CN1668645A

CN1668645A - 治疗缺血再灌注的方法和组合物

Info

Publication number: CN1668645A
Application number: CNA038169738A
Authority: CN
Inventors: C·L·比斯盖尔
Original assignee: Esperion Therapeutics Inc
Current assignee: Esperion Therapeutics Inc
Priority date: 2002-05-17
Filing date: 2003-05-16
Publication date: 2005-09-14
Also published as: EP1556413A4; BR0310100A; NZ537006A; WO2003097696A1; EP1556413A1; AU2003234625A1; KR20050010006A; US20040038891A1; IL165253A0; MXPA04011227A; CA2485989A1; JP2006502976A; PL374126A1

Abstract

本发明提供了治疗或预防缺血再灌注损伤的方法和组合物。本发明的方法包括给予包含载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶的组合物治疗、减少或预防缺血再灌注损伤。

Description

治疗缺血再灌注的方法和组合物

本专利申请要求美国临时申请系列号60/381,653(2002年5月17日递交)和60/405,478(2002年8月23日递交)的优先权，它们的全部内容并入这里作为参考。

1.技术领域

本发明提供了用包含载脂蛋白或载脂蛋白激动剂的组合物治疗、减少或预防缺血再灌注损伤的方法。

2.发明背景

再灌注之后的缺血是哺乳动物骨骼肌和心肌损害的主要原因。缺血是由于血流减少使得供给组织或器官的氧气减少造成的，并可以引起器官机能障碍。血液供应减少可以由脉管血栓形成造成闭塞或血流转向而引起，如心肌梗塞、狭窄、意外脉管损伤或手术过程。随后充氧的血液向组织充足供给的重建可以导致增加的损害，这已知是缺血再灌注损伤或闭塞再灌注损伤的过程。缺血再灌注损伤产生的并发症包括中风、致命或非致命性心肌梗塞、心肌重建、动脉瘤、外周血管病变、组织坏死、肾功能衰竭和术后肌肉张力丧失。

缺血可以继发引起闭塞事件，包括狭窄或血栓形成。狭窄可以由于医学情况如动脉粥样硬化引起，或在手术过程中诱发。例如，手术过程(膝、手、髋和肩手术)、组织移植、心脏操作包括冠状动脉旁路移植(CABG)和经皮腔内冠状动脉血管成形术(PTCA)都可以减少或中断血流并诱发缺血和形成再灌注损伤阶段。此外，在受体的输送和随后移植中，收集的供体组织和器官也容易出现再灌注损伤。

氧自由基被认为是参与缺血/再灌注的病理生理的重要成分(见Banerjee et al.，2002，BMC Pharmacol.2(1)：16；Demir and Inal-Erden1998，Clin.Chim.Acta 275(2)：127-35；Fukuzawa et al.，1995，Transplantation 58(1)：6-9；Sewerynek et al.，1996，Hepatogastroenterology 43(10)：898-905；Serteser et al.，2002，J.Surg.Res.107(2)234-40)。

在动物模型中，已经显示出反应性氧与各种组织和器官的再灌注损伤有关，包括肾、脑、肝和心脏。(Sener et al.，2002，J.Pineal Res.32(2)：120-6；Sener et al.，2003，Life Sci.72(24)：2707-18；Ding-Zhou etal.，2003，J.Pharmacol.Exp.Ther.[网络出版物早于2003年5月2日的印刷出版物]PMID：12730357；Katamaya et al.，1997，Tokai J.Exp.Clin.Med.22(2)：33-44；Grech et al.，1996，Am.J.Cardiol.77(2)：122-7)。

在人中，反应性氧也被认为介导缺血再灌注损伤。黄嘌呤氧化酶负责心肌再灌注过程中氧自由基的释放(参见Guan et al.，1999，Jpn.Cir.J.63(12)：924-8)。用黄嘌呤氧化酶抑制剂-别嘌醇预先治疗急性心肌梗塞后经受冠状动脉手术或PTCA的患者，可改善心脏健康。例如，与对照组相比，用别嘌醇预先治疗患者显示心律失常发作减少和左心室功能改善(Bochenek et al.，1990，Eur.J.Cardiothorac.Surg.4(10)：538-42；Guan et al.，2003，J.Cardiovas.Pharmacol.41(5)：699-705)。

缺血性损伤也可以由于炎症前细胞因子、化学趋化剂和其它调节剂如来自上皮或内皮细胞的肿瘤坏死因子、白介素和干扰素的释放而发生。(Furuicha et al.，2002，Drug News Perspect.15(8)：477-82；Donnahoo et al.，1999，J.Urol.162(1)：196-203；Yoshimoto et al.，1997，Acta Neuropathol.(Berl)93(2)：154-8；Sung et al.，2002，Kidney Int.62(4)：1160-7；Maekawa et al.，2002，J.Am.Coll.Cardiol.39(7)：1229-35)。细胞因子的释放，反过来吸引多数细胞，如白细胞，包括中性粒细胞粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，它们有助于炎性级联(Taub 1996，Cytokine Growth Factor Rev.7(4)：355-76；Krishnadasan et al.，2003，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.125(2)：261-72；Krishnaswamy et al.，1999，J Interferon Cytokine Res.19(2)：91-104；Sener et al.，2003，Life Sci.73(1)：81-91；Yue，et al.，2001，Circulation 104(21)：2588-94)。

已经对各种药物作为治疗或预防缺血再灌注损伤的潜在有效剂进行研究，包括已酮可可碱、N-乙酰半胱氨酸、大蒜、褪黑激素、维生素C和BN 80933(一种神经元一氧化氮合成酶抑制剂和抗氧化剂)，取得了有限的成功(Demir and Inal-Erden 1998，Clin.Chim.Acta 275(2)：127-35；Banerjee et al.，2002，BMC Pharmacol.2(1)：16；Fukuzawaet al.，1995，Transplantation 58(1)：6-9；Sener et al.，2002，J.Pineal Res.32(2)：120-6；Ding-Zhou et al.，2003，J.Pharmacol.Exp.Ther.[网络出版物早于2003年5月2日的印刷出版物]PMID：12730357；Guan et al.，1999，Jpn.Cir.J.63(12)：924-8)。

目前，缺血治疗集中于尽可能快速恢复血流。例如急性心肌梗塞(AMI)之后快速治疗是预防长期损伤的关键。AMI开始后24小时以上溶栓治疗不能改善临床后果。AMI后使用PTCA再血管化仍有争论，但研究表明AMI后48小时内实施PTCA有益处。指出的益处包括，例如AMI后预防左室重建、减少左室重建和动脉瘤，改善左室壁运动和减少心脏事件5年的时间。(Kanamasa etal.，2000，J.Thromb.Thrombolysis 9(1)：47-51；Kanamasa et al.，1 996，J.Cardiol.28(4)：199-205；Horie et al.，1998，Circulation 98(22)：2377-82；Kanamasa et al.，2000，Angiology 51(4)：281-8)。

尽管溶栓治疗和PTCA用于再灌注，但是都具有明显的缺陷。例如，具有活动性内出血、脑血管意外事件病史、颅内或脊柱内手术或外伤、动静脉畸形或动脉瘤、颅内瘤、易出血体质(bleeding diathesis)和严重不可控制的高血压的患者禁忌溶栓治疗(Drug Facts andComparisons，每月更新，January 2003，Facts and Comparions，WolterKluwer Company.，St.Louis，MO).PTCA是创伤性过程并且带有其自身的风险，包括死亡、心肌梗塞和中风，并且以前存在心脏健康状况差和凝血障碍的患者相对禁忌(The Merck Manual，17^th ed.(Beersand Berkow，Eds.)Merck Research Laboratories，Whitehouse Station，N.J.，1999，p，1628-9)。

甚至当溶栓或PTCA可以用于需要再灌注的患者时，两者都不能治疗或预防缺血再灌注损伤。因此需要治疗或改善缺血再灌注损伤的症状的新方法和组合物。

3.发明概述

因此，本发明提供了治疗、减少或预防缺血再灌注损伤的方法和组合物。该方法提供了使用包含载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶(paroxonase)的组合物治疗、减少或预防缺血再灌注损伤。本发明的方法包括给予本发明的缺血再灌注损伤剂。令人惊奇的是，已经发现给予缺血再灌注损伤剂可以治疗、减少或保护个体不受缺血再灌注损伤的危害。

在一个方面，本发明提供了通过给予有效量的缺血再灌注损伤剂来治疗、减少或预防缺血再灌注损伤的方法。在本发明的某些实施方案中，该剂可以是载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶。在具体实施方案中，该缺血再灌注剂是载脂蛋白。载脂蛋白可以是任何载脂蛋白，包括例如，载脂蛋白A-I或其变异体或片段。在某些实施方案中，载脂蛋白是含硫醇硫醇基的载脂蛋白。在本发明的优选实施方案中，载脂蛋白是载脂蛋白A-I Milano(ApoA-I_M)。

在某些实施方案中，缺血再灌注剂可以以包含载脂蛋白和脂类的复合物形式给予。优选，脂类是磷脂。磷脂可以是本领域技术人员已知的任何磷脂。在本发明的优选实施方案中，磷脂可以是磷脂酰胆碱或其衍生物或类似物，如1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱。

本发明的方法和组合物在本文治疗、减少或保护不受缺血再灌注损伤的危害可能有效的任何内容中有用。在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可以保护肌肉或器官如，例如心脏、肝、肾、脑、肺、脾和产生类固醇的器官(如甲状腺、肾上腺和性腺)不受由缺血再灌注损伤引起的损害。在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可以在移植物摘取、转移和移植给移植受体过程中保护组织、肌肉或器官。

