KR20130100970A

KR20130100970A - 재구성된 고밀도 지질단백질 제형 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20130100970A
Application number: KR1020137002377A
Authority: KR
Inventors: 사무엘 라이트; 마르틴 임보덴; 라인하르트 볼리; 마르셀 바엘흐리
Original assignee: 시에스엘 리미티드
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2013-09-12
Also published as: PL3178481T3; CA2803031A1; TW201206446A; EP3178481A1; US11058747B2; US9439946B2; JP2016188226A; HUE042391T2; EP2588113B1; JP2013529648A; ES2617977T3; US20220133852A1; WO2012000048A1; EP2588113A4; IL223815A; TWI531388B; TR201903209T4; PL2588113T3; EP3492085A1; US20130190226A1

Abstract

상대적으로 낮은 독성을 갖는 재구성된 고밀도 지질단백질 제형은 Apo-AI 또는 이의 단편과 같은 아포지질단백질; 지질; 및 사람에게 투여시 일반적으로 간 독성을 일으키는 수준의 약 5 내지 50% 수준의 세제를 포함한다. 상기 지질은 최적으로는 약 30 내지 50g/L의 포스파티딜콜린이고, 아포지질단백질:지질의 몰비는 최적으로는 1:40 내지 1:75의 범위이다. 상기 제형은 급성 관상동맥 증후군(ACS), 죽상 동맥경화증 및 심근 경색을 포함하는 심혈관 질환, 고콜레스테롤혈증 및 저콜레스테롤혈증과 같은 질환 또는 병태를 치료하는데 유용하다.

Description

재구성된 고밀도 지질단백질 제형 및 이의 제조방법{A RECONSTITUTED HIGH DENSITY LIPOPROTEIN FORMULATION AND PRODUCTION METHOD THEREOF}

본 발명은 재구성된 고밀도 지질단백질(rHDL) 제형에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 독성이 감소된 재구성된 고밀도 지질단백질 제형에 관한 것이다.

고밀도 지질단백질(HDL)은, 고밀도(1.063g/mL 초과) 및 소형 크기(스토크(Stoke) 직경 = 5 내지 17nm)를 특징으로 하는, 지질 및 단백질을 포함하는 일 부류의 이종 지질단백질이다. 다양한 HDL 아부류는 지질, 아포지질단백질, 효소 및 지질 전달 단백질의 정량적 및 정성적 함량이 다양하여 형태, 밀도, 크기, 전하 및 항원성이 다르다. Apo-AII 및 Apo-V와 같은 다른 아포지질단백질이 존재할 수 있지만, 아포지질단백질A-I(Apo-AI)가 우세한 HDL 단백질이다.

유행병학 및 임상 연구에 의해 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C) 수준과 심혈관 질환 위험 사이의 역 관계가 확립되었다[참조: Assmann et al., 2004, Circulation 109 III-8]. 보다 구체적으로, 재구성된 HDL 제형의 임상적 투여가 최근의 급성 관상동맥 증후군(ACS)을 앓고 있는 고콜레스테롤혈증 환자에게 유리한 효과를 부여하는 것으로 밝혀졌다.

통상적으로, 이러한 재구성된 HDL 제형은 단백질, 예를 들어 Apo-AI, 지질, 예를 들어 포스파티딜콜린 및 세제, 예를 들어 콜레이트 또는 데옥시콜레이트를 포함한다. 또한, 콜레스테롤이 포함될 수 있다. 미국 특허 제5,652,339호에서 논의되는 바와 같이, 일부의 경우에서 재구성된 HDL 제형을 생성할 때 지질 성분(예: 포스파티딜콜린)을 용해시키는데 사용되는 유기 용매를 사용하지 않고 재구성된 HDL 제형을 생성하는 것이 유리할 수 있다. CSL-111로 표기되는 이러한 유형의 재구성된 HDL 제형이 임상 시험되었으나, 간 기능 시험 이상 후, 고용량 처리는 조기에 중단되었다. CSL111로 처리된 환자들은 플라크 부하 지수에서 유리한 경향을 보였다. 그러나, 위약과 비교하는 경우, 아테롬 용적의 변화율(%) 또는 플라크 용적의 일반적 변화에서 통계학적 유의성이 얻어지지 않았다[참조: Tardif et al., 2007, JAMA-Exp. 297 E1].

발명의 요약

본 발명의 목적은 선행 기술의 재구성된 HDL 제형의 결함 중 하나 이상을 완화시키거나 회피하는 재구성된 HDL 제형을 제공하는 것이다.

본 발명의 바람직한 목적은 감소되거나 최소인 독성을 갖는 재구성된 HDL 제형을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 바람직한 목적은 관상 죽상 동맥경화증을 포함하나 이에 제한되지 않는 질환 또는 병태의 예방적 및/또는 치료적 처치에 효과적인 재구성된 HDL 제형을 제공하는 것이다.

본 발명은 광범위하게는 아포지질단백질, 인지질, 및 무독성 또는 적어도 상대적으로 낮은 독성을 나타내는 수준의 세제를 포함하는 지질단백질 제형에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 세제 및 지질의 수준은 간 독성을 유발하거나 초래하거나 이와 연관되는 수준보다 낮은 수준이다.

하나의 양상에서, 본 발명은 아포지질단백질 또는 이의 단편; 지질; 및 사람에게 투여시 간 독성을 나타내는 재구성된 고밀도 지질단백질(rHDL) 제형 중에 존재하는 수준의 약 5 내지 50% 수준의 세제를 포함하는, rHDL 제형을 제공한다.

다른 양상에서, 본 발명은 사람에게 투여시 간 독성을 나타내는 rHDL 제형 중에 존재하는 수준의 약 5 내지 50% 수준의 세제를 제공하는 단계를 포함하는, 아포지질단백질; 지질; 및 세제를 포함하는 rHDL 제형을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 제1 양상에 따르거나 제2 양상의 방법에 따라 제조된 rHDL를 사람에게 투여하여 사람의 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 단계를 포함하는, 사람에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 사람에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한 제1 양상에 따르거나 제2 양상의 방법에 따라 제조된 rHDL 제형을 제공한다.

바람직하게는, 세제의 수준은 간 독성을 나타내는 수준의 약 5 내지 10%이다. 특정 실시형태에서, 이는 약 0.03g/g 아포지질단백질에 상당한다.

바람직하게는, 세제는 담즙산염 또는 담즙산이다. 보다 바람직하게는, 세제는 나트륨 콜레이트이다.

아포지질단백질은 고밀도 지질단백질(HDL)의 일반적 및/또는 기능성 성분인 임의의 아포지질단백질일 수 있다. 아포지질단백질은 바람직하게는 약 20 내지 50g/L의 농도이다. 바람직하게는, 아포지질단백질은 Apo-AI 또는 이의 단편이다.

적합하게는, 지질의 수준은 간 독성을 유발하거나 이와 연관된 수준의 약 20 내지 70%이다. 바람직하게는, 지질은 약 30 내지 60g/L의 농도이다. 지질의 특히 유리한 농도는 약 30 내지 50g/L, 또는 특정 실시형태에서 약 34 또는 47g/L이다.

바람직하게는, 지질은 인지질이다. 보다 바람직하게는, 인지질은 포스파티딜콜린(PC)이거나 이를 포함한다.

하나의 바람직한 실시형태에서, 아포지질단백질:지질의 몰비는 1:20 내지 1:100의 범위이다. 보다 바람직하게는, 아포지질단백질:지질의 몰비는 1:40 내지 1:75의 범위이다. 아포지질단백질:지질의 특히 유리한 비율은 약 1:40 또는 1:55이다.

적합하게는 rHDL 제형은 안정화제를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 안정화제는 당, 예를 들어 슈크로스이다. 바람직한 농도는 65 내지 85g/L rHDL 제형이다.

본원을 통해서, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 "포함하는"은 기술된 정수 또는 정수의 그룹을 포함한다는 것을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹을 배제하고자 하는 것을 의미하는 것은 아니라는 것을 이해할 수 있을 것이다.

