST血清水平(平均值±SD)

表3：之后的ALT血清水平(平均值±SD)

表4：Apo A-I血清水平(平均值±SD)

结论

总之，只有900mg/kg的Apo AI:PC比例1:50(0.2g/L胆酸盐)的rHDL制剂没有诱发肝功能测试异常。相反，具有较高胆酸盐水平(3g/L)的相同1:50rHDL制剂在600mg/kg时显示出升高的AST和ALT水平。这表明通过控制rHDL制剂的脂质和残留去污剂含量最佳地最小化了肝毒性。

实施例3

比较rHDL制剂中胆酸盐水平的稳定性试验

与现有技术的rHDL制剂CSL111相比，本发明的rHDL制剂的实施方案呈现出降低的肝毒性，同时保持了至少等于CSL111的生物活性。这种rHDL制剂与CSL111不同之处在于较低的蛋白质比PC的比例、较低的胆酸盐水平、较高的蛋白质含量和降低的蔗糖浓度。

重建的HDL制剂

起始材料Apo-AI

作为起始材料，使用了纯化的和巴氏杀菌的Apo-AI溶液。批次大小为30g或35g蛋白质。

脂质溶液

以下给出了用于脂质溶液制造的配方。首先，制得了含有10mM Tris、10mM NaCl和1mM EDTA的缓冲液。根据等式1计算了所需的量。

等式1

接着，将胆酸钠(1.3mol/mol脂质)加入该溶液中，并且溶解。

然后，引入计算量的脂质(等式2)，将混合物温和搅拌6-18小时(脂质溶解)，然后使用预先灭菌的过滤装置0.2μm Millipak 40Gamma Gold(Millipore Art.MPGL04GH2)过滤。

等式2

M(脂质)：对于PC为775g/mol；对于SM为731g/mol

M(Apo-AI)：28’078g/mol

脂质培养和UF/DF

将Apo-AI溶液(30g-35g蛋白质)置于5L双夹套容器中，并且冷却至1-4℃。然后，加入脂质溶液并且在1-4℃下搅拌2-16小时。对于一些实验，将蛋白质-脂质溶液在30℃下加热30分钟，冷却，然后在1-4℃下培养2-16小时。

为了除去胆酸盐，用相对7-9体积的1％蔗糖溶液的10kDa盒进行了UF/DF。

然后将溶液浓缩至22-28g/L(FP中的蛋白质浓度为20g/L)或32-38g/L(FP中的蛋白质浓度为30g/L)并且此后通过加入蔗糖和WFI带至7.5％蔗糖和20g/L或30g/L蛋白质。将rHDL物质无菌过滤(Sartopore 2，150cm²，PES，截留0.1μm，Sartorius Art.5441358K4--00)，并在层流中填充。

使用安珀莱特降低胆酸盐

安珀莱特的制备

所有过滤步骤使用Nalgene 0.2μm PES滤器(Art.595-4520)来进行。

将安珀莱特XAD-2(400g)加入500mL 20％(v/v)甲醇中。将悬浮液搅拌1-2小时，然后将安珀莱特滤掉。接着，将300ml 1M NaOH置于1000mL烧杯中，加入安珀莱特，并且在搅拌下加热至55-60℃，持续15分钟。将安珀莱特滤掉；此后将该程序再重复两次。然后，用水(SWA)洗涤安珀莱特，直至pH中性(大约10-15L)，滤掉，加入300mL甲醇中，搅拌1小时，然后将混合物在2-8℃下放置至少过夜。为了除去甲醇，将安珀莱特滤掉，用大约10L水(SWA)洗涤，并再次滤掉。然后，将安珀莱特倒入大约4L蔗糖溶液中，7.5％或10％，对应于待耗尽的重建HDL的蔗糖浓度。将混合物搅拌几分钟，并且恰在使用前滤掉。