4.附图说明

图1提供了两种载脂蛋白A-I Milano链的图；

图2提供了兰根道尔夫氏(Langendorff)装置非体内治疗和检测分离的兔心脏的心功能的图；

图3提供了安装在兰根道尔夫氏装置中的心脏的更近的视图；

图4提供了在缺血开始前用载体或ETC-216处理分离的心脏的方案实例；

图5提供了冠状静脉流出物中肌酸激酶的活性；

图6提供了从兰根道尔夫氏装置中载体和ETC-216处理的分离的兔心脏收集的心功能的实时监测；

图7提供了30分钟普遍缺血停博以及60分钟再灌注之前、过程中和之后，分离的兔心脏的左室发展压(LVDP)的时间改变；

图8提供了30分钟普遍缺血停博以及60分钟再灌注之前、过程中和之后，分离的兔心脏的左室舒张末压(LVEDP)的时间改变；

图9提供了30分钟普遍缺血停博以及60分钟再灌注之前、过程中和之后，分离的兔心脏的冠状灌注压(CPP)的时间改变；

图10提供了进行30分钟普遍缺血停博，随后60分钟再灌注的载体和ETC-216处理的兔心脏的组织匀浆中脂类氢过氧化物的含量；

图11提供了来自载体和ETC-216处理的兔心脏的心肌样品的电子显微镜图像；

图12提供了本发明另外的方案，其中急性处理组在缺血开始前给予一次预处理，慢性处理组在缺血开始前给予两次预处理；

图13提供了确定梗塞大小的方案；

图14提供了用ETC-216(100mg/kg)或等量载体处理一次(即急性处理)或处理两次(即慢性处理)的兔的风险区的梗塞百分比，左室梗塞百分比和左室的风险区百分比；

图15提供了本发明另外的方案，其中在缺血开始前用载体(第1组)或10，3或1mg/kg ETC-216(第2组)预处理兔；

图16提供了每组用10，3或1mg/kg ETC-216或等量蔗糖-甘露醇载体处理一次(即急性处理)的兔中确定的风险区的梗塞百分比，左室梗塞百分比和左室的风险区百分比；

图17提供了脂蛋白未酯化胆固醇的时间改变；

图18提供了本发明另外的方案，其中在30分钟缺血期的最后5分钟期间给予载体或ETC-26的单次处理；和

图19提供了兔中确定的风险区的梗塞百分比，左室梗塞百分比和左室的风险区百分比。

5.发明详述

本发明提供了用预防再灌注损伤剂治疗、减少或预防缺血再灌注损伤的方法。该药剂可以是这里描述的任何预防缺血再灌注损伤剂，包括例如载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶。

5.1.载脂蛋白

在一个方面，本发明提供了通过给予包含载脂蛋白的组合物治疗、减少或预防缺血再灌注损伤的方法。这里使用的术语“载脂蛋白”是指本领域技术人员已知的载脂蛋白及其变异体或片段以及如下所述的载脂蛋白激动剂，其类似物或片段。

载脂蛋白可以是有效治疗或预防缺血再灌注损伤的任何载脂蛋白。合适的载脂蛋白包括但不限于ApoA-I，ApoA-II，ApoA-IV，ApoA-V和ApoE，和活性多晶型形式、同工型、变异体和突变体以及其片段或截短形式。在某些实施方案中，载脂蛋白是含硫醇基的载脂蛋白。“含硫醇基的载脂蛋白”是指含有至少一个半胱氨酸残基的载脂蛋白、变异体、片段或同工型。最常见的含硫醇基载脂蛋白是含有一个半胱氨酸残基的ApoA-I Milano(ApoA-IM)和ApoA-I Paris(ApoA-Ip)(Jia etal.，2002，Biochem.Biophys.Res.Comm.297：206-13；Bielicki and Oda，2002，Biochemistry 41：2089-96)。ApoA-II，ApoE2和ApoE3也是含硫醇基的载脂蛋白。在某些实施方案中，载脂蛋白不是含硫醇基的载脂蛋白，如ApoA-I。

在某些实施方案中，载脂蛋白可以是其成熟形式，其前载脂蛋白原形式或其前载脂蛋白形式。本发明的范围内也可以利用ApoA-I的前体和成熟体(Duverger et al.，1996，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16(12)：1424-29)，ApoA-I Milano(Klon et al.，2000，Biophys.J.79：(3)1679-87；Franceschini et al.，1985，J.Biol.Chem.260：1632-35)，ApoA-IParis(Daum et al.，1999，J.Mol.Med.77：614-22)，ApoA-II(Shelnesset al.，1985，J.Biol.Chem.260(14)：8637-46；Shelness et al.，1984，J.Biol.Chem.259(15)：9929-35)，以及ApoA-IV(Duverger et al.，1991，Euro.J.Biochem.201(2)：373-83)，和ApoE的(McLean et al.，1983，J.Biol.Chem.258(14)：8993-9000)的同源和异源二聚体(可行的地方)。

在某些实施方案中，载脂蛋白可以是载脂蛋白的片段、变异体或同工型。术语“片段”是指具有短于天然载脂蛋白的氨基酸序列并且该片段保留了天然载脂蛋白活性的任何载脂蛋白，包括结合脂类的性质。“变异体”是指载脂蛋白的氨基酸序列中的置换或改变，其中置换或改变，如氨基酸残基的插入和缺失，不消除天然载脂蛋白的活性，包括结合脂类的性质。因此，变异体可以包含具有与这里提供的天然载脂蛋白基本上等同的氨基酸序列的蛋白或肽，其中一个或多个氨基酸残基已经被化学上类似的氨基酸保守置换。保守置换的实例包括至少一个疏水残基的置换，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个。同样，本发明包括例如至少一个亲水残基的置换，例如精氨酸和赖氨酸之间，谷酰胺和天冬酰胺之间和甘氨酸和丝氨酸之间(见美国专利6,004,925，6,037,323和6,046,166)。术语“同工型”是指具有相同、更大或部分功能和类似，等同或部分序列的蛋白，并且可以是或不是相同基因的产物并通常是组织特异性的(见Weisgraber 1990，J.Lipid Res.31(8)：1503-11；Hixson and Powers 1991，J.Lipid Res.32(9)：1529-35；Lackner etal.，1985，J.Biol.Chem.260(2)：703-6；Hoeg etal.，1986，J.Biol.Chem.261(9)：3911-4；Gordon et al.，1984，J.Biol.Chem.259(1)：468-74；Powell et al.，1987，Cell 50(6)：831-40；Aviram et al.，1998，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.18(10)：1617-24；Aviram et al.，1998，J.Clin.Invest.101(8)：1581-90；Billecke et al.，2000，Drug Metab.Dispos.28(11)：1335-42；Draganov et al.，2000，J.Biol.Chem.275(43)：33435-42；Steinmetz and Utermann 1985，J.Biol.Chem.260(4)：2258-64；Widler et al.，1980，J.Biol.Chem.255(21)：10464-71；Dyer etal.，1995，J.Lipid Res.36(1)：80-8；Sacre et al.，2003，FEBSLett.540(1-3)：181-7；Weers，et al.，2003，Biophys.Chem.100(1-3)：481-92；Gong etal.，2002，J.Biol.Chem.277(33)：29919-26；Ohta et al.，1984，J Biol.Chem.259(23)：14888-93和美国专利6,372,886)。在某些实施方案中，本发明的方法和组合物包括使用载脂蛋白的嵌合构建体。例如，载脂蛋白的嵌合构建体可以由具有高度结合脂类能力的载脂蛋白区域结合含有缺血再灌注保护性能的载脂蛋白区域组成。载脂蛋白的嵌合构建体可以是包括载脂蛋白内间隔区域的构建体(即同源构建体)或嵌合构建体可以是包括不同载脂蛋白之间间隔区域的构建体(即异源构建体)。包含嵌合构建体的组合物也包括载脂蛋白变异体的片段或设计具有特殊特性的片段(如结合脂类、结合受体、酶、酶激活、抗氧化或还原-氧化性质)(见Weisgraber 1990，J.Lipid Res.31(8)：1503-11；Hixson andPowers1991，J.Lipid Res.32(9)：1529-35；Lackner et al.，1985，J.Biol.Chem.260(2)：703-6；Hoeg etal.，1986，J.Biol.Chem.261(9)：3911-4；Gordon etal.，1984，J.Biol.Chem.259(1)：468-74；Powell et al.，1987，Cell 50(6)：831-40；Aviram et al.，1998，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.18(10)：1617-24；Aviram et al.，1998，J.Clin.Invest.101(8)：1581-90；Billecke et al.，2000，Drug Metab.Dispos.28(11)：1335-42；Draganovet al.，2000，J.Biol.Chem.275(43)：33435-42；SteinmetzandUtermann 1985，J.Biol.Chem.260(4)：2258-64；Widleret al.，1980，J.Biol.Chem.255(21)：10464-71；Dyer et al.，1995，J.Lipid Res.36(1)：80-8；Sorenson et al.，1999，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19(9)：2214-25；Palgunachari 1996，Arterioscler.Throb.Vasc.Biol.16(2)：328-38：Thurberg et al.，J.Biol.Chem.271(11)：6062-70；Dyer 1991，J.Biol.Chem.266(23)：150009-15；Hill 1998，J.Biol.Chem.273(47)：30979-84)。

本发明中利用的载脂蛋白也包括重组、合成、半合成或纯化的载脂蛋白。本发明利用的获得载脂蛋白或其等同物的方法是本领域熟知的。例如，可以从血浆或天然产物分离载脂蛋白，例如通过密度梯度离心或免疫亲合层析，或合成、半合成或使用本领域技术人员已知的重组DNA技术产生(见如Mulugeta et al.，1998，J.Chromatogr.798(1-2)：83-90；Chung et al.，1980，J.Lipid Res.21(3)：284-91；Cheung et al.，1987，J.Lipid Res.28(8)：913-29；Persson，etal.，1998，J.Chromatogr.711：97-109；美国专利5,059,528，5,834,596，5,876,968 and 5,721,114；和PCT公开WO86/04920和WO87/02062)。

本发明利用的载脂蛋白进一步包括载脂蛋白激动剂，如模拟ApoA-I，ApoA-I Milano(ApoA-I_M)，ApoA-I Paris(ApoA-Ip)，ApoA-II，ApoA-IV和ApoE活性的肽和肽类似物。例如，载脂蛋白可以是美国专利6,004,925，6,037,323，6,046,166和5,840,688中描述的任何载脂蛋白，它们全文的全部内容引入这里作为参考。