하기에 상세히 기술되는 본 발명의 비-제한적 실시형태를 이해하는데 도움이 되는 하기 도면을 참조한다.
도 1은 콜레이트와 포스파티딜콜린 모두의 동시 감소가 간 독성을 감소시킨다는 것을 나타내는 급성 래트 연구 결과를 나타낸다.
도 2는 콜레이트의 선택적 감소가 간 독성을 감소시킨다는 것을 나타내는 급성 래트 연구 결과를 나타낸다.
도 3은 상이한 농도의 콜레이트의 존재 하에서의 CSL111의 탁도 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 동결건조 및 재구성 후 상이한 농도의 콜레이트의 존재 하에서의 CSL111의 탁도 결과를 나타낸다.
도 5는 실온(RT)에서 재구성된 HDL 1:50 PC의 탁도 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 37℃에서 재구성된 HDL 1:50 PC의 탁도 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 RT에서 재구성된 HDL 1:75 PC의 탁도 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 37℃에서 재구성된 HDL 1:75 PC의 탁도 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 rHDL 제형 제조 과정의 일 실시형태에 대한 개요를 제공한다.

본 발명은, 적어도 부분적으로는 선행 기술에서 기술되는 CSL111 재구성 HDL(rHDL) 제형에 의해 나타나는 간 독성이, 특히 제형 중의 세제 대 Apo-AI의 비율면에서 고려할 때, 과량의 세제에 의한다는 예기치 못한 발견으로부터 비롯된다. 이와 관련하여, 나트륨 콜레이트의 수준은 약 0.3g/g Apo-AI이었다. 그러나, 본 발명자들은 또한 세제가 완전히 제거될 수 없고 일정 수준으로 보유되어야만 rHDL 제형이 충분한 안정성 및 치료 활성을 나타낸다는 것을 밝혀내었다.

또한, 예기치 못하게도, CSL111에 존재하는 지질 농도에 비해 지질 농도를 감소시키면 rHDL 제형의 치료 활성을 실질적으로 손상시키지 않으면서 간 독성이 감소된다는 것이 밝혀졌다.

추가의 발견에서, rHDL 제형에 대해 최적인 아포지질단백질:지질의 몰비가 확인되었다.

따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 아포지질단백질 또는 이의 단편; 지질; 및 사람에게 투여시 간 독성을 나타내는 rHDL 제형 중에 존재하는 수준의 약 5 내지 50% 수준의 세제를 포함하는 rHDL 제형을 제공한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "재구성된 HDL(rHDL)" 제형은 혈액 혈장에 통상적으로 존재하는 고밀도 지질단백질(HDL)과 기능적으로 유사하거나 동족이거나 이에 상응하거나 이를 모방하는 임의의 인위적으로-제조된 지질단백질 제형 또는 조성물일 수 있다. rHDL 제형은 이의 범위내에 "HDL 모사체" 및 "합성적 HDL 입자"를 포함한다.

이러한 맥락에서, "사람에게 rHDL 제형을 투여시 간 독성을 나타낸다"는 것은, 사람에게 투여 후 rHDL 제형 중의 세제의 수준이 차후 유해 사건을 유발하거나 초래하거나 적어도 이와 연관된다는 것을 의미한다. 통상적으로, 유해 사건은, 비정상적 또는 손상된 간 기능으로 입증되는 바와 같은 간 독성이다. 비정상적이거나 또는 손상될 수 있는 간 기능(들)의 비제한적 예는 증가된 알라닌 아미노트랜스퍼라제 활성(ALT), 증가된 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 활성 및/또는 증가된 빌리루빈 수준을 포함한다. 본 발명에 따르면, 세제의 적합한 수준은, 본원에서 기술되는 바와 같이, 유해 사건을 유발하거나 초래하거나 이와 연관되지 않는 것이다. 통상적으로, 이는 주입 말기에 측정된다.

바람직하게는, 세제의 수준은 간 독성을 나타내는 수준의 약 5 내지 35%이다. 이 범위는, 예를 들어 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 및 35%를 포함한다. 보다 바람직하게는, 세제의 수준은 간 독성을 나타내는 수준의 약 5 내지 20%이다. 유리하게는, 상기 수준은 간 독성을 나타내는 수준의 약 5 내지 10%이다. 바람직하게는, 이러한 수준은 간 독성을 나타내는 세제의 최소 수준 또는 역치 수준으로 표현된다.

예로써, 간 독성을 유발하거나 초래하거나 적어도 이와 연관되는, 본 발명을 이끄는 연구에서 밝혀진 세제의 수준은 0.3g/g Apo-AI 또는 6g/L rHDL 제형(20g/L Apo-AI에서)이다. 따라서, 이러한 세제의 수준의 5 내지 10%는 0.015 내지 0.03g/g Apo-AI 또는 0.5 내지 0.9g/L rHDL 제형(30g/L Apo-AI에서)이다.

세제의 "수준"은 세제의 절대량, 세제의 농도(예: 질량(mass)/rHDL 제형의 단위 용적) 및/또는 rHDL 제형의 일 성분의 다른 양 또는 농도에 대한 세제의 양 또는 농도의 비율일 수 있다. 단지 예시로써, 세제의 수준은 rHDL 제형에 존재하는 아포지질단백질(예: Apo-AI)의 총 질량으로 표현될 수 있다.

안전성 및 간 독성의 회피가 본 발명의 하나의 목적이지만, 본 발명은 또한 rHDL 제형 안정성을 유지하기에 충분한 세제의 수준을 필요로 한다. 실시예에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 30g/L 아포지질단백질을 갖는 rHDL 제형 L 당 약 0.45g 이상의 세제 농도가 안정성 및 무독성 모두의 측면에서 최적이다. 안정성은, rHDL 제형의 탁도가 바람직한 척도이지만, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 수단으로 유리하게 측정될 수 있다.

세제는, rHDL 제형에 사용하기에 적합한, 담즙산 및 이의 염을 포함하는, 임의의 이온성(예: 양이온성, 음이온성, 쯔비터이온성) 세제 또는 비-이온성 세제일 수 있다. 이온성 세제는 폴리소르베이트(예: PS80), CHAPS, CHAPSO, 세틸 트리메틸-암모늄 브로마이드, 라우로일사르코신, 3급-옥틸 페닐 프로판설폰산 및 4'-아미노-7-벤즈아미도-타우로콜산을 포함할 수 있다.

담즙산은, 전형적으로, 콜산, 데옥시콜산, 체노데옥시콜산 또는 우르소데옥시콜산을 포함하는, 24개의 탄소를 갖는 디하이드록실화되거나 트리하이드록실화된 스테로이드이다. 바람직하게는, 세제는 담즙산염, 예를 들어 콜레이트, 데옥시콜레이트, 체노데옥시콜레이트 또는 우르소데옥시콜레이트 염이다. 특히 바람직한 세제는 나트륨 콜레이트이다.

아포지질단백질은 천연-발생 HDL 또는 재구성된 고밀도 지질단백질(rHLD)의 기능성 생물학적 활성 성분인 임의의 아포지질단백질일 수 있다. 통상적으로, 아포지질단백질은 혈장-유도된 또는 재조합 아포지질단백질, 예를 들어 Apo-AI, Apo-AII 또는 Apo-AV, pro-apo-AI 또는 변이체, 예를 들어 Apo-AI Milano이다. 바람직하게는, 아포지질단백질은 Apo-AI이다. 또한, 아포지질단백질의 생물학적 활성 단편이 고려된다. 단편은 천연 발생, 화학적 합성 또는 재조합 단편일 수 있다. 단지 예로써, Apo-AI의 생물학적-활성 단편은 Apo-AI의 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT) 자극 활성을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95 내지 100% 또는 심지어 100% 이상 갖는 것이 바람직하다.

적합하게는, 아포지질단백질은 약 20 내지 50g/L의 농도이다. 이는 20, 25, 30, 35, 40, 45 및 50g/L 및 이러한 양 사이의 임의의 범위를 포함한다. 아포지질단백질은 바람직하게는 약 30g/L의 농도이다.

rHDL 제형은 간 독성을 유발하지 않는 수준의 지질을 포함한다. 적합하게는, 지질의 수준은 간 독성을 유발하거나 이와 관련되는 수준의 약 20 내지 70%이다. 특정 실시형태에서, 지질의 수준은 바람직하게는 간 독성을 유발하거나 이와 연관된 수준의 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65% 및 이러한 양 사이의 임의의 범위이다. 바람직하게는, 이들 수준은 간 독성을 나타내는 지질의 최소 또는 역치 수준으로 표현된다.