使用安珀莱特降低胆酸盐

将重建的HDL冷却至2-8℃，加入安珀莱特XAD-2，并将混合物搅拌3.5小时。将安珀莱特滤掉并卸出。将该步骤进行两次。

根据实验，对于5g蛋白质，对于每个耗尽步骤，使用了100-160g安珀莱特。

耗尽后，加回胆酸盐，以获得不同的胆酸盐浓度。

为了将重建的HDL 1:75PC降至0.7g/L的胆酸盐浓度，通过以重建HDL不同比例加入安珀莱特来实验性地确定待加入的安珀莱特的含量(预备性实验)。这些实验发现了每5g蛋白质需要50g安珀莱特的一种处理。然后将这种安珀莱特比蛋白质的比例用于主要批次的耗尽。

稳定性评价

CSL111

我们假设了可能影响肝功能的一种化合物是胆酸盐。因此，最终制剂中的胆酸盐降低是主要目的。使用CSL111进行了初始实验。为了发现仍然产生稳定产品的最小胆酸盐浓度，用安珀莱特处理了重建的CSL111，并且此后将胆酸盐加回，以获得不同浓度。

对这些物质进行了稳定性评价。此外，研究了冷冻干燥对具有不同胆酸盐浓度的CSL111稳定性的影响。

重建的HDL 1:50PC/1:75PC

用安珀莱特耗尽了两种制剂(1:50PC和1:75PC)的胆酸盐，并且补充了胆酸盐，以获得不同的胆酸盐浓度。将这些溶液冷冻干燥、重建并且研究了稳定性，以确定确保这些制剂稳定性所需的最小需要的胆酸盐浓度。

结果

CSL111的结果

用安珀莱特处理了CSL111，以除去胆酸盐。然后加入胆酸盐，以获得研究所需的不同浓度。

在低于2.8g/L胆酸盐的范围中，进一步降低了随着胆酸盐浓度提高的浊度。对于高于2.8g/L的胆酸盐浓度，检测到浊度值几乎没有改变(图3)。

然后将这些样品冷冻干燥并重建。在存储0小时、24小时和7天后测量了浊度。冷冻干燥并重建后的浊度值高于非冷冻干燥样品的(比较图3和图4)。

重建的CSL111颗粒显示出需要最小的胆酸盐浓度来保持稳定。如果胆酸盐浓度太低，将产生聚集和浑浊。此外，在低胆酸盐浓度下，分子大小分布变化较快。

重建的HDL 1:50PC

图5&6中给出了浊度数据。

浊度数据表明了对于≥0.3g/L的胆酸盐浓度，RT下的变化小。

在RT下24小时后的SE-HPLC色谱图(未显示)证明了与浊度值相同的趋势。≥0.3g/L的胆酸盐浓度，变化小。在0.8-1.0g/L之前，色谱图显示出几乎没有差异。因此，预期如果胆酸盐浓度升高高于1.0g/L，将不会获得稳定性提高。因此对于含有20g/L蛋白质的1:50制剂，认为0.3-1.0g/L之间的胆酸盐浓度是最佳的。对含有30g/L蛋白质的产品进行了计算，最佳的胆酸盐浓度范围为0.5-1.5g/L。

重建的HDL 1:75PC

1:75制剂的浊度测量(图7&8)显示出对于低于0.6g/L胆酸盐的浓度明显的提高。对于其他浓度(0.6-2.0g/L胆酸盐)，存储一天后的差异较低。

在RT下24小时后的分子大小分布的SE-HPLC色谱图(未显示)显示出耗尽的和其他样品之间的明显差异。

在1.0-1.3g/L胆酸盐之间，色谱图显示出几乎没有差异。因此，预期对于高于1.3g/L的胆酸盐浓度，稳定性不会有大的提高。因此对于含有20g/L蛋白质的1:75制剂，认为0.6-1.3g/L之间的胆酸盐浓度是最佳的。对于含有30g/L蛋白质的制剂，这等于0.9-2.0g/L的终胆酸盐浓度。