可以使用本领域已知的肽合成的任何技术合成或制造载脂蛋白激动剂肽或肽类似物，包括如美国专利6,004,925，6,037,323和6,046,166中描述的技术。例如，可以使用Merrifield(1963，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)初次描述的固相合成技术制备肽。在Bodanszky et al.，Peptide Synthesis，John Wiley & Sons，2d Ed.，(1976)和本领域技术人员容易获得的其它参考文献中可以找到其它肽合成技术。在Stuart andYoung，Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.，(1984)中可以找到多肽合成技术概述。也可以通过TheProteins，Vol.II，3d Ed.，Neurath et.al.，Eds.，p.105-237，AcademicPress，New York，N.Y.(1976)所述的溶液方法合成肽。上面提及的文章以及McOmie，Protective Groups in Organic Chemistry，Plenum Press，New York，N.Y.(1973)中描述了用于不同肽合成的适当保护基团。也可以从例如载脂蛋白A-I的较大部分化学或酶学切割来制备本发明的肽。

在某些实施方案中，载脂蛋白可以是载脂蛋白的混合物。在一个实施方案中，载脂蛋白可以是同源混合物，也就是，单个类型的载脂蛋白。在另一个实施方案中，载脂蛋白可以是载脂蛋白的异源混合物，也就是两个或多个不同载脂蛋白的混合物。载脂蛋白异源混合物的实施方案可以包括，例如，动物来源的载脂蛋白混合物和半合成来源的载脂蛋白。在某些实施方案中，异源混合物可以包括例如，ApoA-I和ApoA-I Milano。在某些实施方案中，异源混合物可以包括例如，ApoA-IMilano和ApoA-I Paris混合物。用于本发明方法和组合物的合适混合物对本领域技术人员来说是显而易见的。

如果载脂蛋白得自天然来源，那么可以从植物或动物来源获得它。如果载脂蛋白得自动物来源，那么载脂蛋白可以来自任何物种。在某些实施方案中，载脂蛋白可以得自动物来源。在某些实施方案中，载脂蛋白可以得自人来源。在本发明的优选实施方案中，载脂蛋白衍生自与给予载脂蛋白的个体相同的物种。

5.3.卵磷脂胆固醇酰基转移酶

在另一个方面，本发明提供了通过给予包含卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)的组合物来治疗、减少或预防缺血再灌注损伤的方法。这里使用的术语“LCAT”是指本领域技术人员已知的催化卵磷脂酰基转移的酶及其变异体和片段(见Jauhiainen etal.，1988，J.Biol.Chem.263(14)：6525-33；U.S.Patent No.6,498,019在此将其全文引入作为参考)。

LCAT可以是有效治疗或预防缺血再灌注损伤的任何LCAT。本发明利用的LCAT也可以包括重组或纯化LCAT。本发明利用的获得LCAT或其等同物的方法是本领域已知的(见Jauhiainen et al.，1988，J.Biol.Chem.263(14)：6525-33；Vakkilainenet al.，2002，J.Lipid Res.43(4)：598-603；Jianget al.，1999，J.Clin.Invest.103(6)：907-14；Lee，et al.，2003，J.Biol.Chem.278(15)：13539-45；Gambert 1995，C.R.SeancesSoc.Biol.Fil.(article in French)189(5)：883-8；Jonas 2000，Biochim.Biophys.Acta 1529(1-3)：245-56；美国专利6,498,019，它们全部内容并入这里作为参考)。

5.4.氧磷酶

在另一个方面，本发明提供了通过给予包含氧磷酶的组合物来治疗、减少或预防缺血再灌注损伤的方法。这里使用的“氧磷酶”是指最初发现负责对氧磷水解的酶，并且与载脂蛋白(ApoA-I)和含clusterin高密度脂蛋白物理相关和预防低密度脂蛋白被脂类过氧化(Laplaud etal.，1998，Clin.Chem.Lab.Med.36(7)：431-41；Paraghetal.，1998，Nephron 81(2)：166-70；Ayubet al.，1999 Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19(2)：330-5；Tanimotoet al.，2003，Life Sci.72(25)：2877-85；美国专利6,521,226，6,391,298和6,242,186)。

5.5.磷脂复合物

在本发明的某些实施方案中，载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶可以以包含脂类和载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶的复合物给予。脂类可以是本领域技术人员已知的任何脂类。在本发明的某些实施方案中，脂类是磷脂。

可以从本领域技术人员已知的任何来源获得磷脂。例如，可以从商业来源，天然来源或通过本领域技术人员已知的合成或半合成方法获得磷脂(Mel′nichuk et al.，1987，Ukr.Biokhim.Zh.59(6)：75-7；Mel′nichuk et al.，1987，Ukr.Biokhim.Zh.59(5)：66-70；Rameshet al.，1979，J.Am.Oil Chem.Soc.56(5)：585-7；Patel and Sparrow，1978，JChromatogr.150(2)：542-7；Kaduce etal.，1983，J.Lipid Res.24(10)：1398-403；Schlueter etal.，2003，Org.Lett.5(3)：255-7；Tsuji etal.，2002，Nippon Yakurigaku Zasshi 120(1)：67P-69P)。

磷脂可以是本领域技术人员已知的任何磷脂。例如，磷脂可以是小烃链磷脂、磷脂酰胆碱、蛋磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二月桂酰酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-油酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆胺、二月桂酰磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰胆胺、二棕榈酰磷脂酰胆胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、鞘脂、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂、半乳糖脑苷酯、神经节苷酯、脑苷酯、(1、3)-D-甘露糖-(1、3)二甘油酯、氨苯糖甙、3-胆甾醇基-6′-(糖基硫代)己醚糖脂和胆固醇及其衍生物。磷脂也可以是任何上述磷脂的衍生物或类似物。在某些实施方案中，该组合物可以包括两种或更多种磷脂的组合。在本发明的优选实施方案中，载脂蛋白与1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(“POPC”)以复合物给予。在本发明的优选实施方案中，载脂蛋白是与1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱以一比一重量比复合的重组载脂蛋白A-I Milano(ApoA-I Milano)。该复合物称作ETC-216。

该组合物可以包含有效治疗或预防缺血再灌注损伤的任何量磷脂和任何量载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶。在某些实施方案中，该组合物可以包含大约一比大约一比率的载脂蛋白和磷脂的复合物。然而，该组合物可以包含其它比率的磷脂与载脂蛋白的复合物，如大约100∶1、大约10∶1、大约5∶1、大约3∶1、大约2∶1、大约1∶1、大约1∶2、大约1∶3、大约1∶5、大约1∶10和大约1∶100。磷脂和载脂蛋白的最佳比率是本领域技术人员已知的。

5.3.制备载脂蛋白-脂类复合物的方法

在一个方面，本发明提供了通过给予包含与脂类络合的载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶的组合物来治疗、减少或预防缺血再灌注损伤的方法。在一个实施方案中，该组合物由载脂蛋白-脂类复合物组成。

包含载脂蛋白和脂类的复合物可以制备成各种形式，包括但不限于囊、脂质体或脂蛋白体。本领域技术人员熟知的各种方法可以用于制备包含载脂蛋白和脂类的复合物(载脂蛋白-脂类复合物)。可以使用制备脂质体或脂蛋白体的很多可利用技术。例如，可以共同超声处理(使用浴或探针超声波仪)载脂蛋白和适当磷脂形成复合物。或者，载脂蛋白可以与预形成的脂类囊组合以自发形成包含载脂蛋白和脂类的复合物。也可以用洗涤剂透析方法形成载脂蛋白-脂类复合物，如，可以透析载脂蛋白、脂类和洗涤剂如胆酸盐的混合物以除去洗涤剂并重构形成载脂蛋白-脂类复合物(如见Jonas etal.，1986，MethodsEnzymol.128，553-82)，或使用挤压机装置或用均化作用。例如在美国专利6,004,925，6,037,323和6,046,166中公开了其它方法，它们的全部内容并入这里作为参考。美国专利6,287,590中描述了共同冻干法制备载脂蛋白脂类复合物的示例方法，其全部内容并入这里作为参考。制备载脂蛋白-脂类复合物的其它方法对本领域技术人员是显而易见的。

在某些实施方案中，复合物包含卵磷脂胆固醇酰基转移酶和脂类。在另一个实施方案中，复合物包含氧磷酶和脂类。

5.3.1药物制剂

本发明提供了有效治疗、减少或预防缺血再灌注损伤的方法和组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物是药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含药学可接受组合物中的载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶和脂类。如下将描述的药学可接受的组合物包括例如可接受稀释剂、赋形剂或载体。

在优选实施方案中，药物组合物包含载脂蛋白。在另一个优选实施方案中，药物组合物包含载脂蛋白-脂类复合物。就本申请这个部分的目的而言，术语“载脂蛋白”是指载脂蛋白或包含载脂蛋白和脂类的复合物的组合物(“载脂蛋白-脂类复合物”)。

本发明的药物组合物包含适合体内或体外(非体内)给药和输送到组织或器官的药学可接受组合物中的载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶。

药物组合物可以包含盐形式的载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶。例如，因为蛋白可以包括酸性和/或碱性末端和/或侧链，蛋白可以以游离酸或碱形式，或药学可接受盐形式包括在药物组合物中。药学可接受盐可以包括能够与本发明蛋白形成盐的合适酸，包括例如，无机酸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸等等；和有机酸如蚁酸、醋酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、邻氨基苯甲酸、肉硅酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸等等。能够与本蛋白形成盐的合适碱可以包括例如无机碱，如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾等等；和有机碱如单、二和三烷胺(如三乙胺、二异丙胺、甲胺、二甲胺等等)和任选取代的胆胺(如胆胺、二胆胺等等)。

药物组合物可以是适合任何给药途径的各种形式，包括但不限于肠胃外、肠内、局部或吸入。肠胃外给药是指不通过消化道的任何给药途径，包括但不限于注射给药(即如下所述的静脉内、肌内等等)。肠内给药是指经口的任何给药途径，包括但不限于片剂、胶囊、口服液、悬液、喷雾剂等等，如下所述。就这个部分的目的而言，肠内给药也指直肠和阴道给药途径。局部给药是指任何通过皮肤的给药途径，包括但不限于膏剂、软膏、凝胶和透皮贴剂，如下所述(也见Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Edition Gennaro etal.，eds.)Mack Printing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。