예로써, 간 독성을 유발하거나 초래하거나 적어도 이와 연관되는, 본 발명을 이끄는 연구에서 밝혀진 지질의 수준은 84g/L이다. 따라서, 지질은 바람직하게는 약 30 내지 60g/L의 농도이다. 이는 30, 35, 40, 45, 50, 55 및 60g/L 및 이러한 양 사이의 임의의 범위를 포함한다. 특히 유리한 지질 농도는 약 30 내지 50g/L 또는 특정 실시형태에서 약 34 또는 47g/L이다.

지질의 "수준"은 지질의 절대량, 지질의 농도(예: 질량/rHDL 제형 단위 용적) 및/또는 rHDL 제형의 일 성분의 다른 양 또는 농도에 대한 지질의 양 또는 농도의 비율일 수 있다. 단지 예시로써, 지질의 수준은 rHDL 제형에 존재하는 아포지질단백질(예: Apo-AI)의 몰비로 표현될 수 있다.

하나의 바람직한 실시형태에서, 아포지질단백질:지질의 몰비는 1:20 내지 1:100의 범위이다. 이러한 범위는 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80 및 1:90와 같은 몰비를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 아포지질단백질:지질의 몰비는 1:40 내지 1:75의 범위이다. 아포지질단백질:지질의 특히 유리한 비율은 약 1:40 또는 1:55이다.

지질은 천연-발생 HDL 또는 재구성된 고밀도 지질단백질(rHDL)의 기능성 생물학적 활성 성분인 임의의 지질일 수 있다. 이러한 지질은 인지질, 콜레스테롤, 콜레스테롤-에스테르, 지방산 및/또는 트리글리세라이드를 포함한다. 바람직하게는, 지질은 인지질이다. 인지질의 비제한적 예는 포스파티딜콜린(PC)(레시틴), 포스파티드산, 포스파티딜에탄올아민(PE)(세팔린), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PI) 및 스핑고마이엘린(SM) 또는 이들의 천연 또는 합성 유도체를 포함한다. 천연 유도체는, 달걀 PC, 달걀 PG, 대두 PC, 수소화 대두 PC, 대두 PG, 뇌 PS, 스핑고지질, 뇌 SM, 갈락토세레브로사이드, 강글리오사이드, 세레브로사이드, 세팔린, 카르디올리핀, 및 디세틸포스페이트를 포함한다. 합성 유도체는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디데카노일포스파티딜콜린(DDPC), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디라우릴포스파티딜콜린(DLPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일미리스토일포스파티딜콜린(PMPC), 팔미토일스테아로일포스파티딜콜린(PSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디라우로일포스파티딜글리세롤(DLPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디미리스토일포스파티드산(DMPA), 디팔미토일포스파티드산(DPPA), 디스테아로일포스파티드산(DSPA), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE) 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 디팔미토일스핑고마이엘린(DPSM) 및 디스테아로일스핑고마이엘린(DSSM)을 포함한다. 인지질은 또한 상기 인지질 중 임의의 인지질의 유도체 또는 동족체일 수 있다.

바람직하게는, 인지질은, 단독 또는 하나 이상의 다른 인지질과 배합된, 포스파티딜콜린이거나 이를 포함한다. 다른 인지질의 예는 스핑고마이엘린이다.

적합하게는, rHDL 제형은 추가로 안정화제를 포함한다. 특히, 안정화제는 동결건조 동안 rHDL 제형의 안정성을 유지시킨다. 적합하게는, 안정화제는 탄화수소, 예를 들어 당 또는 당 알콜이다. 적합한 당 알콜의 예는 만니톨 및 소르비톨이다. 바람직하게는, 안정화제는 이당류 당, 예를 들어 슈크로스이다. 슈크로스의 바람직한 농도는 rHDL 제제의 약 65 내지 85g/L(약 6.5 내지 8.5% w/v에 상당)이다. 바람직하게는, 슈크로스의 농도는 약 75g/L(약 7.5% w/w에 상당)이다. 이는, CSL11과 비교하여, 절대적 측면 및 지질단백질 농도에 대한 상대적 측면 모두에서, 감소된 슈크로스 농도이다. 이러한 상대적으로 감소된 슈크로스가 본 발명의 rHDL 제형의 더욱 신속한 주입 속도를 가능하게 할 수 있는 것으로 제시된다. 다른 안정화제는 아미노산(예: 글리신, 프롤린), 항산화제, 유화제, 계면활성제, 킬레이트화제, 젤라틴, 합성 오일, 폴리올, 알기네이트 또는 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제이거나 이를 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 이와 관련하여, 예를 들어 문헌[참조: "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor &; Francis (2000), "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000) 및 국제 공개 WO2009/025754]을 참조한다.

특히 바람직한 실시형태에서, rHDL 제형은

(i) 약 30g/L의 Apo-AI;

(ii) 약 0.03g의 나트륨 콜레이트/g Apo-AI;

(iii) 약 34 또는 47g/L의 포스파티딜콜린; 및

(iv) 약 75g/L의 슈크로스를 포함하고,

여기서, Apo-AI:포스파티딜콜린의 몰비는 약 1:40 또는 1:55이다.

바람직하게는, 상기 방법은 사람에게 투여시 간 독성을 나타내는 수준의 약 5 내지 10% 수준의 세제를 제공하는 단계를 포함한다.

상기 방법의 바람직한 실시형태에서, 세제의 초기 또는 개시 수준은 사람에게 rHDL 제형을 투여시 간 독성을 나타내지 않는 수준으로 감소되거나 제거된다.

세제의 감소 또는 제거는, 예를 들어 여과, 소수성 흡착 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피, 투석, 이온-교환 흡착 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한 당해 기술 분야에 공지된 임의의 수단으로 수행될 수 있다.

일부 실시형태에서, 비-극성 폴리스티렌 수지가 세제 수준을 감소시키는데 적합할 수 있다. 이러한 수지는 바람직하게는 가교-결합된 공중합체(예: 가교-결합된 스티렌 및 디비닐벤젠 공중합체)의 형태이다. 비제한적 예는 Amberlite XAD-2 및 Bio Beads SM을 포함한다.

여과는, 당해 기술 분야에서 잘 이해되는 바와 같이, 여과, 겔 투과, 투석여과 및 한외여과를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 겔 투과의 비제한적 예는 다공성의 가교-결합된 덱스트란, 예를 들어 Sephadex 수지를 사용할 수 있다.

대규모 제조에 특히 적합한 특히 바람직한 실시형태에서, 세제의 수준은 투석여과에 의해 감소된다.

적합하게는, 상기 방법은 유기 용매의 부재 하에서 지질 및 아포지질단백질을 조합하는 단계를 포함한다.

따라서, 하나의 바람직한 실시형태에서, 본 발명은

(I) Apo-AI 용액에, 유기 용매 부재 하의 포스파티딜콜린, 및 콜레이트 세제를 첨가하는 단계;

(II) 단계 (I)에서 생성된 용액 중의 콜레이트 세제의 수준을 약 0.03g/g Apo-AI로 감소시키는 단계; 및

(III) 단계 (II)의 용액에 안정화제, 바람직하게는 슈크로스를 첨가하는 단계를 포함하는, rHDL 제형을 제조하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 단계 (I)에서, 포스파티딜콜린은 Apo-AI:포스파티딜콜린 비율이 약 1:40 또는 1:55이도록 첨가된다.

바람직하게는, 단계 (III)에서의 슈크로스의 최종 농도는 약 75g/L이다.

적합하게는, 상기 방법은 단계 (III)에서 제조된 rHDL 제형을 동결건조시키는 단계 (IV)를 추가로 포함한다.

특정 실시형태에서, rHDL 제형을 제조하는 방법이 사람에게 투여하기에 적합한 품질 및 안전성을 갖는 rHDL 제형을 대규모의 시판용으로 제조하는데 적합하다는 것을 알 수 있을 것이다. 대규모의 시판을 위한 제조 과정에 대한 비제한적 예가 도 9에 요약되어 있다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 앞서 기술되거나 앞서 기술된 방법에 따라 제조되는 rHDL를 사람에게 투여하여 사람의 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 단계를 포함하는, 사람에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 사람에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한 앞서 기술되거나 앞서 기술된 방법에 따라 제조되는 rHDL 제형을 제공한다.