结论

对于本发明的rHDL制剂，选择了0.5-1.5g/L的最佳胆酸盐浓度。低于该范围，稳定性降低。高于1.5g/L的胆酸盐浓度引起了稳定性的轻微提高。然而，可以预期使用较高的胆酸盐浓度将会引起可感知的肝毒性提高。

实施例4

使用CSL111的肝毒性试验比较

介绍

该研究的目的是为了证实本发明的rHDL制剂的实施方案在静脉内灌输给兔子后的有利肝毒性特征。将肝中毒定义为血清中提高的肝酶(ALT)活性。认为Apo-AI是两种制剂的活性成分，并且Apo-AI的血浆水平是暴露的关键指示。

材料&方法

测试rHDL制剂的给药

测试rHDL制剂1

测试rHDL制剂2

研究设计

将该研究设计为总共6只雌性兔子的开放式两臂试验。剂量给药方案概述于表5中。

处理组

表5：处理组

实验动物

动物模型

将动物固定于约束装置中(兔子固定器)。将静脉内导管置于耳静脉中。作为40分钟的静脉内灌输来给予测试物质。从耳动脉采取血样并且收集至血清和链激酶-血浆(5％)小瓶中。将血样加工成血清，存储在-20℃，并且加工成血浆，储存在-80℃。

肝酶的测定

使用可购得的酶测光测试盒(Greiner Biochemica)分析了样品的ALT活性。

Apo A-I血浆水平的测定

通过浊度试验进行了人Apo A-I的测定。

结果

表6至7中给出了体内数据的平均值和标准偏差。

在此测试的rHDL制剂的实施方案没有提高ALT血清水平。CSL111在8小时时将ALT从25U/L提高至94U/L。

对于rHDL制剂(1.5mg/dL)和CSL111(1.6mg/dL)，在时间点40分钟时看到了人Apo-AI的峰水平。

表6：ALT血清水平(平均值±SD)

表7：Apo-AI血浆水平(平均值±SD)

实施例5

对于含有较低磷脂水平的颗粒，测定了制备本发明的合成HDL颗粒的能力。Apo A-I比磷脂的比例范围为1:2至1:55。

为了制备合成的HDL颗粒，将胆酸钠(New Zealand Pharmaceuticals)溶解于缓冲液(10mM NaCl、1mM EDTA、10mM TRIS，pH8.0)中，并且搅拌直至清澈。将大豆磷脂酰-胆碱(Phospholipid GmbH)加入合适体积的胆酸盐中，并且在室温下搅拌16小时。用10mM NaCl将apoA-I溶液稀释至9.0g/L的蛋白质浓度(通过OD280测定)，并且与适当体积的脂质溶液混合，以获得合适的蛋白质比脂质的比例。将混合物在2-8℃下搅拌16小时。通过在HiPrep26/10脱盐柱上，使用1％蔗糖作为运行缓冲液，来除去胆酸盐，从而制备HDL模拟物。通过超滤将洗脱液分别浓缩至20g/L的蛋白质浓度和7.5％的蔗糖。

将重建的HDL制剂在2-8℃下培养(存储)，并且在0、5和14天后测量了以下参数。

透射(405nm)、颗粒大小分布(SE-HPLC)、内毒素、SDS-PAGE(还原和非还原)、Native PAGE、LCAT激活、apoA-I浓度和体外毒性。

在第0天，进行了以下的其他测试：i)通过适用于含脂质样品的改良Biuret测量了蛋白质浓度(将脱氧胆酸盐加入Biuret溶液中)；ii)磷脂酰-胆碱浓度(ProDiagnosticamti-diagnostics GmbH)；和iii)通过比色