本发明的肠胃外药物组合物可以注射给予，例如注射到静脉(静脉内)、动脉(动脉内)、肌肉(肌内)，皮下(皮下或药物储槽组合物中)，心包、冠状动脉，或用作输送到组织或器官(例如，用于心肺旁路机器或浸泡浸泡移植组织或器官，如下所述)的溶液。

可注射药物组合物可以是水或油载体中的载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶或其脂类复合物的无菌悬液、溶液或乳液。组合物也可包括配制剂或赋形剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。注射制剂可以以单位剂量形式提供，如在安瓿或在多剂量容器中，并可以包含添加的防腐剂。在某些实施方案中，药物组合物含有缓冲液，如三(羟甲基)甲胺或THAM(氨丁三醇)。

可注射组合物可以是用于任何可注射给药途径的药学适合组合物，包括但不限于静脉内、动脉内、冠状动脉内、心包、血管周、肌内、皮下和关节内。可注射药物组合物可以是直接给予心脏、心包或冠状动脉的药学适合组合物。

肠胃外药物组合物可以是适合输送给打算的受体之前、过程中或之后浸泡移植组织或器官的药学适合组合物。可以在用于移植的组织或器官制备之前或过程中(如收集之前或过程中)使用这种组合物。此外，该制剂可以是心脏手术过程中给予的心麻痹溶液。在某些实施方案中，药物组合物可以例如与心肺旁路机器连接使用，给心脏提供药物组合物。这种制剂可以在心脏手术的诱导、维持或再灌注过程中使用(见Chang etal.，2003，Masui 52(4)：356-62；Ibrahim etal.，1999，Eur.J.Cardiothorac.Surg.15(1)：75-83；von Oppel et al.，1991，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.102(3)：405-12；Ji et al.，2002，J.Extra Corpor.Technol.34(2)：107-10)。在某些实施方案中，药物组合物可以通过机械装置给予，如泵或灌注仪(如PerDUCER)(Hou and March 2003，J.Invasive Cardiol.15(1)：13-7；Maisch et al.，2001，Am.J.Cardiol.88(11)：1323-6；Macris and Igo 1999，Clin.Cardiol.22(1，Suppl 1)：136-9).

或者，可注射药物组合物可以以粉剂形式提供，使用前与合适载体重构，包括但不限于无菌无致热源水、缓冲液、葡萄糖溶液等。为此，载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶可以冻干，或如果适当，与脂类共同冻干。药物组合物可以以单位剂量形式提供并在体内使用前重构。共同冻干制备载脂蛋白脂类复合物的方法在例如美国专利6,287,590中描述，其全部内容并入这里作为参考。

对于延长输送，药物组合物可以作为储槽制剂提供，通过植入给药，如皮下、真皮下或肌内注射。因此，例如，药物组合物可以与合适多聚体或疏水材料(如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或作为少量溶解衍生物；如作为载脂蛋白的少量溶解盐形式。

或者，可以使用缓慢释放活性成分以经皮吸收的制成粘合片或贴片的经皮传递系统。为此，可以使用渗透增强剂来促进活性成分经皮渗透。将载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶或其脂类复合物掺入含硝酸甘油的经皮片可以获得特别的益处，可用于缺血性心脏病和高胆固醇血症的患者。

对于口服给药，药物制剂可以采用下列形式，例如，用常规方法与药学可接受赋形剂制备的片剂或胶囊，所述赋形剂如粘合剂(如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)；崩解剂(如土豆淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或湿润剂(如月桂硫酸钠)。可以用本领域熟知方法对片剂包衣(见Remington′sPharmaceutical Sciences，18′h Edition Gennaro etal.，eds.)MackPrinting Company，Easton，Pennsylvania，1990)。

口服给药的液体药物组合物可以采用下述形式，例如溶液、糖浆或悬液，或它们可以是用于与水或其它合适载体在使用前组成的干燥产物。可以用常规方法与药学可接受添加剂制备这种液体药物组合物，如悬浮剂(如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(如杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。

如果适当，药物组合物也可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。口服给药的药物组合物可适当制备成提供载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶或其脂类复合物的控释。

肠内药物组合物可能适合口腔给药，例如，以片剂、锭剂或糖锭形式。对于直肠和阴道给药途径，载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶或其脂类复合物可以制成溶液(如，对于截留灌肠剂)栓剂或软膏。肠内药物组合物可能适合用作喂饲混合物，如用作含总肠胃外营养(TPN)混合物的混合物或用于喂饲管输送(见Dudrick etal.，1998，Surg.Technol.Int.VII：174-184；Mohandas et al.，2003，Natl.Med.J.India 16(1)：29-33；Bueno etal.，2003，Gastrointest.Endosc.57(4)：536-40；Shikeet al.，1996，Gastrointest.Endosc.44(5)：536-40)。

对于吸入给药，载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶或其脂类复合物可以以来自增压包装或喷雾器的气雾喷雾形式方便地输送，使用合适的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适气体。增压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供瓣以输送计量的量来确定。用于吸入器或吹入器的如明胶胶囊和药筒可以配制成含有化合物和合适粉末底物如乳糖或淀粉的粉末混合物。吸入药物组合物可用于例如有效治疗或预防心-肺移植过程中或之后的肺组织损害。

如果需要，该组合物可以存在于包装或分散装置中，其可以包含含有载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶或其脂类复合物的一种或多种单位剂型。包装可以例如含有金属或塑料箔，如起泡包装。包装或分散装置可以带有使用说明书。

已经描述了药物组合物的各种实施方案。说明和实例意在阐述本发明而不是限制。实际上，对本领域技术人员来说很明显，可以对本发明所述各种实施方案的药物组合物作出改变而不背离本发明的精神。

5.4.治疗方法

本发明的方法和组合物可以用于治疗或预防与缺血再灌注损伤相关的任何病症或减少缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤可能与氧缺失、中性粒细胞活化和髓过氧化物酶生成相关。缺血再灌注损伤可能是很多疾病状态的结果或可以医源性诱发，例如，血凝块、狭窄或手术都可以引起缺血再灌注损伤。就这个部分和下述5.7节而言，“患者”或“个体”是指需要治疗、改善或减少缺血再灌注损伤的动物，包括人。

在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可以用于治疗或预防与氧缺失、中性粒细胞活化和髓过氧化物酶产生相关的病症。在某些实施方案中，该方法和组合物可以用于治疗、减少或预防由于血凝块(一个或一个以上凝块)、狭窄、手术或机械梗阻造成的缺血再灌注损伤。

在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可以用于治疗或预防缺血再灌注损伤导致的中风、致命或非致命性心肌梗塞、外周血管病变、组织坏死和肾功能衰竭，和术后肌肉张力丧失。在某些实施方案中，本发明的方法和组合物减少或减轻缺血再灌注损伤的程度。肌酸激酶可以是组织或器官损伤的尺度。因此，在某些实施方案中，本发明的方法和组合物减少组织或器官肌酸激酶的量。

在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可以用于治疗、减少或预防由于脉管狭窄、血栓形成、意外脉管损伤或手术过程造成的与闭塞或血液转向相关的缺血再灌注损伤。狭窄可以是医学病变的结果，如动脉粥样硬化或医源性诱发的，如手术过程。手术过程，例如，在膝盖、手、髋和肩上的手术、组织移植和心脏操作包括冠状动脉旁路移植术、经皮腔内冠状动脉血管成形术都可以减少或中断血流，诱发缺血和建立再灌注损伤阶段。在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可以用于治疗、减少或预防由于狭窄造成的缺血再灌注损伤，包括动脉粥样硬化，或手术，包括但不限于在膝盖、手、髋和肩上的手术、组织移植和心脏操作包括冠状动脉旁路移植术、经皮腔内冠状动脉血管成形术。本发明的方法和组合物也可以用于治疗或预防与缺血再灌注损伤相关的任何其它病症，如心肌梗塞、中风、间歇性跛行、外周血管病变、急性冠脉综合征、血脉闭塞造成的心血管疾病和肌肉损伤。

在某些实施方案中，本发明的方法和组合物可以用于治疗、预防或减少体外组织或器官的缺血再灌注损伤。体外组织或器官不是个体的组织或器官(也称作非体内)，如移植。对于组织和器官移植，取出的供体组织和器官在收集、输送和随后移植给受体的过程中也对再灌注损伤易感。本发明的方法和组合物可以用于增加可移植组织或器官的活力，通过例如补充用于维持或保存可移植组织或器官的溶液。例如，该方法和组合物可以用于在运输过程中浸泡可移植组织或器官，或在移植之前、过程中或之后，可以放置接触可移植组织或器官。

在某些实施方案中，该方法和组合物可以用于减少或甚至避免个体冠状动脉旁路手术的需要。在其它实施方案中，本发明的方法和组合物可以用于治疗或预防与经皮腔内冠状动脉血管成形术诱发的闭塞相关的情况。在进一步的实施方案中，本发明的方法和组合物可以用于减少从任何手术过程恢复的时间。在某些实施方案中，该方法和组合物可以是心脏手术过程中用于心包、冠状动脉内或动脉内给药的药学可接受组合物。在某些实施方案中，药学可接受组合物可以通过机械装置如泵或灌注仪(如perDUCER)给予。

本方法和组合物可以与心脏手术结合使用，例如，在心脏麻痹溶液中或与该溶液一起预防或使缺血或再灌注对心肌的损伤最小化。在某些实施方案中，本方法和组合物可以在心脏手术过程中与心肺旁路机器一起使用，来预防或减少缺血再灌注对心肌的损伤。