적합하게는, 상기 질환, 장애 또는 병태는 상기 rHDL 제형의 예방적 또는 치료적 투여에 반응한다. 이러한 질환, 장애 또는 병태의 비제한적 예는 심혈관 질환(예: 급성 관상동맥 증후군(ACS), 죽상 동맥경화증 및 심근 경색) 또는 ACS에 취약하게 하는 당뇨병, 뇌졸중 또는 심근경색과 같은 질환, 장애 또는 병태, 고콜레스테롤혈증(예: 상승된 혈청 콜레스테롤 또는 상승된 LDL 콜레스테롤) 및 고밀도 지질단백질(HDL)의 감소된 수준으로부터 초래되는 저콜레스테롤혈증, 예를 들어 탄지에르(Tangier) 질환의 증상을 포함한다.

rHDL 제형은 당해 기술 분야에 공지된 임의 투여 경로로 투여될 수 있다. 전형적으로, rHDL 제형은 비경구로, 예를 들어 정맥내 주입 또는 주사로 투여된다.

rHDL 제형의 투여 용량은 1 내지 120mg/kg 체중의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 용량은, 10mg/kg, 20mg/kg, 30mg/kg, 40mg/kg, 50mg/kg, 60mg/kg 및 70mg/kg의 용량을 포함하는, 5 내지 80mg/kg 범위이다.

본 발명의 바람직한 실시형태를 충분히 이해하고 실시하기 위해, 하기의 비제한적 실시예를 참조한다.

실시예

하기 제공되는 실시예는 rHDL 제형(예: CSL111) 중의 어떤 인자가 간 독성에 기여하는지를 측정하기 위한 초기 연구(실시예 1 및 2) 및 본 발명의 rHDL 제형의 실시형태의 개발 및 독성 시험(실시예 3 내지 8)을 기술한다.

실시예 1

상이한 Apo - AI : PC 비율 및 콜레이트 수준의 조절 효과를 비교한 간 독성 연구

ALT 활성으로 측정되는 간 독성의 수준을 상이한 Apo-AI:PC 비율(1:150, 1:100 & 1:50)을 포함하는 HDL 제제에 대해 래트 모델(하기 실시예 2에서 모델에 대한 상세한 설명을 참조)에서 측정하였다. 각각의 HDL 제제는 1:150 제제에 대해 6g/L로부터 1:50 제제에 대해 1.1g/L까지의 범위의 수준으로 상이한 콜레이트 농도를 포함하였다.

그 결과, 증가된 ALT 수준이 1:150 HDL 제제에 대해 300mg/kg으로부터의 용량에 대해 관찰되었다. 1:100 HDL 제제는 400mg/kg으로부터의 용량에서 증가된 ALT 수준을 유발하였고, 600mg/kg에서는 상당히 증가된 수준을 나타내었다. 이와는 대조적으로, 1:50 HDL 제제에 대해서는 600mg/kg 용량까지 ALT 활성 증가가 관찰되지 않았다(도 1). 이러한 결과는 간 독성이 HDL 제제 중의 PC의 수준 및/또는 콜레이트의 수준에 의해 감소된다는 것을 제시한다. 콜레이트 수준이 ALT 활성에 직접적인 영향을 미치는지의 여부를 조사하기 위해서, CSL111에 콜레이트가 고갈된(depleted) 추가의 연구를 수행하였다. 그 결과, CSL111 제제에서 콜레이트를 감소시킴으로써 300mg/kg으로 래트에 주입시 ALT 수준이 감소되었다(도 2). 또한, 고갈된 HDL 제제에 콜레이트를 다시 첨가하는 경우, 재보충된 HDL 제제는 300mg/kg로 래트에 주입시 ALT 수준을 증가시켰다(도 2). 이들 연구는 콜레이트를 약 1g/L로 감소시키면 rHDL 독성이 실질적으로 감소하지만, 약 1:50 Apo-AI:PC의 비율에 대해 추가의 기여 인자가 PC의 감소라는 것을 입증한다.

실시예 2

단계적( graded ) 콜레이트 수준 및 Apo - AI : PC 비율을 비교하는 간 독성 연구

도입

본 연구의 목적은 계단적 콜레이트 농도 및 Apo-AI 대 PC 비율[rHDL PC 1:150(3g/L 콜레이트), rHDL PC 1:100(1g/L 콜레이트), rHDL PC 1:50(3g/L 콜레이트), rHDL PC 1:50(0.2g/L 콜레이트)]를 사용하여 재구성된 HDL 제형(rHDL)의 간독성을 측정하는 것이었다. 간 기능에 대한 상기한 제형의 효과를 측정하기 위해 의식이 있는 래트 모델을 사용하였다. 간 독성은 혈청 중의 간 효소 활성(ALT 및 AST)을 측정함으로써 평가되었다.

Apo-AI는 제형의 활성 성분인 것으로 간주되고, Apo-AI의 혈장 수준이 노출의 주요 지표이다.

재료 및 방법

시험 rHDL 제형의 투여

시험 rHDL 제형 1

물질/INN: rHDL PC 1:150 (3g/L 콜레이트)

제조자: CSL Behring AG, Bern, Switzerland

로트 번호: Q.3

용량: 600mg/kg b.w.

경로: 꼬리 정맥을 통한 i.v. 주입

빈도: 주입 t = 0 내지 60분

적용 용적: 31.25mL/kg/h

시험 rHDL 제형 2

물질/INN: rHDL PC 1:100 (1g/L 콜레이트)

제조자: CSL Behring AG, Bern, Switzerland

로트 번호: O.3-2

용량: 600mg/kg b.w.

경로: 꼬리 정맥을 통한 i.v. 주입

빈도: 주입 t = 0 내지 60분

적용 용적: 30.30mL/kg/h

시험 rHDL 제형 3

물질/INN: rHDL PC 1:50 (3g/L 콜레이트)

제조자: CSL Behring AG, Bern, Switzerland

로트 번호: P.3

용량: 600mg/kg b.w.

경로: 꼬리 정맥을 통한 i.v. 주입

빈도: 주입 t = 0 내지 60분

적용 용적: 31.58mL/kg/h

유효 날짜: n.a.

시험 rHDL 제형 4

물질/INN: rHDL PC 1:50 (0.2g/L 콜레이트)

제조자: CSL Behring AG, Bern, Switzerland

로트 번호: P.2

용량: 900mg/kg b.w.

경로: 꼬리 정맥을 통한 i.v. 주입

빈도: 주입 t = 0 내지 120분

적용 용적: 23.08ml/kg/h b.w.

연구 디자인

본 연구는 총 14마리의 래트에서 개방식 4-아암 시험(open four-armed trial)으로 디자인되었다. 투약 요법이 표 1에 요약되어 있다.

처리 그룹

실험 동물

종류: 래트

스트레인: CD

성별: 수컷

동물의 수: 14

공급: Charles River Laboratories(Sulzfeld, Germany)

체중: 286 내지 328g

도착시 나이: 7 내지 9주

하우징: 마크롤론 케이지

베딩: 목귀(wood shavings)(Braun, Battenberg, Germany)

물: 수돗물, 임의 공급

음식: 표준 래트 식이(Ssniff-Versuchsdiaten, Soest,

Germany)

명/암: 12h / 12h

온도: 21 내지 22℃

상대 습도: 40 내지 50%

동물들을 통제 디바이스(래트 홀더)에 놓고, 외측 꼬리 정맥을 i.v. 카테터로 뚫었다. 시험 물품을 60/120분 동안 주입하였다.

기준선 및 i.v. 주입 후 1h/2h 및 7h/8h에 혈액 샘플을 눈뒤 정맥 컴플렉스(retro-orbital venous complex)로부터 채취하여 혈청 튜브에 수거하였다. 혈액 샘플을 혈청으로 프로세싱하고, -20℃에 저장하였다.

간 효소의 측정

샘플들을 시판되는 효소적 광도측정 시험 키트(Greiner Biochemica)를 사용하여 AST 및 ALT 활성에 대해 분석하였다.

Apo - AI 혈장 수준의 측정

사람 Apo-AI 수준의 측정을 비탁분석(nephelometric) 검정으로 수행하였다.

결과

1:50, 1:100 및 1:150의 Apo-AI 대 PC 비율 및 1 또는 3g/L의 정규 콜레이트 농도 또는 고갈된 콜레이트 농도(0.2g/L)를 갖는 rHDL 제형을 조사하였다. 식염수를 비히클로서 사용하고, CSL111은 양성 대조군으로서 사용하였다. 기준선(시점: 0), 주입 말(1h 또는 2h, 각각 600 및 900mg/kg) 및 7h 또는 8h에 혈액을 샘플링하였다. 간 효소 활성(ALT 및 AST) 및 사람 Apo-AI 수준을 상기한 시점에서 평가하였다.