测试盒和

-Stoppreagens(Trinity Biotech)测量了胆酸盐浓度。

通过SE-HPLC，使用Superose 610/300GL柱(GE Healthcare)和PBS+0.1％叠氮化钠作为流动缓冲剂，测定了颗粒大小分布。流速为0.5mL/分钟，注入5μL样品，在280nm波长下进行了检测。使用XCell SureLock Mini-Cell以及NuPAGE Novex Bis-Tris Gels 4-12％和MOPS或MES电泳缓冲液(Invitrogen)，通过SDS-PAGE(还原/非还原)分析了合成的HDL颗粒。用Bio-Safe考马斯染色剂(Bio-Rad)观察了蛋白质条带。使用XCell SureLockMini-Cell以及Native PAGE Novex Bis-Tris Gels 4-16％和NativePAGE运行缓冲液试剂盒(Invitrogen)，进行了Native PAGE。用GelCode蓝色染色试剂(Thermo Scientific)观察了蛋白质条带。使用3D CE装置(Agilent technologies)和延长光路CE毛细管(50μm，56cm，都来自Agilent Technologies)，通过毛细管电泳测定了apoA-I浓度。电泳缓冲液为53mMNa-Borat pH9.1，0.21％SDS，5％甲醇。在25kV下运行电泳。

重复四次测定了LCAT活性。简而言之，将10μL样品吸移至冷却的试管中。将150μL人血浆、150μL PBS和20μL 14C胆固醇(Perkin Elmer)溶解于25mg/mL人白蛋白溶液中，混合并在2-8℃培养90分钟。将两份样品在37℃下培养，另外2份样品(空白)在2-8℃培养30分钟。加入2mL乙醇，以停止反应，并且随后用己烷(1×5mL，1×3mL)萃取两次。将己烷蒸干，并且将残余物重新溶解于0.5mL己烷中。通过将提取物通过固相Amino SPE柱，将胆固醇酯与其他物质分离，用2×1mL己烷洗脱。在闪烁β计数器上测定了洗脱液中的放射性。

体外毒性涉及制备HEP-G2细胞(第1天)：获取来自一个T75烧瓶的HEP-G2细胞的对数期培养物，除去培养基并且用PBS洗涤细胞。胰蛋白酶处理并重悬浮于10mL培养基(90％DMEM，10％灭活FCS，1％非必需氨基酸，1％Pen/Strep)中后，通过Neubauer/Trypan蓝测定了浓度。将100μL细胞(10×104C/mL)/孔接种于96孔F-底平板中。将平板在37℃/5％CO₂，95％H₂O下培养过夜。培养(第2天)：在培养基中制备了700μL最高化合物浓度的样品。除去第一排孔的培养基，并且将200ul溶液加入细胞中。进行了系列的1:2稀释系列，并且将平板在37℃/5％CO₂，95％H₂O下培养72小时。生活力(第3天)：将50μL 3×自然红溶液(100mL PBS中70mg自然红)加入每个孔中。将平板在37℃/5％CO₂，95％H₂O下培养2小时，并且用200μLPBS/孔将孔洗涤一次，将100μL乙醇加入每个孔中，并且将平板置于摇床上20分钟。在540nm下阅读每个孔的吸收值。

表8中提供了含有不同磷脂比蛋白质比例的合成HDL颗粒的特征概述。％透射表示颗粒是稳定的。随着合成颗粒中存在的脂质水平降低，LCAT值降低。这与作为LCAT底物的磷脂相一致。

HPLC-SEC结果表明了具有1:20和1:30比例的颗粒作为单个对称峰洗脱。具有较低脂质比Apo A-I水平的合成HDL颗粒含有肩状部分，在具有1:5和1:2比例的颗粒中更为明显。此外，随着磷脂比蛋白质比例的降低，主峰的洗脱时间逐渐延后。这表明了颗粒变得越来越小。在Native PAGE结果中也反映出这种大小变化，其中随着比例从1:55降至1:2，在递增强度下观察到了低分子量条带。SDS-PAGE对所有样品相似。

体外试验结果表明了每种制剂的细胞生活力在14天的时间段内保持稳定。用最高浓度(2mg/mL)的重建HDL培养细胞时，观察到了随着递增的脂质水平，细胞生活力存在小的降低(参见以下表9)。