在某些实施方案中，本方法和组合物可以以单一、一次剂量或慢性给予。慢性的意思是本发明的方法和组合物给给定个体给药一次以上。例如，慢性给药可以是药物组合物多剂量给予动物，包括个体，以每天一次的基础，每天两次的基础，或更多或更少频率，这对本领域技术人员是显而易见的。在另一个实施方案中，可以急性给予本方法和组合物。急性的意思是本发明的方法和组合物在缺血或闭塞事件接近或同时的时间段给予。例如，急性给药可以是单一剂量或多次剂量的药物组合物，在急性心肌梗塞开始时，在例如中风的早期表现时，或手术过程之前、过程中或之后给予。与缺血或闭塞事件接近或同时的时间段将根据缺血事件而变化，但也可以例如在经历心肌梗塞、中风或间歇性跛行大约30分钟内。在某些实施方案中，急性给药是缺血事件大约一小时内给药。在某些实施方案中，急性给药是缺血事件后大约2小时，大约6小时，大约10小时，大约12小时，大约15小时或大约24小时。

多剂量，意思是给予组合物一次以上。多剂量可以是例如一剂量每天给予一天以上，一剂量以上给予一天或多剂量给予多天。

5.5.联合治疗

在本发明方法中，载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶或其脂类复合物或其药物组合物可以单独或与其它药物联合治疗。这种治疗包括但不限于同时或连续给予包括的药物。

例如，载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶或其脂类复合物或其药物组合物可以与其它药物活性剂一起施用，包括但不限于α/β肾上腺素能拮抗剂、抗肾上腺素剂、α-1肾上腺素能拮抗剂、β肾上腺素能拮抗剂、AMP激酶活化剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、抗心律失常药、血管舒张药、硝酸酯、血管加压药、影响收缩力的药剂、利尿剂、抗凝剂、抗血小板聚集剂、溶栓剂、抗糖尿病剂、抗氧化剂、抗炎剂、胆酸螯合剂、他汀类、胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂、胆固醇还原剂/脂类调节剂、阻断花生四烯酸转化的药物、雌激素替代疗法、脂肪酸类似物、脂肪酸合成抑制剂、贝特类、组氨酸、烟酸衍生物、过氧物酶体增生剂活化剂受体激动剂或拮抗剂、脂肪酸氧化抑制剂、沙利度胺或噻唑烷二酮类(Drug Facts and Comparisons，updated monthly，January 2003，Wolters Kluwer Company，St.Louis，MO；PhysiciansDeskReference(56th edition，2002)Medical Economics)。这些药物可以具有预防缺血再灌注损伤的辅助和协同作用。

可以添加或可以协同载脂蛋白保护哺乳动物组织和器官不受缺血再灌注损伤的有益性能的单独或联合的其它剂，包括但不限于：α/β肾上腺素能拮抗剂如卡维地洛，(Coreg)；盐酸拉贝洛尔，(Normodyne)；抗肾上腺素能药物如胍那决尔，(Hylorel)；胍乙啶，(Ismelin)；利血平，可乐定，(Catapres和Catapres-TTS)；胍法辛，(Tenex)；胍那苄，(Wytensin)；甲基多巴和甲基多巴乙酯，(Aldomet)；α-1肾上腺素能拮抗剂如多沙唑嗪，(Cardura)；哌唑嗪，(Minipress)；特拉唑嗪，(Hytrin)；和酚妥拉明，(Regitine)；β肾上腺素能拮抗剂如索他洛尔，(Betapace AF和Betapace)；噻吗洛尔，(Blocadren)；心得安，(InderalLA和Inderal)；倍他洛尔，(Kerlone)；醋丁洛尔，(Sectral)；阿替洛尔，(Tenormin)；美托洛尔，(Lopressor和Toprol-XL)；比索洛尔，(Zebata)；卡替洛尔，(Cartrol)；艾司洛尔，(Brevibloc)；纳洛尔，(Corgard)；喷布洛尔，(Levatol)；和吲哚洛尔，(Visken)；AMP激酶活化剂如ESP 31015，(ETC-1001)；ESP31084，ESP 31085，ESP 15228，ESP 55016和ESP 24232；gemcabene(PD72953和CI-1027)；和MEDICA 16；血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂如喹那普利，(Accupril)；贝那普利，(Lotensin)；卡托普利，(Capoten)；依那普利，(Vasotec)；雷米普利，(Altace)；福辛普利(Monopril)；莫昔普利，(Univasc)；赖诺普利，(Prinivil和Zestril)；群多普利，(Mavik)，培哚普利，(Aceon)；和血管紧张素II受体拮抗剂如坎地沙坦，(Atacand)；依贝沙坦，(Avapro)；洛沙坦，(Cozaar)；缬沙坦，(Diovan)；替米沙坦，(Micardis)；依普沙坦，(Tevetan)；和奥美沙坦，(Benicar)；钙通道阻滞剂如心痛定，(Adalat，AdalatCC，Procardia和Procardia XL)；维拉帕米，(Calan，CalanSR，Covera-HS，IsoptinSR，Verelan和VerelanPM)；硫氮卓酮，(Cardizem，CardizemCD和Tiazac)；尼莫地平，(Nimotop)；氨氯地平，(Norvasc)；非洛地平，(Plendil)；尼索地平，(Sular)；苄普地尔，(Vascor)；依拉地平，(DynaCirc)；和尼卡地平，(Cardene)；抗心律失常药如各种奎尼丁；普鲁卡因胺，(Pronestyl和rocan)；利多卡因，(Xylocaine)；美西律，(Mexitil)；妥卡尼，(Tonocard)；氟卡尼，(Tambocor)；普罗帕酮(Rythmol)，乙吗噻嗪，(Ethmozine)；依布替胺，(Covert)；双异丙吡胺，(Norpace)；溴苄乙铵，(Bretylol)；胺碘酮，(Cordarone)；腺嘌呤，(Adenocard)；多菲莱德(Tikosyn)；和地高辛，(Lanoxin)；血管舒张药如二氮嗪，(Hyperstat IV)；肼苯达嗪，(Apresoline)；非诺多泮，(Corolpam)；长压定，(Loniten)；和硝普盐，(Nipride)；硝酸酯如异山梨醇二硝酸酯；(Isordil和Sorbitrate)；异山梨醇一硝酸酯，(Imdur，Ismo和Monoket)；硝酸甘油糊剂，(Nitrol)；各种硝酸甘油片；硝酸甘油SL，(Nitrostat)，Nitrolingual喷雾剂；和硝酸甘油IV，(Tridil)；加压剂如去甲肾上腺素，(Levophed)；和脱羟肾上腺素，(Neo-Synephrine)；影响收缩性药剂如氨力农；(Inocor)；多巴胺，(Intropine)；多巴酚丁胺，(Dobutrex)；肾上腺素，(Adrenalin)；异丙肾上腺素，(Isuprel)，甲腈吡酮，(Primacor)；利尿剂如螺内酯，(Aldactone)；托拉塞米，(Demadex)；氢氟噻嗪，(Diucardin)；氯噻嗪，(Diuril)；利尿酸，(Edecrin)；双氢克尿噻，(hydroDIURIL和Microzide)；阿米洛利，(Midamor)；氯噻酮，(Thalitone和Hygroton)；布美他尼，(Bumex)；速尿，(Lasix)；吲达帕胺，(Lozol)；美托拉宗，(Zaroxolyn)；氨苯蝶啶，(Dyrenium)；和氨苯蝶啶和双氢克尿噻的组合(Dyazide和Maxzide)；抗凝剂/抗血小板剂如比伐卢定，(Angiomax)；重组水蛭素，(Refludan)；各种肝素；达那肝素，(Orgaran)；各种低分子量肝素；达肝素，(Fragmin)；依诺肝素，(Lovenox)；亭扎肝素，(Innohep)；华法林，(Coumadin)；双香豆素，(Dicoumarol)；茴茚二酮，(Miradone)；阿司匹林；阿加曲班，(Argatroban)；阿昔单抗，(Reopro)；埃替非巴肽，(Integrilin)；替罗非班，(Aggrastat)；氯吡格雷，(Plavix)；噻氯匹定，(Ticlid)；和双嘧达莫，(Persantine)；溶栓剂如阿特普，(Activase)；组织纤溶酶原激活剂(TPA)，(Activase)；阿尼普酶，APSAC，(Eminase)；瑞替普酶，rPA，(Retavasae)；链激酶，SK，(Streptase)；尿激酶，(Abbokinase)；抗糖尿病剂如二甲双胍，(Glucophage)；格列吡嗪，(Glucotrol)；氯磺丙脲，(Diabinese)；醋磺己脲，(Dymelor)；妥拉磺脲，(Tolinases)；格列美脲，(Amaryl)；优降糖，(DiaBeta和Micronase)；阿卡波糖，(Precose)；米格列醇，(Glyset)；瑞格列奈，(Prandin)；那格列奈，(Starlix)；罗格列酮，(Avandia)；和匹格列酮(Actos)；抗氧化剂和抗炎剂；胆酸螯合剂如消胆胺，(LoCholest，Prevalite和Questran)；降胆宁，(Colestid)；和colesevelam，(Welchol)；他汀类如瑞舒伐他汀，(Crestor)；氟伐他汀；(Lescol)；阿伐他汀，(Lipitor)；洛伐他汀，(Mevacor)；普伐他汀，(Pravachol)；和辛戈他汀，(Zocor)；CETP抑制剂；阻断花生四烯酸转化的药物：雌激素替代疗法；脂肪酸类似物如PD 72953，MEDICA 16，ESP 24232和ESP31015；脂肪酸合成抑制剂；脂肪酸合成抑制剂；脂肪酸氧化抑制剂，雷诺嗪，(Ranexa)；贝特类如氯贝丁酯，(Atromid-S)；吉非贝齐，(Lopid)；微粒化非诺贝特胶囊，(Tricor)；苯扎贝特和环丙贝特；组氨酸；烟酸衍生物如烟酸缓释胶囊，(Niaspan)；过氧物酶体增生剂活化剂受体激动剂和拮抗剂；沙利度胺，(Thalomid)和美国专利6,459,003、6,506,799和美国申请公开号20030022865，20030018013，20020077316，和20030078239中描述的化合物，它们的全部内容并入这里作为参考。