기준선에서의 AST 농도는 63 내지 87U/L의 범위였다. AST 농도는 주입 말 및 7h/8h 시점에서 Apo-AI:PC 1:50(콜레이트 0.2g/L)를 제외한 모든 제형에 대해 증가되었다.

기준선에서의 ALT 농도는 39 내지 45U/L의 범위였다. AST 농도는 주입 말 및 7h/8h 시점에서 Apo-AI:PC 1:50(콜레이트 0.2g/L)를 제외한 모든 제형에 대해 증가되었다.

기준선에서의 사람 Apo-AI 농도는 검출 최저 한계 이하였다. 주입 말에 농도는 600mg/kg으로 투약된 모든 제형에 대해 약 13g/L로 증가되었다. 900mg/kg에서의 제형 1:50은 15g/L의 Apo-AI 농도를 가졌다.

모든 그룹, 용량 및 시점에 대한 평균 및 표준 편차가 표 2 내지 표 4에 제공된다.

결과

결론적으로, 900mg/kg에서의 rHDL 제형 Apo-AI:PC 비율 1:50(0.2g/L 콜레이트)만이 간 기능 시험 이상을 유발하지 않았다. 이와는 대조적으로, 600mg/kg에서의 높은 콜레이트 수준(3g/L)을 갖는 1:50 rHDL 제형은 AST 및 ALT 모두 증가된 수준을 보였다. 이는 rHDL 제형의 지질 및 잔류 세제 함량을 조절함으로써 간 독성이 가장 최소화된다는 것을 제시한다.

실시예 3

rHDL 제형 중의 콜레이트 수준을 비교하는 안정성 시험

본 발명의 rHDL 제형의 일 실시형태는 종래 기술의 rHDL 제형 CSL111과 비교하여 상당히 감소된 간 독성을 보이며, CSL11과 적어도 동등한 생물학적 활성을 유지한다. 이러한 rHDL 제형은 더욱 낮은 단백질 대 PC 비율, 더욱 낮은 수준의 콜레이트, 더욱 높은 단백질 함량 및 감소된 슈크로스 농도가 CSL11과 구별된다.

재구성된 HDL 제형

출발 물질 Apo - AI

출발 물질로서, 정제되고 저온살균된 Apo-AI 용액을 사용하였다. 배치 크기는 30g 또는 35g 단백질이었다.

지질 용액

지질 용액의 제조를 위한 제조법이 하기에 제공된다. 우선, 10mM Tris, 10mM NaCl 및 1mM EDTA를 포함하는 완충 용액을 만들었다. 필요량을 수학식 1에 따라 계산하였다:

다음, 나트륨 콜레이트(1.3mol/mol 지질)를 상기 용액에 첨가하고 용해시켰다.

이어서, 계산된 양의 지질을 도입하고(수학식 2), 혼합물을 6시간 내지 18시간 동안 약하게 교반한 후(지질 용해됨), 0.2μm Millipak 40 Gamma Gold(Millipore Art. MPGL04GH2)(미리멸균된 필터 셋업)을 사용하여 여과시켰다.

M(지질): PC에 대해서는 775g/mol; SM에 대해서는 731g/mol

M(Apo-AI): 28'078g/mol

지질 인큐베이션 및 UF / DF

Apo-AI 용액(30g 내지 35g 단백질)을 5L 이중 자켓 용기에 넣고, 1 내지 4℃로 냉각시켰다. 이어서, 지질 용액을 첨가하고, 1 내지 4℃에서 2 내지 16시간 동안 교반하였다. 일부 실험에 대해서는 단백질-지질 용액을 30℃에서 30분 동안 가열하고, 냉각시킨 후, 1 내지 4℃에서 2 내지 16시간 동안 인큐베이션하였다.

콜레이트를 제거하기 위해서, 1% 슈크로스 용액의 7 내지 9 용적에 대해 10kDa 카세트로 UF/DF를 수행하였다.

이어서, 이 용액을 22 내지 28g/L(FP에서 20g/L 단백질 농도) 또는 32 내지 38g/L(FP에서 30g/L 단백질 농도)로 농축시킨 후, 슈크로스 및 WFI를 첨가해 7.5% 슈크로스 및 20g/L 또는 30g/L 단백질로 만들었다. rHDL 벌크를 멸균 여과시키고(Sartopore 2, 150cm², PES, 컷 오프 0.1μm, Sartorius Art. 5441358K4--00), 층류(laminar flow)에 채웠다.

앰버라이트를 사용한 콜레이트의 감소

앰버라이트의 제조

모든 여과 단계를 Nalgene 0.2μm PES 필터(Art. 595-4520)로 수행하였다.

Amberlite XAD-2(400g)를 500mL 메탄올 20%(v/v)에 첨가하였다. 현탁액을 1 내지 2시간 동안 교반시킨 후, 앰버라이트를 여과제거하였다. 이어서, 300ml의 1M NaOH를 1000mL 비이커에 넣고, 앰버라이트를 첨가한 후, 15분 동안 교반 하에 55 내지 60℃로 가열하였다. 앰버라이트를 여과제거한 후, 이러한 절차를 다시 2회 반복하였다. 이어서, 앰버라이트를 pH가 중성이 될 때까지 물(SWA)(약 10 내지 15L)로 세척하고, 여과제거한 후, 300mL 메탄올에 첨가하고, 1시간 동안 교반한 후, 혼합물을 적어도 밤새 2 내지 8℃에 방치하였다. 메탄올을 제거하기 위해, 앰버라이트를 여과제거하고, 약 10L의 물(SWA)로 세척한 후, 다시 여과제거하였다. 이어서, 앰버라이트를 약 4L 슈크로스 용액(7.5% 또는 10%)(고갈되는 재구성된 HDL의 슈크로스 농도에 상응)에 부었다. 혼합물을 수분 동안 교반하고, 사용하기 직전에 여과제거시켰다.

앰버라이트를 사용한 콜레이트의 감소

재구성된 HDL을 2 내지 8℃로 냉각시키고, Amberlite XAD-2를 첨가한 후, 혼합물을 3.5시간 동안 교반하였다. 앰버라이트를 여과제거하고, 방출시켰다. 이 단계를 2회 수행하였다.

실험에 따라, 5g의 단백질에 대해 각각의 고갈 단계 동안 100 내지 160g의 앰버라이트를 사용하였다.

고갈 후, 콜레이트를 다시 첨가해 상이한 콜레이트 농도를 만들었다.

재구성된 HDL 1:75 PC의 콜레이트 농도를 0.7g/L로 감소시키기 위해, 첨가되는 앰버라이트의 양을 앰버라이트를 재구성된 HDL에 상이한 비율로 첨가함으로써(예비 실험) 실험적으로 측정하였다. 이들 실험으로, 50g 앰버라이트/5g 단백질을 사용한 한 번의 처리가 필수적인 것으로 밝혀졌다. 이어서, 이러한 앰버라이트 대 단백질 비율을 주요 배치물의 고갈에 이용하였다.

안정성 평가

CSL111

본 발명자들이 간독성에 영향을 미칠 수 있다고 가정한 하나의 화합물은 콜레이트이다. 따라서, 최종 제형에서의 콜레이트의 감소가 주요 목표였다. 초기 실험은 CSL111로 수행되었다. 안정한 생성물이 보장되는 최소 콜레이트 농도를 밝히기 위해, 재구성된 CSL111을 앰버라이트로 처리한 후, 콜레이트를 다시 첨가해 상이한 농도를 만들었다.

안정성 평가를 이들 물질에 대해 수행하였다. 또한, 상이한 콜레이트 농도를 갖는 CSL111의 안정성에 대한 동결건조의 영향을 조사하였다.

재구성된 HDL 1:50 PC / 1:75 PC

2개의 제형(1:50 PC 및 1:75 PC)에 대해 앰버라이트를 사용하여 콜레이트를 고갈시킨 후, 콜레이트를 보충하여 상이한 콜레이트 농도를 만들었다. 이들 용액을 동결건조시키고, 재구성한 후, 안정성을 조사하여 이들 제형의 안정성을 보증하는데 필수적인 최소로 요구되는 콜로이트 농도를 측정하였다.