表9：具有不同Apo A-I比磷脂比例(1:2至1:55)的合成HDL颗粒的生活力％概述

实施例6

检测了对使用不同去污剂重建的合成HDL颗粒的毒性影响。

为了制备颗粒，通过在20％甲醇中培养过夜来清洗安珀莱特XAD-2珠子，并且随后通过用1M氢氧化钠洗涤四次以及用超纯水洗涤两次来清洁。在使用前，用7.5％蔗糖洗涤珠子并且在滤器上干燥。

通过以下方法制得了合成HDL颗粒。用WFI重建含有残余胆酸盐的冷冻干燥HDL颗粒至30g/L的蛋白质浓度。将安珀莱特XAD-2珠子(10g/g蛋白质)加入重建HDL制剂中，并且边振荡边在2-8℃下培养3.5小时。通过过滤除去珠子后，用另一部分安珀莱特XAD-2珠子(10g珠子/g蛋白质)再一次重复该程序。然后通过过滤除去珠子，并且加入去污剂(胆酸盐、脱氧胆酸盐、辛基葡糖苷、聚山梨酸酯80)以获得1g/L或6g/L的终去污剂浓度。

然后如以上实施例中测定的，测试了样品的稳定性。

对于聚山梨酸酯80制剂，通过测光试验测定了去污剂水平：用5mL 0.1M醋酸铵沉淀1000μL样品中的蛋白质，并且通过离心沉淀。将上清液蒸干，并且重新溶解于1ml pH9.1的四硼酸钠缓冲液(0.953g四硼酸钠，用水补足100mL，加入10mL HCl)中，加入4ml TBPE-K溶液(1.76g氯化钾，0.48g四硼酸钠，4800μL 0.1M KOH，5mL乙醇中0.015g TBPE-K，用H₂O补足100mL)，并且在翻滚式混合器上用2.5ml二氯甲烷萃取30分钟。相分离后，在611nm处测量了二氯甲烷相的吸收(参照波长700nm)。

表10中提供了含有不同比例的磷脂比蛋白质的合成HDL颗粒的特征概述。％透射和LCAT值表明了颗粒是稳定的并且是功能性的。

HPLC-SEC结果表明了具有不同去污剂的颗粒作为单个对称峰洗脱。这在NativePAGE中观察到的条带模式中也得到反映。SDS-PAGE对所有样品相似。体外试验结果表明了细胞生活力根据存在的去污剂水平而改变。特别地，高去污剂水平导致了降低的细胞生活力。然而，在14天的时间段内，数值仍然保持稳定(参见表11)。

实施例7

按照以上实施例5中所述的，制得了合成的HDL颗粒，除了使用POPC(NOFCorporation)来重建HDL颗粒。然后通过实施例5中所述的方法来检测颗粒。

结果表明了呈现出与用大豆磷脂酰胆碱重建的合成HDL颗粒相似毒性性质的稳定/功能性产品(表12&13)。

表13：在不同磷脂存在下的合成HDL颗粒的％生活力概述

实施例8

可以通过健康志愿者的单次或多次静脉内灌输来评估本发明的重建HDL制剂的安全性和耐受性以及递增剂量的药物动力学。该研究具有两臂，一个涉及使用递增剂量的合成HDL颗粒，而另一个涉及使用生理盐水(0.9％)安慰比较剂。灌输将是随机的和双盲的(受试者，研究者和结果评估者(Subject，Investigator and Outcomes assessor))。

健康志愿者可以是18岁至55岁且体重至少为45kg的男性或女性。其他准入标准可以包括18至42.0kg/m²的体重指数(BMI)。排除标准可以包括i)临床上明显的医学病症、障碍或疾病的迹象；ii)肝胆疾病的迹象；iii)临床上相关的异常实验室测试结果的迹象；和iv)醇或药品滥用史的迹象。