5.6.给药方法

载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶或其脂类复合物可以以本领域技术人员已知的确保循环中生物利用度的任何合适途径给予。药物组合物的类型可以指示给药途径，例如可注射组合物可以肠胃外给予，包括但不限于静脉内(IV)、肌内(IM)、真皮内，皮下(SC)、冠状动脉内、动脉内、心包、关节内和腹膜内(IP)注射剂。在某些实施方案中，给药通过机械泵或输送装置，如心包输送装置(PerDUCER)或心肺旁路机器。在某些实施方案中，组合物可以通过注射给予，通过皮下植入泵或储槽制剂，以获得循环血清浓度等于通过肠胃外给药所获得浓度的量，如上所述。

本发明的方法提供了载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶或氧磷酶或其脂类复合物或药物组合物通过各种不同方案治疗方案给药。例如，如上所述，该方法提供了慢性或单一剂量给药。该方法提供了例如急性给药(如缺血或闭塞事件的同时或时间接近)。

在某些实施方案中，慢性给药可以是一天期间定期给予几次静脉内注射。在另一个实施方案中，慢性给药可以是以弹丸式给予一次静脉内注射或每日，大约隔天，大约每隔3至15天，优选大约每隔5至10天，和最优选大约每隔10天连续输入。优选，给予剂量低于毒性剂量。优选治疗过程中，剂量和给药方案提供治疗或预防缺血再灌注损伤的足够或稳定状态水平的有效量的一种或多种组合物成分。在某些实施方案中，可以给予逐步增加的剂量。在某些实施方案中，间歇给予组合物。根据个体需要，给药可以通过缓慢输注，持续大约一小时以上的一段时间，通过快速输注，大约一小时或更少，或通过单一弹丸式注射。

在另一个实施方案中，可以在缺血或闭塞事件开始时或缺血或闭塞事件症状早期表现时急性给药。在一个实施方案中，该方法提供了急性给予本发明的组合物，例如由急救医师或有资格人员(如医学训练消防员或警察)针对紧急呼叫可能的心肌梗塞进行应答。在另一个实施方案中，可以紧急实施该方法，例如，在中风表现后给予该组合物。

本发明组合物的实际剂量将随给药途径、患者的身高、体重、年龄和疾病严重程度、合并医学病症的存在等等而变化。本发明的组合物通常将以获得期望目的的有效量使用。当然，应理解使用的量将依赖于特定的应用。

例如，对于用于预防缺血再灌注损伤，预防有效量的组合物可以应用于或给予需要它的动物或人。预防有效量是指抑制或减轻缺血再灌注损伤症状的本发明的组合物量。实际预防有效量将依赖于特定应用而变化。本领域普通技术人员无需过多实验就能够确定用于特定应用的预防有效量的特定组合物，使用例如本领域技术人员已知的体外试验和体内试验。下面实施例中描述了示例试验。

对于用于治疗或预防缺血再灌注损伤相关的疾病，可以以治疗有效量给予或应用本发明的组合物。治疗有效量是指有效改善缺血再灌注损伤症状，或改善、治疗或预防缺血再灌注损伤的量。确定治疗有效量是本领域技术人员能力范围内的事情，尤其是根据这里提供的详细公开内容。

对于全身给药，可以从体外试验初步估计治疗有效量。例如，在动物模型中可以配制剂量以获得有益循环组合物浓度范围。也可以使用本领域熟知的技术从体内数据估计首剂量，如动物模型。这种信息可以用于更精确确定在人中的有效剂量。具有本领域普通技术的人员可以基于动物数据容易地优化人的给药。

这里描述的组合物的毒性可以在细胞培养或实验动物中用标准药学程序确定，如通过确定LD₅₀(群体50％致死的剂量)或LD₁₀₀(群体100％致死的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比率是治疗指数。优选表现出高治疗指数的组合物。在配制用于人类时无毒的剂量范围中可以使用从这些细胞培养试验和动物研究获得的数据。这里描述的组合物的剂量优选在循环浓度范围内，它包括具有很少毒性或无毒性的有效剂量。在这个范围内剂量可以根据采用剂量和利用的给药途径而变化。各个医师可以根据患者情况选择组合物给药的确切途径和剂量(如见Fingl etal.，1975，In：The Pharmacological Basis ofTherapeutics，Ch.1，p.l)。

6.实施例

6.1.实施例1：非体内兰根道尔夫氏试验

这个实施例证明了在再灌注的分离的缺血兔心脏中，预防性ETC-216的心脏保护作用。研究使用雄性新西兰白兔得自CharlesRiver，体重近2-3kg。雄性新西兰白兔选择作为本研究目的的适当测试系统。分离的缺血-再灌注兔心脏是人心肌梗塞模型。到达后，给动物分配唯一的识别号。

动物按照密歇根州大学动物使用和护理委员会的指导停居在不锈钢笼中。密歇根州大学实验动物医疗单位提供兽医护理。密歇根州大学由美国实验动物健康护理委派协会委派，动物护理使用程序符合DHEW(NIH)Publ.No.86-23的实验动物护理和使用指导标准。

ETC-216是重量比为1∶1的重组载脂蛋白A-I Milano/1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱复合物(图1)。ETC-216原液含有14mg蛋白/ml蔗糖甘露醇缓冲液。由于蔗糖-甘露醇缓冲液与Krebs-Henseleit缓冲液不相容，对于单独甘露醇的任何独立作用的对照，透析ETC-216获得含2％葡萄糖的4mM磷酸钠的背景缓冲液，pH7.4.Krebs-Henseleit缓冲液稀释ETC-216产生0.45mg/ml药物浓度。类似地稀释载体。

剂量选择基于Esperion’s人I期单一剂量安全临床试验中使用剂量的历史数据，其中达到100mg/kg ETC-216的剂量给予人。对于这个方案中概述的研究，0.5mg/ml的浓度大约等于给予人25mg/kg的静脉内剂量。

使用兰根道尔夫氏装置(图2和3)灌注兔心脏进行实验。通过脱颈使兔丧失意识并快速取出心脏并与套管连接通过主动脉进行灌注。灌注介质由循环Krebs-Henseleit缓冲液(pH7.4，37℃；“KH”)组成，它连续暴露于95％O2/5％CO₂混合物并以20-25ml/分的恒定速度输送。在整个方案中，心脏通过与右心房连接的电极而跳动。从实验室正方形波发生器传送跳动刺激(10％以上生理跳动，持续时间1毫秒，Grass 588，Quincy，MA)。用Silastic^TM管套住肺动脉以促进代表冠状静脉返回冠状窦的肺动脉流出物的收集。结扎上腔静脉和下腔静脉和肺静脉，预防来自其它分开脉管的灌注液损失。通过左心房插入左心室引流管、热敏电阻探针和乳胶球并定位于左心室。流体填充的乳胶球通过硬管与Miller导管压力传感器连接，以允许测定左心室发展压。用蒸馏水扩张心室内球得到大约10mmHg的最初基线左心室舒张期末压。用与主动脉套管策臂连接的压力传感器测定冠状灌注压。由于冠状动脉灌注速度保持不变，冠状动脉灌注压的改变起着冠状动脉抵抗改变的标志的作用。使用与多视图软件数据获取系统接口的多波道记录器，如Grass Polygraph 79D(Quincy，MA)持续监测所有血液动力变量。实验期间，通过心脏装入温度调节双腔玻璃室中并使灌注介质通过加热的贮器和输送系统，使心脏保持在37℃。

两个处理组用于如下显示的实验程序。

组处理测试物质浓度(mg/ml)

1 缺血&再灌注载体 0

2 缺血&再灌注 ETC-216 0.45

如图4所示对心脏进行实验处理。诱导普遍缺血前，分离的心脏在含氧量正常(氧气水平正常)条件下稳定20分钟。这个时期的前20分钟期间，心脏单独接触KH缓冲液，接着接触含有载体(第1组)或ETC-216(第2组)的KH缓冲液另外10分钟。然后心脏接受30分钟时间的缺血，随后用含载体(第1组)或ETC-216(第2组)的KH缓冲液再灌注60分钟时间。通过中断心脏灌注流完成总普遍缺血的诱导，和打开泵恢复最初流速来完成心脏的再灌注。

在基线(缺血前)，和最初每分钟到高达5分钟，和每隔5分钟，以后灌注期间，从所有组的心脏收集等分的肺动脉流出物。分析流出物的肌酸激酶浓度(图5)，组织损伤指数。肌酸激酶是不可逆损伤细胞释放的胞质酶。连续监测心脏功能(图6)。

测定心脏终点：

1-心电图-心率(心律)检测心律失常的存在或不存在；

2-左心室发展压(图7)(数据显示为每组指出编号的心脏的平均数±平均数的标准误)

3-左心室dP/dt

4-左心室舒张末压(图8)(数据显示为每组指出编号的心脏的平均数±平均数的标准误)；

5-冠状动脉灌注压(图9)(数据显示为每组指出编号的心脏的平均数±平均数的标准误)；

6-再灌注前和后，淋巴引流液的收集以确定组织肌酸激酶的释放(图5)

实验方案结束时，每个处理组达五个心脏的心脏活检组织立即浸入液氮中并保存在-80℃进行随后脂类氢过氧化物分析。在进行脂类氢过氧化物试验前，匀浆样品用蛋白含量校正(图10)。在这个实施例中ETC-216使心脏脂类氢过氧化物降低46％。

指定方案完成后，每组的两个心脏用含2.5％戊二醛和1％LaCl₃的0.1M calcodylate钠(pH7.4)灌注3分钟。正常条件下亲渗LaCl₃保留在与血管壁结合的血管隔室并作为血管完整性的标志。LaCl₃外渗到血管外间隙用于表示血管损伤的存在。取出来自左心室心肌的组织样品并切成侧面测定大约1mm的节段。样品在上面提及的缓冲液中4℃固定另外2小时。此后，样品在乙醇系列中脱水并包埋在EM bed-812(Electron Microscopy Sciences，Ft，Washington，PA)中。用Reichert超微切片机对组织集团进行切片并放置到formvar包裹的铜格上，随后用4％醋酸双氧铀染色。用Phillips CM-10电子显微镜观察切片。