결과

CSL111 에 대한 결과

CSL111을 앰버라이트로 처리하여 콜레이트를 제거하였다. 이어서, 콜레이트를 첨가하여 연구에 필요한 상이한 농도를 얻었다.

2.8g/L 이하의 콜레이트 범위에서는 콜레이트 농도가 더욱 감소함에 따라 탁도가 증가되었다. 2.8g/L 초과의 콜레이트 농도에서는, 탁도 값의 변화가 거의 검출되지 않았다(도 3).

이어서, 이들 샘플을 동결건조시키고, 재구성하였다. 0시간, 24시간 및 7일 저장한 후 탁도를 측정하였다. 동결건조 및 재구성 후의 탁도 값은 동결건조되지 않은 샘플보다 높다(도 3 및 도 4 비교).

재구성된 CSL111 입자는 안정성을 유지하는데 최소 콜레이트 농도를 필요로 하는 것으로 보인다. 콜레이트 농도가 너무 낮으면, 응집되고 혼탁해진다. 또한, 분자 크기 분포도 낮은 콜레이트 농도에서 더욱 빠르게 변화한다.

재구성된 HDL 1:50 PC

탁도에 대한 데이터가 도 5 및 도 6에 나타나 있다.

탁도 데이터는 0.3g/L 이상의 콜레이트 농도에 대해 RT에서의 변화가 적다는 것을 나타냈다.

RT에서 24시간 후의 SE-HPLC 크로마토그램(데이터 도시되지 않음)은 탁도 값과 동일한 경향을 입증하였다. 0.3g/L 이상의 콜레이트 농도에서 변화가 적다. 0.8 내지 1.0g/L에서 크로마토그램은 거의 차이가 없다. 따라서, 콜레이트 농도가 1.0g/L 이상으로 증가되는 경우, 안정성 증가가 얻어지지 않는 것으로 예상된다. 따라서, 20g/L 단백질을 갖는 1:50 제형에 대해, 0.3 내지 1.0g/L의 콜레이트 농도가 최적인 것으로 간주된다. 30g/L 단백질을 포함하는 생성물에 대해 계산하면, 최적 콜레이트 농도는 0.5 내지 1.5g/L 범위일 것이다.

재구성된 HDL 1:75 PC

1:75 제형의 탁도 측정(도 7 및 도 8)은, 0.6g/L 이하의 콜레이트 농도에 대해 뚜렷한 증가를 보인다. 다른 농도(0.6 내지 2.0g/L 콜레이트)에 대한 1일 저장 후의 차이는 적다.

RT에서 24시간 후의 분자 크기 분포의 SE-HPLC 크로마토그램(데이터 도시되지 않음)은 고갈된 샘플과 다른 샘플 사이에 뚜렷한 차이를 보였다.

1.0 내지 1.3g/L 콜레이트에서, 크로마토그램은 거의 차이를 보이지 않았다. 따라서, 1.3g/L 초과의 콜레이트 농도에 대한 큰 안정성 증가는 기대되지 않는다. 따라서, 20g/L 단백질을 갖는 1:75 제형에 대해, 0.6 내지 1.3g/L의 콜레이트 농도가 최적인 것으로 간주된다. 30g/L 단백질을 갖는 제형에 대해, 이는 0.9 내지 2.0g/L 최종 콜레이트 농도에 상응한다.

결론

본 발명의 rHDL 제형에 대해 0.5 내지 1.5g/L의 최적 콜레이트 농도가 선별되었다. 이러한 범위 이하에서는 안정성이 감소되고, 1.5g/L 초과의 콜레이트 농도는 안정성을 약간 증가시켰다. 그러나, 높은 콜레이트 농도에서는 감지할 수 있는 간 독성의 증가가 예상될 수 있다.

실시예 4

CSL111을 사용한 간 독성 시험 비교

도입

본 연구의 목표는 본 발명의 일 실시형태의 rHDL 제형을 토끼에 정맥내 주입한 후 이에 대한 유리한 간독성 프로필을 확인하는 것이다. 간독성은 혈청 내 증가된 간 효소(ALT) 활성으로 정의된다. Apo-AI는 모든 제형의 활성 성분인 것으로 간주되고, Apo-AI의 혈장 수준은 노출의 주요 지표이다.

재료 & 방법

시험 rHDL 제형의 투여

시험 rHDL 제형 1

물질/INN: rHDL CSL111

제조자: CSL Behring AG, Bern

로트 번호: E502-03750-00005

용량: 75mg/kg b.w.

경로: i.v.

빈도: 주입 t = 0 내지 40분

적용 용적: 4.95mL/kg/h

시험 rHDL 제형 2

물질/INN: rHDL (PC 1:55)

제조자: CSL Behring AG, Bern

로트 번호: 1003.E009.01

용량: 75mg/kg b.w.

경로: i.v.

빈도: 주입 t = 0 내지 40분

적용 용적: 3.87mL/kg/h

연구 디자인

본 연구는 총 6마리의 암컷 토끼에서 개방식 2-아암 시험으로 디자인되었다. 투약 요법이 표 5에 요약되어 있다.

처리 그룹

실험 동물

종: 토끼

스트레인: CHB

동물의 수, 성별: 6 (암컷)

공급: Fa. Bauer (Neuenstein-Lohe, Germany)

체중: 3.1 내지 3.3kg

도착시 나이: 약 3 내지 4개월

하우징: 와이어스틸 케이지; 동물 1마리/케이지

베딩: 없음

물: 수돗물, 임의 공급

음식: Deukanin Pellets(Deuka), 임의 공급

명/암: 12h / 12h

온도: 21 내지 23℃

상대 습도: 50%

동물 모델

동물들을 통제 디바이스(토끼 홀더)에 고정시켰다. i.v. 카테터를 귀 정맥에 꽂았다. 시험 물품을 40분 i.v.주입으로 제공하였다. 혈액 샘플을 귀 동맥으로부터 채혈하고, 혈청 및 스트렙토키나제-혈장(5%) 바이알에 수집하였다. 혈액 샘플을 혈청으로 프로세싱하여 -20℃에서 저장하고, 혈장으로 프로세싱하여 -80℃에서 저장하였다.

간 효소의 측정

샘플들을 시판되는 효소적 광도측정 시험 키트(Greiner Biochemica)를 사용하여 ALT 활성에 대해 분석하였다.

Apo - AI 혈장 수준의 측정

사람 Apo-AI 측정을 비탁분석 검정으로 수행하였다.

결과

생체내 데이터의 평균 및 표준편차가 표 6 및 표 7에 제공된다.

본원에서 시험된 rHDL 제형의 실시형태는 ALT 혈청 수준을 증가시키지 않았다. CSL111은 ALT를 8시간에 25U/L로부터 94U/L까지 증가시켰다.

사람 Apo-AI의 피크 수준은 rHDL 제형(1.5mg/dL) 및 CSL111(1.6mg/dL)에 대해 40분 시점에서 나타났다.

실시예 5

본 발명의 합성 HDL 입자 제조 능력을 낮은 인지질 수준을 포함하는 입자에 대해 측정하였다. Apo-AI 대 인지질의 비율은 1:2 내지 1:55의 범위였다.

합성 HDL 입자를 제조하기 위해서, 나트륨 콜레이트(New Zealand Pharmaceuticals)를 완충액(10mM NaCl, 1mM EDTA, 10mM TRIS, pH 8.0)에 용해시키고, 청명해질 때까지 교반하였다. 대두 포스파티딜-콜린(Phospholipid GmbH)을 적당한 용적의 콜레이트에 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. Apo-AI 용액을 10mM NaCl로 9.0g/L(OD280으로 측정)의 단백질 농도로 희석하고, 적합한 용적의 지질 용액과 혼합하여 적합한 단백질 대 지질 비율을 만들었다. 혼합물을 16시간 동안 2 내지 8℃에서 교반하였다. HiPrep 26/10 탈염 컬럼 상에서 실행(running) 완충액으로 1% 슈크로스를 사용하여 콜레이트를 제거함으로써 HDL 유사체를 제조하였다. 용출물을 한외여과로 각각 20g/L의 단백질 농도 및 7.5% 슈크로스로 농축시켰다.