将通过i)在灌输后直至14天药物相关的临床不利事件的频率；和ii)灌输后直至14天测量肝功能测试(例如，丙氨酸转氨酶(ALT)或天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的升高)来测量安全性和耐受性。可以在灌输合成HDL颗粒后直至10天测量药物动力学信息。颗粒测量将包括测定脂蛋白的血浆水平。

结论

已经评价了本发明的rHDL制剂的实施方案和CSL111制剂，来测试本发明的rHDL制剂是否具有提高的毒性特征，且保持了生物活性。本发明的rHDL制剂具有降低的1:40或1:55的Apo-AI比PC比例，而CSL111具有1:150的比例。此外，更多的纯化努力导致了制剂中胆酸盐实质性的降低。因此，本发明的rHDL制剂呈现出降低的肝毒性，与CSL111相比。重要地，两种制剂的Apo-AI血清水平相似，表明对活性成分的暴露相似(参见表7)。

在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而没有将本发明限于任何一个实施方案或特定的特征集合。可以对所述和所示的实施方案进行各种改变和修改，而没有脱离本发明。

本说明书中引用的每一篇专利和特定文献的公开内容、计算机程序和算法在此以其整体引入作为参考。

Claims

1.重建的高密度脂蛋白(rHDL)制剂，其包含载脂蛋白；脂质；和去污剂，去污剂水平为选自0.5-1.5g/L和0.015-0.030g/g载脂蛋白；所述去污剂选自以下组成的组：

聚山梨酸酯，胆酸或其盐，脱氧胆酸，脱氧胆酸盐，辛基葡糖苷；

载脂蛋白是Apo-A1；

脂质是磷脂；

所述磷脂水平为30-60g/L，并且载脂蛋白:磷脂的摩尔比在1:20至1:100的范围中。

2.权利要求1的rHDL制剂，其中磷脂是磷脂酰胆碱。

3.权利要求1至2中任一项的rHDL制剂，其中制剂进一步包含稳定剂。

4.权利要求3的rHDL制剂，其中稳定剂是碳水化合物。

5.权利要求4的rHDL制剂，其中稳定剂是糖或糖醇。

6.权利要求5的rHDL制剂，其中稳定剂是甘露糖醇或山梨糖醇。

7.权利要求5的rHDL制剂，其中稳定剂是双糖。

8.权利要求7的rHDL制剂，其中稳定剂是蔗糖。

9.权利要求8的rHDL制剂，其中蔗糖浓度为rHDL制剂的65-85g/L，即6.5-8.5％w/v。

10.权利要求8的rHDL制剂，其中蔗糖浓度为rHDL制剂的约75g/L，即约7.5％w/v。

11.权利要求3的rHDL制剂，其中稳定剂是氨基酸、抗氧化剂、表面活性剂、螯合剂、明胶、合成油、多元醇或海藻酸盐。

12.权利要求11的rHDL制剂，其中稳定剂是乳化剂。

13.权利要求11的rHDL制剂，其中稳定剂是甘氨酸或脯氨酸。

14.生产权利要求1至13中任一项的rHDL制剂的方法，所述方法包括提供所述去污剂的步骤，去污剂水平选自0.5-1.5g/L和0.015-0.030g/g载脂蛋白。

15.权利要求14的方法，包括以下步骤：

(A)将不含有机溶剂的磷脂酰胆碱和胆酸盐去污剂加入Apo-A1溶液中；

(B)将步骤(A)中产生的溶液中的胆酸盐去污剂水平降至约0.03g/g Apo-A1；

(C)将稳定剂加入步骤(B)的溶液中。

16.可根据权利要求14-15任一项的方法获得的rHDL制剂。

17.根据权利要求1-13或权利要求16任一项的rHDL制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗心血管疾病、高胆甾醇血症或低胆甾醇血症。

18.根据权利要求1-13或权利要求16任一项的rHDL制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗急性冠脉综合征(ACS)、动脉粥样硬化和心肌梗死。