传动电子显微镜用于检测每个研究组的心肌样品。图像表明载体处理心脏的肌节结构特征消失和存在挛缩带。线粒体显著膨胀，含有破坏的晶体和易渗包涵体。在ETC-216处理的心脏中，肌节结构相对正常和且线粒体显示完整，仅轻微膨胀。实质上不存在挛缩带与对照心脏中观察到的形成显著对照。ETC-216预防挛缩带坏死与ETC-216预处理的心脏不显示出再灌注时LVEDP增加的观察相一致。挛缩带坏死和LVEDP持续增加与细胞内钙负荷增加和不可逆细胞损伤有关。Z-带肌原纤维模糊的存在，和胶原纤维体系结构破坏是广泛损害的标志。其它预期的形态学损害包括线粒体中破坏的嵴和基质，以及大的电子致密体。所有显微照片放大系数是7900倍(图11)。

肌酸激酶浓度分析(图5)表明酶释放到静脉流出物的快速期发生在再灌注时期。对照心脏(用载体处理的)显示与ETC-216处理的心脏相比，肌酸激酶明显释放。此外，ETC-216处理的心脏显示与对照相比，左心室舒张期未压降低(图6和8)，左心室发展压升高(图7)，冠状动脉灌注压降低(图9)和脂类氢过氧化物降低(LHP)。此外，ETC-2165保护心肌抵抗形态学改变。这些结果证明在缺血事件前给予ETC-216的心脏保护作用。

6.2.实施例2：在LAD闭塞-再灌注兔心脏中以100mg/kg急性和慢性给药

这个实施例证明了区域性心肌缺血和再灌注的体内模型中ETC-216的心脏保护作用。为了这个研究的目的，选择雄性新西兰白兔作为适当的测试系统，因为其缺乏到心脏的侧支血供，因此使得不需要进行心肌血流测定。在这个研究中，通过冠状动脉结扎和再灌注接受30分钟区域性心肌缺血的分开的兔组使用不同剂量方案。使用两个剂量方案。在第一个方案中，检测ETC-216作为单一预处理，其中就在区域性缺血开始前，心脏接触100mg/kg该剂，而在第二个方案中，区域性缺血开始(前一天和之前立即)给予两个100mg/kg预处理。这些方案在(图12)中显示。这个研究集中于在体内研究中ETC-216作为心脏保护剂的作用，其中兔心脏接受30分钟时间的区域性心肌缺血，随后再灌注最少四个小时。这个实施例证明了ETC-216在缺血事件后给予是心脏保护剂。

这个研究中使用的程序与密歇根州大学动物使用和护理委员会的指导一致。密歇根州大学实验动物医疗单位提供兽医护理。密歇根州大学由美国实验动物健康护理委派协会委派，动物护理使用程序符合DHEW(NIH)Publ.No.86-23的实验动物护理和使用指导标准。

研究使用雄性新西兰白兔，得自Charles River，体重近2-3kg。到达后，给动物分配唯一的识别号。用赛拉嗪(3.0mg/kg)和氯胺酮(35mg/kg)的混合物肌内注射，随后静脉内注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉兔。用戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉内注射维持麻醉。插入胶头气管插管，动物置于室温空气的正压换气。分离右颈静脉并插套管，给予ETC-216或匹配体积的载体。分离右颈动脉，就在紧接动脉瓣上安装MillarTM导管微触点压力传感器监测主动脉血压并获得所得的脉压(dP/dt)的第一个衍生值。整个实验中监测II导联心电图。实施左胸廓切开术和心包切开术，随后鉴定左前降支(LAD)冠状动脉。丝线(3.0；Deknatel，Fall River，MA)通过动脉后，线的两端插入长度短的聚乙烯管。对线的游离端施加向上拉力时，聚乙烯管上的向下压力压迫其下的冠状动脉，导致血管闭塞和区域性心肌缺血。线上拉力释放后，闭塞维持30分钟，抽出聚乙烯管，允许发生再灌注。闭塞血管分布区域中区域存在和与透壁区域性心肌缺血存在一致的心电图改变(ST段升高)证实区域性心肌缺血。

主要的终点确定由梗塞大小占左心室的百分比和占风险区百分比的测定大小组成(图13和14)。研究结束时，在麻醉中给兔施用肝素(静脉内1,000U)，之后安乐死。切除心脏，接着在兰根道尔夫氏装置上，用Krebs-Henseleit缓冲液，以22-24ml/分的恒定流速准备通过主动脉灌注。用缓冲液洗涤心脏10分钟以确保组织清洁。四十五毫升1％氯化三苯基四唑(TTC)溶液灌注通过心脏。TTC用砖红色区分开风险区内的非梗塞心肌，表明有活力心肌组织中存在的辅酶还原TTC产生甲(formazan)沉淀的存在。不可逆损伤组织，缺乏胞质脱氢酶，不能形成甲(formazan)沉淀，呈灰黄色。在与诱导区域性心肌缺血过程中结扎区域等同的位置结扎左前降支(LAD)动脉。停止灌注泵并通过与主动脉套管连接的侧臂口缓慢注射2ml 0.25％伊文思蓝。染料通过心脏10秒确保染料均匀分布。伊文思蓝的存在用于区分没有经历区域性缺血的左心室组织，与风险区相反。从灌注装置取出心脏并以右角至纵轴切成横截片段。丢弃右心室、心尖和心房组织。每个横截片段的表面到澄清醋酸盐薄片上示踪。复印图像并放大。扫描复印件并下载到Adobe PhotoShop(Adobe SystemsInc.，Seattle，WA)。使用Adobe PhotoShop软件计算每个区域占据的象素数量确定正常左心室(NLV)非风险区区域、风险区和梗塞。总风险区表示为占左心室的百分比。梗塞大小表示为占风险区的百分比(ARR)(图13和14)。

用ETC-216(100mg/kg)或等体积载体处理一次(即急性处理)或处理两次(即慢性处理)兔的风险区的梗塞百分比，左心室的梗塞百分比，和左心室的风险区百分比。数据是n＝6的每组的平均数±平均数的标准误。图14中的星号表示与各个相应对照显著差异。

确定其它终点。最终梗塞大小可能受心肌氧利用的增加或减少的影响。心肌氧代偿的两个重要决定因素是心率和压力负荷。速度压力乘积(心率×平均动脉压)提供了心脏的心肌氧需求改变的近似值。因此，计算速度-压力乘积确定观察的梗塞大小减少是否与速度压力乘积改变有关。实验方案过程中持续检测心率和平均主动脉压，数据用于计算本研究每个实验组的具体时间点的速度压力乘积。

与对照相比，急性和慢性给药的ETC-216处理的心脏的左心室的风险区百分比降低，然而结果没有统计学显著性。与对照相比，急性和慢性给药的ETC-216处理的心脏的风险区的梗塞百分比和左心室的梗塞百分比显著降低。这些结果表明当急性和慢性给药时ETC-216都具有心脏保护作用。

风险和非风险区中心肌组织的肌酸激酶活性可以比较。该试验的原理是基于等摩尔NAD还原为NADH造成的反应混合物在340nm的吸光度增加。吸光度改变速度直接与肌酸激酶活性成比例。一个单位定义为在试验程序条件下每分钟产生一摩尔NADPH的酶量。

接受延长时间血流丧失(缺血)无再灌注的心肌组织将经历坏死的特征形态学改变和出现炎性细胞。缺血诱导细胞死亡的形态学外观不同于再灌注结果发生的外观。后者的特征是挛缩带并称作挛缩带坏死。保存每组的心脏组织并准备用电子显微镜检测。

缺血再灌注损伤与风险区的炎性细胞蓄积有关，主要是中性粒细胞。髓过氧化物酶(MPO)是几乎仅存在于中性粒细胞的酶(Liu etal.，J.Pharmacol.Exp.Ther.287：527-537，1998)。因此，预期可以检测心脏各个区域的组织的MPO活性作为损伤的标志。也预期能够减少炎性反应的干预将伴随与未处理动物风险区的心脏组织相比，灌注的风险区中MPO活性降低。因此，药物处理的心脏与对照载体处理的心脏相比，MPO活性改变的百分比(风险区/非风险区)将降低。

在实验最后，初步的无对照无验证试验确定组织髓过氧化物酶(MPO)活性。心脏组织样品得自风险区和非风险区，在0.5％溴化十六烷基三甲铵中进行匀浆化并溶于50mM磷酸钾缓冲液，pH6.0中(也见Liu etal.，1998，J.Pharmacol.Exp.Ther.287：527-537)。匀浆在12,500g，4℃离心30分钟。收集上清并与含0.167mg/ml o-联茴香胺二盐酸盐(Sigma)和百分之0.0005H₂O₂的50mM磷酸钾缓冲液，pH6.0反应。在460nm分光光度测定吸光度改变。一个单位MPO定义为25℃水解1mmol H₂O₂/分钟的酶量。这个初步试验的结果，这里没有提供，看来表明ETC-216和载体处理的心脏在缺血再灌注损伤方面没有显著性差异，然而，结果尚需验证，例如通过缺血再灌注损伤前MPO水平的比较。

风险区的梗塞百分比和左心室的梗塞百分比降低证明ETC-216处理的心脏被保护不受缺血再灌注损伤的损害。两种剂量方案均提供了心脏保护，也就是，缺血开始前以单一100mg/kg剂量或以两个100mg/kg剂量给予ETC-216，缺血前一天给与一计量和缺血前立即给予第二剂量。

6.3.实施例3：LAD闭塞-再灌注兔心脏中，急性给药的最低有效剂量的确定

这个实施例证明了当作为就在区域性缺血开始前单一预处理给予时，各种剂量ETC-216的预防功效。实施例2的研究集中于体内研究中ETC-216作为心脏保护剂的效果，其中兔心脏接受30分钟时间的区域性心肌缺血，随后最少四个小时的再灌注。使用两剂量方案。在第一个方案中，ETC-216作为单一预处理来测试，其中就在区域性缺血开始前，全身循环接受100mg/kg该剂，而在第二个方案中，区域性缺血开始前(前一天和之前立即)给予两个100mg/kg预处理。两个方案都显示100mg/kg ETC-216一次或两次处理都具有心脏保护作用。