재구성된 HDL 제제를 2 내지 8℃에서 인큐베이션하고(저장하고), 0일, 5일 및 14일 후에 하기 변수를 측정하였다:

- 투과(405nm), 입자 크기 분포(SE-HPLC), 내독소, SDS-PAGE(환원 및 비환원), Native PAGE, LCAT 활성화, Apo-AI 농도, 및 시험관내 독성

0일에 하기의 추가 시험을 수행하였다: i) 지질 함유 샘플에 대해 적응된 변형된 뷰렛(Biuret)에 의한 단백질 농도(데옥시콜레이트를 뷰렛 용액에 첨가하였다); ii) 포스파티딜-콜린 농도(ProDiagnostica mti-diagnostics GmbH); 및 iii) 콜레이트 농도를 비색계 갈사우렌(Gallsauren) 시험 키트 및 갈사우렌-스토프레아겐스(Gallsauren-Stoppreagens)(Trinity Biotech)로 측정하였다.

입자 크기 분포를 실행 완충액으로서의 PBS + 0.1% 아지드화나트륨과 Superose 6 10/300 GL 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 SE-HPLC로 측정하였다. 유속은 0.5mL/분이었으며, 5μL 샘픔을 주사하고, 280nm 파장에서 검출하였다. 합성 HDL 입자를 NuPAGE 노벡스 비스-트리스 겔(NuPAGE Novex Bis-Tris Gels) 4 내지 12%를 갖는 XCell 슈어록 미니-셀(XCell SureLock Mini-Cell) 및 MOPS 또는 MES 전기영동 완충액(Invitrogen)을 사용하여 SDS-PAGE(환원/비환원)로 분석하였다. 단백질 밴드를 바이오-세이프 쿠마시 염색(Bio-Safe Coomassie Stain)(Bio-Rad)으로 가시화하였다. Native PAGE를 Native Page Novex Bis-Tris Gels 4 내지 16%를 갖는 XCell SureLock Mini-cell 및 NativePAGE Running Buffer Kit(Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. 단백질 밴드를 GelCode Blue Stain Reagent(Thermo Scientific)로 가시화하였다. Apo-AI 농도를 3D CE 기구(Agilent technologies) 및 연장된 광 패쓰 CE 모세관(Extended Light Path CE capillary)(50μm, 56cm, 모두 Agilent Technologies 제품)을 사용하여 모세관 전기영동으로 측정하였다. 전기영동 완충액은 53mM Na-Borat pH 9.1, 0.21% SDS, 5% 메탄올이었다. 전기영동은 25kV에서 수행하였다.

LCAT 활성을 사중으로 측정하였다. 간단히, 10μL의 샘플을 냉각 튜브에 피펫팅하고, 150μL 사람 혈장, 150μL PBS 및 20μL 14C 콜레스테롤(Perkin Elmer)을 25mg/mL 사람 알부민 용액에 용해시킨 후, 혼합하고, 90분 동안 2 내지 8℃에서 인큐베이션하였다. 이중 샘플을 37℃에서 인큐베이션하고, 다른 2개의 샘플(블랭크)을 30분 동안 2 내지 8℃에서 인큐베이션하였다. 2mL 에탄올을 첨가해 반응을 정지시킨 후, 헥산으로 2회 추출하였다(1x5mL, 1x3mL). 헥산을 증발시켜 건조시키고, 잔사를 0.5mL 헥산에 재용해시켰다. 추출물을 2x1mL 헥산으로 용출시키면서 고체상 Amino SPE 컬럼을 통과시킴으로써 콜레스테롤 에스테르를 다른 물질로부터 분리시켰다. 용출물 중의 방사능을 섬광 베타 계수기로 측정하였다.

HEP-G2 세포 제조를 수반하는 시험관내 독성(1일): 하나의 T75 플라스크로부터의 HEP-G2 세포의 대수증식기 배양물을 취해, 배양 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하였다. 트립신 처리하고, 10mL 배양 배지(90% DMEM, 10% 불활성화된 FCS, 1% 비필수 아미노산, 1% Pen/Strep) 중에 재현탁한 후, 노이바우어/트리판 블루(Neubauer/Trypan blue)로 농도를 측정하였다. 100ul 세포(10 x 10⁴C/mL)/웰을 96-웰 F-바닥 플레이트에 씨딩하였다. 플레이트를 37℃/5% CO₂, 95% H₂O에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션(2일): 최고 농도 화합물의 700μL 샘플을 배양 배지 중에서 제조하였다. 웰의 제1 열로부터 배지를 제거하고, 200ul의 용액을 세포에 첨가하였다. 일련의 1:2 희석을 수행하고, 37℃/5% CO₂, 95% H₂O에서 72시간 동안 플레이트를 인큐베이션하였다. 생존력(3일): 50μL의 3x 뉴트랄 레드 용액(Neutral Red Solution)(100mL PBS 중의 70mg 뉴트랄 레드)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃/5% CO₂, 95% H₂O에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 웰을 200μL PBS/웰로 1회 세척한 후, 100μL 에탄올을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 20분 동안 셰이커에 두었다. 각각의 웰에서의 흡광도를 540nm에서 판독하였다.

상이한 비율의 인지질 대 단백질을 포함하는 합성 HDL 입자의 특성 요약이 표 8에 나타나 있다. 투과율(%)은 입자가 안정하였다는 것을 나타낸다. LCAT 값은 합성 입자 중에 존재하는 인지질의 수준이 감소됨에 따라 감소되었다. 이는 인지질이 LCAT에 대한 기질로서 작용한다는 것과 일치한다.

HPLC-SEC 결과는 1:20 및 1:30의 비율을 갖는 입자가 단일 대칭 피크로서 용출되었다는 것을 나타내었다. 낮은 수준의 지질 대 Apo-AI를 갖는 합성 HDL 입자는 1:5 및 1:2의 비율을 갖는 입자에서 더욱 두드러졌던 숄더(shoulder)를 포함하였다. 또한, 주요 피크의 용출 시간이 인지질 대 단백질 비율이 감소됨에 따라 점진적으로 늦어졌다. 이는 입자가 점진적으로 작아진다는 것을 나타낸다. 이러한 크기 변화는 또한 Native PAGE 결과에도 반영되고, 여기서, 저분자량 밴드가 비율이 1:55에서 1:2로 감소됨에 따라 증가하는 강도가 관찰되었다. SDS-PAGE는 모든 샘플에 대해 유사하였다.

시험관내 검정 결과는 각각의 제제에 대한 세포 생존력이 14일의 기간 내내 안정하였다는 것을 나타내었다. 세포를 최고 농도(2mg/mL)의 재구성된 HDL과 함께 인큐베이션하는 경우, 지질 수준의 증가와 함께 세포 생존력에 있어 약간의 감소가 관찰되었다(하기 표 9 참조).

실시예 6

상이한 세제를 사용하여 재구성된 합성 HDL 입자의 독성에 대한 효과를 조사하였다.

입자를 제조하기 위해 Amberlite XAD-2 비드를 밤새 20% 메탄올 중에서 인큐베이션한 후, 1M 수산화나트륨으로 4회 및 초순수 물로 2회 세척하여 세정하였다. 사용 전에 비드를 7.5% 슈크로스로 세척하고, 필터 상에서 건조시켰다.

합성 HDL 입자를 하기 방법으로 제조하였다. 잔류 콜레이트를 포함하는 냉동건조된 HDL 입자를 WFI를 사용하여 30g/L의 단백질 농도로 재구성하였다. Amberlite XAD-2 비드(10g/g 단백질)를 재구성된 HDL 제제에 가하고, 3.5시간 동안 진탕하면서 2 내지 8℃에서 인큐베이션하였다. 여과로 비드를 제거한 후, 이러한 절차를 Amberlite XAD-2 비드(10g 비드/g 단백질)의 다른 부분으로 1회 더 반복하였다. 이어서, 비드를 여과시켜 제거하고, 세제(콜레이트, 데옥시콜레이트, 옥틸글루코사이드, 폴리소르베이트 80)를 첨가해 1g/L 또는 6g/L의 최종 세제 농도를 수득하였다.

이어서, 샘플을 상기 실시예에서 측정된 바와 같이 안정성에 대해 시험하였다.