因此，ETC-216作为单一预处理来测试，其中在区域性缺血开始前，心脏接触单一剂量的该剂或等体积载体，以确定对心脏保护的作用。用实施例2中所用的相同方法分析心脏。此外，设计这个方案去发现ETC-216处理兔心脏产生缺血保护的最低有效剂量。

为了发现ETC-216的最低有效剂量，使用相同方案急性处理(见图12)，其中动物接受10，3或1mg/kg ETC-216或等体积载体的单一处理，如图15所示。对于10mg/kg处理组，对照组和处理组中，表示为占总左心室的百分比的风险区(AAR)或缺血区类似(图16)。与载体处理的兔相比，用10mg/kg ETC-216处理的兔发生较小的梗塞(p＜0.0005)，表示为占AAR的百分比(图16)。当数据表示为占总左心室的百分比时，也观察到心肌梗塞大小减少(p＜0.0001)(图16)。

用3mg/kg的剂量也观察到类似结果。ETC-216处理的和载体处理的组，表示为占左心室百分比的AAR类似(图16)。与载体处理的兔相比，用3mg/kg ETC-216处理的兔发生较小的梗塞(p＜0.05)，表示为占风险区的百分比(图16)。

在表示为占左心室的百分比的AAR大小上，1mg/kg剂量的ETC-216和载体之间没有注意到显著性差异(图16)。在1mg/kg时，AAR的百分比(图16)和心肌梗塞大小表示为占总左心室百分比时，组间没有注意到显著性差异(图16)。

图16显示了四个急性处理组(即100，10，3和1mg/kg)以及它们各自的对照的每组数据的总结。四个组每个组的梗死的AAR类似。梗塞大小无论表示为占风险区的百分比还是占左心室的百分比，与各个对照相比，在四个剂量方案中，100，10和3mg/kg ETC-216剂量组的梗塞大小都降低。相比之下，接受1mg/kg的动物组的梗塞大小与各自的载体处理组中观察到的没有差异。

图17显示了脂蛋白未酯化胆固醇的时间变化实例。就在给予1，3，10或100mg/kg ETC-216或载体给予前和周期后，从兔获得血液样品。显示的是代表性时间血液血清样品中获得的未酯化胆固醇谱，其中基于含在线未酯化胆固醇分析的凝胶-过滤层析的大小基础上分开血清脂蛋白。注意在给予ETC-216后45分钟，高密度胆固醇未酯化胆固醇升高，特别是以100mg/kg，和以10mg/kg达较小程度，尽管在静脉内给予ETC-216测试剂中实际上缺乏未酯化胆固醇。也注意到给予10mg/kg或100mg/kg ETC-216后210和270分钟，极低密度脂蛋白未酯化胆固醇显著升高延迟。也注意到以3mg/kg ETC-216处理剂量，在评价的时间点，脂蛋白未酯化胆固醇改变不明显，然而，如图16中显示，这个剂量有心脏保护作用。

结果证明100mg/kg，10mg/kg和3mg/kg是ETC-216的有效预防剂量。

6.4.实施例4：在闭塞-再灌注兔心脏中，当LAD闭塞开始后给予ETC-216时，预防缺血-再灌注损伤

这个实验证明了当缺血或闭塞事件后给予ETC-216时，它预防或减少缺血再灌注损伤的功效。实施例2和3中的研究阐明了缺血开始前，处理心肌的预防益处。因此为了确定缺血开始后，ETC-216是否能够保护心肌，给予测试剂或载体前，LAD被闭塞。在这个方案中，ETC-216用单一处理来测试，其中心脏接触10mg/kg剂或等体积载体，在区域性缺血最后5分钟期间并持续经过再灌注的前55分钟给予(图18)。表示为占总左心室百分比的AAR或缺血区，10mg/kg处理组与对照组类似(图19)。与载体处理的兔相比，用ETC-216处理的兔发生较小梗塞(p＜0.001)，表示为AAR的百分比(图19)。当数据表示为占总左心室的百分比时，也观察到心肌梗塞大小减少(p＜0.0005)(图19)。

这个实施例证明了缺血事件后给予的单一处理减轻或减少了缺血再灌注损伤。

已经描述了本发明的各种实施方案。说明书和实施例意在阐明本发明而不是限制它。实际上，对本领域技术人员很明显可以对描述的本发明的各种实施方案做出改动而不背离本发明精神或下面列出的所附权利要求的范围。本文引用的所有文献均以整体引入作为参考。

Claims

1.一种治疗、预防或减少组织或器官缺血再灌注损伤的方法，包括使该组织或器官与有效量的载脂蛋白接触。

2.权利要求1的方法，其中载脂蛋白不是含硫醇基的载脂蛋白。

3.权利要求1的方法，其中载脂蛋白是含硫醇基的载脂蛋白。

4.权利要求1的方法，其中载脂蛋白是apoA-I、apoA-II、apoA-IV、apoA-V、apoE或其变异体或片段。

5.权利要求1的方法，其中载脂蛋白是人或非人来源的。

6.权利要求1的方法，其中载脂蛋白是天然或合成载脂蛋白，或其变异体或片段。

7.权利要求1的方法，其中载脂蛋白是载脂蛋白的同源混合物。

8.权利要求1的方法，其中载脂蛋白是载脂蛋白的异源混合物。

9.权利要求1的方法，其中载脂蛋白是全长载脂蛋白、天然或合成载脂蛋白的片段，或其变异体。

10.权利要求1的方法，其中载脂蛋白是载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-I Milano或载脂蛋白A-I Paris。

11.权利要求10的方法，其中载脂蛋白是载脂蛋白A-I Milano。

12.权利要求1的方法，其中载脂蛋白是包含载脂蛋白和脂类的复合物形式。

13.权利要求12的方法，其中脂类包含一种或多种磷脂、胆固醇、甘油三酯和胆固醇酯。

14.权利要求13的方法，其中磷脂选自：小烃链磷脂、磷脂酰胆碱、卵磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-油酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆胺、二月桂酰磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰胆胺、二棕榈酰磷脂酰胆胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、鞘脂、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂、半乳糖脑苷酯、神经节苷酯、脑苷酯、(1、3)-D-甘露糖-(1、3)二甘油酯、氨苯糖甙、3-胆甾醇基-6′-(糖基硫代)己醚糖脂、胆固醇和胆固醇衍生物。

15.权利要求13的方法，其中磷脂是磷脂酰胆碱或其类似物。

16.权利要求15的方法，其中磷脂是1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱。

17.权利要求12的方法，由此脂类和载脂蛋白形成脂质体结构。

18.权利要求1的方法，其中载脂蛋白减少组织或器官氧化产物。

19.权利要求1的方法，其中载脂蛋白减少组织或器官肌酸激酶。

20.权利要求1的方法，其中该方法是治疗性处理。

21.权利要求1的方法，其中该方法是预防性或防止性的。

22.权利要求1的方法，其中该方法减少缺血再灌注损伤。

23.权利要求1的方法，其中组织或器官在个体中。

24.权利要求23的方法，其中缺血再灌注损伤是由于心肌梗塞、狭窄、至少一个血凝块、中风、间歇性跛行、外周血管病变、急性冠脉综合征、血管闭塞造成的心血管疾病或肌肉损伤。

25.权利要求1的方法，其中组织或器官是体外的。

26.权利要求25的方法，其中组织或器官是移植的组织或器官。

27.权利要求26的方法，其中输送过程中，载脂蛋白与移植的组织或器官接触。

28.权利要求26的方法，其中移植过程中，载脂蛋白与移植的组织接触。

29.权利要求24的方法，其中缺血后载脂蛋白迅速与组织或器官接触。

30.权利要求23的方法，其中缺血再灌注损伤是由于个体手术引起，和接触组织或器官包括给个体施用包含载脂蛋白的药物组合物。

31.权利要求30的方法，其中手术是心脏手术。

32.权利要求31的方法，其中心脏手术过程中给予载脂蛋白。

33.权利要求30的方法，其中心脏手术是冠状动脉旁路手术或经皮腔内冠状动脉血管成形术。

34.权利要求23的方法，其中冠状动脉旁路手术的需要降低。

35.权利要求23的方法，其中经皮腔内冠状动脉血管成形术的需要降低。

36.权利要求30的方法，其中手术恢复时间缩短。

37.权利要求23的方法，其中狭窄是一条或多条病变的血管造成的。

38.权利要求23的方法，其中狭窄是由闭塞的一条或多条血管机械性诱发的。

39.权利要求23的方法，其中损伤是由于一个或多个血凝块造成的。

40.权利要求39的方法，其中血凝块是由斑块破裂造成的。

41.权利要求1的方法，其中损伤是对肌肉的损伤。

42.权利要求41的方法，其中肌肉是心肌。

43.权利要求41的方法，其中肌肉是骨骼肌。

44.权利要求41的方法，其中肌肉是平滑肌。

45.权利要求1的方法，其中损伤是对器官的损伤。

46.权利要求45的方法，其中器官是心脏、肺、肾、脾、肝或脑。

47.权利要求1的方法，其中载脂蛋白是1∶1比率的载脂蛋白A-IMilano和1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱的形式。

48.权利要求11的方法，其中载脂蛋白肠胃外给予。

49.权利要求23的方法，其中载脂蛋白静脉内、动脉内、心包、血管周或冠状动脉内给予。

50.权利要求1的方法，进一步包括给予溶栓剂。

51.权利要求50的方法，其中溶栓剂是组织纤溶酶原激活剂(TPA)、链激酶、阿尼普酶、瑞替普酶或尿激酶。

52.权利要求1的方法，进一步包括给予抗凝剂或抗血小板剂。

53.权利要求53的方法，其中该剂是阿司匹林、氯吡格雷或肝素。

54.一种预防或治疗与氧缺失相关的病症，随后需要其的组织或器官氧供增加的方法，包括该组织或器官与有效量的载脂蛋白接触。

55.权利要求54的方法，其中与氧缺失相关的病症是中性粒细胞粒细胞活化。

56.权利要求54的方法，其中与氧缺失相关的病症是髓过氧化物酶产生。

57.权利要求54的方法，其中该方法降低与氧缺失相关的病症的严重性。

58.权利要求54的方法，其中氧缺失后载脂蛋白迅速与该组织或器官接触。