폴리소르베이트 80 제제에 대해, 세제 수준을 광도측정 검정으로 측정하였다: 1000μL 샘플 중의 단백질을 5mL 0.1M 암모늄 아세테이트로 침전시키고, 원심분리시켜 침강시켰다. 상청액을 증발시켜 건조시키고, 1mL 나트륨 테트라보레이트 완충액 pH 9.1(0.953g 나트륨 테트라보레이트, H₂O를 첨가하여 100mL가 되게 함, 10mL HCl를 가함)에 재용해시키고, 4mL TBPE-K 용액(1.76g 염화칼륨, 0.48g 나트륨 테트라보레이트, 4800μL 0.1M KOH, 5mL 에탄올 중의 0.015g TBPE-K, H₂O를 첨가하여 100mL가 되게 함)을 첨가한 후, 30분 동안 엔드-오버-엔드(end-over-end) 혼합기 상에서 2.5mL 디클로로메탄으로 추출하였다. 상 분리 후, 디클로로메탄 상의 흡광도를 611nm(참조 파장 700nm)에서 측정하였다.

상이한 비율의 인지질 대 단백질을 포함하는 합성 HDL 입자의 특성 요약이 표 10에 나타나 있다. 투과율(%) 및 LCAT 값은 입자가 안정하고 기능성이었다는 것을 나타낸다.

HPLC-SEC 결과는 상이한 세제를 갖는 입자가 단일 대칭 피크로서 용출되었다는 것을 나타내었다. 이는 또한 Native PAGE에서 관찰된 밴드 패턴에도 반영되었다. SDS-PAGE는 모든 샘플에 대해 유사하였다. 시험관내 검정 결과는 세포 생존력이 존재하는 세제의 수준에 따라 상이하다는 것을 나타내었다. 특히, 고수준의 세제는 세포 생존력을 감소시켰다. 그러나, 그 값은 14일 기간 내내 안정함을 유지하였다(표 11 참조).

실시예 7

POPC(NOF Corporation)를 HDL 입자를 재구성하는데 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 5에 기술된 바와 같이 합성 HDL 입자를 제조하였다. 이어서, 입자를 실시예 5에 기술된 방법에 따라 조사하였다.

그 결과, 대두 포스파티딜콜린으로 재구성된 합성 HDL 입자와 유사한 독성 특성을 나타내는 안정한/기능성 생성물을 나타낸다(표 12 및 표 13).

실시예 8

본 발명의 재구성된 HDL 제형의 상승 용량에 대한 안전성 및 내성 및 약동학을 건강한 지원자에서 단일 또는 다수 정맥내 주입에 의해 평가할 수 있다. 본 연구는 점증 용량으로 합성 HDL 입자를 사용하는 것을 수반하는 하나의 아암과 일반적인 식염수(0.9%) 위약 대조군을 사용하는 다른 아암을 갖는 2개의 아암을 갖는다. 주입은 무작위로 실시하며 이중 맹검으로 수행할 것이다(Subject, Investigator and Outcomes assessor).

건강한 지원자는 18세부터 55세까지의 적어도 45kg의 체중이 나가는 남성 또는 여성일 수 있다. 다른 참가 기준은 18 내지 42.0kg/m²의 신체 질량 지수(BMI)를 포함할 수 있다. 배제 기준은 i) 임상적으로 유의한 의학적 병태, 장애 또는 질환의 증거; ii) 간담즙성 질환의 증거; iii) 임상적으로 관련된 이상 실험실 시험 결과의 증거; 및 iv) 알콜 또는 물질 남용 이력의 증거를 포함할 수 있다.

안전성 및 내성은 i) 주입 후 14일까지 약물 관련된 임상 부작용의 빈도; 및 ii) 주입 후 14일까지 간 기능 시험 측정(예: 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)의 증가)에 의해 측정될 것이다. 약동학적 정보는 합성 HDL 입자의 주입 후 10일까지 측정될 수 있다. 특정 측정은 지질단백질의 혈장 수준을 측정하는 것을 포함할 것이다.

결론

본 발명의 rHDL 제형이 개선된 독성 프로필을 가지면서도 생물학적 활성을 보유하는지를 시험하기 위해 본 발명의 rHDL 제형 실시형태들 및 CSL111 제형을 평가하였다. CSL111은 1:150의 비율을 갖는 반면, 본 발명의 rHDL 제형은 1:40 또는 1:55의 감소된 Apo-AI 대 PC 비율을 갖는다. 또한, 추가의 정제에 의해 제형 중의 콜레이트를 실질적으로 감소시켰다. 그 결과, 본 발명의 제형은 CSL111에 비해 감소된 간 독성을 나타낸다. 중요하게도, Apo-AI의 혈청 수준이 두 제형 모두 유사하였으며, 이는 활성 성분에 대한 유사한 노출을 나타내는 것이다(표 7 참조).

본 명세서의 전반에 걸쳐서 본 발명을 임의의 하나의 실시형태 또는 특정한 특징의 집합으로 제한하지 않으면서 본 발명의 바람직한 실시형태를 기술하고자 했다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변경이 기술된 실시형태에 가해질 수 있다.

본 명세서에서 언급되는 각각의 특허 및 과학 문헌, 컴퓨터 프로그램 및 알고리즘에 대해 기술은 전체가 참조로 삽입된다.

Claims

아포지질단백질 또는 이의 단편; 지질; 및 사람에게 투여시 간 독성을 나타내는 재구성된 고밀도 지질단백질(rHDL) 제형 중에 존재하는 수준의 약 5 내지 50% 수준의 세제를 포함하는, 재구성된 고밀도 지질단백질(rHDL) 제형.
제1항에 있어서, 상기 세제의 수준이 간 독성을 나타내는 수준의 약 5 내지 10%인, rHDL 제형.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세제의 수준이 약 0.5 내지 1.5g/L인, rHDL 제형.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세제의 수준이 약 0.015 내지 0.030g/g 아포지질단백질인, rHDL 제형.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세제가 담즙산염 또는 담즙산인, rHDL 제형.
제6항에 있어서, 상기 세제가 나트륨 콜레이트인, rHDL 제형.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아포지질단백질이 Apo-AI 또는 이의 단편인, rHDL 제형.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질이 인지질인, rHDL 제형.
제8항에 있어서, 상기 인지질이 포스파티딜콜린인, rHDL 제형.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질이 간 독성을 나타내는 수준의 20 내지 70% 수준인, rHDL 제형.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 안정화제를 추가로 포함하는, rHDL 제형.
사람에게 투여시 간 독성을 나타내는 재구성된 고밀도 지질단백질(rHDL) 제형 중에 존재하는 수준의 약 5 내지 50% 수준의 세제를 제공하는 단계를 포함하는, 아포지질단백질; 지질; 및 세제를 포함하는 rHDL 제형을 제조하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 세제의 수준이 간 독성을 나타내는 수준의 약 5 내지 10%인, 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 세제의 수준이 약 0.5 내지 1.5g/L인, 방법.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세제의 수준이 약 0.015 내지 0.030g/g 아포지질단백질인, 방법.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세제가 담즙산염 또는 담즙산인, 방법.
제16항에 있어서, 상기 세제가 나트륨 콜레이트인, 방법.
제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아포지질단백질이 Apo-AI 또는 이의 단편인, 방법.
제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질이 인지질인, 방법.
제19항에 있어서, 상기 인지질이 포스파티딜콜린인, 방법.
제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질이 간 독성을 나타내는 수준의 20 내지 70% 수준인, 방법.
제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
(A) Apo-AI 용액에, 유기 용매 부재 하의 포스파티딜콜린, 및 콜레이트 세제를 첨가하는 단계;
(B) 단계 (A)에서 제조된 용액 중의 콜레이트 세제의 수준을 약 0.03g/g Apo-AI로 감소시키는 단계; 및
(C) 단계 (B)의 용액에 안정화제를 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
제12항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득가능한, rHDL 제형.
제1항 내지 제11항 또는 제23항 중 어느 한 항에 따른 재구성된 고밀도 지질단백질(rHDL) 제형을 사람에게 투여하여 사람의 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 단계를 포함하는, 사람에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 심혈관 질환, 고콜레스테롤혈증 또는 저콜레스테롤혈증을 포함하는, 방법.
제25항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 급성 관상동맥 증후군(ACS), 죽상 동맥경화증 및 심근 경색을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제11항 또는 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 사람에서 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한, rHDL 제형.
제27항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 심혈관 질환, 고콜레스테롤혈증 또는 저콜레스테롤혈증을 포함하는, rHDL 제형.
제28항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 급성 관상동맥 증후군(ACS), 죽상 동맥경화증 및 심근 경색을 포함하는, rHDL 제형.